(*) Gata T›p Fakültesi, Göz Hastal›klar› Ad, A nkara (**) Gata T›p Fakültesi Hematoloji Bd, Ankara
(***) Gata T›p Fakültesi, Patoloji Ana Bilim Dal›, Ankara (****) Gata T›p Fakültesi, Araflt›rma Merkezi, Ankara
◆ Türk Oftalmoloji Dernegi 41.Ulusal Oftalmoloji Kongresi'nde serbest bildiri olarak sunulmufl ve bilimsel araflt›rma ödülü alm›flt›r.
Yaz›flma adresi: Asistan Gökhan Özge, Gata Göz Hastal›klar› Anabilim Dal› Etlik/Ankara E-posta: [email protected]
Tavflan Tapetoretinal Dejenerasyon Modelinde ‹ntravitreal Uygulanan Kemik ‹ligi Mezenkimal Kök Hücre Arac›l› Gen
Tedavisi ‹çin Canl› ve Cans›z Ortamda Kan›t:
Yeflil Flöresan Protein (YFP)
◆Gökhan Özge (*), R›za Güngör (*), Güngör Sobac› (*), Ferit Avcu (**), Murat Demiriz (***), Elvin Akdag (****), Ali Ugur Ural (**)
ÖZET
Amaç: Tavflanlarda tapetoretinal dejenerasyon modelinde kemik iligi mezenkimal kök hüc- re (MKH) intravitreal uygulamas›n›n etkinligini göstermifltik (TOD UOK, 2006). Bu çal›flma- m›zda MKH arac›l› gen tedavisinin uygulanabilirligi araflt›r›lm›flt›r.
Yöntem-Gereçler: GATA Araflt›rma Merkezi'nde eriflkin Yeni Zelanda albino tavflan›n fe- mur proksimali kemik iliginden al›nan MKH'ler vücut d›fl›nda farkl›laflt›r›ld› ve 4. pasajdaki hücreler kullan›ld›. Kültür ortam›nda bu hücrelere plazmid arac›l› olarak 48 saat içinde 2 defa Yeflil Flöresan Protein (YFP) aktar›m› sagland›. Eriflkin, pigmentli 3 tavflana intravenöz 40 mg/
kg sodyum iyodat-NaIO(3)- enjeksiyonu uyguland› (çal›flma grubu). Hemen sonras›nda bu tav- flanlar yan›s›ra bir eriflkin pigmentli tavflan›n (kontrol) sag gözlerine 2.5X10(5) hücre/0.1ml, sol gözlerine dengeli tuz solusyonu 0.1ml intravitreal uyguland›. 1, 5, 10 ve 45. günlerde enükleas- yon uygulanan tavflanlarda, izlem sürecinde, klinik, Fundus Floresein Anjiyografi (FFA, HRA- 2®), Elektroretinografi (ERG, Roland®) ve histopatoloji (immünflöresan) incelemeleri yap›ld›.
Bulgular: Birinci günde çal›flma grubundaki tavflanlarda anormal ERG b dalga degerleri ve HRA(Heidelberg Retinal Anjiografi)'da vitreusta YFP'li hücre kümeleri gözlendi. Beflinci gün- de retinada ödem, ERG'de b dalgas›nda silinme ve FFA'da lokalize hiper ve hipoflöresan odak- lar saptand›. Birinci tavflanda uygulanan enükleasyon sonras› immünflöresan yöntemi ile retina- da YFP tafl›yan hücreler gösterildi. Onuncu günde FFA'da lokalize hiperflöresan ve hipoflöre- san odaklarda art›fl, ERG'de silinme izlenen bir tavflanda canl› ve cans›z ortamda uygulanan yöntemler (HRA ve immünflöresan) ile vitreusta ve retinada YFP'li hücrelerin varl›g› gösterildi.
K›rkbeflinci gündeki kontrollü gözlemlerde bu hücrelerin retina katmanlar›ndaki varl›g›n›n de- vam ettigi saptand›.
Sonuçlar: Akut tapetoretinal dejenerasyon modelinde, plazmid arac›l›g›yla transfekte edi-
Mecmuaya Gelifl Tarihi: 12.01.2008 Düzeltmeden Gelifl Tarihi: 30.06.2008 Kabul Tarihi: 02.07.2008
G‹R‹fi
Retinan›n kal›tsal ve edinsel kökenli dejeneratif hastal›klar› tüm toplumlarda önde gelen körlük nedeni- dir. Günümüzde bu hastal›klar›n kökten tedavileri konu- sunda somut geliflmeler izlenmektedir. Bunlar aras›nda kök hücre arac›l› tedavi aray›fllar› önde gelmektedir. Bu hücrelerin özgün hücre tiplerine dönüflme potansiyeli hücre replasman› tedavisinde yeni bir ç›g›r açmakla bir- likte uygun koflullar alt›nda genetik olarak modifiye edi- lebilmeleri yeni bir dönemin iflaretçisi olabilir (1-3). Bu hücrelerin hemen her organda bulunduklar› ve doku ye- nilenmesinde görev ald›klar› bilinmektedir. Multipotent olan bu hücre grubunun ortamdaki uygun uyaranlar ile
pek çok ifllevsel hücre tipine farkl›laflt›r›labilecegi göste- rilmifltir (4,5). Varl›g› son y›llardaki çal›flmalarla kan›t- lanm›fl olan göz içi dokular› ile retinadaki kök hücrele- rin miktar›n›n azl›g› ve teminindeki zorluklar, bunlar›n tedavi maksatl› uygulamalar›n› zorlaflt›rmaktad›r. Halen klinik uygulanmada temini kolay ve etkinligi kan›tlan- m›fl olan kemik iligi kökenli mezenkimal kök hücrelerin (K‹-MKH) kas, cilt ve nöron hücrelerine dönüfltügü ve koroid neovasküler membran (KNM) gelifliminde de rol ald›g› gösterilmifltir (4,6). ‹nsanda bu hücrelerin temini kolayd›r ve otojenik ya da allojenik baflar›l› klinik uygu- lamalar› da vard›r. Genetik olarak modifiye edilebilen bu hücreler, retina dejenerasyon ve distrofilerinin teda- visinde bir umut kaynag› olabilir.
len ve intravitreal uygulanan allojenik kök hücrelerden retinaya YFP aktar›m› saglanabil- mektedir. Bu yöntem, otolog MKH'lerin kullan›lma avantaj› bulunan retinal dejenerasyon olgu- lar› için yeni bir gen tedavisi yaklafl›m› olarak gelifltirilebilir.
Anahtar Kelimeler: gen tedavisi, kök hücre, tavflan, tapetoretinal dejenerasyon, yeflil flö- resan protein (YFP)
SUMMARY
In Vivo and in Vitro Proof for Intravitreal Implanted Bone Marrow Mesenchimal Stem Cell (MSC) Mediated Gene Therapy in Rabbit Tapetoretinal Degeneration Model: Green Fluorescent Protein (GFP)
Purpose: We have shown the efficacy of intravitreal use of bone marrow mesenchimal stem cell (MSC) in rabbit tapetoretinal degeneration model. In this study, the feasibility of MSC mediated gene therapy is investigated.
Material-Methods: In GATA Research Center, MSCs were differantiated in vitro from bone marrow which was obtained from proximal femur of a New Zelland albino rabbit, and the cells from the forth passage were used. In cultere environment, plasmid mediated green fluores- cent protein (GFP) transmission to these cells was performed two times in 48 hours. Intraveno- us 40 mg/kg NAIO(3) injection was done to 3 adult pigmented rabbits.(study group). After- wards 2.5x10(5) cell/0,1 ml to right eyes and 0,1 ml balanced salt solution to left eyes intravit- realy, were performed in the study and the control eyes (1 pigmented rabbit, two eyes). Clinical, angiographic (FA-HRA 2), ERG and hystopathological evaluations were performed during the observation period (1., 5., 10., 45th day).
Findings: On first day, abnormal ERG b-wave amplitudes and cluster of GFP loading cells in the vitreous were observed. On the fifth day, retinal edema, diminished b-wave amplitudes and hypofluorescent and hyperfluorescent areas on FA were noted. Immunofluorescence exami- nation of the first rabbit showed GFP loading cells in the retinal layers. In vivo and ›n vitro as- says done on the 10th day showed GFP loading cells in the vitreous and in the retina which had angiographically increased hypo and hyperfluorescent spots. Our controlled observation showed that these cells were still in the retinal layers on the 45th day.
Results: In this acute tapetoretinal degeneration model intravitreally injected allogenic stem cells transfected by plasmid enabled GFP transmission to the damaged retina. This method may be developed as a new made of gene therapy in the retinal degeneration patients who has the advantage of using otolog MSCs.
Key Words: Gene therapy, stem cell, rabbit, tapetoretinal degeneration, green fluorescent protein GFP)
Tavflanlardaki tapetoretinal dejenerasyon modelin- de K‹-MKH'lerin intravitreal implantasyonundaki tedavi etkinligini göstermifltik (7). Ayn› modelde gerçeklefltir- digimiz bu çal›flmam›zda, d›fl ortamda YFP (Yeflil Flö- resan Protein) üretmek üzere plazmid arac›l› olarak mo- difiye edilen bu hücrelerin intravitreal implantasyonun- daki tedavi etkinligi araflt›r›lmaktad›r.
GEREÇ ve YÖNTEM
Çal›flmam›z Nisan-May›s 2007 tarihlerinde Gülha- ne Askeri T›p Akademisi (GATA) Araflt›rma Merkezin- de gerçeklefltirildi. Çal›flma için GATA Hayvan Çal›fl- malar› Etik Kurulu'nun onay› al›nd›. Uygulamalar:
1. K‹-MKH'lerin elde edilmesi:
GATA Araflt›rma Merkezi'nde eriflkin bir Yeni Ze- landa albino tavflan›n femur proksimalinden al›nan ke- mik iligi stromal hücrelerden in-vitro koflullarda K‹- MKH diferansiye edildi ve 4. pasajdaki hücreler kulla- n›ld›. Bu amaçla hücresel içerik 1:1 oran›nda düflük glu- kozlu DMEM (Dulbecco'nun hücre kültür ortam›) orta- m›nda seyreltildi. Elde edilen süspansiyon 15ml Ficoll- Pague Plus (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, ‹s- vec) üstünde topland› ve oda ›s›s›nda 800 devirde santri- füj ifllemi uyguland›. Üstteki k›s›m ara yüzey ile birlikte 0.1 ml PBS (fosfat tamponlu tuzlu su solusyonu) ile sey- reltilip 800 devirde 10 dakika santrifüj ifllemi uyguland›.
Üst k›sm› at›l›p 1ml'lik k›s›mda pellet kar›flt›r›ld›. Nuk- leuslu hücreler say›ld› ve kültür ortam›nda (2mg/ml L- glutamin 50mg/ml streptomisin ve %10 oran›nda ›s›
inaktivasyonlu buzag› serumu içeren DMEM solusyonu) 1x10(7)/ml olacak flekilde süspanse edildi ve 100ml'lik kültür tabaklar›nda 3x10(6) hücre/cm(2) olacak flekilde ekildi. Bu hücreler 3 gün kültür ortam›nda tutuldu ve yap›flmayan hücreler 3 kez y›kanarak ortamdan uzaklafl- t›r›ld›. Kültür ortam›nda yeterince yogunlasan (konflu- ent) hücrelere tripsin-EDTA uygulanarak üreme orta- m›ndan ayr›lmalar› sagland›.
2. K‹-MKH'lerde YFP Plazmid vektör transfeksiyonu:
Transfeksiyon uygulamalar› için K‹-MKH kültürle- rinde 4. pasajdaki hücreler kullan›ld›. Gen ekspresyonu için YFP olarak, Monster Green™ Flöresan protein phMGFP (Promega, USA) kullan›ld›. Kültür ortam›nda bu hücrelere plazmid arac›l› olarak 48 saat içinde iki de- fa Yeflil Flöresan Protein (YFP: GFP) aktar›m› sagland›.
Daha önceden tan›mlanm›fl protokole (8) uygun olarak yap›lan ön çal›flmalarla K‹-MKH'lerinde yüksek trans- feksiyon etkinligi saglayan parametreler belirlendi. K›-
saca, bir gün önceden kültür ortam›ndan al›narak serum ve antibiyotik içeren tafl›ma ortamlar›na geçirilen hücre- ler 10ml'lik tüplerde y›kama ve santrifüjleme ifllemleri ile kültür ortam›ndan uzaklaflt›r›ld›. Hücrelerin ekimi, seyreltilmesi, inkübasyonu ile haz›rlanan DNA-Enhans›r solusyonunun pipetle kar›flt›r›lmas›, çalkalanmas› sonra- s› elde edilen efektif reagant içeren kar›fl›m, 60ml kültür ortam› için 1µg (mikrogram) plazmid DNA's›na 8 µg Enhans›r ve 25 µg Effektan Reagan olacak flekilde uy- guland›.
3. Tapetoretinal dejenerasyon modelinde uygulamalar:
Üç eriflkin (3-3.5 kg) pigmentli tavflana kulaktan intravenöz yolla, dengeli tuz solusyonundaki (FTS)
%1'lik sodyum iyodat (NaIO(3), Sigma, St Louis, MO) solusyonundan 40 mg/kg dozunda enjeksiyon uyguland›
(çal›flma grubu). Hemen sonras›nda bu tavflanlar yan› s›- ra bir eriflkin pigmentli tavflan›n (kontrol tavflan) sag gözlerine 2.5X10 (5) hücre/0.1ml, sol gözlerine 0.1ml FTS uyguland›. Bunun için %0.5 tropicamide (Tropamid®, Bilim, Istanbul, Türkiye) ile pupiller mid- riyazis ve Betadine %10 solusyon ile konjunktival steri- lizasyon sagland›. 30 G igne ile limbustan 1.5 mm geri- den ve üst temporalden kontrollü olarak intravitreal en- jeksiyon uyguland›. Bazal degerleri belirlemek üzere te- davi öncesinde ve tedavi sonras› 1., 5., 10., ve 45. gün- lerde oftalmoskopik, anjiyografik, elektrofizyolojik ve immünflöresan incelemeler yap›ld›. Bu amaçla klinigi- mizde mevcut görüntüleme sistemleri (Zeiss HRA™, Roland Elektrodiagnostik ünit™) kullan›ld›. Histopato- lojik inceleme için intrakardiak embolizasyon ile feda edilen tavflan gözlerinde enükleasyonu takiben gözlerin gözd›fl› bag ve kas dokular› yan› s›ra Ora Serrata önün- deki dokular› makroskopik olarak ay›kland› ve bu doku- lardan haz›rlanan parafin bloklar›ndan 5 mikronluk transvers kesitler al›nd›. Bu örnekler ‹mmunflöresan mikroskop ve Hemotoksilen-Eozin ile boyama sonras›
›fl›k mikroskopu ile retina katmanlar› incelendi.
Çal›flma grubundaki tavflanlar ve kontrol tavflan›n sag ve sol gözlerindeki bulgular grup içi ve gruplar aras›
degifliklikler bak›m›ndan karfl›laflt›r›ld›.
BULGULAR
Kültür ortam›nda YFP-plazmid ile transfekte K‹- MKH gözlenmektedir (fiekil 1).
Birinci günde kontrol ve çal›flma grubundaki ERG (Elektroretinografi) kay›tlar› fiekil 2'de izlenmektedir.
HRA ile otoflöresan modda gözlem yap›ld›g›nda kontrol ve çal›flma grubundaki tüm tavflanlarda intravitreal YFP'li hücreler saptand› (fiekil 3a, 3b).
Beflinci günde retinada ödem, ERG'de b dalgas›nda silinme ve FFA'da lokalize hiper ve hipoflöresan odak- lar belirginleflme gözlendi. HRA'da vitreusta ve retinada fotoreseptör ve RPE katman›nda YFP eksprese eden hücreler saptand› (fiekil 4a, 4b).
Onuncu günde FFA'da lokalize hiperflöresan ve hi- poflöresan odaklarda art›fl (fiekil 5a) ile ERG de silinme izlenen bir tavflanda canl› ve cans›z ortamda uygulanan yöntemlerle (HRA ve immünflöresans) vitreusta ve reti- nada yayg›n YFP'li hücre kümelerinin varl›g› gösterildi (fiekil 5b).
K›rkbeflinci gündeki gözlemlerde retinan›n minimal pigmentasyon degifliklikleri ile birlikte normaldekine benzer görünüme kavufltugu ve bu hücrelerin retina kat- manlar›ndaki varl›g›n›n devam ettigi saptand› (fiekil6a, 6b).
Kontrol tavflan gözünde 15.gün muayenesinde izle- nebilen YPF'li hücrelerin 45.günde kayboldugu sap- tand›.
TARTIfiMA
Kemik iligi kök hücrelerin retina nöron hücrelerine transdiferansiasyonu ile vasküler ve nörotropik etkinlik- leri gösterilmifltir (9). Amfibiandakinin aksine insan re- tina nöral hücreleri apoptosise ugray›p kayboldugunda kay›plar›n rejenerasyonla karfl›lanamad›g› bilinmekte idi. Son y›llarda insanda retinal nöral kök hücreleri (RNKH) ve bunlara öncülük eden embriyonik kök hüc- reler (EKH), nöral kök hücreler (NKH) ve retinal kök hücreler (RKH) gösterilmifltir (10,11). Ancak bu kök hücre gruplar›n›n tedavi maksatl› uygulamalar›nda ciddi sorunlar gözlenmesi olas›l›g› vard›r. EKH'de MHC (Ma- jor Histocompatibility Complex) sisteminin d›fllay›c› et- kisi yan› s›ra teratom gelifltirebilme riski vard›r (12);
NKH'nin ise Hipokampus'tan temini zordur. S›kl›kla Korpus Siliare'de bulunduklar› gösterilmifl olan RNKH (retinal nöral kök hücre)'nin say›lar› oldukça s›n›rl› olup temini zordur. Günümüzde, uygulanmas› kolay ve he- matoloji pratiginde etkinligi kan›tlanm›fl olan kemik ili- gi kökenli kök hücrelerinden evrensel boyuttaki beklen- tiler, Kociok'un "Hastan›n kendi kök hücresi retinitis pigmentoza ve diger göz hastal›klar›nda koni görüflünü koruyabilir mi?" bafll›kl› makalesinde ifadesini bulmufl- tur (13). K‹-MKH gibi eriflkin kök hücre grubunda etkin transfeksiyon yöntemlerinin gelifltirilmifl olmas› bu so- runun yan›t›n›n olumlu olacag›na inanc›m›z› artt›rmak- tad›r (2).
Kemik iligi kök hücrelerin kemirici ve insanlarda hemopoetik kök hücreler yan› s›ra mezenkimal kökenli kas, cilt ve nöron hücrelerine dönüfltügü gösterilmifltir
(4). Koroid neovasküler membran (KNM) gelifliminde K‹-MKH katk›s›n›n gösterilmesi dikkat çekicidir (11).
Japon araflt›rmac›lar, retina yaralanmal› s›çanlarda K‹- MKH'lerin yaralanmal› alana lokalizasyonu ile birlikte retina sinir hücresine dönüfltügünü göstermifllerdir (14).
Ayn› araflt›rmac› grup B6 transjenik fare gözlerine retina fotokoagulasyonu ile birlikte intravitreal kök hücre transplantasyonu uygulad›klar›nda bunlar›n retinal nöron hücrelerine dönüfltüklerini ve bu transforme hücrelerin 1 y›l süreyle ifllevselliginin devam ettigini saptam›fllard›r.
Fotokoagulasyon ile uyar›m yap›lmayan kontrol gözler- de ise nöronal hücrelere dönüflüm daha k›sa süreli ve da- ha az say›da olmufltur (15).
Kemiricilerde sodyum iyodat ile tapetoretinal deje- nerasyon geliflimi, uzun y›llar içinde oldukça iyi tan›m- lanm›fl örnek bir modeldir. Enzmann ve arkadafllar› B6 transjenik fare sujunda yapt›klar› özgün çal›flmada RPE (Retina Pigment Epiteli)'nin anatomik degiflikliklerine efllik eden ifllevsel degiflikliklerin uygulanan sodyum iyodat dozu ve uygulama sonras› süre ile dogrusal etki- lenim gösterdigini bildirmektedirler (16). Çal›flmam›z tavflan retinas›n›n geç dönemde kendini yenileme olas›l›- g›na karfl› 45 günlük dönem için planlanm›fl ve sodyum iyodat›n etkinligi kan›tlanm›fl olan 40mg/kg dozu uygu- lanm›flt›r. Bu modeldeki tomografik, fundoskopik, anji- yografik, elektrodiyagnostik ve histopatolojik degiflik- likler geçen y›lki Türk Oftalmoloji Dernegi Ulusal Kongresinde sunulmufltur (7). K›saca, bu çal›flmam›zda önceki çal›flmam›zdakine benzer flekilde 1. günde ERG ile tan›mlanan ifllevsel degifliklikler gözlenmifltir (fiekil 1). Beflinci günden itibaren OKT (Optikal Koherens To- mografi) retinada kal›nlaflmay› göstermifl ve FFA'da 1.
haftada RPE defektleri oluflmufl, 2. haftadan itibaren tüm retinada yerleflmifltir. Geçen y›lki gözlemimizdekine benzer tarzda K‹-MKH uygulanan gözlerde kayda deger enflamasyon gözlenmemifltir. Bunda K‹-MKH'lerin va- roldugu ileri sürülen antienflamatuvar etkilerinin rolü bulunabilir (5). K‹-MKH'lerin intravitreal implante edil- digi gözlerde fonksiyonel kazanç elde edilmesinde bu hücrelerin retinaya migrasyonu ve transdiferasyonunun rolü bulunabilecegi bildirilmiflti (17). Retinan›n kal›tsal ve edinsel pek çok hastal›g›nda RPE yap›sal ve ifllevsel bozukluklar göstermektedir. Fötal yada embriyonik hüc- re transplantasyonu yan› s›ra eriflkin RPE hücreleri ile RPE yap›sal ve ifllevsel bozukluklar›n›n giderilmesi ça- l›flmalar›nda karfl›lafl›lan sorunlar, üzerinde yogun çal›fl- malar›n yap›ld›g› subretinal RPE transplantasyonu ben- zeri yöntemlerin klinik uygulamaya geçirilmesini güç- lefltirmektedir. Bu sorunlar›n bafl›nda progenitor hücrele- rin nitelik ve niceliksel olarak yetersiz kalmas›, retinaya ulaflt›r›lamamas› yada reorganizasyon olamamas› gel- mektedir. Bu zorluklar, K‹-MKH'lerin intravitreal imp-
lantasyonu ile afl›labilir gözükmektedir. Ancak, bu yön- temin oftalmolojide uygulanmas›nda gözün özgün ana- tomik ifllevsel bütünlügü, örnegin kan-retina ve kan- aköz bariyerleri yan› s›ra gözün immün özgünlügünün dikkate al›nmas› gerektigini düflündük. Bu maksatla, bafllang›ç aflamas›nda bu yöntemin uygulanabilirliginin irdelendigi bu çal›flmam›z›n sonuç hedefi, bu yöntemin klinik uygulamaya geçirilmesidir. Yöntemin pratikte uy- gulanabilirligini araflt›rmak üzere, temini, muayenesi ve izleminin kolayl›g› ile öteden beri preklinik çal›flmalar- da kulland›g›m›z ve insandakine yak›n boyutta gözü olan tavflan, denek olarak seçilmifltir. Bu amaçla, tapeto- retinal dejenerasyon oluflturdugu kaynakçada iyi tan›m- lanm›fl olan sodyum iyodat modeli kullan›lm›flt›r. Oksi- dasyon yoluyla etkili oldugu bilinen sodyum iyodatla tepkimeye girmesi için retinas›nda melanin içeren pig- mente tavflanlar seçilmifl, böylece insandakine benzer bir konum saglanm›flt›r. K‹-MKH temin etmek üzere GATA Araflt›rma Laboratuar›'nda üretimi gerçeklefltiri- len Yeni Zelanda tipi albino tavflan›n proksimal femu- rundan al›nan kemik iligi stromal hücrelerden in-vitro koflullarda mezenkimal kök hücreler diferansiye edilmifl ve yenilenme potansiyellerini kaybetmemeleri için 4.
pasajdaki hücreler kullan›lm›flt›r. Bu hücreler in vitro koflullarda YFP protein sentezleyen plazmidler arac›l›g›
ile transfekte edilmifltir.
YFP proteini retinaya gen transferinin araflt›r›ld›g›
kontrollü gözlemlerde tan›mlay›c› olarak kullan›lmakta- d›r. Bu geni içeren hücreler mavi ›fl›k alt›nda yeflil flöre- sans ile mikroskop alt›nda izlenebilmektedir. Gen trans- ferinin yap›ld›g› hücreler canl› ortamda izlenerek, gen aktar›m›n›n etkinligi mevcut organizmaya zarar verme- den kan›tlanabilmektedir. Çal›flmam›zda, tapetoretinal dejenerasyona ugrayan katmanda YFP eksprese eden bu hücrelerin varl›g›n›n kan›tlanmas› K‹-MKH'lerin bu maksatla uygulanabilecegini göstermektedir. Kontrol tavflandakinin aksine vitreustaki MKH'lerin akut dejene- rasyona ugrayan gözde retinaya göç etmeleri ve bu hüc- relerin retinan›n rejenerasyonu aflamas›ndaki fonksiyo- nel katk›s› düflündürücüdür.
Liposomal transfeksiyon yöntemi, d›fl ortamda transfeksiyonun gerçeklefltirilmesinde günümüzde etkin bir yöntem olarak oldukça s›k olarak uygulanmaktad›r.
Nükleotransfeksiyon olarak da adland›r›lan bu yöntemin digerleri ile k›yasland›g›nda en etkin gen transfer yönte- mi oldugu bildirilmifltir (3). Bununla birlikte, bu yönte- min hücreye özgün olarak farkl›l›klar gösterebildigi ve gen transferi aflamas›nda toksik olmayan en etkin kar›fl›- m›n elde edilmesi gerektigi bilinmektedir. Bunun için çal›flmam›zda, ön çal›flmalarla transfeksiyon etkinligi daha önceden kan›tlanm›fl olan protokole uygun YFP transfeksiyon yöntemi uygulanm›flt›r.
K‹-MKH teminindeki sorunlar nedeniyle çal›flma- m›zda denek say›s› s›n›rl› tutulmufl (3 adet), etik neden- ler ve kontrol saglanabilmesi bak›m›ndan sol gözlere plasebo ifllem (FTS) uygulanm›flt›r. Ayn› nedenle otojen yerine allojenik transplantasyon uygulanarak bu yönte- min tedavideki etkinligi araflt›r›lm›flt›r. Çal›flmam›z allo- jenik K‹-MKH intravitreal uyguland›g›nda immün redde ugrayamayacaklar›n› göstermektedir. Bu durum K‹- MKH uyguland›g› diger çal›flmalarda da izlenmifl olup bunun bu hücrelerin immünosüpressif etkisinden kay- nakland›g› ileri sürülmüfltür (5).
Kontrol tavflan gözünde daha önceki çal›flmam›zda- kine benzer kayda deger bir yap›sal degifllik gözlenme- di. Bununla birlikte vitreustaki YFP hücre yogunlugunu giderek azalmakla birlikte 45 günlük takipte retinada yerleflmedikleri gözlendi. Nd:YAG hasar› oluflturulan s›çan gözlerindeki 50 günlük takiplerde, normaldekine k›yasla intravitreal K‹-MKH uygulanan tarafta retinaya kök hücre geçifli ve antiapopitotik gen aktar›m› gözlen- mifltir (9). Li ve arkadafllar›, RPE'den sal›nan kemoat- raktanlar›n (SDF: stromal kökenli büyüme faktörü ve C3: kompleman 3) K‹-MKH'lerin migrasyonu ve trans- diferasyonunu saglad›g›n› göstermifllerdir (18). Obata ve arkadafllar› tavflan sodyum iyodat mododelinde, fibrob- last ve vasküler endotel hücrelerindan farkl› olarak RPE üzerinde stimülan etkisi olan doku faktör plazminojen yol inhibitörü (TFPI) nün intravitreal uyguland›g› tarafta RPE katman›n›n korundugunu, bu koruman›n kal›tsal retina dejenerasyonlu RCS s›çanlarda k›smen gerçeklefl- tigini göstermifllerdir (19). Hayvan modellerinde büyü- me faktörlerinin retinay› dejenerasyon gelifliminden ko- ruduklar› gösterilmifltir (20). Bununla birlikte bu faktör- lerin uygulanmas›nda karfl›lafl›lan en önemli sorun or- tamdaki homeostazisin bozularak istenmeyen hücre gruplar›, örnegin, fibroblastlar üzerinde trofik etki gös- terebilme olas›l›klar›d›r. K‹-MKH'lerin edinsel faktörler yan› s›ra kal›tsal faktörler ile ortama çagr›ld›g›n›, mig- rasyona ve transdiferansiasyona zorland›g›n› gösteren çal›flmalar vard›r (21). Daha ileri çal›flmalarla bu faktör- ler daha iyi tan›mlanabilir ve immünhistokimyasal bo- yama yöntemleri kullan›larak rejenere olan hücrelerin kök hücre ile iliflkileri tam olarak ortaya konabilir.
Gözün immün özgünlügünün, d›fl ortamlardan so- yutlanm›fl anatomik ve ifllevsel düzeneginin kök hücre ve gen tedavileri için uygun bir ortam oluflturdugu bilin- mektedir (22). Kök hücre arac›l› yöntemlerle istenilen hücre tipinin, eksikligi duyulan alanda yeniden kazan›l- mas› mümkündür. Ancak, bunun için uygun bir uyaran ortama gereksinim duyulmaktad›r (23). Retina distrofi ve dejenerasyonlar› böyle bir ortam› saglayabilir. Gide- rek saflaflt›r›lan ve kolaylaflt›r›lan kök hücre üretme tek- nikleri gündemdedir. Bu maksatla CNTF (Siliyer nörot-
rofik faktör), bFGF (bazik fibroblast grovt fakrör), EGF (epidermel grovt faktör) ve aközhümör ile RPE'nin kul- lan›ld›g› bilinmektedir (24,25) Memelilerde iris doku- sunda retinal dogurgan kök hücre varl›g› ve bunlar›n fo- toreseptörlere dönüflümü gösterilmifltir (26).
Günümüzde gen transfer yöntemlerindeki h›zl› ge- liflmeler dikkat çekicidir (27). Moleküler tan›mlay›c›
yöntemlerdeki geliflmeler, insanda retinaya özgün genle- rin tan›mlanmas›n› kolaylaflt›rm›flt›r. ‹lerde amfibianlar- daki ömür boyu retinal nöronlar›n oluflumunu saglayan moleküler mekanizmalar›n (regülatör genlerin) ayd›nla- t›lmas› ile insanda sürekli retina rejenerasyonu için bu moleküllerin gen transferi ile kal›c› tedaviler sag- lanabilir.
KNM (Koroid Neovasküler Membran)'lar›n oluflu- munda etkin rol ald›g› gösterilen MKH'lerin endotel hücre matürasyonu ile bu hücrelerin hipoksik hasara karfl› stabilizasyonunu saglad›klar›, besledikleri retinal nöronlar› apoptosisden koruduklar› bilinmektedir. Böyle bir yaklafl›m›n retinan›n iskemik hasar›na bagl› neovas- külarizasyon geliflimi için koruyucu tedavi yaklafl›m›
saglayabilecegi öne sürülmektedir (28). Örnegin, yafla bagl› maküla dejenerasyonundaki KNM için antianjiyo- genetik gen transferi ile birlikte uygulanabildiginde böy- le bir yaklafl›m kökten tedavi olanag› sunabilir. K‹- MKH'leri s›çan prematür retinopati modelinde uygula- yan Ritter ve arkadafllar›, bu hücrelerin iskemik alanlara göçüyle birlikte neovaskülarizasyon geliflimini önledik- lerini bildirmektedirler (29). Halen bu amaçla destrüktif fiekil 1. ‹n-vitro plazmid arac›l› YFP aktar›lan
K‹-MKH
fiekil 2a. Kontrol ERG (13.gün) fiekil 2b. Çal›flma, ERG (1.gün)
uygulamalara baflvuruldugu göz önüne al›n›rsa benzer bir tedavi yaklafl›m›n›n klinik uygulamaya geçirilmesi- nin avantajlar› daha iyi anlafl›labilir.
Tüm bu ümit verici geliflmelerle birlikte göz önüne al›nmas› zorunlu koflullar da vard›r. Allojenik MKH uy- gulamalar›nda immün red gözlenebildigi de bildirilmifl- tir (30) Henüz, KH tan›mlay›c› moleküller tam olarak ortaya konamam›flt›r; transplantasyon yada gen transferi için en uygun hücre tipi bilinmemektedir. En uygun uy-
gulama flekli (intravitreal, subretinal) bilinmemektedir.
Dönör yafl›n›n rolü (31), uygulama için en uygun za- manlama, hastal›kl› ortamdaki yeni homeostazis ile bu uygulamalar›n uzun dönem etkinlik, emniyetleri ve olas›
tümörojenik potansiyelleri göz önünde bulundurulmal›- d›r.
Karfl›laflt›rmal› bir çal›flmada fotoreseptörlere ta- ransdiferansiyasyon saglanabilmesi bak›m›ndan retinal KH'lerin daha avantajl› oldugu bildirilmektedir (32) Arnhold ve arkadafllar›n›n yak›n zamandaki çal›flmala- r›nda, dogufltan rodopsin yoklugu ile karakterize RCS (Royal Collage of Surgeon) kör s›çan modelinde, K‹- MKH'lerin transplantasyonunda, bu hücrelerin RPE ve nöroretinal katmanlara entegrasyonu, nöral ve glial hüc- fiekil 3a. Kontrol, intravitreal YFP-MKH (1.gün)
fiekil 3b. Çal›flma, intravitreal YFP-MKH
fiekil 4a. Çal›flma, intravitreal YFP-MKH (5.gün)
fiekil 4b. Çal›flma, intraretinal YFP-MKH
relere transdiferansiasyonu ile ifllevsel baflar› bildirmek- tedirler (33). Yak›n zamanda yay›nlanan çal›flmas›nda Inoue ve arkadafllar› K‹-MKH'lerin subretinal transplan- tasyonunda baflar›l› sonuçlar al›nd›g›n› bildirmektedirler (34).
K‹-MKH'lerin tedavi maksatl› ilk in vivo uygula- malar› Kicic ve arkadafllar› ile Tomita ve arkadafllar›na aittir (32,35). Onlar, mekanik debritmanl› s›çan gözle- rinde.bu hücrelerin retinan›n özellikle d›fl nükleer kat- man›nda yogunlaflt›g›n› ve bunlar›n retinal nöral hücre- lere dönüfltügünü göstermifllerdir (32). Çal›flmam›zdaki gözlemimiz benzerlik göstermektedir. Çal›flmam›zda, daha homojen retina hasar oluflturmak ve kal›tsal model-
lerdekine benzerlik göstermesi bak›m›ndan sodyum iyo- dat ile tapetoretinal dejenerasyon modeli kullan›lm›flt›r.
Bu çal›flmam›zdaki gözlemlerimiz, intravitreal K‹- MKH implantasyonunun tapetoretinal dejenerasyon ile seyreden hastal›klarda etkin bir yöntem olarak uygula- nabilecegini düflündürmektedir. Bununla birlikte, ileri emniyet ve etkinlik çal›flmalar›na gereksinim duyuldugu da göz ard› edilemez.. Çal›flmam›zda bu etkinligin allo- jenik transplantasyonlarda gözlenmesi anlaml›d›r. Allo- jenik transplantasyon modeli üzerine kurulmufl bu çal›fl- mada, albino tavflan kemik iliginden al›nan ve plazmid arac›l› YFP transdüksiyonu saglanan kök hücreler, pig- mentli tavflanda oluflturulan tapetoretinal dejenerasyonlu fiekil 5a. Çal›flma, FFA (10.gün)
fiekil 5b. Çal›flma, immun flöresans (10.gün)
fiekil 6a. Çal›flma, fundus görünümü (45.gün)
fiekil 6b. Çal›flma, HRA, otoflöresans
gözlerde intravitreal uyguland›g›nda, retinadaki tedavi edici etkinligin kök hücre arac›l› oldugu, bu hücrelerden olan tan›t›c› gen ekspresyonu ile kan›tlanm›flt›r. Bununla ilgili ileri çal›flmalar›m›z halen devam etmekte olup de- jenere RPE modelinde kök hücrenin pigment epiteline dönüflümü sagland›g›nda oluflan RPE tabakas›n›n mela- nosit içeriginin bu tedavinin etkinligi için histolojik bir parametre olarak da degerlendirilmesi planlanm›flt›r.
‹nsanda, intravitreal uygulamadaki tecrübelerimiz, hayvandakinden daha kolay otolog K‹-MKH temin ede- bilme olas›l›g›m›z ve bu tedaviden beklentilerimizin bü- yüklügü, in-vivo etkin ve emniyetli oldugunu gösterdi- gimiz bu yöntemin klinige uyarlanabilmesi dogrultusun- da ileri preklinik doz ve emniyet çal›flmalar›n›n yap›l- mas›n› zorunlu k›lmaktad›r. Bu yöntemin kal›tsal tipteki tapetoretinal dejenerasyonlar üzerindeki etkinlik ve em- niyetini belirlemek üzere ileri preklinik çal›flmalar yap›l- mas› planlanm›flt›r.
KAYNAKÇA
1. Lakshmipathy U, Pelacho B, Sudo K, Linehan JL, Cou- couvanis E, Kaufman DS, Verfaillie CM, Efficient trans- fection of embryonic and adult stem cells. Stem Cells.
2004;22(4):531-43.
2. Okazaki A , Jo J, Tabata Y . A reverse transfection techno- logy to genetically engineer adult stem cells. Tissue Eng.
2007 Feb;13(2):245-51.
3. Wang F, Xia X, Hu H, Li L, Tian Y , Chen X, Huang Q.
Liposome-mediated gene transfer into retina. Zhonghua Yan Ke Za Zhi. 2002 Sep;38(9):520-2.
4. Brazelton TR, Rossi FM, Keshet GI, Blau HM. From marrow to brain : expression of neuronal phenotypes in adult mice. Science 2000; 290:1775-1779.
5. Le Blanc K, Ringden O. Mesenchymal stem cells: pro- perties and role in clinical bone marrow transplantation.
Curr Opin Immunol. 2006; 18:586-591.
6. Li Y, Reca RG, Atmaca-Sonmez P, Ratajczak MZ, Ild- stad ST, K aplan HJ, Enzmann V: Retinal pigment epithe- lium damage enhances expression of chemoattractants and migration of bone marrow-derived stem cells. Invest Ophthalmol V is Sci. 2006 Apr;47(4):1646-52.
7. Özge G, Sobac› G, Avcu F, Safal› M, Pamuk K, Ural AU.
Tavflan Tapetor etinal Dejenerasyon Modelinde Kemik
‹ligi Mezankimal Kök Hücre Intravitreal ‹mplantasyonu- nun Uygulanabilirliginin Araflt›r›lmas›. TOD 40. Ulusal Oftalmoloji Kongresi Program ve Özet Kitab› (Antalya).
sf:145; 2006.
8. Baran Y, Ural AU, Avc› F, Sarper M, Elçi P, Pekel A:
Mezenkimal Kök Hücrelerin invivo takibinde yeflil flore- san protein aktar›lmas›n›n optimizasyonu. 33. Ulusal He- matoloji Kongresi, 2007, Ref No:107.
9. Zhang J, Shan Q, Ma P, Jiang YM, Chen P, Wen J X, Zhou Y, Qian HW, Pei XT. O bservation of bone marrow
mesenchymal stem cells after subretinally transplanted into laser-injured rat retina. Zhonghua Yi Xue Za Zhi.
2003 Nov 25;83(22):1993-8. Chinese.
10. Hara A, Niwa M, Kunisada T, Y oshimura N, Katayama M, Kozawa O et al. Embriyonic stem cells are capable of generating a neuronal network in adult mouse retina. Bra- in Res 2004; 999:216-221.
11. Young MJ: Stem cells in the mammalian eye: a tool for retinal repair. APMIS. 2005 Nov-Dec;113(11-12):845- 57.
12. Koch CA, Jordan CE, Platt JL. Complement-Dependent Control of Teratoma Formation by Embryonic Stem Cells. J Immunol 2006; 177: 4803-4809.
13. Kociok N. Can the injection of the patient's own bone marrow-derived stem cells preserve cone vision in retini- tis pigmentosa and other diseases of the eye? Graefe's Arch Clin Exp Ophthalmol . 2005; 243:187-188.
14. Tomita M, Adachi Y, Yamada H, Takabashi K, Kluchi K, Oyaizu H. Bone marrow-derived stem cells can differen- tiate into injured rat retina. Stem Cells 2002; 20;279-283.
15. Minamino K, A dachi Y, Y amada H et al: Long-term sur- vival of bone marrow-derived retinal nerve cells in the re- tina. Neuroreport. 2005 Aug 22;16(12):1255-9.
16. Enzmann V, Row BW, Yamauchi Y, Kheirandish L, Go- zal D, Kaplan HJ, McCall MA: Behavioral and anatomi- cal abnormalities in a sodium iodate-induced model of re- tinal pigment epithelium degeneration. Exp Eye Res.
2006 Mar;82(3):441-8.
17. Arnhold S, A bsenger Y, Klein H, Addicks K, Schraerme- yer U. Tr ansplantation of bone marrow-derived mesench- ymal stem cells rescue photoreceptor cells in the dystrop- hic retina of the rhodopsin knockout mouse Graefe's Arch Clin Exp Ophthalmol 2007; 245: 3; 414-422.
18. Li Y, Reca RG, Atmaca-Sonmez P, Ratajczak MZ, Ild- stad ST, Kaplan HJ, Enzmann V. Retinal pigment epithe- lium damage enhances expression of chemoattractants and migration of bone marrow-derived stem cells. Invest Ophthalmol V is Sci. 2006;47(4):1646-52.
19. Obata R, Yanagi Y, Tamaki Y , Hozumi K, Mutoh M, Ta- naka Y: Retinal degeneration is delayed by tissue factor pathway inhibitor-2 in RCS rats and a sodium-iodate-in- duced model in rabbits. Eye.2005 A pr;19(4):464-8.
20. Ohtaka K, Machida S, Ohzeki T, Tanaka M , Kurosaka D, Masuda T, I shii T: Protective effect of hepatocyte growth factor against degeneration of the retinal pigment epithe- lium and photoreceptor in sodium iodate-injected rats.
Curr Eye Res. 2006 A pr;31(4): 347-55.
21. De Becker A, Van Hummelen P, Bakkus M, Vande Bro- ek I, De Wever J, De Waele M, Van Riet I. Migration of culture-expanded human mesenchymal stem cells thro- ugh bone marrow endothelium is regulated by matrix me- talloproteinase-2 and tissue inhibitor of metalloproteina- se-3.Haematologica. 2007 Apr;92(4):440-9.
22. Sobac› G. Oftalmolojide gen tedavisi in Oftalmik ilaçlar, eds: Oto S, Y›lmaz G, Ayd›n P, Günefl Kitabevi, Ankara 2003.
23. Hori Y, Inoue S, Hirano Y, Tabata Y: Effect of culture
substrates and fibroblast growth factor addition on the proliferation and differentiation of rat bone marrow stro- mal cells. Tissue Eng 2004; 10: 995-1005.
24. Yang J, Klassen H, Pries M, Wang W, N issen MH. A qu- eous Humor Enhances the Proliferation of Rat Retinal Precursor Cells in Culture and this Effect is Partially Reproduced by Ascorbic Acid. Stem Cells. 2006 dec;
24(12): 2766-75.
25. Jérome R, Valérie B, Sylvie T Anni H, José-Alain S, Xa- vier G, Olivier G. Involvement of Pleiotrophin in CNTF- mediated differentiation of the late retinal progenitor cells. Dev Biol. 2006;298:527-39.
26. Abe T, Y oshida M, Yoshioka Y, Wakusawa R, Tokita-Is- hikawa Y, Seto H, Tamai M, Nishida K. Iris pigment epithelial cell transplantation for degenerative retinal di- seases. Prog Retin Eye Res. 2007 May;26(3):302-21.
27. Sobac› G. 2000'li y›llara girerken retina hastal›klar›n›n gen tedavisi: Retina-Vitreus 2000;8(2): 187-196.
28. Friedlander M, Dorrell M, Ritter, M, M archetti,V, More- no S, El-Kalay, M, Bird, A, Banin E, A guilar E. Progeni- tor cells and retinal angiogenesis. Angiogenesis 2007; 10 (2): 89-101.
29. Ritter, M, Banin E, Aguilar EA, Dorrell MI, Moreno S.K, Friedlander M. Myeloid progenitors differentiate into microglia and promote vascular repair in a model of isc- hemic retinopathy. J. Clin. Invest. 116:3266-3276 (2006).
30. Ryan JM, Barry FP, Murphy JM, Mahon BP. Mesench- ymal stem cells avoid allogeneic rejection. J Inflamm 2005; 2: 8.
31. Gudrun UM, Ramesh RB. Donor site, age, and health af- fect fibroblast growth in culture. In vitro Cell Dev Biol Anim. 1995 Jul-Aug;31(7):494-6.
32. Kicic A , Shen WY, Wilson A S, Constable JJ, Robertson T, Rakoczy P A. Differentiation of Marrow Stromal Cells into Photoreceptors in the Rat Eye. J Neuroscience 2003;
23(21):7742-7749.
33. Arnhold S, Heiduschka P, Klein H, Absenger Y, Basna- oglu S, Kreppel F, Henke-Fahle S, Kochanek S, Bartz- Schmidt KU, Addicks K, Ulrich S. Adenovirally Trans- duced Bone Marrow Stromal Cells Differentiate into Pig- mentEpithelial Cells and Induce Rescue Effects in RCS Rats. Invest Ophthalmol Vis Sci 2006; 47.4121-4129.
34. Inoue Y, Iriyama A, Ueno S, Takahas hi H, Kondo M, Ta- maki Y, Araie M, Yanagi Y. Subretinal transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells delays retinal de- generation in the RCS rat model of retinal degeneration.
Exp Eye Res. 2007; 85(2):234-41.
35. Tomita N, Higaki J, Kaneda Y, Yu H, Morishita R, Mika- mi H, Ogihara T. H ypertensive rats produced by in vivo introduction of the human renin gene. Circ. Res. 1993;
73;898-905.
