VİRÜS SAFLAŞTIRMA YÖNTEMLERİ
SAFLAŞTIRMA: Virüs partiküllerinin konukçu hücreye ait
kısımlardan, biyolojik özellikleri bozulmadan ve aktif şekilde elde edilmesidir.
Virüs saflaştırılmasına neden ihtiyaç duyulur?
1. Antibodi (antikor) üretimi
2. Virüsün fiziksel özelliklerinin incelenmesi
3. Virüsün biyokimyasal özelliklerinin araştırılması
4. Virüsün moleküler özelliklerinin araştırılması
SAFLAŞTIRMANIN ANA AŞAMALARI
• 1. Konukçuda virüsün çoğaltılması (Propagation)
• 2. Bitki öz suyunun elde edilmesi (Extraction)
• 3. Kaba bitki materyalinin uzaklaştırılması (Clarification)
• 4. Virüs partiküllerinin konsantre hale getirilmesi (concentration)
• 5. Yüksek hızda santrifüjleme ile ileri düzeyde
saflaştırma (Higher purification)
SAFLAŞTIRMANIN BAŞARISI 2 ŞEKİLDE KONTROL EDİLİR:
• 1. Spektrofotometre cihazı ile saflaştırılan virüs preparasyonunun UV absorbans
değerlerinin kontrol edilmesi
• 2. Saflaştırılan preparasyonun, konukçu bitkiye
inokulasyonu ve virüsün biyolojik olarak aktif
olup olmadığının incelenmesi
• Her virüsün partikül özelliği farklıdır. Bu nedenle bir virüsün saflaştırılmasında
kullanılan bir yöntem diğer bir başka virüste sonuç vermeyebilir.
• Her virüs için kullanılan kimyasallar ve işlem basamakları farklı farklı olabilir.
• Fakat yine de ana işlem basamakları çok
değişmez.
Uygun Konukçu Bitkide Virüsün Çoğaltımı
Enfekteli Bitki Dokusunun Hasat Edilmesi
Bitki Dokusunun Homojenizasyonu (Extraction)
Ekstraktın Isıtılması veya Bazı Organik Solventler ile Muamele Edilmesi (Clarification)
Düşük Hızda Santrifüj (Low speed centrifugation)
Santrifüj Sonrası Supernatant Kısmının Alınması
NaCl veya PEG ilavesi Yüksek Hızda Santrüfüj
Düşük Hızda Santrüfüj Düşük Hızda Santrifüj Peletin buffer içinde çözülmesi Yüksek Hızda Santrifüj
Düşük Hızda Santrifüj Bu işlemin birkaç sefer tekrarı
Supernatantın alınması ve yüksek hızda santrüfüj
Sukroz Density veya CsCl/CsSO4 Denge Density Gradient Santrifüj Yöntemi ile İleri Düzey Saflaştırma
• Genellikle hücre dışında stabil olan ve bitki
dokularında yüksek düzeyde çoğalabilen virüsler (TMV, ToMV, PVX gibi) daha başarılı şekilde
saflaştırılırlar.
• Hücre içinde düşük konsantrasyonda olan ve
stabil olmayan (unstabil) virüslerin saflaştırılması zordur.
• Virüs çoğaltımı için hücre içinde inhibitör madde içermeyen bitkiler (tütün, hıyar, petunya, börülce gibi) tercih edilmelidir.
1. ÇOĞALTIM
Her virüs türü için en iyi çoğaltım konukçusu farklıdır.
Çoğaltım konukçusuna inokulasyon yapıldıktan sonra, bitkide virüs miktarının en yüksek seviyeye ulaştığı gün(ler) belirlenmelidir.
Örneğin; Potato mop top virus için virüsün purifikasyonu için uygun olan konukçu Nicotiana benthamiana’ dır. Bu bitkide inokulasyondan sonra virüs miktarının 16-20.
günde en yüksek düzeye çıktığı bilinmektedir.
Virus Çoğaltım Konukçusu
Purifikasyon için Çoğaltım
Konukçusu
Lokal Lezyon Konukçusu
Alfalfa mosaic virus
Nicotiana glutinosa
N. tabacum Chenopodium quinoa
Arabis mosaic virus
Petunia hybrida N. clevelandii C. amaranticolor
Bean yellow mosaic virus
Phaseolus vulgaris Vicia faba
Vicia faba N. clevelandii
C. quinoa
Cucumber mosaic virus
N. tabacum N. clevelandii C. quinoa
Lettuce mosaic virus
Lactuca sativa C. quinoa L. sativa
C. quinoa
C. amaranticolor Potato virus Y N. glutinosa N. tabacum C. quinoa
C. amaranticolor Tobacco ring
spot virus
N. tabacum Cucumis sativus
Cucumis sativus Vigna sinensis Kaynak: Walkey, D. 1991. Plant Virology. Chapman and Hall . p. 338
En uygun dönemde toplanan virüs enfekteli bitki dokusu havan ve havan eli yardımıyla, uygun bir tampon çözelti içerisinde homojenize edilir. Bu işleme ekstraksiyon denilir. Ekstraksiyon işlemi 0-5
oC arasında yapılır.
Ekstraksiyon işlemi için kullanılan buffer (çözelti) çeşitli kimyasalları içerir.
Ekstraksiyon için kullanılan çözeltinin pH değeri kritiktir. Çünkü ekstraksiyon sırasında sağlam bir hücrenin parçalanması söz konusudur. Virüs partiküllerini içeren hücre stoplazması içindeki organeller, hücre membranı ve vakuoller parçalanırken virüs partikülleri farklı bir ortam ile karşı karşıya kalır. Farklı bir iyonik çevre ve pH değişimi virüsün stabilitesini etkiler.
Bu nedenle virüsün stabilitesini koruyacak maddelerin ekstrasiyon çözeltisine İlave edilmesi önemli bir konudur.
Birçok virüs, stabilite için belirli bir pH ve iyonik düzeye ihtiyaç gösterir. Virüsün belirli bir çözeltide çökelmesini sağlayan pH değerine VİRÜSÜN İZOELEKTRİK NOKTASI denir.
2. EKSTRAKSİYON
Birçok virüsün izoelektrik noktası hafif bazik pH değeridir. Bu sebeple hazırlanan Ekstraksyon Çözeltilerinin pH değeri genelde 7.0-8.0 arasındadır.
Bu pH değerindeki süspansiyon içinde virüs partikülleri stabilitesini daha iyi korur. Ancak birkaç virüs bazen bu pH değerinde dahi stabilitesini kaybetmektedir.
Ekstraksiyon Çözeltilerinde Bulunan Maddeler:
BORAT, SİTRAT, FOSFAT, TRİS
Konsantrasyon Aralığı: 0.005-0.5 M
• Saflaştırma sırasında virüs partiküllerini bekleyen diğer bir tehlike Oksidasyon’ dur.
• Oksidasyon virüsün enfektivitesinin kaybına sebep olur.
• Bu nedenle ekstraksiyon çözeltisine oksidasyonu azaltan maddeler ilave edilir.
• Bu maddelere örnekler (0.01-0.1 M konsantrasyonda) Askorbik asit,
Sistein hidroklorit, Sodyum Sülfit
Thioglycollic asit
2-Mercapta ethanol (ME) oksidasyonu önleyen yani
antioksidan bir maddedir. Ancak bazı virüs türleri için 2-ME
kullanılamaz. Çünkü 2-ME bazı virüsleri inaktif hale getirir.
Madde Kullanılma Amacı
Sistein Hidroklorit Oksidasyonu Engelleme Sodyum sülfit Oksidasyonu Engelleme
PVP (Polyvinyl Pyrolidine) Virüs partiküllerinin fenolik bileşiklere bağlanmasını engelleme
PEG (Polyethylene Glycol) Virüs partiküllerinin fenolik bileşiklere bağlanmasını engelleme
Triton-X Konukçuya ait bileşenlerden virüs partiküllerinin serbest hale getirilmesi
Tween-80 Konukçuya ait bileşenlerden virüs partiküllerinin serbest hale getirilmesi
Na2EDTA-ethylene diamine tetracetic acid
Konukçu protein ve ribozomların uzaklaştırılması ve oksidasyonu engelleme
Bentonite Nükleaz enzimlerine ve ribozomlara karşı virüs partiküllerini koruma
Potyvirus cinsinde yer alan virüslerin partikül yapıları uzun ipliksi yapıda olduğu için bu virüsler ekstraksyon sırasında agregatlaşma eğilimi gösterirler. Bunu önlemek için Ekstraksyon buffırına 0.1-0.5 molar konsantrasyonda Üre veya 2-ME eklenir ve pH 8.0- 8.5’a ayarlanır.
• Bu işlem konukçuya (host) ait bileşenlerin uzaklaştırılması için yapılır.
• Düşük devirde santrifüj işleminde 1000-10.000 rpm devir kullanılır ve süre olarak 5-15 dakika uygulanır.
• Bu işlem sonunda virüs partikülleri çökelmez.
• Çökelen yapıya PELET denir. Bu işlemden sonra tüpün dibinde oluşan pelet, konukçuya ait kaba bileşenleri içerir.
• Bu aşamada tüpün dip kısmındaki pelet atılır, üstteki sıvı faz (Supernatant) alınır.
3. DÜŞÜK DEVİRDE SANTRİFÜJ
PELET VE SUPERNATANT
• Ultrasantrifüj cihazı kullanılır.
• 35.000-60.000 rpm’de genellikle çalışılır.
• Uygulanan süre 1.5-2 saattir.
• Santrifüj sonunda virüs pelet olarak tüpün dibine çöker.
• Bu işlemden sonra supernatant kısım atılır.
• Pelet buffer içinde çözülür.
• Takiben daha saf hale getirmek için düşük ve yüksek devirde santrifüj işlemi tekrarlanır.
4. YÜKSEK DEVİRDE SANTRİFÜJ
SOLUSYONDAKİ PARTİKÜLLERİN BÜYÜKLÜK VE YOĞUNLUKLARINA GÖRE DÜŞÜK ve YÜKSEK DEVİRDE SANTRİFÜJ YÖNTEMİ (DİFERANSİYEL SANTRİFÜJ) İLE AYRILMASI
Düşük devirde büyük partiküller çöker, küçük partiküller sıvı fazda kalır.
• Density Gradient Santrifüj İşlemi virüsün konukçuya ait küçük bileşenlerden daha iyi ayrılmasını ve konsantre hale getirilmesini sağlar.
• Yüksek devirde (50.000-70.000 rpm) santrifüj işlemi uygulanır.
• Tüpe virüs preparasyonu konulmadan önce farklı yoğunluklarda (%60, %50, %40,…%10 gibi) sukroz veya sezyum klorür (CsCl2) çözeltileri hazırlanır ve tüpe yüklenir.
5. DENSİTY GRADIENT SANTRİFÜJ İŞLEMİ İLE
VİRÜSÜ DAHA KONSANTRE HALE GETİRME
SUKROZ GRADİENT HAZIRLAMA TEKNİĞİ (1)
1. Teknikte tüpün en alt kısmına %10’luk sukroz çözeltisi pipet ile konulur. Daha sonra sırasıyla % 20’lik, %30’luk……%50’lik şeklinde ilave yapılır. Bu işlemde her çözelti ilave edilirken pipet tüpün dibine yerleştirilir ve çözelti yavaş yavaş dikkatli bir şekilde bırakılır.
En yoğun (%50) en son ilave edilir.
SUKROZ GRADİENT HAZIRLAMA TEKNİĞİ (2)
2. Teknikte sukroz çözeltisinin ilave edilmesine %50’lik çözelti ile başlanır. Sırasıyla
%40, %30…….%10 şeklinde devam edilir. Ancak bu teknikte, her yoğunlukta çözelti ilave edildikten sonra -80oC’de çözelti dondurulur, daha sonra diğeri ilave edilir.
• En son olarak virüs preparasyonu tüpe konulur ve tüp santrifüj cihazına yerleştirilir.
• Cihaz çalıştırılır. Bu işlem sırasında virüs preparasyonu içindeki bileşenler şekil, büyüklük ve yoğunluklarına göre
(Sedimentasyon Katsayılarına= Sedimentation Coefficient) ayrılır ve farklı sukroz yoğunluklarında birikir.
• En son aşamada virüsün saflığı spektrofotmetre veya jel
elektroforez yöntemi ile kontrol edilir.
1. veya 2. teknikten herhangi biri ile yerleştirildikten sonra Sukroz, bir gece 4oC’de inkube edilir (Solusyonun diffüzyon yoluyla gradient oluşturması için)
Daha sonra virüs preparasyonu en üste ilave edilir ve tüpler ultrasantrifüj cihazına yerleştirilir.
DENSİTY GRADİENT SANTRİFÜJ İŞLEMİ İÇİN KULLANILAN ROTOR TİPİ (SWINGING-BUCKET ROTOR)
Santrifüjün çalışması sırasında tüplerin pozisyonu
Densitiy gradient santrifüj işleminde, partiküller büyüklük ve kütlelerine göre birbirlerinden ayrılırlar. Benzer büyüklükte olanlar aynı alanda ve sukroz yoğunluğunda birikirler.
Santrifüj sonrası farklı yoğunluktaki Sukroz içinde ayrışan kısımların tüplere alınması
Citrus Crinkly-leaf virus ‘ün Enfekteli Limon Yapraklarından SUKROZ GRADİENT SANTRİFÜJ YÖNTEMİ İLE SAFLAŞTIRILMASI
B: SAĞLIKLI LİMON A: ENFEKTELİ LİMON
Virüs partikülleri (III. Bölge)
Kaynak: Yot-Dauthy, D. and Bove, J.M. ?. Purification of Citrus Crinkly leaf virus
