KOZMETİK ÜRÜN BİLEŞİMLERİNİN KONTROLÜ İÇİN GEREKLİ ANALİZ YÖNTEMLERİ HAKKINDA TEBLİĞ TEBLİĞ NO:İEG-2005/2

Bakanlık Adı

:

Tebliğin Adı

:

Tebliğ No

:

R. Gazete Tarihi

:

R. Gazete Sayısı

: 25862

KOZMETİK ÜRÜN BİLEŞİMLERİNİN KONTROLÜ İÇİN GEREKLİ ANALİZ YÖNTEMLERİ HAKKINDA TEBLİĞ

TEBLİĞ NO:İEG-2005/2 Amaç

Madde 1- Bu Tebliğin amacı, saç bakım ürünlerindeki okside edici ajanların tanımlanması ve hidrojen peroksidin saptanması, saç boyalarındaki belirli oksidasyon renklendiricilerinin tanımlanması ve yarı nicel (semi-kantitatif) olarak saptanması, nitritin tanımlanması ve saptanması, serbest formaldehidin tanımlanması ve saptanması, şampuan ve saç losyonlarında rezorsinolün tayini ve etanol ve propan-2-ol ile bağlantılı olarak metanolün saptanması konularındaki analiz yöntemleri ile ilgili usul ve esasları belirlemektir.

Kapsam

Madde 2- Bu Tebliğ, aşağıdaki analiz metodlarının uygulamalarını kapsar:

a) Saç bakım ürünlerindeki okside edici ajanların tanımlanması ve hidrojen peroksidin

saptanması EK’teki Yöntem I’e göre yapılır.

b) Saç boyalarındaki belirli oksidasyon renklendiricilerinin tanımlanması ve yarı nicel

(semi-kantitatif) olarak saptanması EK’teki Yöntem II ’ye göre yapılır.

c) Nitritin tanımlanması ve saptanması EK’teki Yöntem III’e göre yapılır.

d) Serbest formaldehidin tanımlanması ve saptanması EK’teki Yöntem IV’e göre yapılır.

e) Şampuan ve saç losyonlarında rezorsinolün tayini EK’teki Yöntem V’e göre yapılır.

f) Etanol ve propan-2-ol ile bağlantılı olarak metanolün saptanması EK’teki Yöntem

VI’ya göre yapılır.

Hukuki Dayanak

Madde 3 - Bu Tebliğ, 23/5/2005 tarihli ve 25823 sayılı Resmi Gazete’de yayımlanan Kozmetik Yönetmeliği’nin 16 ncı maddesine dayanılarak hazırlanmıştır.

Uyumlaştırılan Avrupa Birliği Mevzuatı

Madde 4- Bu Tebliğ, 82/434/EEC sayılı Kozmetik Ürün Bileşimlerinin Kontrolü İçin Gerekli Analiz Yöntemleri Hakkında İkinci Komisyon Direktifi dikkate alınarak Avrupa Birliği mevzuatına uyum kapsamında hazırlanmıştır. Bu Tebliğ, laboratuarların denenmiş ve bilimsel geçerliliği olan yöntemleri kullanmasını engellemez.

Yürürlük

Madde 5- Bu Tebliğ yayımı tarihinde yürürlüğe girer.

Yürütme

Madde 6- Bu Tebliğ hükümlerini Sağlık Bakanı yürütür.

EK

YÖNTEM I- SAÇ BAKIM ÜRÜNLERİNDE OKSİDE EDİCİ AJANLARIN TANIMLANMASI VE HİDROJEN PEROKSİD TAYİNİ

KAPSAM VE UYGULAMA ALANI

Kozmetik ürünlerde hidrojen peroksidin iyodimetrik tayini sadece, iyodürlerden iyot oluşturan diğer oksitleyici ajanların yokluğunda mümkün olabilir. Sonuç olarak, hidrojenperoksidin iyodimetrik tayininden önce, mevcut olan diğer tüm oksitleyici ajanların saptanması ve

tanımlanması önemlidir. Bu tanımlama iki aşamaya ayrılır; birinci aşama persülfatlar, bromatlar ve hidrojen peroksidi kapsar. İkinci aşama baryum peroksidi kapsar.

A- PERSULFATLARIN, BROMATLARIN VE HİDROJEN PEROKSİDİN TANIMLANMASI

1. PRENSİP

Sodyum persülfat, potasyum persülfat ve amonyum persülfat; potasyum bromat, sodyum bromat ve hidrojen peroksit (baryum peroksitten meydana gelsin veya gelmesin) Kağıt Kromatografisi Yöntemiyle, iki yürütme solvanı kullanılarak yapılır.

2. REAKTİFLER

Bütün çözeltiler analitik saflıkta olmalıdır.

2.1. Kullanılan tüm kimyasallar analitik saflıkta olmalıdır.

2.1.1. Sodyum persülfat

2.1.2. Potasyum persülfat

2.1.3. Amonyum persülfat

2.1.4. Potasyum bromat

2.1.5. Sodyum bromat

2.1.6. Hidrojen peroksit

2.2. Yürütme Solvanı A, 80% (v/v) etanol

2.3. Yürütme solvanı B, benzen-metanol-3-metil butan-1-ol-su (34:38:18:10, v/v/v/v)

2.4. Püskürtme reaktifi A, % 10 m/v sulu potasyum iyodür.

2.5. Püskürtme reaktifi B, % 1 m/v nişasta çözeltisi

2.6. Püskürtme reaktifi C, % 10 m/m hidroklorik asit

2.7. 4N HCl

3. DÜZENEK VE EKİPMAN

3.1. Kromatografi kağıdı (whatman paper No: 3 ve No: 4 veya eşdeğeri)

3.2. Mikropipet 1 mikrolitre

3.3. Standart balonlar 100 ml.

3.4. Oluklu filtreler

3.5. Kağıt Kromatografisi için gerekli düzenekler

4. ÖRNEK HAZIRLAMA

4.1. Suda çözünebilir ürünler:

1 gr ve 5 gr örnek tartılıp, 100’er ml suda çözünür. Her solüsyondan 1 µl kullanılmak üzere bölüm 5’de bahsedildiği şekilde Kağıt Kromatografisine uygulanır.

4.2. Suda az veya zor çözünen ürünler

4.2.1. 1 gr ve 5 gr numune tartılıp, 50’şer ml suda dispers hale getirilir ve su ile 100 ml’ye tamamlanır, karıştırılır. Bu iki dispersiyon oluklu filtreden (3.4) süzülür. Süzüntülerin her birinden 1 µl kullanılmak üzere, bölüm 5’de bahsedildiği şekilde Kağıt Kromatografisine uygulanır.

4.2.2. Bir kez daha her örnekten 1 gr ve 5 gr tartılır. 50 ml distile su içinde dispers hale getirilir ve dilüe HCl (2.7) ile asitlendirilir ve su ile 100 ml’ye tamamlanarak karıştırılır. Bu karışımlar oluklu filtreden (3.4) isüzülür. Her bir süzüntüden 1’er µl kullanılmak üzere bölüm 5’de bahsedildiği şekilde Kağıt Kromatografisine uygulanır.

4.3. Kremler

5 gr ve 20 gr’lık örnekler alınır ve 100 ml suda dispers hale getirilir. Bölüm 5’de bahsedildiği şekilde Kağıt Kromatografisine uygulanır.

5. METOD

5.1. Uygun miktarlarda A (2.2) ve B (2.3) solvanları kağıt kromatografisi uygulanmak üzere iki

ayrı yürütme tankına koyularak en az 24 saat doyurulur.

5.2. 1 µl örnek solsüyonundan ve referans solüsyonundan (4 ve 2.1 bölümlerine göre hazırlanmış)

kromatografi kağıdına damlatılır. (Whatman No: 3 veya eşdeğeri) “40 cm uzunluğunda 20 cm genişliğinde (3.1)” veya diğer uygun formatta açık havada kurutulur.

5.3. Kromatografi kağıdı (5.2) içinde A (5.1) yürütme solvanı bulunan tank içine daldırılır ve 35 cm

yüksekliğine kadar (yaklaşık 15 saat) yürütülür.

5.4. (5.2) ve (5.3) bölümünde belirtilen yol izlenerek ve (3.1)’de belirtilen whatman No: 4 kromatografi kağıdı veya eşdeğeri kullanılarak damlatma işlemi tekrarlanır ve B yürütme solvanında 35 cm (10 cm) yüksekliğe kadar (yaklaşık 5 saat) yürütülür.

5.5. Yürütme işlemi tamamlandıktan sonra tanktan çıkartılan kromatogramlar havada kurutulur.

5.6. Noktalar aşağıdaki şekilde püskürtme reaktifleri yardımıyla belirlenir.

5.6.1. Püskürtme reaktif A (2.4) ve arkasından kısa bir süre sonrada püskürtme reaktifi B (2.5) püskürtülerek izlenir. İlk önce persülfatlar belirginleşmeye başlar, arkasından hidrojen peroksit noktaları belirginleşir. Bu noktalar kalemle işaretlenir.

5.6.2. Yukarıdaki kromatograma (5.6.1) püskürtme reaktif C (2.6) uygulandıktan sonra bromatlar grimsi mavi renkli noktalar halinde kromatogram üzerinden belirginleşeceklerdir.

5.7. Yukarıdaki şartlara göre yürütme solvanı A (2.2) ve yürütme solvanı B (2.3)’e göre referans maddelerinin (2.1) Rf değerleri yaklaşık aşağıdaki şekildedir.

Yürütme Solvanı Yürütme Solvanı

A (2:2) B (2.3)

Sodyum persülfat 0.40 0.10

Potasyum persülfat 0.40 0.02+0.05

Amonyum persülfat 0.50 0.10+0.20

Sodyum bromat 0.40 0.20

Potasyum bromat 0.40 0.10+0.20

Hidrojen peroksit 0.80 0.80

B- BARYUM PEROKSİD TANIMLANMASI

1. PRENSİP

Baryum peroksit, (A.4.2)’deki örneğin asitlendirilmesinden sonra hidrojen peroksit oluşumuna göre ve Baryum iyonları varlığında tanımlanır:

Persulfatların (A) mevcut olmadığı durumlarda, asidik numune solsüyonunun bir kısmına (B.4.1) dilüe H

SO

ilave edilerek baryum sülfat beyaz çökelek halinde oluşur. Örnekte (B.4.1) bulunan baryum iyonları aşağıdaki şekilde Kağıt Kromatografisi metoduyla (B.5), tekrar doğrulanır.

Eğer baryum peroksit ve persülfatlar birlikte mevcut bulunuyorlarsa (B.4.2), bir alkali içinde solüsyondan (B.4.2) elde edilen bakiye HCl’de çözündükten sonra eriyikte (B.4.2.3) yer alan baryum iyonlarını Kağıt Kromatografisi Yöntemiyle veya baryum sülfat çökeleği oluşturularak teşhis edilir.

2. REAKTİFLER

2.1. Metanol

2.2. % 36 (m/m) konsantre hidroklorik asit

2.3. 6N Hidroklorik asit

2.4. 4N Sülfürik asit

2.5. Rodizonik asit di sodyum tuzu

2.6. Baryum klorür (BaCl₂-2H₂O)

2.7. Susuz sodyum karbonat

2.8. % 1( m/v) Baryum klorür çözeltisi

2.9. Yürütme solvanı; metanol-% 36 HC-H2O (80:10:10, v/v/v)

2.10. Püskürtme reaktifi; % 0.1 (m/v) Rodizonik asit disodyum tuzunun sulu çözeltisi (Kullanımdan hemen önce hazırlanmalıdır.)

3. DÜZENEK VE EKİPMAN

3.1. Mikropipet, 5 mikrolitre

3.2. Platin krozeler

3.3. Standart balonlar 100 ml

3.4. Schleicher ve Schull 2043b veya eşdeğeri kromatografi kağıtları, yürütme tankında (A.3.5)

yürütme solvanı (B.2.9) ile bir gece bekletilerek temizlenir ve kurutulur.

3.5. Oluklu filtre kağıdı

3.6. Genel kullanımlı kağıt kromatografi düzeneği

4. ÖRNEK HAZIRLAMA

4.1. Persülfat içermeyen ürünler

4.1.1. 2 gr örnek 50 ml su içinde dispers hale getirilir HCl (B.2.3) kullanılarak pH: 1 civarına ayarlanır.

4.1.2. Yukarıda dispers hale getirilmiş olun örnek 100 ml ölçülü bir balona transfer edilir. Su ile hacme tamamlanır ve karıştırılır. Bu dispersiyon bölüm 5’de anlatılan kağıt kromatografisinde ve sülfat halinde çöktürülerek baryum teşhisinde kullanılır.

4.2. Persülfat içeren ürünler için

4.2.1. 2 gr örnek 100 ml suda dispers hale getirilir ve süzülür.

4.2.2. Kurutulmuş bakiyenin ağırlığının 7-10 katı kadar sodyum karbonat (B.2.7) karıştırılır ve karışım platin krozede yarım saatte eritilir.

4.2.3. Eriyik oda sıcaklığına kadar soğutulur, 50 ml suda çözülür ve süzülür (B.3.5)

4.2.4. Kalıntı HCl’de (B.2.3) çözülür ve su ile 100 ml’ye tamamlanır. Bu solüsyon bölüm 5’de anlatıldığı şekilde Kağıt Kromatografisinde ve sülfat halinde çöktürülerek baryum teşhisi yapmak üzere kullanılır.

5. METOD

5.1. Uygun miktarlarda yürütme solvanı (B.2.9) yürütme tankına konulur ve en az 15 saat

doyurulur.

5.2. Bölüm (B.3.4)’de bahsedilen şekilde işlem görmüş kağıda bölüm (B.4.1.2) ve bölüm

(B.4.2.4)’e göre hazırlanan solüsyonlardan ve referans solüsyon (B.2.8)’dan 5’er µl uygulanır.

5.3. Kağıt havada kurutulur ve tanka konulduktan sonra 30 cm yürütülür.

5.4. Tanktan alınan kağıt havada kurutulur.

5.5. Kağıda (B.2.10)’daki püskürtme reaktifi püskürtülür. Rf yaklaşık 0.10’da kırmızı noktalar halinde baryum teşhis edilir.

C. HİDROJENPEROKSİT TAYİNİ

1. PRENSİP

Hidrojen peroksidin iyodimetrik olarak tayini aşağıdaki reaksiyona dayanır.

H

O

+ 2H

+2

Bu reaksiyon yavaş ilerler ama amonyum molibdat eklenerek hızlandırılabilir. Meydana gelen iyot sodyumtiyosülfata karşı titrimetrik olarak tayin edilir ve hidrojen peroksit miktarı hesaplanır.

2. TANIM

Aşağıda anlatılacağı şekilde tayin edilen H2O2 miktarı yüzde kütle cinsinden (% m/m) ifade edilir.

3. REAKTİFLER

Kullanılan tüm kimyasallar analitik saflıkta olmalıdır.

3.1. 2N Sülfürik asit

3.2. Potasyum iyodür

3.3. Amonyum molibdat

3.4. 0.1N Sodyum tiyosülfat

3.5. % 10 (m/v) potasyum iyodür solüsyonu kullanımdan hemen önce taze olarak

hazırlanır.

3.6. % 20 (m/v) amonyum molibdat solüsyonu

3.7. % 1 (m/v) nişasta solüsyonu

4. DÜZENEK VE EKİPMAN

4.1. 100 ml’lik beherler

4.2. 50 ml büret

4.3. 250 ml’lik ölçülü balonlar

4.4. 25 ve 100 ml’lik mezürler

4.5. 10 ml’lik bullu pipetler

4.6. 250 ml’lik erlenler

5. METOD

5.1. Yaklaşık 0.6 gr Hidrojen peroksit ihtiva eden 10 gr örnek 100 ml’lik behere tartılır, su

ile 250 ml’lik ölçülü balona aktırılır ve su ile hacme tamamlanarak karıştırılır.

5.2. Örnek çözeltisinden (5.1) 10 ml alınıp 250 ml’lik erlene (4.6) konulur ve üzerine

sırayla 100 ml 2N H2SO4 (3.1), 20 ml potasyum iyodür solüsyonu (3.5) ve 3 damla amonyum molibdat solüsyona (3.6) ilave edilir.

5.3. Oluşan iyod hemen 0.1 N sodyum tiyosülfata karşı (3.4) titre edilir ve dönüm

noktasına varmadan hemen önce birkaç damla nişasta indikatörü (3.7) ilave edilir.

Harcanan 0.1N sodyum tiyosülfat (3.4) mililitre olarak kaydedilir (v).

5.4. (5.2) ve (5.3)’te anlatıldığı şekilde işlem 10 ml örnek çözeltisi yerine 10 ml su ile

tekrarlanarak kör deney yapılır. 0.1N Na2S2O4sarfiyatı ml olarak kaydedilir (Vo ml).

6. HESAPLAMA

% kütle olarak H2O2miktarı (% m/m) aşağıdaki formülden hesaplanır:

% H2O2 = (V-Vo

m x 10 x 1000

) x 1.7008 x 250 x 100

= (V-Vo

m ) x 4.252

Burada:

m = Analiz için tartılan örnek miktarı (5.1) gr olarak

Vo = Kör için harcanan 0.1 N sodyum tiyosülfat miktarı (5.4)

V = Numune için harcanan 0.1 N sodyum tiyosülfat miktarı (5.3)

7. TEKRARLANABİLİRLİK (Norm ISO 5725)

Yaklaşık % 6 (m/m) H2O2 ihtiva eden ürünlerde paralel olarak çalışılan iki örnek sonucu arasındaki fark % 0.2’yi geçmemelidir.

YÖNTEM II-SAÇ BOYALARINDAKİ BELİRLİ OKSİDASYON

RENKLENDİRİCİLERİNİN TANIMLANMASI VE SEMİKANTİTATİF MİKTAR TAYİNİ

1. KAPSAM VE UYGULAMA ALANI

Bu metod, krem veya likit formundaki saç boyalarında aşağıdaki maddelerinin tanıma veya semikantitatif tayinleri için uygundur.

Maddeler Sembol

Fenilendiaminler

O-Fenilendiamin (OPD)

m-Fenilendiamin (MPD)

P-Fenilendiamin (PPD)

Metilfenilendiaminler

4-metil-1,2-fenilendiamin (toluen 3,4-diamin) (OTD) 4-metil-1,3-fenilendiamin (toluen-2,4-diamin) (MTD) 2-metil-1,4-fenilendiamin (toluen-2,5-diamin) (PTD) Diaminofenoller

2,4-diaminofenol (DAP) Hidrokinon

1,4 Benzendiol (H)

α-Naftol (α-N)

Pirogallol

1,2,3 trihidroksibenzen (P)

Rezorsinol

1,3-dihidroksibenzen (R)

2. PRENSİP

Oksidasyon boyaları, pH 10’da % 96’lık etanol ile ekstre edilerek krem yada likit saç boyalarından ayrılır ve İnce Tabaka Kromatografi Yöntemiyle (bir veya 2 boyutlu) teşhis edilir.

Bu maddelerin semikantitaf tayini, aynı zamanda ve mümkün olduğunca aynı şartlarda hazırlanmış örnek ve standartların dört ayrı yürütme solvanında gösterdikleri kromatogramlar karşılaştırılarak yapılır.

3. REAKTİFLER

Kullanılan tüm kimyasallar analitik saflıkta olmalıdır.

3.1. Etil alkol (susuz)

3.2. Aseton

3.3. Etil alkol % 96 v/v

3.4. Amonyak solüsyonu % 25 (d4

20 = 0.91)

3.5. L (+) Askorbik asit

3.6. Kloroform

3.7. Siklohekzan

3.8. Azot, teknik saflıkta

3.9. Toluen

3.10. Benzen

3.11. n-Butanol

3.12. butan-2-ol

3.13. Hidrofosforus asit %50 v/v solüsyonu

3.14. Diazo reaktifi: Aşağıdakilerden biri olabilir.

3-Nitro-1- benzendiazonyumklorobenzensülfonat, (stabilize tuz şekli) (Red 2JN-Francolor) gibi

2-Kloro-4 nitro-1-benzendiazonyumnaftalenbenzoat, (stabilize tuz

formunda) (NNCD Reaktifi-referans no: 74 150 Fluka) gibi veya eşdeğeri

3.15. Gümüş nitrat

3.16. p-Dimetilamino benzealdehit

3.17. 2,5 Dimetilfenol

3.18. Ferri klorür hekzahidrat

3.19. Hidroklorik asit çözeltisi % 10 m/v

3.20. Referans maddeler

Referans maddeler paragraf 1’de “amaç ve uygulama alanı” bölümünde gösterilenlerdir.

Amin bileşikleri söz konusu olduğunda referans madde ya hidroklorürü (mono veya di), yada serbest bazı olmalıdır.

3.21. Referans Solüsyonlar % 0.5 (m/v)

Bölüm (3.20)’de belirtilen referans maddelerin her birinin % 0.5 m/v solüsyonları hazırlanır.

50 mg ± 1 mg referans madde 10 ml’lik ölçülü balona tartılır.

Üzerine 5 ml % 96’lık etanol (3.3) ve 250 mg askorbikasit (3.5) ilave edilir.

Bu solüsyon, amonyak solüsyonu (3.4) ilave edilerek alkali yapılır ve indikatör kağıdı

ile kontrol edilerek pH: 10’a ayarlanır.

% 96 etanol (3.3) ile 10 ml’ye tamamlanır ve karıştırılır.

Solüsyon 1 hafta süreyle aydınlık olmayan serin bir yerde muhafaza edilebilir.

Bazı durumlarda, askorbik asit ve amonyak ilavesinden sonra, bir çökelti olabilir. Bu durumda işleme başlamadan önce çökmesi için bekletilmelidir.

3.22. Yürütme solvanları

3.22.1. Aseton-Kloroform-Toluen (35:25:40 ,v/v/v)

3.22.2. Kloroform-Siklohekzan-mutlak alkol-% 25 amonyak (80:10:10:1, v/v/v/v)

3.22.3. Benzen-butan-2-ol-su (50:25:25, v/v/v)

Bu karışım iyice çalkalanır ve oda sıcaklığında (20-25^oC) üst faz ayrıldıktan sonra üst faz kullanılır.

3.22.4. n-butanol-kloroform-reaktif M (7:70:23, v/v/v)

Oda sıcaklığında (20-25^oC) dikkatlice ayrılarak alt faz kullanılır.

Reaktif M’in hazırlanışı:

Amonyak solüsyonu % 25 (v/v) 24 hacim

Hipofosforus asit % 50 (3.13) 1 hacim

Su 75 hacim

NOT: Amonyak ihtiva eden yürütme solvanları kullanılmadan hemen önce iyice çalkalanmalıdır.

3.23. İndikatör spreyler (püskürtme solvanı)

3.23.1. Diazo Reaktifi

(3.14)’de seçilen reaktiften % 5 (m/v) sulu çözelti hazırlanır. Bu çözelti kullanılmadan hemen önce taze hazırlanmalıdır.

3.23.2. Ehrlich Reaktifi

p-dimetilaminobenzaldehitden (3.16) 2 gr alınır ve % 10 HCl (3.19) çözeltisinin 100 ml’sinde çözülür.

3.23.3. 2.5-dimetilfenol-ferri klorürhekzahidrat

Solüsyon 1: 1 gr dimetilfenol (3.17) 100 ml % 96’lık etanol (3.3)’de çözülür.

Solüsyon 2: 4 gr ferriklorürhekzahidrat (3.18), 100 ml % 96 etanol (3.3)’de çözülür.

3.23.4. Amonyaklı gümüş nitrat

% 25 amonyak (3.4), % 5 (m/v) sulu gümüş nitrat (3.15)’a çökeltinin çözünmeye başlaması gözlenene kadar ilave edilir. Bu reaktif kullanılmadan hemen önce hazırlanır.

Saklanmaz.

4. DÜZENEK

4.1. İnce Tabaka Kromatografisi için gerekli laboratuar düzenekleri

4.1.1. Plastik veya cam kaplamalar, kromatografik plak damlatılma ve kuruma esnasında azotla çevrilmiş olacak şekilde yerleştirilir. Belirli renklerin kolay okside olmaları nedeniyle bu önlemin alınması gerekir.

4.1.2. İğne ucu kare kesilmiş 0,2 µl derecelendirilmiş 10 µl’lik mikro şırınga ve plağı azot altında tutacak şekilde kıskaçla tutturulmuş 50 µl’lik dağıtıcı.

4.1.3. Silikagel ince tabaka plakları, kullanıma hazır 0.25 mm kalınlığında 20 x 20 cm ebadında (Macherey and Nagel, Silica G-HR plastik tutucu üzerinde veya eşdeğeri)

4.2. Santrifüj, 4000 devir/dakika

4.3. Santrifüj tüpleri, 10 ml teflon kapaklı veya eşdeğeri

5. İŞLEM

5.1. Test örneği hazırlama yöntemi

Tüpten ilk çıkan 2 veya 3 cm.lik krem atılır.

Önceden azotla temizlenmiş bir santrifüj tüpüne (4.3) 300 mg askorbik asit, 3 gr krem

veya 3 gr homojenize edilmiş likit koyulur.

Üzerine pH 10 oluncaya kadar % 25’lik Amonyak çözeltisi (3.4) damla, damla ilave edilir ve % 96’lık (3.3) etanol ile 10 ml’ye tamamlanır.

Azot altında (3.8) homojenize edilip, ağzı kapatılır ve 4000 devir/dakika’da 10 dakika santrifüjlenir.

Üstteki likit faz kullanılır.

5.2. Kromatografi

5.2.1. Plak damlatma

Azot (3.8) atmosferi altında kromatografi plağına (4.1.3) yukarıda tarif edilen referans solsüyonlardan 9 nokta halinde birer µl damlatılır. Damlalar birbiri arası 1,5 cm olacak şekilde ve plağın kenarlarından da 1,5 cm kalacak şekilde damlatılmalıdır.

Referans solüsyon noktaları aşağıdaki gibi düzenlenir:

1 2 3 4 5 6 7 8 9

R P H PPD DAP PTD OPD OTD MPD

MTD α-N

Buna ilaveten 10 ve 11. noktalara 2 µl’lik (5.1)’deki bölümdeki örnek test çözeltilerinden damlatılır.

Yürütmeye koymadan önce plak azot atmosferi altında tutulmalıdır.

5.2.2. Yürütme

Tank önceden azot (3.8) ile temizlenip, (3.22)’deki 4 solvan sisteminden biri ile doyurulur ve plak, oda sıcaklığında 20-25^oC’de karanlıkta, tabandan 15 cm yükselinceye kadar yürütülür.

Plak çıkartılıp, oda sıcaklığında azot (3.8) ile kurutulur.

5.2.3. Püskürtme

4 solüsyondan bir tanesi (3.23) derhal plak üzerine püskürtülür.

5.2.4. Tanımlama

Örnek ve referansın Rf seviyeleri ve renkleri mukayese edilir.

Tablo 1’de değişik solvan sistemleri ve indikatörlere bağlı olarak maddelerin Rf değerleri ve renkleri verilmektedir.

Herhangi bir kararsızlık durumunda ise deney, yeterli miktar referansın örnek ekstraktına ilave edilmesiyle tekrarlanarak çözüme ulaşılabilir.

5.2.5. Yarı Kantitatif Tayin

Yakın konsantrasyonlarda damlatılmış örnek ve referansın lekelerinin renk şiddetleri gözle karşılaştırılır.

Eğer bir veya daha fazla madde (örnekte bulunan) konsantrasyonu aşırı görülürse;

örnek ekstraktı dilüe edilerek ölçüm tekrarlanır.

TABLO I

Spreylemeden hemen sonra oluşan renkler ve Rf değerleri

Referans Maddeler

Yürütme solvanı Püskürtme spreyi

Rf değerleri Sonuçta oluşan renkler

(3.22.1) (3.22.2) (3.22.3) (3.22.4) Diazo (3.23.1)

Ehrlich (3.23.2)

Dimethyl- Fenol (3.23.3)

AgNO (3.23.4)

OPD 0.62 0.60 0.30 0.57 uçuk

kahve

---- ---- uçuk

kahve

MPD 0.40 0.60 0.47 0.48 mor kahve

(*)

sarı uçuk

kahve

uçuk kahve

PPD 0.20 0.50 0.30 0.48 kahve parlak

kırmızı(*)

mor gri

OTD 0.60 0.60 0.53 0.60 kahve (*) uçuk

turuncu

uçuk kahve

grimsi kahve

MTD 0.40 0.67 0.45 0.60 kırmızımsı

kahve(*)

sarı kahve siyah

PTD 0.33 0.65 0.37 0.70 kahve turuncu mor(*) gri

DAP 0.07 --- 0 0.05 kahve(*) turuncu mor kahve

H 0.50 0.35 0.80 0.20 --- turuncu mor siyah(*)

α-N 0.90 0.80 0.90 0.75 turuncu-

kahve

--- mor(*) siyah

P 0.37 --- 0.67 0.05 kahve çok uçuk

mor

çok uçuk kahve

kahve(*)

R 0.50 0.37 0.80 0.17 turuncu

(*)

uçuk mor çok uçuk kahve

uçuk kahve NOT:

1. OPD sadece zayıf bir şekilde görülür. OPD’yi OTD’den net bir şekilde ayırabilmek için

çözücü (3.22.3) kullanılmalıdır.

2. (*): Oluşan en iyi rengi gösterir.

6. İKİ BOYUTLU İNCE TABAKA KROMATOGRAFİSİ İLE İNCELEME

Bu iki boyutlu kromatografi işlemi, ek standartların ve ayraçların kullanılmasını gerektirir.

6.1. Ek referans çözeltiler ve maddeler

6.1.1. β-naftol (β-N)

6.1.2. 2-aminofenol (OAP)

6.1.3. 3-aminofenol (MAP)

6.1.4. 4-aminofenol (PAP)

6.1.5. 2-nitro-1,4-fenilendiamin (2-NPPD)

6.1.6. 4-nitro-1,2-fenilendiamin (4-NOPD)

Ek referans çözeltilerinin her birinden, 3.2.1’de anlatıldığı şekilde % 0.5’lik (m/v) çözeltisi hazırlanır.

6.2. Ek yürütme solvanı

6.2.1. Etil asetat-siklohekzan-% 25’lik amonyak (65:30:05, v/v/v)

6.3. Ek belirleme sistemi

İnce Tabaka Kromatografisi için, yürütme tankının içine küçük bir beherde 2 gr kadar kristalize iyot konur ve tankın kapağı kapatılır.

6.4. Kromatografi

6.4.1. İnce tabaka plağını (4.1.3) kaplanmış yüzeyine, şekil 1’de gösterildiği gibi iki çizgi çizilir.

6.4.2. Bir azot atmosferi altında (4.1.1) ekstrakt (5.1), taban noktasına 1-4 µl damlatılır (Şekil 1), 2 kenardan da 2 cm uzaklıkta olmalıdır. Kromatogramlardaki (5.2) lekelerin yoğunluğu çözeltinin konsantrasyonuna bağlıdır.

6.4.3. Şekil 1’deki gibi 5.2’de tamamlanan noktalar arasındaki boşluk 1.5 cm olmalıdır.

Referans çözeltilerinden her birinden 6 mikrolitre uygulanması gereken DAP hariç 2 mikrolitre uygulanır. Tüm işlem azot altında yürütülür (6.4.2).

6.4.4. 6.4.3’deki işlemi 4 ve 5 için tekrarlayın (Şekil 1) ve Kromatografi başlayıncaya kadar plak azot altında tutulur. (Noktalar arasındaki aralık 1.5 cm olmalıdır.)

6.4.5. Bir kromatografi tankı azotla yıkanır ve içine uygun bir miktar yürütme solvanı konur, 3.22.2 plak (6.4.4) tanka yerleştirilir ve karanlıkta ilk elüsyon yönünde yürütülür (şekil 1).

Yürütme solvanı plaktaki işaretli çizgiye ulaşıncaya kadar devam edilir. (Yaklaşık 13 cm)

6.4.6. Plak tanktan çıkartılır, solvanını uçurmak için önceden en az 60 dakika boyunca azotla yıkanmış olan kromatografi tankına konulur.

6.4.7. Azotla yıkanmış tanka uygun bir miktar yürütme solvanı konur. Plak 90^o çevrilerek tanka yerleştirilir (karanlıkta). Çizgiye kadar ikinci yönde yürütülür, tanktan çıkarılır ve havada kurutulur.

6.4.8. Plak 10 dakika iyot buharlı kromatografi tankına tutulur (6.3) ve aynı anda kromatografiye tabi tutulan referans maddelerinin Rf değerlerinden ve renklerinden yararlanarak iki-yollu kromatogram yorumları yapılır (Tab lo II, Rf d eğerleri ve renk rehberini vermektedir).

NOT:Noktaların maksimum renklenmesini sağlamak için, yürütme bittikten sonra plak yarım saat boyunca havada kurutulur.

6.4.9. 6.4.8’de bulunan oksidasyon renklendiricilerinin varlığı, 6.4.1’den 6.4.8’e kadar olan basamaklarda anlatılan işlemler tekrarlanarak ve 6.4.2’de belirlenen örnek miktarı üzerine, 6.4.8’de belirlenen referans maddesinden 1 mikrolitre, taban noktası 1’e eklenerek kesin olarak doğrulanabilir. 6.4.8’de elde edilen kromatogramla karşılaştırıldığında farklı hiçbir başka nokta bulunmazsa kromatogram 6.4.8’in yorumu doğrudur.

TABLO II

Kromatografi sonrası iyot buharı ile saptanan referans maddelerin renkleri

Referans maddeler İyot buharı ile saptanan renkler

R p α-N β-N

H MPD

Bej

Kahverengi Mor Uçuk kahve Mor-kahve Sarımsı kahve

PPD MTD PTD DAP OAP MAP PAP 2-NPPD 4-NOPD

Mor-kahve Koyu kahve Sarımsı kahve

Koyu kahve Turuncu Sarımsı kahve

Mor-kahve Kahverengi Turuncu

III- NİTRİT TANI VE TAYİNİ

B- TANIMLAMA

1. KAPSAM VE UYGULAMA ALANI

Bu metod, kozmetik ürünlerde, özellikle krem ve macunlardaki nitritin tanımlanması için uygundur.

2. PRENSİP

Nitritin varlığı, 2-aminobenzaldehidfenilhidrazon (Nitrin^®) ile renkli türevlerinin oluşmasıyla saptanır.

3. REAKTİFLER

Kullanılan tüm kimyasallar analitik saflıkta olmalıdır.

3.1. Seyreltik sülfürik asit: 2 ml konsantre sülfürik asit (d4

20=1.19) 11 ml saf su ile seyreltilir.

3.2. Seyreltik hidroklorik asit: 1 ml konsantre hidroklorik asit (d4

20=1.19) 11 ml saf su ile seyreltilir.

3.3. Metanol

3.4. Menatol içinde 2-amino benzaldehid fenilhidrazon (nitrin reaktifi) solüsyonu

2 gr Nitrin® tartılır. 100 ml.lik ölçülü balona aktarılır, 4 ml seyreltilmiş hidroklorik asit (3.2) damla damla eklenir ve çalkalanır, hacme kadar metanolle tamamlanır ve çözelti tamamen berrak oluncaya kadar karıştırılır. Çözelti kahverengi bir cam şişede saklanır (4.3).

4. EKİPMAN

4.1. Beherler, 50 ml

4.2. Ölçülü balon, 100 ml

4.3. Kahverengi cam şişe, 125 ml

4.4. Cam plak 10x10 cm

4.5. Plastik spatul

4.6. Filtre kağıdı, 10x10 cm

5. İŞLEM

5.1. İncelenecek örneğin bir kısmı cam plak (4.4) üzerine, 1 cm’den daha fazla olmayacak

bir kalınlıkta yüzeyi kaplayacak şekilde eşit olarak yayılır.

5.2. Filtre kağıdı (4.6) saf suya batırılır. Örneğin üzerine yayılır ve plastik bir spatül (4.5)

ile aşağıya doğru bastırılır.

5.3. Bir dakika kadar beklenir ve filtre kağıdının ortasına aşağıdakiler uygulanır:

2 damla seyreltilmiş sülfürik asit (3.1) damlatılır.

Bunun ardından da 2 damla Nitrin ® çözeltisi (3.4) damlatılır.

5.4. Beş, on dakika sonra, filtre kağıdı çıkartılır ve gün ışığına karşı incelenir, Nitritin

varlığı kırmızımsı mor bir renklenmeyle belli olur.

Nitrit içeriği azsa, kırmızımsı mor renk, beş on saniye sonra sarıya dönüşür. (Eğer nitrit miktarı çok fazlaysa bu renk değişimi sadece 1-2 dakika içinde oluşur.)

6. YORUM

Kırmızımsı mor rengin yoğunluğu ve sarı renge dönüşmeden önce geçen zaman numunedeki nitrit miktarının bir göstergesi olabilir.

B- TAYİN

1. AMAÇ

Bu metod kozmetik ürünlerde nitrit tayini içindir.

2. TANIM

Bu metod uyarınca saptanan sodyum nitrit miktarı % kütle cinsinden ifade edilir.

3. PRENSİP

Numune suyla seyreltilip berraklaştırıldıktan sonra, mevcut olan nitrit, sülfanilamid ve N-1-Naftiletilendiamin ile reaksiyona sokulur ve elde edilen rengin optik yoğunluğu 538 nm’de ölçülür.

4. REAKTİFLER

Kullanılan tüm kimyasallar analitik saflıkta olmalıdır.

4.1. Berraklaştırma Reaktifleri

Bu reaktifler hazırlandıktan sonra 1 haftadan daha uzun süre kullanılamazlar.

4.1.1. Carrez Ι Reaktifi

106 gr potasyum ferrosiyanat (ΙΙ) K4Fe(CN)6.3H2O saf suda çözülür ve distile su ile 1000 ml’ye tamamlanır.

4.1.2. Carrez ΙΙ Reaktifi

219.5 gr çinko asetat, Zn(CH3COO)2.2H2O ve 30 ml glasial asetik asit saf suda çözülür ve saf su ile 1000 ml’ye tamamlanır.

4.2. Sodyum Nitrit Solüsyonu

1000 ml’lik ölçülü balon içinde 0.5 gr sodyum nitrit saf suda çözülür ve saf su ile hacme tamamlanır. Bu stok standart çözeltinin 10 ml’si 500 ml’ye seyreltilir. İkinci çözeltinin 1 ml’si 10 mikrogram NaNO2

içerir.

4.3. 1N Sodyum hidroksid çözeltisi

4.4. % 0.2 Sülfanilamide hidroklorür çözeltisi:

2 gr sülfanilamid ısıtılarak 800 ml suda çözülür, soğutulur ve karıştırılarak 100 ml konsantre hidroklorik asit ilave edilir, su ile 1000 ml’ye tamamlanır.

4.5. 5N Hidroklorik asit

4.6. N-1-naftil reaktifi

Bu çözelti kullanılacağı gün hazırlanmalıdır. 0.1 gr N-1-naftiletilendiamin dihidroklorür suda çözülür ve su ile 100 ml’ye tamamlanır.

5. EKİPMAN

5.1. Analitik terazi

5.2. Volumetrik kaplar, 100, 250, 500 ve 1000 ml.lik

5.3. Bullu veya dereceli pipetler

5.4. Mezürler, 100 ml’lik

5.5. Nitrit içermeyen oluklu filtre kağıdı 15 cm çapta

5.6. Su banyosu

5.7. Spektrofotometre (1 cm.lik küvetli) 5.8. PH metre

5.9. Mikrobüret, 10 ml.lik

5.10. Beherler, 250 ml.lik

6. İŞLEM

6.1. Homojenize edilmiş numuneden 0.1 mg doğrulukta 0.5 gr kadar tartılır. Sıcak saf su ile birlikte 250 ml.lik bir behere aktarılır. Saf su ile hacim yaklaşık 150 ml.ye getirilir, yarım saat süresince 80^oC’lik su banyosunda tutulur. Bu süre boyunca içerik arada bir karıştırılır.

6.2. Oda ısısında soğutulur ve karıştırılırken sırasıyla 2 ml Karez I (4.1.1) reaktifi ve 2 ml Karez II (4.1.2) reaktifi eklenir.

6.3. PH’ı 8.3’e getirmek için 1 N Sodyum hidroksit (4.3) çözeltisi eklenir (PH metre (5.8) kullanılır). İçerik 250 ml’lik bir dereceli kaba (5.2) aktarılır ve işaret çizgisine kadar saf su ile tamamlanır.

6.4. İçeriği karıştırın ve oluklu filtre kağıdında süzün (5.5).

6.5. 25 ml’den fazla olmayacak şekilde, berrak süzüntüden uygun bir miktar (V ml) 100 ml’lik bir erlen (5.2) içine pipetlenir (5.3) ve 60 ml.ye tamamlayıncaya kadar distile su ilave edilir.

6.6. Karıştırdıktan sonra 10 ml sülfanilamid hidroklorür solsüyonu (4.4) ilave edilir, sonra 6 ml 5 N hidroklorik asit eklenir (4.5). Karıştırılır ve 5 dakika bekletilir. 2 ml N-1 naftil reaktifi (4.6) eklenir, karıştırılır, 3 dakika bekletilir. Su ile hacime tamamlanır ve karıştırılır.

6.7. 6.5 ve 6.6 işlemleri tekrarlanarak N-1 naftil reaktifi (4.6) eklemeden bir kör deney yapılır.

6.8. Kör deney çözeltisini (6.7) referans olarak kullanarak (6.6)’da elde edilen çözeltinin optik yoğunluğu 538 nanometrede ölçülür (5.7).

6.9. Çözeltinin, 6.8’de ölçülen optik yoğunluğuna karşılık gelen sodyum nitrit içeriği 100 ml’de mikrogram cinsinden kalibrasyon grafiğinden (6.10) okunur (m1 mikrogram).

6.10. 10 µg/ml’lik sodyum nitrit çözeltisini kullanarak (4.2), 100 ml’de 0, 20, 40, 60, 80, 100 mikrogram sodyum nitrit konsantrasyonları için bir kalibrasyon grafiği hazırlanır.

7. HESAPLAMA

Aşağıdaki formül yardımıyla sodyum nitrit içeriği, yüzde kütle cinsinden hesaplanır:

% NaNO2 = 250 x m1 x 10^-6 x 100 = m V m V x m x 40

1_____

m : Analiz için alınan örneğin gram cinsinden kütlesi

m1: 6.9’daki sodyum nitrit içeriğinin mikrogram cinsinden ifadesi

V : Ölçümde (6.5) kullanılan süzüntünün mililitre cinsinden ifadesi

8. TEKRARLANABİLİRLİK (Norm ISO 5725)

Yaklaşık % 0.2 m/m sodyum nitrit içeriği için, aynı örnekte yürütülen iki paralel çalışmanın sonuçları arasındaki fark % 0.005’i aşmamalıdır.

YÖNTEM IV. SERBEST FORMALDEHİT TANI VE TAYİNİ

1. KAPSAM VE UYGULAMA ALANI

Bu metot formaldehitin varlığına veya formaldehit vericilerinin yokluğuna bağlı olarak iki tayin ve tanınmayı açıklar. Bütün kozmetik ürünlere uygulanır.

1.1. Tanınma

1.2. Pentan 2,4-dion ile kolorimetrik tayini

Bu metod formaldehit tek başına ise veya formaldehit vermeyen diğer koruyucular ile birlikte iken uygulanır.

Eğer durum böyle değil ise ve sonuçlar izin verilen maksimum konsantrasyonu aşıyorsa, aşağıdaki metod kullanılmalıdır.

1.3. Formaldehit vericilerinin varlığında tayin

Yukarıdaki bahsedilen metotta (1.2) türevlendirme işlemi sırasında formaldehit vericileri ayrılır ve yüksek sonuçlara sebebiyet verirler. (Kombine ve polimerize formaldehit)

Serbest formaldehiti likit kromatografiyle ayırmak gerekir.

2. TANIM

Bu metoda göre numunedeki serbest formaldehit miktarı yüzde kütle olarak verilir.

3. TANIMLAMA

3.1. Prensip

Sülfürik asit ortamında serbest ve bağlı formaldehit schiff’s reaktifini pembe veya pembeye bakan leylak rengine dönüştürür.

3.2. Reaktifler

Kullanılan tüm kimyasallar analitik saflıkta olmalı ve suda demineralize olmalıdır.

3.2.1. Fuksin

3.2.2. Sodyum sülfit 7H2O

3.2.3. Konsantre hidroklorik asid (d= 1.19)

3.2.4. Sülfürik asit yaklaşık 1 M

3.2.5. Schiff reaktifi

100 mg füksin (3.2.1) bir behere tartılır, 75 ml 80^oC’de suda çözülür, soğuduktan sonra 2.5 gr sodyum sülfit (3.2.2) ilave edilir 100 ml’ye tamamlanır. Bu çözelti iki hafta içinde kullanılmalıdır.

3.3. İşlem

3.3.1. 10 ml.lik bir behere 2 gr örnek tartılır.

3.3.2. 2 damla sülfürik asit (3.2.4) ve 2 ml schiff reaktifi (3.2.5) ilave edilir. Bu reaktif

kullanıldığında tamamen renksiz olmalıdır.

Çalkalanır ve 5 dakika bekletilir.

3.3.3. 5 dakika içinde pembe veya pembemsi mor renk görülürse, formaldehit % 0.01 fazlalıkla mevcut anlamındadır ve bu formaldehit serbest ve bağlı metod (4) ile ve eğer gerekirse prosedür (5) ile tayin edilir.

4. PENTANE-2,4 DIONE İLE GENEL KOLORİMETRİK TAYİNİ

4.1. Prensip

Formaldehit, amonyum asetat varlığında pentane –2,4 dione ile reaksiyona girer ve 3,5 diasetil-1,4 dihidrolutidin oluşturur. Bu butan-1-ol ile ekstre edilir ve 410 nm’de ekstraktın absorbansı ölçülür.

4.2. Reaktifler

Kullanılan tüm reaktifler analitik saflıkta olmalı ve suda demineralize olmalıdır.

4.2.1. Susuz amonyum asetat

4.2.2. Konsantre asetik asit d4

20 = 1.05

4.2.3. Vakum altında (25 mm Hg 25^oC) taze distillenmiş Pentan-2,4-dion

(410 nm’de herhangi bir apsorbsiyon vermemelidir.)

4.2.4. Butan-1-ol

4.2.5. Hidroklorik asit 1 M

4.2.6. Hidrklorik asit yaklaşık 0,1 M

4.2.7. Sodyum Hidroksid 1M

4.2.8. Avrupa Farmakopesine (2. baskı 1980 kısım-I-VII-I-I) göre taze hazırlanmış nişasta çözeltisi (1 gr/50 ml suda)

4.2.9. % 37-% 40 w/v formaldehit

4.2.10. Standart iyot solüsyonu 0,05M

4.2.11. Standart sodyum tiyosülfat solüsyonu 0,1 M

4.2.12. Pentan 2,4dion reaktifi:

1000 ml.lik bir ölçülü balona

150 mg amonyum asetat (4.2.1)

2 ml pentan-2,4 dion (4.2.3),

3 ml asetik asit (4.2.2) konulur.

Su ile 1000 ml’ye tamamlanır. (PH’sı yaklaşık 6.4)

Bu reaktif taze hazırlanmalıdır.

4.2.13. Pentan-2,4-dion içermeyen reaktif (4.2.12)

4.2.14. Formaldehit Standardı: stok solüsyonu

5 gr formaldehit (4.2.9) 1000ml.lik bir ölçülü balonda 1000 ml su ile tamamlanır.

Solüsyon aşağıdaki şekilde ayarlanır.

10 ml alınır, üzerine 25 ml standart iyot solüsyonu (4.2.10) ve 10 ml sodyum hidroksit solüsyonu (4.2.7) eklenir.

5 dakika bekletilir.

11 ml hidroklorik asit (4.2.5) eklenerek asidik ortam sağlanır. İndikatör olarak nişasta solüsyonu (4.2.8) kullanarak standart sodyum tiyosülfat solüsyonu ile iyot fazlası tayin edilir.

1 ml 0.05 M iyot (4.2.10) 1,5 mg formaldehite ekivalandır.

4.2.15. Formaldehit Standardı: seyreltik solüsyon

Formaldehit stok solüsyonu önce 1/20 su ile sonra 1/100 su ile seyreltilir.

Bu solüsyonun 1 ml.si 1 µg formaldehit içerir.

Kesin miktar hesaplanır.

4.3. Ekipman

4.3.1. Standart laboratuar aletleri

4.3.2. Faz ayırma filtresi, whatman 1PS (yada eşdeğeri)

4.3.3. Santrifüj

4.3.4. 60^oC’ye ayarlanmış su banyosu

4.3.5. Spektrofotometre

4.3.6. 1 cm.lik cam küvetler

4.4. İşlem

4.4.1. Örnek Solüsyon

150 µg formaldehite karşı gelen test örneği tartılır, 0,001 gr hassasiyetle ve 100 ml’lik ölçülü balona aktarılır.

100 ml su ile tamamlanır ve karıştırılır (Solüsyon S).

(PH kontrol edilir, yaklaşık 6 olmalıdır. Değilse hidroklorik asit solüsyonu ile seyreltilir. (4.2.6))

50 ml’lik erlen içine

- 10 ml solüsyon S

- 5 ml pentan-2,4 dion reaktifi (4.2.12) eklenir.

- 30 ml’ye su ile tamamlanır.

4.4.2. Referans Solüsyon

Oluşabilecek renk etkileşmesi, referans solüsyon kullanılarak elimine edilir.

50 ml’lik erlen içerisine

- 10 ml solüsyon S

- 5.00 ml reaktif (4.2.13) eklenir

- 30 ml’ye su ile tamamlanır

4.4.3. Kör Test

50 ml’lik erlen içerisine

- 5 ml pentan-2,4 dion reaktifi (4.2.12) eklenir.

- 30 ml’ye su ile tamamlanır.

4.4.4. Tayin

4.4.4.1. 4.4.1, 4.4.2, 4.4.3 karışımları çalkalanır, erlenler 60^oC’de su banyosunda tam 10 dakika bekletilir, buzlu su banyosunda 2 dakika soğutulur.

4.4.4.2. 10 ml butan-1-ol (4.2.4) içeren 50 ml’lik ayırma hunilerine transfer edilir. (Erlenler 3- 5 ml su ile yıkanır.) 30 sn kadar şiddetlice çalkalandıktan sonra fazların ayrılması beklenir.

4.4.4.3. Butan-1-ol fazları ayırma hunilerinden süzgeç kağıdı yardımıyla ölçüm cam küvetine süzülür (4.3.2), gerekirse 5 dakika 3000 g santirfüj edilirler.

4.4.4.4. 4.4.1’den örnek solüsyonun ekstraktı 4.4.2 referans solüsyonunun ekstraktına karşı apsorbansı (A¹) 410 nm’de ölçülür.

4.4.4.5. Benzer şekilde kör solüsyonun ekstraktının (4.4.3) butan-1-ol’e karşı apsorbansı (A²) ölçülür.

NOT: Bütün bu işlemler, erlenler 60^oC’deki su banyosuna yerleştirildiği andan itibaren 25 dakika içinde tamamlanmalıdır.

4.4.5. Kalibrasyon eğrisi

4.4.5.1. 50 ml’lik bir elen içerisine:

- 5 ml seyreltik standart solüsyon (4.2.15)

- 5 ml pentan-2,4-dion reaktifi (4.2.12)

- Demineralize su ile 30 ml’ye tamamlanır.

4.4.5.2. 4.4.4.’de tarif edildiği gibi devam edilir ve butan-1-ol’e karşı (4.2.4) absorbans ölçülür.

4.4.5.3. Aynı işlemi 10, 15, 20 ve 25 ml seyreltik standart solüsyon (4.2.15) ile tekrar edilir.

4.4.5.4. Reaktiflerin renklenmesine karşı gelen sıfır değerini elde etmek için 4.4.4.5 uygulanır.

4.4.5.5. 4.4.5.1 ve 4.4.5.3’den elde edilen absorbanslardan sıfır değer çıkartıldıktan sonra kalibrasyon eğrisi çizilir. Beer kanunu 30 µg formaldehite kadar geçerlidir.

4.5. Hesaplamalar

A2, A1’den çıkartılır ve kalibrasyon eğrisinden (4.4.5.5) numunedeki (4.4.1) formaldehit miktarı (C), µg olarak okunur.

4.5.2. Aşağıdaki formül yardımıyla örneğin formaldehit miktarı (% m/m) hesaplanır:

C

formaldehit miktarı % =

.m

Burada:

m= test edilen örneğin ağırlığı (gr)

4.6. Tekrarlanabilirlik (Norm ISO 5725.)

% 0.2’lik formaldehit miktarı için, aynı örnek ile paralel çalışılarak (pentan-2,4-dion kolorimetrik tayini) bulunan iki deney sonuçları arasında fark % 0.005’i geçmemelidir.

Eğer serbest formaldehitin test sonuçları, Kozmetik Yönetmeliğinde bildirilen maksimum konsantrasyondan daha büyükse;

a) % 0.05 ve% 0.2 arasında etiketsiz ürününde

b) % 0.2’den büyükse etiketli veya etiketsiz üründe

5’de tanımlanan prosedür uygulanmalıdır.

5. FORMALDEHİT VERİCİLERİNİN VARLIĞINDA TAYİN

5.1. Prensip

Ayrılmış formaldehit bir post-kolon reaktörde pentane-2,4-dione ile reaksiyona sokularak sarı lutidinic türevi oluşturulur. Elde edilen bu türev 420 nm’de saptanır.

5.2. Reaktifler

Kullanılan tüm kimyasallar analitik saflıkta olmalı ve suda demineralize olmalıdır.

5.2.1. HPLC veya eşdeğer kalitede su

5.2.2. Susuz amonyum asetat

5.2.3. Konsantre asetik asit

5.2.4. Pentan-2.4-dion (4^oC’da tutulan)

5.2.5. Susuz disodyum fosfat

5.2.6. Ortofosforik asid % 85 (d= 1,7)

5.2.7. HPLC kalitede metanol

5.2.8. Diklorometan

5.2.9. Formaldehit % 37-% 40 w/v

5.2.10. 1M sodyum hidroksit

5.2.11. 1M hidroklorik asit

5.2.12. 0,002M hidroklorik asit

5.2.13. Avrupa Farmakopesine göre taze hazırlanmış nişasta solüsyonu (4.2.8)

5.2.14. 0.005M standart iyot solüsyonu

5.2.15. 0,1M standart sodyum tiyosülfat solüsyonu

5.2.16. Mobil Faz

0.006M disodyum fosfat sudaki solüsyonu, pH 2.1’e ortofosforik asit ile (5.2.6) ayarlanır.

5.2.17. Post kolon reaktifi

- 1000 ml.lik ölçülü balon içerisine

- 62.5 gr amonyum asetat (5.2.2)

- 7.5 ml asetik asit (5.2.3)

- 5 ml pentan-2.4-dion (5.2.4)

Su (5.2.1) ile 1000 ml’ye tamamlanır:

Bu reaktif karanlık yerde saklanır.

Saklama zamanı: 25^oC’de maksimum 3 gün.

Renginde bir değişme gözlenmemelidir.

5.2.18. Formaldehit standardı: stok solüsyonu

10 gr formaldehit 1000 ml’likölçülü balona tartılır ve su ile hacme tamamlanır.

Solüsyon aşağıdaki şekilde ayarlanır:

Bu solüsyondan 5 ml alınır, üzerine 25 ml standart iyot solüsyonundan (5.2.14) ve 10 ml’de sodyum hidroksit solüsyonundan (5.2.10) ilave edilir.

5 dakika dinlenmeye bırakılır.

11 ml hidroklorik asit ile (5.2.11) asitlendirilir, nişasta (5.2.3) indikatörü kullanılarak iyot fazlası standart tiyosülfat solsüyonu ile titre (5.2.15) edilir.

1 ml iyot solüsyonu (5.2.14), 1,5 mg formaldehide ekivalandır.

5.2.19. Formaldehit standardı: seyreltik solüsyon

Stok solüsyon 1/100 oranında mobil faz (5.2.16) ile seyreltilir.

Bu solüsyonun 1 ml.si yaklaşık 37 mg formaldehit içerir.

Tam miktarı hesaplanır.

5.3. Ekipman

5.3.1. Standart laboratuar ekipmanları

5.3.2. HPLC pompa, vuruntusuz

5.3.3. Reaktif için düşük basınçlı vuruntusuz pompa (veya 2. bir HPLC pompası)

5.3.4. 10 µl lup’lu enjeksiyon valfi

5.3.5. Aşağıdaki parçalarla beraber Post-kolon reaktörü

+ 1 adet 1 litrelik 3 boyunlu balon

+ 1 adet 1 litrelik balon ısıtıcısı

+ 2 adet min. 10 plakalı vigreux kolonu, 2 hava soğutuculu

+ Paslanmaz çelik tüp (ısı transferi için) 1.6 mm-iç çap 0.23 mm, uzunluk 400 mm

+ 1.6 mm teflon tüp-iç çapı 0.3 mm, uzunluğu 5 m (Fransız örgüsü) (EK 1’e bakınız.)

+ 1 adet ölü hacimsiz T borusu (Valco veya eşdeğeri)

+ Ölü hacimsiz üç birleşme

veya: 1 ml reaktörlü 1 adet post-kolon modülü. Applied Biosystems PCRS 520 veya eşdeğeri.

5.3.6. Membran filtre, 0.45 µm

5.3.7. SEP-PAK^R C18kartuş veya eşdeğer

5.3.8. Kullanıma hazır kolonlar:

Bischoff hypersil RP 18 (type NC referans C 25.46 1805).

( 5 µm, uzunluk: 250 mm, iç çap: 4.6 mm )

veya Dupont, Sorbax ODS

(5 µm, uzunluk: 250 mm, iç çap: 4.6 mm )

veya Phase SEP, spherisorb ODS

(5 µm, uzunluk: 250 mm, iç çap: 4.6 mm )

5.3.9. Pre-kolon

Bischoff K1 hypersil RP 18 (referans K1G6301 1805)

(5 µm, uzunluk: 10 mm veya eşdeğeri)

5.3.10. Kolon ve prekolon Ecotube sistemi, vasıtasıyla birleştirilmiştir. (Referans A 15020508 Bischoff) veya eşdeğeri

5.3.11. Ek 2’deki blok diyagramda gösterildiği şekilde (5.3.5) düzenek kurulur.

Enjeksiyon sonrası bağlantılar mümkün olduğu kadar kısa olmalıdır. Bu durumda reaktör çıkışı ile dedektör girişi arasındaki paslanmaz çelik tüp, dedeksiyon öncesi karışımın soğuması içindir. Dedektör içindeki sıcaklık bilinmez, fakat sabittir.

5.3.12. UV-VIS dedektör

5.3.13. Kaydedici

5.3.14. Santrifüj

5.3.15. Ultrasonik banyo

5.3.16. Titreşimli karıştırıcı (vortex veya eşdeğeri)

5.4. İşlem

5.4.1. Kalibrasyon Eğrisi

Kalibrasyon eğrisi, formaldehit seyreltik standardının oluşturduğu pik yüksekliklerinin konsantrasyona karşı oluşturulan eğrisidir.

Formaldehit referans solüsyonu (5.2.19) mobil faz (5.2.16) ile seyreltilerek aşağıdaki standart solüsyonlar elde edilir.

- 1.00 ml (5.2.19) çözeltisi 20 ml’ye seyreltilir. (Yaklaşık 185 µg/100 ml)

- 2.00 ml (5.2.19) çözeltisi, 20 ml’ye seyreltilir (Yaklaşık 370 µm/100 ml)

- 5.00 ml (5.2.19) çözeltisi, 25 ml’ye seyreltilir. (Yaklaşık 740 µg/100 ml)

- 5.00 ml (5.2.19) çözeltisi, 20 ml’ye seyreltilir. (Yaklaşık 925 µg/100 ml)

Standart çözeltiler yaklaşık 1 saat laboratuar sıcaklığında tutulmalı ve taze hazırlanmalıdır.

Kalibrasyon eğrisinin linearitesi 1.00 ile 15.00 µg/ml arasındaki konsantrasyonlar için iyidir.

5.4.2. Örneklerin Hazırlanması

5.4.2.1. Emülsiyonlar (kremler, make up base, eye liner)

100 ml’lik kapaklı erlene 0.001 gr hassasiyetle 100 µg formaldehit içerdiği düşünülen miktarda örnek (mg) tartılır. 20 ml diklormetan (5.2.8) ve 20 ml HC (5.2.12) tam olarak ilave edilir. Ultrasonik banyoda karıştırılır (5.3.15). Santrifüjle 2 faz ayrıştırılır (3000 g iki dakika). Bu arada bir kartuş (5.3.7) 2 ml metanol ile (5.2.7) yıkanır ve 5 ml su ile (5.2.1) şartlandırılır.

Ekstraktın sulu fazının 4 ml’si bu kartuştan geçirilir ilk 2 ml’si atılır, geri kalan süzüntü kullanılır.

5.4.2.2. Losyon ve Şampuanlar

100 ml’lik kapaklı ölçülü balona 0.001 gr hassasiyetle 500 µg formaldehit içerdiği düşünülen miktardaki örnek (mg) tartılır.

Mobil fazla (5.2.16) ile hacme tamamlanır.

Solüsyon bir filtre (5.3.6) yardımıyla süzülür ve daha önceki gibi (5.4.2.1) şartlandırılmış kartuştan (5.3.7) geçirilir. Tüm solüsyonlar hazırlandıktan sonra hemen enjekte edilmelidir.

5.4.3. Kromatografik şartlar

- Mobil faz, akış hızı: 1 ml/dak.

- Reaktif, akış hızı: 0.5 ml/dak.

- Dedektör çıkışı toplam akış: 1.5 ml/dak.

- Enjeksiyon hacmi: 10 µl

- Kolon sıcaklığı: Zor ayırımların olduğu durumlarda, kolon buzlu su banyosuna

daldırılır ve ısının stabil olması için 15-20 dakika beklenir.

- Post-kolon reaksiyon sıcaklığı: 100^oC

- Saptama dalga boyu: 420 nm

NOT: Tüm kromatografik sistem ve post-kolon analizden sonra su ile yıkanmalıdır (5.2.1). Eğer sistem 2 gün içinde tekrar kullanılmayacaksa, sudan sonra metanol geçirilmelidir (5.2.7).

Sistemi tekrar şartlamadan önce kristallenmeyi önlemek için su geçirilir.

5.5. Hesaplama

Emülsiyonlar (5.4.2.1)

Formaldehit miktarı % (m/m)

C.10^-6.100 = C.10 5 m 5 m

-4

Losyon ve Şampuanlar:

C.10^-6.100 = C.10 m m

-4

Burada:

m= Analiz edilen örnek kütlesi gr olarak (5.4.2.1)

C= Kalibrasyon eğrisinden okunan (5.4.1) formaldehit konsantrasyonu µg/100 ml cinsinden.

5.6. Tekrarlanabilirlik (Norm ISO 57)

- % 0.05’lik formaldehit içeriği için, örnekteki 2 paralel tayin sonucu arasındaki fark

% 0.001’i geçmemelidir.

- % 0.2 formaldehit içiriği için, örnekteki iki paralel tayin sonucu arasındaki fark % 0.005’i geçmemelidir.

EK 1

FRANSIZ ÖRGÜSÜ

GEREKLİ MALZEMELER

- Bir tahta makara

Merkez boyunca açılmış 1.5 cm çaplı deliğe sahip 5 cm dış çap 4 çevik çivi yerleştirilir (Şekil 1 ve 2’de gösterildiği gibi), 2. çivi arasındaki mesafe 1.8 cm ve delikten uzaklığı 0.5 cm olmalıdır.

- Bir bükülmeyen iğne (tığ tipi) (Teflon boruyu ilmeklemek için)

- İç çapı 0.3 mm olan 1.6 mm teflon borudan 5 m

PROSEDÜR

Fransız örgüsüne başlarken, teflon boru mavnanın tepesinden sonuna kadar merkezi delik yolu ile geçirilir (örgü prosesi sırasında zincirin çekilmesini kolaylaştıracak şekilde tüpü makaranın altından 10 cm dışarı çıkararak); sonra şekil 3’de gösterildiği gibi boruyu 4 çivi etrafından sırasıyla sarın, fransız örgüsünün üstü ve altı metal halka ve sıkıştırma vidaları ile korunur. Sıkı çekerken teflonu ezmemeye dikkat edilir. Boruyu her bir vidanın etrafında ikinci defa sarın ve aşağıdaki gibi

“dikişler” yapın.

- Aşağıdaki boruyu çengelle yukarıdaki boruya asın (Şekil 4’e bakın); 5 m veya istenilen

uzunluktaki örgü elde edilinceye kadar bu prosesi her bir çivi üzerinde sırasıyla tekrarlayın (1, 2, 3, 4 saat yönünün tersine)

- 10 cm boruyu zinciri kapatmak için ayırın. Boyu her dört ilmekten geçirin ve zinciri kapatın.

NOT: Fransız örgüsü post-kolon reaktörleri için (Supelco tarafından üretilmiş olup, piyasada mevcuttur.)

EK-2

1- Likit kromatografi pompası

2- Enjeksiyon valfi

3- Prekolonlu kolon