Taksan Tipi Diterpenoitlerin Elde

FABAD J. Pharm. Sci., 25, 121-137, 2000

BİLİMSEL TARAMALAR/ SCIENTIFIC REWIEVS

Taksan Tipi Diterpenoitlerin Elde

Edilmesinde ve Analizlerinde Kullanılan

Yöntemler

Nurgün ERDEMOGLU*", Bilge

ŞENER*

Taksan Tipi Diterpenoitlerin Elde Edilmesinde ve Analizlerinde Kullanılan Yöntemler

Özet: Önemli bir antikanser ilaç olan taksan sınıfı diterpenoit taksa!, ilk kez 1971 yılında Taxııs brevifolia Nutt. 'nın ka- buklarından izole edilmiştir. Birçok kanser tiplerine karşı geniş bir klinik aktivite gösteren taksol, dünyayı geniş bir araş­

tırnıaya teşvik etmiştir. Bu araştırmalar sonucu, değişik Taxus türlerinden birçok taksan tipi diterpenoit izole edilmiştir. Bu

çalışmada Taxııs türlerindeki taksan tipi diterpenoitlerin elde edilme ve analizlerinde kullanılan yönteınler verilnıiştir.

Anahtar kelimeler : Taxus türleri, taksol, taksoitler, di-

Received Revised Accepted

GİRİŞ

terpenoitler, antitünıör bileşikler

16.11.1999 15.02.2000 15.02.2000

Taksa! (1), ilk defa T. brevifolia'dan elde edilen

1,

an- tikanser etkisinden

dolayı

bugün özellikle meme, ovaryum ve küçük hücreli olmayan

akciğer

kan- serinin tedavisinde

kullanılan

taksan

yapısında doğal

bir

bileşiktir2. Farklı

etki

mekanizması

ile kan- ser kemoterapisinde önemli bir yere sahip ol-

muştur3.

Taksolün antikanser etkisinin belirlenmesinden sonra

diğer Taxus türleri üzerinde de taksan tipi di-

terpenoitlerin elde edilmesi ve aktivitelerinin be- lirlenmesi yönünde

çalışmalar yapılmışhr.

Bugüne kadar Taxus türlerinden 250'den fazla taksan tipi di- terpenoitin izole

edildiği bildirilmiştir4-6. Taxus

türlerinde bulunan taksan tipi diterpenoitler "Tak- soitler"2,4 veya

bazıları

(örn. taksol) azot ihtiva et-

The Methods of Iso/ation and Analysis of the Taxane-Type Ditel]Jenoids

Summary : The taxane class diterpenoid taxol is an im- portant anticancer drug first isolated from the bark of the Pacific Yew tree (Taxus brevifolia Nutt.) in 1971. lts broad spectrum anticancer activity in clinical trials has spurred a worldwide search. During these researches, nıany ıaxane­

type diterpenoids have been isolated /rom different Taxus species. in this paper, the metlıods of isolation and analysis of taxane-type diterpenoids /rom Taxus species have be en re- viewed.

Keywords: Taxus sp., taxol, taxoids, diterpenoids, anti- tumor agents

!iği

için "Taxus Alkaloitleri"

7,S

ismiyle de bi- linmektedir. Taxus cinsinin ülkemizde

yetişen

tek türü olan T. baccata L.9 üzerinde

yaphğımız

ça-

lışmalarda

da bitkinin taksol

yanında

benzeri taksan tipi diterpenoitleri ihtiva

ettiği

tespit

edilmiştir⁶,1D.

Bu makalede Taxus türlerinde bulunan taksan tipi diterpenoitlerin elde edilmesinde ve analizlerinde

kullanılan

yöntemler verilmektedir.

KULLANILAN YÖNTEMLER

Taxus

türlerinin

değişik kısımlarından

taksan tipi diterpenoitlerin elde edilmesinde genel yön- temlerden

yararlanılmıştır5. T.

baccata'dan ya-

pısında

azot ihtiva eden taksan tipi diterpenoitlerin elde edilmesi için son

yıllarda yapılan bazı

ça-

lışmalarda

asit-baz

değişiminin kullanıldığı

gö- rülmektedir. Verilen yöntemlerde taksan tipi di-

*

Gazi Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Farmakognozi Anabilim Dalı, 06330 Etiler, Ankara

0 Yazışma Adresi

Erdemoglu, ^Şener

terpenoitler seyreltik ^{% 0.5-2} HCl veya H₂S04 ile sulu faza geçirilmektedir. ^Ardından nötral bi-

leşiklerin uzaklaşhrılması amacıyla bir organik çö- zücüyle yapılan yıkama işleminden soma, alkali or- tamda organik çözücülerle ^yapılan tükehneler sonucu ham taksan tipi diterpenoit ^karışımı elde edilmektedir. Bu ham ekstre kolon kromatografisi veya preparatif Yüksek Performanslı Sıvı Kro- matografisi (High Performance Liquid Chro- matography-HPLC) teknikleri kullanılarak bi- leşiklerine ayrılmaktadırll·B

Taksan tipi diterpenoitlerin elde edilmesi için etanol veya metanol, bazan da diklorometan-metanol ka-

rışımı kullanılmakta, birinci tükehneyi takiben ge- nellikle diklorometan ve su ^arasında, taksan tipinde olmayan bileşiklerin uzaklaştırılması amacıyla ikinci bir tüketme ^işlemi uygulanmaktadır. Bazı ça-

lışmalarda yaprak ve kabukta bulunan mumlar ve lipitleri uzaklaştırmak için petrol eteri veya hek- zanla bir ön temizleme işlemi yapılmıştrr14-21. Tak- san tipi diterpenoitlerin elde edilmesinde kullanılan

çözücüler Tablo l'de verilmiştir.

Tablo

1.

Taksan Tipi Diterpenoitlerin Elde Edilmesinde Kullanılan Çözücüler

1. Tükehne 2. Tüketme Tür Bitki kısmı

Metanol Metanol Metanol Metanol Metanol Metanol Metanol Metanol Metanol Metanol Metanol Metanol Metanol Metanol Metanol Metana!

Metanol Metanol Metanol Metana!:

Diklorometan Metanol:

Diklorometan Etanol Etanol Etanol Etanol Etanol Etanol Etanol Eter

Diklarometan:Su Diklorometan:Su Diklorometan:Su Diklorometan:Su Diklorometan:Su Diklarometan:Su Diklorometan:Su Diklorometan:Su Diklorometan:Su Kloroform: Su Kloroform:Su Klaroform:Su Kloroform:Su

Klaroforın:Su

Kloroform: Su Toluen:Su

Hekzan

Diklorometan:Su

Petrol eteri Klaroform:Su Kloroform:Su Diklorometan:Su Diklorometan:Su

Taxussp.

Taxus ^sp.

Taxussp.

T. brevifolia T. cuspidata T. brevifolia T. wallichiana T. baccata T. brevifolia T. brevifolia T. brevifolia T. baccata T. wallichiana T. cuspidata T. wallichiana T. cuspidata T. media T. cuspidata T. brevifolia T. cuspidata

T. baccata

T. cuspi da ta T. baccata T. baccata T. cuspidata T. chinensis T. baccata T. chinensis T. yunnanensis

Kabuk Yaprak

Kabuk, yaprak Kabuk

Kabuk, yaprak Kabuk

Yaprak Yaprak

Kabuk, yaprak Kabuk

Yaprak Kabuk Kabuk

Gövde, tohum Kök

Gövde Yaprak, dal Kabuk, yaprak Kabuk

Yaprak, dal

Yaprak

Dal Yaprak Odun, kabuk Gövde, yaprak Kabuk

Kabuk, yaprak Yaprak Kök

Kaynak

22

23

24

1,25,26 27

28,29 30

31 32

33,34

35 36

37 38

39

40-42 43 44 45

21

46,47

48 49 6

50 51 52

53,54

55

FABAD J. Pharm. Sci., 25, 121-137, 2000

Taxus

türlerinden taksolün elde edilmesi

sırasında, yapı

olarak kendisine çok benzeyen se- falomannin'den (2)

ayırımı

oldukça güçtür (taksa!

ve sefalomannin'in

yapısındaki

tek

farklılık

3'-N- açil

grubundadır;

taksa) benzoil grubu

taşırken,

se- falomannin'de tigloil grubu

bulunmaktadır).

Bu amaçla

ilk yıllarda,

silika jel kolon üzerinde di- klorometan/ n-butanol çözücü sistemi ile daha az

duyarlıkta gerçekleşen

bir

ayırım,

ya da HPLC me- todu

kullanılmıştır²⁶,28.

Daha sonra KINGSTON ve

arkadaşları

sefalomannin'in yan zincirinde ger-

çekleştirdikleri

selektif kimyasal

değişikliklerle

se- falomannin diol'lerini elde

etmişler

ve bu türevleri de flash kromatografi ile taksolden

ayırmayı

ba-

şarmışlardır56.

Bu amaçla son

yıllarda

Yüksek

Hızlı Karşı Akım

Kromatografisi (High-Speed Counter Current Chromatography-HSCCC)57 ve

Karşı Akım

Kromatografisi (Counter Current Chromatography-

ccqss

kullanılınıştır.

Yine iki

farklı araştırıcı

grubu, kimyasal reaksiyonlarla

hazırladıkları

se- falomannin türevlerini taksolden

ayırmayı

ba-

şarmışlardır59·60.

o

Rl'lH

(r{o· o

0

⁰ _#

""" ^ô

f""'irco-

1 R = v

o

2 R=

V ANDANA ve

arkadaşları T brevifolia ka-

buklarından

taksolün

ayırımı

için Süperkritik

Sıvı

Ekstraksiyonu (Supercritical Fluid Extraction-SFE) yöntemini

uygulamışlardır.

Ekstraksiyonda sü- perkritik çözücü olarak azot oksit ve

yardımcı

çö- zücü olarak etanol

kullanılmıştır.

Azot oksit orta kritik

sıcaklığa (T ,=36.5°C) sahip olduğu

için, tak- solün

ısıyla parçalanmasını

en aza indirmesi ve ay-

rıca

polar bir çözücü olarak etanolün son

yıllarda

taksolün

sıvı

ekstraksiyonunda çok

kullanılınası,

bu

çalışmada

azot oksit+etanol

karışımının

tercih edil-

mesine neden

olmuştur.

Elde edilen süperkritik eks- trede laksal

miktarı

ters faz kolon üzerinde gradient elüsyonun

uygulandığı

bir HPLC sisteminde tayin

edilıniştir⁶1.

Bu yöntemlerle elde edilen ekstrelerdeki taksan tipi diterpenoitlerin birbirinden

ayrılması

için ço-

ğunlukla

silika jel'in adsorban olarak

kullanıldığı

kolon kromatografisinden veya ters faz preparatif HPLC sistemlerinden

yararlanılmaktadır.

Birkaç ça-

lışmada

bu amaçla Flash Kromatografisi62-64 ve

Düşük Basınçlı Sıvı

Kromatografisi (Low-Pressure Liquid Chromatography-LPLC)'nden63 de fay-

dalanıldığı görülınektedir.

Elde edilen

bileşiklerin saflaştırılınasmda

preparatif

İnce

tabaka kro- matografisi

(İTK)

veya kristalizasyondan ya-

rarlanılmaktadır.

Taksan tipi diterpenoitler me- tanol6,45,65-67, etanol68

,69,

dietileter

66,

aseton- dietileter7D, kloroform6 ya da n-hekzan-aseton6,1S,71

karışımlarından

kristallendirme sonucu saf-

laştırılınıştır.

Kolon Kromatografisi

Kolon kromatografisinde adsorban olarak genellikle silika jel

kullanılınaktadır. Kullanılan

çözücü sis- temleri Tablo 2'de

verilıniştir.

İnce

Tabaka Kromatografisi

Taksan tipi diterpenoitlerin

teşhisinde kullanılan bazı İTK adsorbanları

ve çözücü sistemleri Tablo 3'de

verilmiştir.

Taksan tipi diterpenoitlerin

ayırımında

çift boyutlu

İTK tekniği

de

kullanılmıştır.

Taksan tipi di- terpenoitlerin nitril, difenil ve amino

bağlı

plaklarda

ayırımı

ve

teşhisleri gerçekleştirilıniştirlOS.

Developmandan soma taksan tipi diterpenoitlere ait lekeler UV254 nm'de incelenmekte ve

^ardından

çe-

şitli

reaktiflerle renklendirilmektedir. Bu amaçla ge-

nellikle seyreltik H2SO 4'in

^(%

3 veya

% 10)

me-

tanoldeki çözeltilerilS,37,46,63,66,101,105,

% 40

sülfürik

asit içinde

%

1 potasyum kroma! çözeltisi106 veya

anisaldehit çözeltisi

[%

76 metana!,

%

19 o-fosforik

Erdeınoğlu,Şener

Tablo 2. Kolon Kromatografisinde

Kullanılan

Çözücü Sistemleri Adsorban Çözücü Sistemi

Silika jel Kloroform, Metana!

Nötr Alumina

Kloroform, Aseton Kloroform, Etilasetat Kloroform, Asetonitril Kloroform, Etanol Diklorometan, Etilasetat Diklorometan, Metana!

Hekzan, Etilasetat

Hekzan, Aseton

Hekzan, n-Butanol Aseton, Diklorometan Petrol eteri, Diklorometan Petrol eteri, Aseton Petrol eteri, Kloroform

Toluen, Aseton

Toluen, Etilasetat, Metanol Hekzan, Etilasetat, Metanol Kloroform, n-Hekzan, Metana!

Aseton, Metanol, Su Diklorometan, Metanol Etilasetat, Siklohekzan

Tablo

3. İnce Tabaka Kromatografisinde Kullanılan Çözücü Sistemleri

Adsorban Çözücü Sistemi

Silika jel Hekzan: Aseton (1 : 1) Hekzan : Aseton (7 : 3) Hekzan: Etilasetat (1 : 1) Hekzan : Etilasetat (3 : 7) Hekzan: Etilasetat (1 : 9) Kloroform : Metana! (95 : 5)

Kloroform: Metana! (9 : 1), (8 : 2), (7: 3) Kloroform: Metana! (10: 1)

Kloroform: Etanol (9: 1) Diklorometan : Metanol (95 : 5) Diklorometan : Metanol (10 : 1)

Kaynak

6,15,17-19 ,33-35,37,39,42, 48 ,50 ,54,68 ,71-84

38-41,55,85-89 33,73,75,90 87

13,91 62

14,20 ,65 ,92-96

12,18,33-35,56,71,72,87,94,97,98 6,14,16,23 ,34,35 ,38 ,40,41,62,64, 73. '7,99,100

14

14,20,34,81,101 51,102

53,54,76,92 15

103 42,104 78,104 86 45 36 67

Kaynak 105

6

105 25,81

81 6,68

6

106

90 105,107

66,101 Metana! : Aseton: Diklorometan (1 : 4: 15) 66,101

asit

(%

85),

%

5 p-anisaldehit

(%

98)]

6•108

kul- vanilin'in etanol içerisindeki çözeltileri püs-

lanılmaktadır.

Çözeltilerin plak üzerine püs- kürtüldükten sonra 105°C'de 10 dakika

ısıhlmasıyla

kürtüldükten soma

plağın

ll0°C'de 5 dakika

ısı-

10-deasetilbakkatin III'ün gri renk

aldığı

bil-

hlmasıyla

taksan tipi diterpenoitler, seyreltik

dirilrniştir1D⁷.

asitlerle

yeşilimsi-mavi⁶•⁶⁶JOl,lOS

anisaldehit çö- zeltisi ile taksol grimsi-kahverengi

6,108, diğer t<l,k-

sanlar ise

yeşilden

maviye ve

kırmızıya

kadar de-

ğişen

renkler

almaktadır⁶.

Bir

diğer çalışmada

renklendirme için

%

3 H

₂

SO

₄

'in ve

ardından %

1.5

Preparatif

İnce

Tabaka Kromatografisi

Adsorban olarak silika jel'in

kullanıldığı

çözücü sis-

temleri

aşağıda belirtilıniştir.

FABADJ. Pharm. Sci., 25, 121-137, 2000

Tablo 4. Preparatif

İnce

Tabaka kromatografisinde

Kullanılan

Çözücü Sistemleri Çözücü Sistemi

Hekzan : Etilasetat

(8 : 92)

Hekzan: Etil asetat

(3: 5)

Hekzan: Etilasetat

(1 : 1)

Hekzan : Aseton (7 :

3)

Hekzan: 2-Propanol

(1: 1)

Kloroform: Metanol

(19 : 1)

Kloroform : Metanol

(95 : 5)

Kloroform : Metana!

(10 :

0.5)

Kloroform: Metanol

(97: 3), (9 : 1),

(8 : 2) Kloroform: Etilasetat (8 :

1)

Kloroform : Aseton

(95 : 5)

Diklorometan: izo·Propanol (24:

1)

Diklorometan: izo-Propanol

(49: 1)

Diklorometan : Metanol

(95 : 5)

Toluen: Aseton (80: 20) Toluen: Aseton (3: 1)

n- Hekzan: Kloroform: Metanol

(5 : 4: 1)

Diğer

Yöntemler

Taksan tipi diterpenoitlerin bitkinin

çeşitli kı­

sımlarında

çok az miktarlarda

^bulunması

nedeniyle daha

duyarlı

metotlar gereklidir. Bu metotlar sadece

Taxus türlerinde değil, çeşitli Taxus hücre ve doku

kültürlerinde, biyolojik s1V1larda taksan tipi di- terpenoitlerin tespiti

amacıyla

da

kullanılınaktadır.

Taksan tipi diterpenoitlerin

^teşhis

ve tayininde kul-

lanılınış

olan ileri teknikler

şunlardır:

Yüksek

Performanslı Sıvı

Kromatografisi (High Per- formance Liquid Chromatography-HPLC)

Çeşitli Taxus bitki ekstrelerinden, doku veya hücre

kültürlerinden ve biyolojik

sıvılardan

taksan tipi di- terpenoitlerin

ayırımı

ve

teşhisi

için en çok kul-

lanılan

metottur.

Ayrıca

taksolün ve me- tabolitlerinin

çeşitli

biyolojik

sıvılarda teşhisi113-115

ve ham taksolde taksol

miktarının

belirlenmesi116

amacıyla

da çok

kullanılmaktadır.

Bu amaçla pek-

Kaynak

63 109 100 6 63 31,63 6,16,63

110 6 73

39

111

31 16,1 I'

18,37

82 86

çok sistem

geliştirilmiştir.

Genellikle fenil-, siyano- veya oktadesil-

bağlı

kolonlarda metanol-asetonitril- diklorometan-su çözücü

karışımlarının

gradient veya izokratik

elüsyorıla uygulandığı

ters faz HPLC, özellikle taksol, sefalomannin, bakkatin III ve

10-

deasetil türevinin

ayırımında başarılı olmuştur.

En az bir aromatik veya sübstitüe olefinik

kısmın

bu-

lunduğu bileşiklerin teşhisi,

UV

absorbsiyorılarına

dayanarak genellikle 227 nm'de ger- kl tiril . . 117 li li

çe

eş mıştır

. Be ·r ·

aralıkta

dalga

boylarının tarandığı

fotodiyot düzeni dedektörü (Photodiode Array detector-DAD) ile uygun dalga

boyları

bu- lunarak hassas sonuçlar

alınmıştır. Bazı

analizlerde diferansiyel refraktometrenin

kullanıldığı

da gö-

rülmektedir13,9o,9ı.

Taksan tipi diterpenoitlerin HPLC ile analizinde

kullanılan bazı

sistemler daha önceki

çalışmamızda bildirilmiştirııs.

Taksan tipi diterpenoitlerin analizi için son

geliştirilen

HPLC sistemleri

şunlardır:

Analitik HPLC

Erdenıoğlu,Şener

Tablo 5. Analitik Amaçlı Kullanılan HPLC Sistemleri

Materyal Kolon Çözücü Sistemi Eliisyon Kaynak

T. baccata ZorbaxODS Asetonitril: Su Gradient lll

(Cıs)

T. baccata Zorbax SB-CN Asetonitril: Metanol Gradient 119

(CNbaltlı)

T baccata Lichrosorb® RPıs Asetonitril :Metan ol: Su ^İzokratik 16

ev. Stricta (38 : 42 : 20)

T. x media Rainin 80-Dl5-C5 Asetonitril:Metanol:Su ^İz.okra tik 43 Microsorb(fenil ^bağlı) (12: 55: 33)

T brevifolia ve PFP HPLC kolon Asetonitril:Sn Gradient 116 ham taksa! (Pentaflorofenil ^bağlı)

T. cuspi da ta Spheri-5 RP18 Su:Asetonitril: ^İzokratik 44

(Cıs bağlı) Tetrahidrofuran (55:35: 10)

Taxus kültürleri Curosil G Etilen glikol Gradient 120

Monometil eter : Su : Asetonitril

Taxus sp. Curosil B Asetonitril: Su (2 : 3) ^İzokratik 121

% 0.05 formik asit

Taxus haccata Techsphere Asetonitril:Su:Metanol: ^İzokratik 122 var. fastigiata (Fenil kolon) Tetrahidrofuran

(37:63:20:2.5)

T. brevifo/ia Rainin Dynamax Metanol:Asetonitril: ^İzokratik 123

(Fenil kolon) Amonyum ^ası;tat (20:32:48) (nH 4.4)

T brevifolia Lichrosorb RP-18 Metana!: Su (65 : 37) ^İzokratik 32

T brevifolia Lichrosorb RP-18 Metana!: Su Gradient 124

Taxus sp.

c"

Metanol: Su (68 : 32) ^İzokratik 22

T. cusoi da ta Hvnersil (Fenil ^baltlı) Asetonitril:Metanol:Su Gradient 21 Taxus <tı. Fenil bai>lı kolon Asetonitril:Metanol:Su Gradient 23 Taxus sp. Fenil bağlı kolon Metanol:Asetonitril: ^İzokratik 24

Amonyum asetat (20:32:48) lnH 4.4) .

Tx media Hicksii Taxsil ,, .. Asetonitril:Metanol:Su Gradient 125 T.x media Ni=

Taksa/ ve ^Fluofıx® Asetonitril:42mM ^İzokratik 126

türevleri (Poliflorür bağlı) Amonyum asetat (40: 60) (pH 5.0)

T. baccata BioRad Bio-Sil Asetonitril:Metanol: Gradient 127

cıs HL 90-10 %1 Formik asit

Taxus sn. Nucleosil Cı8 Asetonitril:Su lnH 2.5) Gradient . ₁₂₈

Taxus sp. Hvnersil C-18 Asetonitril: Su Gradient 129

T. baccata Shandon Hypercarb 1,4-Dioksan: Su ^İzokratik 130

(Poröz grafıtize (46:54) karbon kolon)

T. baccata Zorbax SB-Cs Asetonitril:Metanol:Su Gradient 131

Taxus sp. Taxil(Pentaflorofenil), A)Alkol:Tetrahldrofuran: Gradient 132 Supelcosil (Difenil) Metil-t-butil eter (A,BveC

ve Curosil G (50: 30: 20) ^kanşınu)

B)Alkol: Su (6:94) ClAsetonitril (%100)

-

FABADJ. Pharm. Sci., 25, 121-137, 2000

T baccata l) Nova-Pak® Cıs 1 ve 2 için izokratik 133

2

J

Symmetry™ Cıs Asetonitril:Su:

Tetrahidrofuran (23 : 77 : 0.05)

T brevifolia Taxsil™ve Asetonitril: 10 mM İzokratik 134

(Kallus kültürü) Taxsoı™ Sodyum asetat (47.5: 52.5)

Taxus sp. Sherisorb Cıs Asetonitril: Metanol:Su İzokratik 135

(Kallus kültürü) (25 : 35 : 45)

T. cuspidata Curosil G Asetonitril: Su iz okra tik 136

(Hücre süspansiyon (52.5 : 47.5)

kültürleri)

T. brevifolia Econosphere C -18 Su:Asetonitril: izokratik 137

(Kail us kültürü) Tetrahidrofuran

(58 : 33 : 9)

T. baccata Tessek- Praha SGX- Asetonitril: Metanol:Su Gradient 138 (Kallus kültürü) Phenvl (Fenil bağlı)

T. brevifo/ia TaxsolF 12.5 mM Sodyum asetat: İzokratik 139

(Kallus kültürü) Asetonitril (52.5 : 47.5)

T cuspidata Curosil G Asetonitril:Su İzokratik 140

(Süspansiyon (45: 55)

kültürü)

T. baccata Taxsil™ ve Asetonitril: 10 mM izokratik 141

(Hücre süspansiyon Taxsol™ Sod)'umasetat (47.5:52.5) kültürü)

T. wal/ichiana Supelcosil C-18 Asetonitril:Metanol:Su. İz okra tik 142 (Hücre süspansiyon (30 : 40 : 30)

kültürü)

T cuspidata Fenil bağlı kolon Asetonitril:Metanol:Su Gradient 143 (Kallus kültürü)

Taxus sp. Dynamax phenyl Metanol : 50 mM asetat İz okra tik 144

(Kallus kültürü) tamponu : Asetonitril

(20: 41 : 39) (oH 4.4)

T xmedia Curosil B 1 OmM Amonyum İzokratik 145

(İn vitro kültür) asetat : Asetonitril (55 : 45) (pH 4.0)

T. baccata Separon-SGX-RP/S Asetonitril : 20 mM Gradient 146

(Kallus kültürü) Fosforik asit

Taxus sp. Curosil G lOmM Asetat Gradient 147

(İn vitro kültür) tamponu:Asetonitril

lnH 4.0)

Biyolojik sm Octyl kolon Asetonitril:Metanol:Su İzokratik 148

(İnsan plazması) (4:1:5) (oH5.0)

Biyolojik SIVI APEX Asetonitril:Metanol: iz okra tik 149 (İnsan idrarı) octyl kolon 0.02 M Amonyum asetat

(4: 1 : 5) (pH 5.0)

Biyolojik sıvı APEX Asetonitril:Metanol: İzokratik 115 (Fare idrar, feçes octyl kolon 0.2 M Amonyum asetat

plazma ve doku) (4: l: 5) lnH5.0)

Biyolojik sıvı APEX Asetonitril: Metana!: iz okra tik 114 (İnsan plazması) octyl kolon 0.02 M Amonyum asetat

(4: l : 5) (pH 5.0)

Erdemoğlu, Şener

Biyolojik sıvı Curosil G % 45 Asetonitril içinde İzokratik 113

(İnsan plazması) :l mMAmonyum

asetat tamnonu lnH 5.0)

Biyolojik sıvı ODS kolon Asetonitril:2mM İzokratik 150

(İnsan plazması) fosforik asit (45: 55)

Biyolojik sıvı Spherosil C18 Metana!:% 0.3 İzokratik 151

(İnsan plazması) Ortofosforik asit

(67.5: 32.5)

Biyolojik sıvı M Bondapak Cıs Asctonitril:Su İzokratik 152

(Fare nlazması) (70:30)

Biyolojik sıvı Inertsil ODS-80A Amonyak:Metanol: İzokratik 153

(İnsan plazması) Tetrahidrofuran:Su

(0.1 :60:2.5:37.5)(PH 6.0)

Preparatif HPLC

Tablo 6.

Yarıpreparatif Amaçlı Kullanılan

HPLC Sistemleri

Materyal Kolon Çözücü Sistemi Elüsyon Kaynak

T baccata Lichrosorb® RP-18 Asetonitril:Metanol: Su ^İzokratik 105 (45:20:40)

7'. baccata Lichrosorb® RP-18 Asetonitril:Mctanol:Su ^İzokratik 16

ev. Stricta (45:20:40)

T baccata Watrers Deltapack Asetonitril;Su (3 : 1) İzokratik 65

c.,

T brevifolia Rainin Dynamax- Hekzan:izo-Propanol ^İz okra tik 28 ,--....,ano® (2 : 1)

T. canadensis ODS-2 MAG 9(C,,J Asetonitril:Su (31 : 69) ^İzokratik 62 7: x media Hicksii Rainin Dynamax Metan ol: Asetonitril: ^İzokratik 154

Phenyl 50 ml\.1 Amonyum asetat

(20:34:46)

Taxussp. Prep Nova-Pak® Heptan:izo-Propanol: ^İzokratik 133 HR Silica Trietilamin

190: 10:0. 1)

Preparatil HPLC

Tablo 7. Preparatif

Amaçlı Kullanılan

HPLC Sistemleri

Materyal Kolon Çözücü Sistemi Elüsyon Kaynak

T. brevifolia Nova-Pak ^(Cıs) Meta.nol: Su (60 : 40) ^İzokratik 35 T. brevifolia Rainin Dynamax Asetonitril: Metan ol: Su Gradient 29

(CN baifü)

Taxus sp. Fenil bağlı kolon Asetonitril:Metanol:Su İz okra tik 23 144 : 10 : 46)

T_ baccata W aters Micromr.ısil K1oroforın:Etanol( 19 : 1) İzokratik 91 T. wallichiana Delta Pack C-18 Asetonitril:Metanol:Su ^İzokratik 14

(3 : 2 : 5)

T. \.i-'allichiana W aters Micronnrasil Klorofornı:Etanol<95 : 5) İzokratik 70 T. vunnanensis Cosmosil 10 ^Cııı Metatıol:Su (3 : 1) İzokratik 55 T. vunnanensis Cosmosil 10 C18 Metanol:Su (65 : 35) İzokratik 88 T. x media Hicksii Spherisocb Asetonitril: Su Gradient 155 T. floridana (Cııı ba"¹ı)

T. baccata Waters Prep-pak Asetonitril: Su İzokratik 65

Bondan.:ılc C1 s (25 : 75)

T canadensis ZorbaxSW- Taksane Heptan:Etanol (50 : 50) İzolcratik 156 Alkyl Phenyl Heptan:Etanol (96 : 4)

PentaflouroPhenvl Hentan:Etanol (93 : 7)

T. brevifolia LiChrosorb RP-8 Metanol:Su 170 : 30) İzokratik 25

1'. baccata Tessek-Praha Asetonitril:Metanol:Su Grad.ient 138

(Hücre kültürü) SGX-Phenyl

---

FABAD J. Pharm. Sci., 25, 121-137, 2000

Süperkritik

Sıvı

Kromatografisi (Supercritical Fluid Chromatography-SFC)

Süperkritik

Sıvı

Kromatografisi (SFC), HPLC ve Gaz Kromatografisi (Gas Chromatography-GC)'ne göre daha

gelişmiş

bir metottur. UV ve alev-iyonizasyon gibi HPLC ve GC detektörlerinin her ikisinin kul-

lanılabilmesi

ve

ayrıca ısıya dayanıksız bileşiklerin

analizinin de mümkün

olması avantajlarıdır.

Bu ne- denle hem kapiler hem de

doldurulmuş

kolonlar

kullanılabilir.

Farmasötik

bileşiklerin

analizlerinde SFC ile

yapılan çalışmalar bulunınaktadır.

Son

yıl­

larda taksol ve benzeri

bileşiklerinin

analizi için de

hızlı

bir SFC metodu (LiChrospher diol kolon, mobil faz: 150 bar' da C0

₂ + gradient elüsyonda me-

tanol,

fırın sıcaklığı:

izotermal 30°C,

basınç:

150 bar,

akış hızı

: 2.0 mi/ dak., dalga boyu: 227 nm) ge-

liştirilmiştir.

Bu metotla 35 dakikada taksol ve

diğer

taksan tipi diterpenoitlerin

ayırımı sağlanmıştırl57.

Misel Elektrokinetik Kromatografi (Micellar Elect- rokinetic Chromatography-MEKC)

Bazı

kolloidal çözeltilerde moleküllerin kimyasal olarak adsorbana

bağlanması

ile

ayırımın

ger-

çekleştirildiği

MEKC daha iyi

ayırım

yapabilmeyi

sağlayan

yeni bir yöntemdir. Son

yıllarda

taksan tipi diterpenoitlerin

kaplanmamış

bir silika kapiler kolon üzerinde elektroforez tamponu olarak 25 mM tris-fosfat (pH 8.5), 50 mM sodyum dodesil sülfat ve

%

25 asetonitril'in

kullanıldığı

MEKC ile

ayırımı gerçekleştirilmiştir.

Her iki metotla

sağlanan ayırım karşılaştırıldığında;

MEKC'nin taksan tipi di- terpenoitlerin en iyi

ayırımını

veren izokratik HPLC sistemlerinden daha iyi olarak, tüm

bileşikleri

yük- sek bir

duyarlıkta ayırdığı

tespit

edilmiştir.

Taksan tipi diterpenoitlerin MEKC ile minimum çözücü

atığı

ve 15 dakikadan daha az bir sürede ng mik-

tarında

örnekte analizi

gerçekleştirilmiştirıss. Ayıu çalışmacılar tarafından

taksan tipi diterpenoitlerin,

Taxııs

türlerinin kabuk ve

yapraklarında

MEKC ile

ayırımları bildirilmiştirl59_

MEKC daha basit, daha

hızlı,

daha ekonomik ve herhangi bir özel kolon ge- rektirmeden mükemmel bir

ayırım sağlaması

ne- deniyle HPLC metotuyla

kıyaslanmaktadırlSS,159_

MEKC yönteminin bitki doku kültürlerinde, ya- nsentez

çalışmalarında

ve biyolojik

sıvılarda

taksol ve metabolitlerinin tayininde

kullanılabileceği

de

bildirilmiştirl59_

Yüksek

Performanslı Sıvı

Kromatografisi- Elektrosprey Kütle Spektrometresi (High Per- formance Llquid Chromatography-Electrospray Mass Spectrometry-HPLC-MS).

Çeşitli Taxııs

türlerinin bitki

kısımları

ve hücre kül- türü ekstrelerinde taksan tipi diterpenoitlerin analizi için HPLC-ESMS yöntemi

kullanılmıştır.

ESMS son

yıllarda

steroitler,

çeşitli

ilaçlar ve metabolitleri gibi

düşük

molekül

ağırlığına

sahip polar

bileşikler

ile peptitler ve proteinler için mükemmel bir teknik ola- rak

gösterilmiştir.

HPLC ile ESMS'nin

birleştiği

bu metotla taksan tipi diterpenoitlerin hücre kültürü ekstrelerinde hem

ayırımı

hem de

teşhisi hızlı

ve du-

yarlı

bir

şekilde gerçekleştirilmiştirl60_

Enzim

Bağlı İmmunolojik

Test (Enzyme-Llnked Im- munosorbent Assay- ELISA)

Taxııs

türlerinin bitki ekstreleri ve doku kültürleri içindeki taksan tipi diterpenoitlerin

hızlı, duyarlı

ve spesifik olarak incelenmesi ve

yarıkantitatif

tayinleri

yanında; antitümör aktivite için ümit verici veya

taksolün

yarısentezinde

prekürsör olarak kul-

lanılabilecek

taksan tipi diterpenoitlerin

araş­

tırılması amacıyla

bir enzim

bağlı

immunolojik test olarak

geliştirilmiştir.

Son

yıllarda T. baccata'nın

biyoaktif

bileşiklerinin araştırılması sırasında

bu yöntem

kullanılmıştır.

Anti-taksol

antikorları

2'-süksinil

taksol-sığır

serum albumini (Bovine Serum Albumin-BSA) konjugatma

karşı

immünize

edilmiş tavşanlardan

elde edil-

miştir.

Her bir kromatografik fraksiyon ELISA ile test edilerek biyoaktif

bileşikler

elde

edilmiştirl6.

Yine bir

başka çalışmada Taxııs

türleri ve doku kül- türlerindeki 10-deasetil bakkatin III'ün tayini ve

miktarı

7- veya 10-süksinil-10-deasetilbakkatin III- BSA

konjugatınm kullanıldığı

ELISA testi ile in-

celenmiştirl07. Diğer

bir

araştırmada, T. baccata

gövde

kabukları

irnmünojen olarak 10-süksinil-10- deasetilbakkatin l!I-BSA'mn

kullanıldığı

ELISA testi ile

incelenmiş

ve biyoaktif taksan tipi diterpenoitleri tespit

edilmiştirl61

_

Enzim İmmunotestinin

(Competitive lnhibition

CIEIA)

Yarışmalı hıhibisyonu

Enzyme

hnmırnoassay-

Taxus

türlerindeki ve insan

plazmasındaki

taksol ve

Erdemoğlu, Şener

diğer

taksan tipi diterpenoitlerin tayini için bir po- liklonal antikorun

kullanıldığı

irrununoenzimatik bir reaksiyon olan CIEIA yöntemi

geliştirilmiştir.

Analizde 7-süksiniltaksol-deniz salyangozu he- mosiyanini konjugahna

karşı tavşanlarda oluş­

turulan poliklonal antikorlar

kullanılmışhr.

Bu test ile taksol ve sefalomannin 0.3 ng/ml, bakkatin III ve 10-deasetilbakkatin III 1000 ng/ml kon- santrasyonlarda tayin edilebilmektedir. T. brevifolia

kabuklarının

CIEIA analizi ile ham metanollü ekst- resinde

^%

0.018 ve bu ekstrenin diklorometan frak- siyonunda

%

0.009

miktarında

taksan tipi di- terpenoit

bulunduğu belirlenmiştir.

Yöntemin yük- sek

duyarlılığı,

kolay

uygulanabilirliği, hızlı

ve spesifik

olması

nedeniyle taksol ve

diğer !aksanların

biyolojik örneklerden rutin analizinde kul-

lanılabileceği belirtilmiştir¹⁶2.

Bu yöntemde 7- süksiniltaksol- ve 7-süksinilbakkatin IIl-deniz sal- yangozu hemosiyanini konjugatma

karşı tavşan

ye- rine immünize

^edilmiş

farelerden elde edilen mo- noklonal antikorlar da

kullanılarak

T. brevifolia ekstrelerinde taksol, bakkatin III ve total taksan tipi diterpenoitler tayin

edilmiştir163.

Bir

başka çalışmada

süksinil-10-deasetilbakkatin ll!- BSA

konjugatına karşı

immünize

^edilıniş

ta- vuklardan elde edilen anti-10-deasetilbakkatin

I!I

antikorlarının,

bakkatin benzeri !aksanlarla spesifik olarak

etkileştiği

CIEIA metodu ile

belirlenmiştir.

Bu antikorlarla Taxus türlerinden yeni taksol pre- kürsörlerinin

araşhrılabileceği

de

bildirilmiştir164.

Radyoimmunolojik Test

{Radio!ınmunoAssay-RIA)

Bir fare monoklonal anti-taksol antikoru ve bir tav-

şan

poliklonal anti-taksol antiserumu

kullanılarak

RIA

tekniği

ile Taxus bitki ekstreleri içindeki taksol ve sefalomannin'in

miktarları ölçülmüştür.

Sonuçlar HPLC ile

karşılaşhrılmış

ve benzer

bulunmuştur.

Bu antikorlar

kullanılarak

taksan tipi di- terpenoitlerin, bitki ekstrelerinde veya

diğer doğal

kaynaklarda tayin edilmesinin mümkün

olabileceği bildirilmiştir165.

Karşı Akım

Kromatografisi (Counter Current Chro- rnatography-CCC)

Taksan tipi diterpenoitlerin

ayırunı ıçın,

modern teknikler içerisinde yer alan bu teknikten de fay-

dalanılmışhr.

WANI ve WALL

tarafından T. bre-

vifolia gövde kabuklarından

taksolün ilk olarak izo- lasyonu

sırasında

birbirini takip eden bir dizi ece

uygulanmışhrl66,167.

Kaynaklara

bakıldığında

!ak-

sanların ayırunı

için High-Speed Counter Current Chromatography (HSCCC)

tekniğinin

de kul-

lanıldığı

görülmektedir16,57,119,161.

SONUÇ

Taksan tipi diterpenoitlerin elde edilmesi

^sırasında

farklı ayırma

ve

saflaştırma metotlarından

fay-

dalanılmıştır.

Bu amaçla etanol veya metanol'ün, bazan da diklorometan-metanol

karışunının

kul-

lanıldığı

birinci

tüketıneyi

takiben, taksan tipinde ol- mayan

bileşiklerin uzaklaştırılması amacıyla

ge- nellikle diklorometan ve su

^arasında

ikinci bir

tüketıne işlemi uygulanmışhr.

Bu

şekilde

elde edi- len ekstrelerdeki taksan tipi diterpenoitlerin bir- birinden

ayrılınası

için,

çoğunlukla

silika jel'in ad- sorban olarak

kullanıldığı

kolon kromatografisinden veya ters faz preparatif HPLC sistemlerinden ya-

rarlanılımştır.

Elde edilen

bileşiklerin

saf-

laştırılmasında

preparatif

İTK

veya kristalizasyon teknikleri

kullanılmışhr.

Taksan tipi diterpenoitlerin bitkinin

çeşitli kı­

sımlarında

çok az miktarlarda

^bulunması

nedeniyle daha

duyarlı

metotlar (Yüksek

Performanslı Sıvı

Kromatografisi, Süperkritik

^Sıvı

Kromatografisi, Misel Elektrokinetik Kromatografi, Yüksek Per-

formanslı Sıvı

Kromatografisi-Elektrosprey Kütle Spektrometresi, ELISA Testi, Enzim

İmmünotestinin Yarışmalı İnhibisyonu,

Radyoimmünolojik Test,

Karşı Akım

Kromatografisi) gerekli

^olmuştur.

Bu metotlar günümüzde Taxus türlerinde, biyolojik

^sı­

vılarda, çeşitli Taxus hücre ve doku kültürlerinde,

taksan tipi diterpenoitlerin tespiti

^amacıyla

kul-

lanılanılmaktadır.

KAYNAKLAR

1. Wani MC, Taylor HL, Wall ME, Coggon P, McPhail AT. Plant Antiturnor Agents. VL The Isolation and Structure of Taxol, A Novel Antileukemic and An- titumor Agent from Taxus brevifolia, ]. Am. Chem.

Soc., 93(9), 2325-2327, 1971.

2. Eisenhauer EA, Verrnorken JB. The Taxoids, Drugs, 55(1), 5-30, 1998.

3. Şener B, Küçükboyacı N. Taxus Türlerinin ve Tak- solün Biyolojik Aktiviteleri,

J

Inst. Sci. Tech., Gazi

Univ., 8, 56-68, 1995.

FABAD J. Pharm. Sci., 25, 121-137, 2000

4. Kingston DG!. Natura! Taxoids: Structure and Che- rnistry, in Suffness M. (ed.), Taxol: Science and App- lications, CRC Press, Boca Raton, Florida, pp. 287- 316, 1995.

5. Şener B, Küçükboyacı N. Taxus Türlerinde Bulunan Taksan Tipi Diterpenoitler,

J

Jnst. Sci. Tech., Gazi Unlv., 7, 87-111, 1994.

6. Erdemoğlu, ·N. Türkiye'de Yetişen Taxus baccata L.

Bitkisinin Taksan Türevi Bileşikleri Üzerinde Araş­

tırmalar, Doktora Tezi, Gazi Üniversitesi Sağlık Bi- limleri Enstitüsü, Ankara 1999.

7. Lythgoe B. The Taxus Alkaloids, in Manske, RHF (ed.), The Alkaloids, Chemislry and Physiology, Aca- dernic Press, New York,Vol.10, pp.597-626, 1968.

8. Blechert S, Guenard D. Taxus Alkaloids, in Brossi A.

(ed.L The Alkaloids, Academic Press, New York, Vol. 39, pp. 195-238, 1990.

9. Erdemoğlu N, Şener B. Taxus Cinsi ve Türkiye'deki Tek Türü: Taxus baccata L., Ot Sistematik Botanik Dergisi, 5(2), 5-14, 1998.

10. Şener B, Küçükboyacı N. High-Pressure Liquid Chromatographic Detennination of Taxol in Taxus baccala, GUEDE-J Fac. Pharm. Gazi, 11(1), 11-15, 1994.

11. jenniskens LHD, Van Rozendaal ELM, Van Beek TA.

Identification of Six Taxine Alkaloids from Taxus

baccaıa Needles,]. Nal. Prod., 59(2), 117-123, 1996.

12. Barboni L, Gariboldi P, Appendino G, Enrui R, Ga- betta B, Bombardelli E.: New Taxanes from Taxus baccala, Liebigs. Ann., (2), 345-349, 1995.

13. Appendino G, Tagliapietra S, Özen HÇ, Gariboldi P, Gabetta B, Bombardelli E. Taxanes from the Seeds of Taxus baccala,f Nal. Prod., 56(4), 514-520, 1993.

14. Barboni L, Gariboldi P, Torregiani E, Appendino G, Gabetta B, Zini G, Bombardelli E. Taxanes from the Needles of Taxus wallichiana, Phytochemislry, 33(1), 145-150, 1993.

15. Guo Y, Diallo B, Jaziri M, Vanhaele-Fastre R, Van- haelen M, Ottinger R. Two New Taxoids frorn the Stem Bark of Taxus baccala, J Nal. Prod., 58(12), 1906-1912, 1995.

16. Guv Y, Vanhaelen-Fastre R, Diallo B, Vanhaelen M, Jaziri M, Homes

L

Ottinger R. Immunoenzymatic Methods Applied to the Search for Bioactive Taxoids from Taxus baccala, J Nal. Prod., 58(7), 1015-1023, 1995.

17. Zhang ZP, Wiedenfeld H, Röder E. Taxanes from Taxus chinensis, Phylochemislry, 38(3), 667-670, 1995.

18. Chattopadhyay SK, Saha GC, Kulshreshtha M, Shar-

ma RP, Kumar S. Studies on the Himalayan Yew Taxus wallichiana: Part II, Indian ]. Chem. Seci. B:

Org. Chem. Incl. Med. Chem., 35B(2), 175-177, 1996.

19. Chattopadhyay SK, Sharma RP, Appendino G, Ga- riboldi P. A Rearranged Taxane frorn the I:-:Iimalayan Yew, Taxus wallichiana, Phytochemistry, 39(4), 869- 870, 1995.

20. Zhong S, Hua Z, Fan ). A New Taxane Diterpene from Taxus yunnanensis, J Nal. Prod., 59(6), 603-605, 1996.

21. Fettneto AG, Dicosmo F. Distribution and Amounts of Taxol in Different Shoot Parts of Taxus cuspidata, Planla Med., 58(5), 464-466, 1992.

22. Vidensek N, Lim P, Campbell A, Carlson C. Taxol Content in Bark, Wood, Root, Lea( Twig, and Se- edling from Several Taxus Species,

f.

Nal. Prod., 53 (6), 1609-1610, 1990.

23. Witherup M, Look SA, Stasko MW, Ghiorzi Tj, Musc- hikk GM. Taxus sp. Needles Contain Amounts of Taxol Comparable to the Bark of Taxus brevifolia:

Analysis and Jsolation, J Nal. Prod., 53(5), 1249-1255, 1990.

24. Wheeler NC, jech K, Masters S. Effects of Genetic, Epigenetic, and Environmental Factors on Taxol Con- tent in Taxus brevifolia and Related Species,

J

Nat.

Prod., 55(4), 432-440, 1992.

25. Huang CHO, Kingston DGJ, Magri NF, Sa- maranayake G. New Taxanes from Taxus brevifolia~

f.

Nal. Prod., 49(4), 665-669, 1986.

26. Witherup KM, Look SA, Stasko MW, McCloud TG, Jssaq HJ, Muschik GM. High Performance Liquid Chromatographic Separation of Taxol and Related Compounds from Taxus brevifolia,

J

Liq. Chro- malog., 12(11), 2117-2132, 1989.

27. Auriola SOK, Lepisto A, Naaranlahti T, Lapinjoki SP.

Determination of Taxol by High-Performance Liquid Chromatography-Thermospray Mass Spectrometry,

f.

Chromaıogr., 594 (1-2), 153-158, 1992.

28. Cardellina jH. HPLC Separation of Taxol and Cep- halomannine, J Liq. Chromalogr., 14(4), 659-665, 1991.

29. Beutler JA, Chmumy GM, Look SA, Witherup KM.

Taxinine M, A new Tetracyclic Taxane from Taxus brevifolia, J Nal. Prod., 54(3), 893-897, 1991.

30. Appendino G, Gariboldi P, Gabetta B, Pace R, Bom- bardelli E, Viterbo D. 14~-Hydroxy-10-

deacetylbaccatin III, A New Taxane from Himalayan Yew (Taxus wallichiana Zucc.), J Chem. Sac. Perkin

Trans. 1, (21), 2925-2929, 1992.

31. Soto j, Fuentes M, Castedo L. Teixidol, An Abeo-

Erdemoğlu, Şener

Taxane from European Yew, Taxus baccata, Phytoc- hemistry, 43(1), 313-314, 1996.

32. Kelsey RG, Vance NC. Taxol and Cephalomannine Concentrations in the Foliage and Bark of Shade- Grown and Sun-Exposed Taxus brevifolia Trees, ].

Nat. Prod., 55(7), 912-917, 1992.

33. Chu A, Zajicek), Davin LB, Lewis NG, Croteau RB.

Mixed Acetoxy-Bezoxy Taxane Esters from Taxus brevifolia, Phytochemistry, 31(12), 4249-4252, 1992.

34. Chu A, Davin LB, Zajicek ), Lewis NG, Croteau R.

Intramolecular Acyl Migrations in Taxanes from Taxus brevifolia, Phytochemistry, 34(2), 473-476, 1993.

35. Chu A, Furlan M, Davin LB, Zajicek), Towers GHN, Soucy-Breau CM, Rettig SJ, Croteau R, Lewis NG.

Phenylbutanoid and Taxane-Like Metabolites from Needles of Taxus brevifolia, Phytochemistry, 36(4), 975-985, 1994.

36. Breeden SW, }ardan AM, Lawrence

NJ,

^McGown

AT. 2'-Deacetoxyaustrospicatine from the Stem Bark of Taxus baccata, Planta Med., 62(1), 94-95, 1996.

37. Chattopadhyay SK, Saha GC, Kulshreshtha M, Shar- ma RP, Kumar S. Studies on the Himalayan Yew Taxus wallichiana: Part IV- lsolation of Dihydrotaxol and Dibenzoylated Taxoids, Indian]. Chem. Sect. B:

Org. Chem. Incl.Med.Chem., 35B, 754-756, 1996.

38. Wang X, Shigemori H, Kobayashi J. Taxezopidines B-H, New Taxoids from Japanese Yew Taxus cus- pidata,J. Nat. Prod., 61, 474-479, 1998.

39. Chattopadhyay SK, Saha GC, Kulshreshtha M, Tri- pathi V, Sharma RP, Mehta VK. The Taxoids Cons- tituents of the Roots of Taxus wallichiana, Planta Med.,64, 287-288, 1998.

40. Wang X, Shigemoi H, Kobayashi ). Taxuspines K, L, and M, New Taxoids from Japanese Yew Taxus cus- pidata, Tetrahedron, 52(7), 2337-2342, 1996.

41. Shigemori H, Wang X, Yoshida N, Kobayashi ). Ta- xuspines X-Z, New Taxoids from Japanese Yew Taxus cuspidata, Chem. Pharm. Bull., 45(7), 1205- 1208, 1997.

42. Morita H, Gonda A, Wei L, Yamamura Y, Takeda K, Itokawa H. Taxuspinananes A and B, New Taxoids from Taxus cuspidata var. nana/]. Nat. Prod./ 60(4), 390-392, 1997.

43. Castor TP1 Tyler TA. Determination of Taxol in Taxus media Needles in the Presence of Interfering Components,J Liq. Chromatog., 16(3), 723-731, 1993.

44. Fang W, Wu Y, Zhou j, Chen W, Fang Q. Qualitative and Quantitative Determination of Taxol and Re- lated Compounds in Taxus cuspidata Sieb. Et Zucc.,

Phytochem. Anal., 4(3), 115-119, 1993.

45. Araslanian RL, Bailey DT, Kent MC, Richheimer SL, Thornburg KR, Timmons DW, Zheng QY. Brevitaxin, A New Diterpenolignan from the Bark of Taxus bre- vifolia,J Nat. Prod., 58(4), 583-585, 1995.

46. Das B, Rao SP, Srinivas KVNS, Yadav )S, Das R. A Taxoid from Needles of Himalayan Taxus baccata/

Phytochemistry, 38(3), 671-674, 1995.

47. Das B, Rao SP, Srinivas KVNS, Kashinath A, Yadav JS. Studies on Phytochemicals: Fart XIII-Variation in the Taxoid Constituents in Two Collections of the Needles of Himalayan Taxus baccata Linn., Indian].

Chem. Sect. B: Org. Chem. Incl. Med. Chem., 358(6), 624-626, 1996.

48. Kontla Y, Sasaki T, Sun X, Li X, Onda M, Takayanagi H, Harigaya Y. Absolute Structure of 2'- Desacetoxyaustrospicatine Established by X-Ray Analysis and Circular Dichroism Spectroscopy, Chem. Pharrn. Bull., 42(12), 2621-2624, 1994.

49. Chauviere G, Guenard D1 Pascard C, Picot F, Potier P, Prange T. Taxagifine: New Taxane Derivative from Taxus baccata L. (Taxaceae), ]. Chem. Soc. Chem.

Commun., (9), 495-496, 1982.

50. Tong X, Fang W, Zhou ), He C, Chen W, Fang Q.

Three New Taxane Diterpenoids from Needles and Stems of Taxus cuspidata, f. Nat. Prod., 58(2), 233- 238, 1995.

51. Liang ), Huang KS, Guantilaka AAL. A New 1,2- Deoxytaxane Diterpenoid from Taxus chinensis/

Planta Med., 64, 187-188, 1998.

52. Sorochinskii BV, Prokhnevskii Al, Grodzinskii DM.

Method of Isolating Taxol from Taxus baccata, Khim.

Prir. Soedin., (5), 702-703, 1990.

53. Fang WS, Fang QC, Liang XT, Lu Y, Zheng Q. Ta- xachitrienes A and B, Two New Bicyclic Taxane Di- terpenoids from Taxus chinensis, Tetrahedron, 51 (31), 8483-8490, 1995.

54. Fang W, Fang QC, Liang XT. Bicylic Taxoids from Needles of Taxus chinensis, Planta Med., 62(6), 567- 569, 1996.

55. Zhang H1 Tadeda Y, Sun H. Taxanes from Taxus yunnanensis, Phytochemistry, 39(5), 1147-1151, 1995.

56. Kingston DGI, Gunatilaka AAL, lvey CA. Modified Taxols, 7. A Method for the Separation of taxol and Cephalomannine,

J.

Nat. Prod., 55(2), 259-261, 1992.

57. Gu ), Tong X, Ding Y, Fang Q. Application of High- Speed Countercurrent Chromatography ta the Se- paration of Taxol and Cephalomannine, Fitoterapia/

65(2), 149-152, 1994.

58. Chiou F, Kan P, Chu !, Lee C. Separation of Taxol

FABADJ. Plıarm. Sci., 25, 121-137, 2000

and Cephalomannine by Countercurrent Chro- matography, f Liq. Chrom. & Rel. Technol., 20(1), 57-61, 1997.

59. Rimoldi JM, Molinero AA, Chordia MD, Gharpure MM, Kingston DGI. An lmproved Method lor the Se- paration of Paclitaxel and Cephalomannine, f. Nat.

Prod., 59, 167-168, 1996.

60. Beckvermit )T, Anziano Dj, Murray CK. An Imp- roved Method for Separating Paclitaxel and Cep- halomannine Using Ozone and Girard Reagents,

J

Org. Chem., 61, 9038-9040, 1996.

61. Vandana V, Teja AS, Zalkow LH. Supercritical Ext- raction and HPLC Analysis of Taxol from Taxus bre- vifolia Using Nitrous Oxide and Nitrous Oxide+Ethanol Mixtures, Fluid Phase Equilib., 116(1- 2), 162-169, 1996.

62. Zamir L, Balachandran S, Zheng YF, Nedea ME, Caron G, Nikolakakis A. Acid Catalyzed Re- arrengement and Acyl Migration Studies on 9- Dihydro-13-acetylbaccatin IH, A Major Taxane from Taxus canadensis, Telrahedron, 53(47), 15991-16008, 1997.

63. Doss RP, Carney JR, Shanks Jr. CH, Williamson RT, Chamberlain JD. Two New Taxoids from European Yew (Taxus baccata) that Act as Pyrethroid In- secticide Synergists with the Black Vine Weevil (Oti- orhynchus sulcatus),

J

Nat. Prod., 60(11), 1130-1133, 1997.

64. Zamir L, Nedea ME, Zhou Z, Belair S, Caron G, Sa- uriol F, Jacqmain E, Jean F, Garneau F, Mamer O.

Taxus canadensis Taxanes: Structures and Ste- reochernistry, Can.]. Chem., 73(5), 655-665, 1995.

65. Gabetta B, De Bellis P, Pace R, Appendino G, Bar- boni L, Torregiani E, Gariboldi P, Viterbo D. 10- Deacetylbaccatin III Analogues from Taxus baccata, f Nal. Prod., 58(10), 1508-1514, 1995.

66. Koppaka VR, Bhakuni RS, Hanuman JB, Davies R, Johnson J. Taxanes from the Bark of Taxus brevifolia, Phytochemislry, 41(3), 863-866, 1996.

67. Lian JY, Min Z, Mizuno M, Tanaka T, Linuına M.

Two Taxane Diterpenes from Taxus mairei, Phytoc- hemislry, 27(11), 3674-3675, 1988.

68. Zhang Z, Jia Z, Zhu Z, Cui Y, Cheng J, Wang Q. New Taxanes from Taxus chinensis, Planta Med., 56(3), 293-294, 1990.

69. Yeh M, Wang ), Liu L, Chen F. A New Taxane De- rivative from the Heartwood of Taxus mairei, Phylochemislry, 27(5), 1534-1536, 1987.

70. Appendino G, Özen HÇ, Gariboldi P, Torregiani E, Gabetta B, Nizzola R, Bombardelli E. New Oxetane-

type Taxanes from Taxus wallichiana Zucc.,

J

Chem.

Sac. Perkin Trans. 1, (14), 1563-1566, 1993.

71. Balza F, Tachibana S, Barrios H, Towers GHN. Bre- vifoliol, A Taxane from Taxus brevifolia, Phytoc- hemislry, 30(5), 1613-1614, 1991.

72. Appendino G, Lusso P, Gariboldi P, Bombardelli E, Gabettta B. A 3,11-Cyclotaxane from Taxus baccata, Phylochemislry, 31(12), 4259-4262, 1992.

73. Kobayashi J, Ogiwara A, Hosoyama H, Shigemori H, Yoshida N, Sasaki T, Li Y, lwasaki S, Naito M, Tsu- ruo T. Taxuspines A~C, New Taxoids from Japanese Yew Taxus cuspidata Inhibiting Drug Transport Ac- tivity of P-Glycoprotein in Multidrug-Resistant Cells, Telrahedron, 50(25), 7401-7416, 1994.

74. Zhang S, Lee CT, Kashiwada Y, Chen K, Zhang D, Lee K. Yunantaxusin A, A New 11 (15~1)-abeo­

Taxane from Taxus yunnanensis,

J

Nat. Prod., 57 (11), 1580-1583, 1994.

75. Kobayashi ), Hosoyama H, Katsui T, Yoshida N, Shi- gemori H. Taxuspines N, O, and P, New Taxoids from Japanese Yew Taxus cuspidata, Tetrahedron, 52(15), 5391-5396, 1996.

·76. Topçu G, Sultana N, Akhtar F, Rehman H, Hussain T, Choudhary MI, Rahman A.-ur. Taxane Diterpenes frorn Taxus baccala, Nal. Prnd. Lel., 4(2), 93-100, 1994.

77. Zhang Z, Jia Z. Taxanes from Taxus chinensis,

Phyıochemislry, 30(7), 2345-2346, 1991.

78. Morita H, Wei L, Gonda A, Takeya K, Itokawa H. A Taxoid from Taxus cuspidata var. nana, Phyto- chemislry, 46(3), 583-586, 1997.

79. Chattopadhyay SK, Kulshreshtha M, Saha GC, Shar- ma RP, Jain SP, Kumar S. The Taxoid Constituents of the Hearthwood of Taxus wallichiana, Planta Med., 62, 482, 1996.

80. Chattopadhyay SK, Sharma RP. A Taxane from the Himalayan Yew, Taxus wallichiana, Phytochemistry, 39(4), 935-936, 1995.

81. Barboni L, Gariboldi P, Torregiani E, Appendino G, Varese M, Gabetta B, Bombardelli E. Minor Taxoids from Taxus wallichiana,]. Nal. Prod., 58(6), 934-939, 1995.

82. Chattopadhyay SK, Saha GC, Sharma RP, Kumar S, Roy R. A Rearranged Taxane from the Himalayan Yew Taxus wallichiana, Phytochemistry, 42(3), 787- 788, 1996.

83 Zhang Z, Jia Z. Taxanes from Taxus yunnanensis/

Phyıochemislry, 29(11), 3673-3675, 1990.

84. Yue Q, Fang Q, Liang X, He C. Taxayuntin E and F:

Two Taxanes from leaves and Stems of Taxus yw1-

Erdemoğlu, Şener

nanensis, Phytochemistry, 39(4), 871-873, 1995.

85. Shen Y, Tai H, Chen C. New Taxane Diterpenoids from !he Roots of Taxus mairei, J Nat. Prod., 59(2), 173-176, 1996.

86. Shen Y, Chen C. Taxanes from the Roots of Taxus mairei, Phytochemistry, 44(8), 1527-1533, 1996.

87. Kobayashi ), Inubushi A, Hosoyama H, Yoshida N, Sasaki T, Shigemori H. Taxuspines E,...,H and

J,

New Taxoids frorn the Japanese Yew Taxus cuspidata,

Tetrahedron, 51(21), 5971-5978, 1995.

88. Zhang H, Sun H, Takeda Y. Four New Taxanes frorn the Roots of Taxus yunnanensis, J Nal. Prod., 58(8), 1153-1159, 1995.

89. Hongjie Z, Qing M, Wei X, Ping Y, Handong S, Ta- keda Y. Intramolecular Transesterified Taxanes from

Taxus yunnanensis, Phytochemistry, 44(5), 911-915, 1997.

90. Appendino G, Cravotto G, Gariboldi P, Gabetta B, Bombardelli E. The Chernistry and Occurrence of Ta- xane Derivatives. X. The Photochemistry of Taxine B, Gazz. Chim. ItaL, 124(1), 1-4, 1994.

91. Appendino G, Özen HÇ, Fenoglio !, Gariboldi P, Ga- betta B, Bornbardelli E. Pseudoalkaloid Taxanes from Taxus baccata, Phytochemistry, 33(6), 1521-1523, 1993.

92. Yue Q, Fang Q, Liang X, He C, Jing L. Rearranged Taxoids from Taxus yunnanensis, Planta Med? 61(4), 375-377, 1995.

93. Yue Q, Fang Q, Liang X. A Taxane-11,12-0xide from Taxus yunnanensis, Phytochemistry, 43(3), 639-642, 1995.

94. Appendino G, Cravotto G, Enriu R, jakupovic ), Ga- riboldi P, Gabetla B, Bombardelli E. Rearranged Ta- xanes frorn Taxus baccata, Phytochemistry, 36(2), 407-411, 1994.

95. De Bellis P, Lovati M, Pace R, Peterlongo F, Zini GF.

Isolation of 7-Epi-cephalomannine from Taxus x media ev. Hicksii Needles, Fitoterapia, 66(6), 521- 524, 1995.

96. Zhang ), Fang Q, Liang X, He C, Kong M, He W, )in X. Taxoids frorn the Barks of Taxus wallichiana, Phytochemistry, 40(3), 881-884, 1995.

97. Barboni L, Gariboldi P, Torregiani E, Appendino G, Cravotto G, Bornbardelli E, Gabetta B, Viterbo D.

Chemistry and Occurrence of Taxane Derivatives.

Part 16. Rearrenged Taxoids from Taxus x media Rehd. ev. Hicksü. X-Ray Molecular Structure of 9-0- Benzoyl-9,10-dide-O-acetyl-11(15->1 )abeo-baccatin VI., J Chem. Soc., Perkin Trans. 1, (21), 3233-3238, 1994.

98. Shrestha TB, Chetri SKK, Banskota AH, Manandhar MD, Taylor WC 2-Deacetoxytaxinine B: A New Ta- xane from Taxus wallichiana, J Nal. Prod., 60(8), 820- 821, 1997.

99. Fuji K, Tanaka K, Li B. Novel Diterpenoids from Taxus chinensis, J Nal. Prod., 56(9), 1520-1531, 1993.

100. Yoshizaki F, Fukuda M, Hisamichi S, Ishida T, in Y.

Structures of Taxane Diterpenoids from the Seeds of Japanese yew, Taxus cuspidata, Chem. Pharm. Bull., 36(6), 2098-2102, 1988.

101. Koppaka VR, juchum ). Taxanes !rom the Bark of Taxus brevifolia, Phytochemistry, 47(7), 1315-1324, 1996.

102. Liang ), Huang KS, Guanatilaka AAL, Yang L. 2- Deactoxytaxinine B: A Taxane Diterpenoid from Taxus chinensis, Phytochemistry, 47(1), 69-72, 1998.

103. Barboni L, Gariboldi P, Torregiani E, Appendino G, Gabetta B, Bombardelli E. Taxol Analogues from the Roots of Taxus x media, Phytochemistry, 36(4), 987- 990, 1994.

104. Morita H, Gonda A, Wei L, Yamamura Y, Wa- kabayashi H, Takeya K, Itokawa H. Four New Ta- xoids from Taxus cuspidata var. nana, Planta Med., 64, 183-186, 1998,.

105. Vanhaelen-Fastre R, Diallo B, Jaziri M, Faes M, Homes J, Vanhaelen MH. High-Speed Co- untercurrent Chrornatography Separation of Taxol and Related Diterpenoids frorn Taxus baccata, f. Liq.

Chromatogr., 15(4), 697-706, 1992.

106. McLaughlin JL, Miller RW, Powell RG, Smith )r. CR.

19-Hydroxybaccatin III, 10-Deacetylcephalomannine, and 10-Deacetyltaxol: New Antiturnor Taxanes from Taxus wallichiana,J Nal. Prod., 44, 312-319, 1981.

107. Guo Y, jaziri M, Diallo B, Vanhaelen-Fastre R, Zhiri A, Vanhaelen M, Homes ), Bombardelli E. Im- munological Detection and Quantitation of 10- deacetylbaccatin III in Taxus sp. Plant and Tissue Cultures, BioL Chem. Hoppe-Seyler, 375(4), 281-287, 1994.

108. Stasko SA, Witherup KM, Ghiorzi T, McCloud TG, Look S, Muschik GM, lssaq HJ. Multimodal Thin Layer Chromatographic Separation of Taxol and Re- lated Compounds from Taxus brevifolia,

J

Liq. Chro- matog., 12(11), 2133-2138, 1989.

109. Liang ), Kingston DGL Two New Taxane Di- terpenoids from Taxus mairei,

f.

Nat. Prod., 56(4), 594-599, 1993.

110. Rojatkar SR, Sinha B, Sawaikar DD, Sonawane KB, Panse GT, Ravindranathan T, Nagasampagi BA. Ta- xanes from the Needles of Taxus baccata, Indian

J