T.C.
GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu
Sonuç Raporu
Proje No: 2011-15 Projenin Başlığı
Allium vineale L. Bitkisindeki Sekonder Metebolitlerin İzolasyonu, Yapı Tayini ve Antioksidan İncelemeleri
Proje Yöneticisi Doç.Dr.Ramazan ERENLER
Birimi
Gaziosmanpaşa Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü Araştırmacılar ve Birimleri
Doç.Dr.Mahfuz Elmastaş Hüseyin Akşit
Gaziosmanpaşa Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü (Ekim/2012)
T.C.
GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu
Sonuç Raporu
Proje No: 2011-15 Projenin Başlığı
Allium vineale L. Bitkisindeki Sekonder Metebolitlerin İzolasyonu, Yapı Tayini ve Antioksidan İncelemeleri
Proje Yöneticisi Doç.Dr.Ramazan ERENLER
Birimi
Gaziosmanpaşa Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü Araştırmacılar ve Birimleri
Doç.Dr.Mahfuz Elmastaş Hüseyin Akşit
Gaziosmanpaşa Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü (Ekim 2012)
ÖZET
Allium vineale L. Bitkisindeki Sekonder Metebolitlerin İzolasyonu, Yapı Tayini ve
Antioksidan İncelemeleri (*)
Bu çalışmanın amacı, Allium vineale bitkisinin su ekstraktındaki kimyasal bileşikleri ve antioksidan kapasitelerini incelemektir. Fenolik bileşikler iceren su ekstrakt fraksiyonu, etil asetat ile ekstrakte edildi ve bu fraksiyondan sefadeks LH-20, RPC 18 ve silika gel dolgu malzemesi kullanılarak gerçekleştirilen kolon kromatografisi ile flavonoidler izole edildi. İzole edilen bu bileşiklerin yapıları fizikokimyasal özellikleri ve spektral verilerden (UV, HPLC–TOF/MS, 1H NMR, 13C NMR and 2D NMR) belirlendi. Üç adet flavonoid izole edilerek yapıları belirlendi. Bu bileşikler, chrysoeriol-7-O-[2"-O-E-feruloyl]-β-D-glucoside (1), chrysoeriol (2), ve isorhamnetin-3-β-D-glucoside (3) dır. Su ektraktı ve izole edilen flavonoidler üzerinde gerçekleştirilen antioksidan aktivite çalışmaları, bunların önemli derecede antioksidan aktivite gösterdiğini ortaya koydu. Toplam antioksidan, İndirgeme gücü, metal şelatlama aktivitesi, ve DPPH serbest radikal giderme aktivitesi testleri gerçekleştirildi. Sudan elde edilen etilasetat fraksiyonu ile metanol farksiyonları HPLC–TOF/MS kullanılarak kimyasal bileşenler kıyaslandı. Anahtar Kelimeler: Allium vineale, Flavonoidler, Antioksidan aktivitesi
(*) Bu çalışma Gaziosmanpaşa Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu tarafından desteklenmiştir (Proje No: 2011-15).
ABSTRACT
Isolation and Identification of Secondary metabolites from Allium vineale L,
Investigation of Antioxidant Activities (*)
The aim of this work was to examine the chemical constituents and antioxidant potential of water soluble fractions from the commonly consumed vegetable, Allium vineale. The water-soluble fraction, containing phenolic compounds, was extracted with ethyl acetate to obtain flavonoids which were separated and purified by repeated column chromatography over Sephadex LH-20, RP C18 and silica gel. The isolated compounds were identified according to their physicochemical properties and spectral data (UV, HPLC–TOF/MS, 1H NMR, 13C NMR and 2D NMR). Three flavonoids were isolated and identified as chrysoeriol-7-O-[2"-O-E-feruloyl]-β-D-glucoside (1), chrysoeriol (2), and isorhamnetin-3-β-D-glucoside (3). Antioxidant studies of the aqueous extract and three isolated compounds, 1, 2, 3, were undertaken and they were found to have significant antioxidant activity. Antioxidant activities were evaluated for total antioxidant activity by the ferric thiocyanate method, ferric ion (Fe3+) reducing antioxidant power assay (FRAP), ferrous ion (Fe2+) metal chelating activity, and DPPH free radicalscavenging activity. The water-soluble ethyl acetate and methanol extraction methods were also compared using HPLC–TOF/MS.
ÖNSÖZ
Bu çalışma Çankırı Karatekin Üniversitesi ve Gaziosmanpaşa Üniversitesi Araştırma Laboratuvarlarında gerçekleştirildi. HPLC–TOF/MS analizleri Çankırı Karatekin Üniversitesi’de yapıldı. Üzerinde çalışılan bitkiler ise Van’ın Erek dağlarından toplandı.
İÇİNDEKİLER ÖZET ...i ABSTRACT ... ii ÖNSÖZ ... iii 1. GİRİŞ ... 1 2. MATERYAL VE YÖNTEM ... 2 2.1. Bitkisel Materyal ... 2 2.2. Kullanılan çözücü, reaktifler ... 2 2.3. Cihazlar ... 2 2.4. Ekstraksiyon ... 2
2.5. Ayırma ve Saflaştırma Basamağı: Kolon Kromatografisi ... 3
2.6. İzole Edilen Bileşiklerin Yapılarının Tayini ... 4
2.7. Antioksidan Aktivitenin Belirlenmesi ... 4
2.7.1. Serbest Radikal Giderme Aktivitesi ... 5
2.7.2. İndirgeme Gücü Aktivitesi ... 5
3. BULGULAR ... 7
3.1. Bitkinin Özütlenmesi: ekstraksiyon ... 7
3.2. Ekstraktların kolon kromatografiye hazırlanması ... 7
3.3. Bitki Bileşenlerinin Ayrılması ve saflaştırılması ... 7
3.4. Bileşenleri Yapı Tayini ... 9
3.5. Antioksidan Aktiviteleri ... 15
3.6. Toplam antioksidan aktivitesi ... 15
3.7. İndirgenme gücü aktivitesi ... 15
3.8. Metal Şelat Oluşturma Aktivitesi ... 16
3.9. Serbest Radikal Giderme Aktivitesi ... 16
ŞEKİLLER ve TABLOLAR İNDEKSİ
Şekil 2. 1. Kolon kromatografisi görüntüleri ... 3
Şekil 2. 2. İTK gözlemleri ... 4
Şekil 3. 1. İzolasyon Şeması ... 8
Şekil 3. 2. İzole edilen flavonoidler: Chrysoeriol-7-O[2''-O-E-feruloyl]-β-D-glucoside (1), Chrysoeriol (2), Isorhamnetin-3-β-D-glucoside (3). ... 9
Şekil 3. 3. Chrysoeriol-7-O-[2''-O-E-feruloyl]-β-D-glucosid 1H-NMR Spektrumu ... 10
Şekil 3. 4. Chrysoeriol-7-O-[2''-O-E-feruloyl]-β-D-glucosid 13C-APT NMR Spektrumu ... 11
Şekil 3. 5. Chrysoeriol-7-O-[2''-O-E-feruloyl]-β-D-glucosid HETCOR NMR Spektrumu ... 12
Şekil 3. 6. Chrysoeriol-7-O-[2''-O-E-feruloyl]-β-D-glucosid HPLC kromatogramı (280 nm) ... 13
Şekil 3. 7. Toplam antioksidan aktivitesi ... 17
Şekil 3. 8. Metal Şelat Oluşturma Aktivitesi ... 17
Şekil 3. 9. İndirgenme gücü aktivitesi ... 18
Şekil 3. 10. Serbest Radikal Giderme Aktivitesi ... 18
1. GİRİŞ
Allium türleri (Liliaceae) Dünya’da asırlardan beri geleneksel tedavi amaçlı kullanılmaktadır. (Block, 1985; Fenwick, Hanley, & Whitaker 1985; Najjaa, Ammar, & Neffati, 2009). Bazı doğal yiyeceklerin değişik hastalıkların gelişimini önlediğini birçok epidemolojik çalışmalar ortaya koydu. Allium türleri bu tür doğal yiyeceklerdendir. Bu türler tümör gelişimini durduran aktiviteye sahiptirler (Reuther, 1995). Sulfur içeren Allium türlerinden elde edilen doğal ürünlerin biyolojik aktivite gösterdikleri çok iyi bilinmektedir (Fritsch & Keusgen, 2006; Parry & Sood, 1989). Allium vineale bitkisinden elde edilen saponinler biyolojik ve antifungal aktivite göstermektedir (Corea, Fattorusso, & Lanzotti, 2003). Allium vineale Türkiye’de gıda sanayinde kullanılmakta ve antibakteriyal aktivite göstermektedir (Sagun, Durmaz, Tarakci, & Sagdic, 2006). Allium cinsinin değişik türleri üzerinde birçok çalışma (uçucu yağ bileşenleri ve biyolojik aktiviteleri) olmasına rağmen, Allium vineale’nın sekonder metabolitleri ve antioksidan aktiviteleri alanıdaki çalışmalar oldukça sınırlıdır. Bu çalışmada (1) Su ekstraktından flavonoidlerin izolasyonu, (2) spektroskopik metotlarla (1D, 2D NMR, MS, HPLC, IR ve UV) izole edilen moleküllerin yapılarını belirlenmesi, (3) Kaynar su ekstraktının antioksidan kapasitesini belirlenmesi, (4) izole edilen üç flavonoidin antioksidan kapasitelerini ortaya konması amaçlandı. Total antioksidan aktivite, indirgenme gücü aktivitesi, Metal şelatlama aktivitesi ve DPPH serbest radikal giderme aktivite testleri yapıldı.
2. MATERYAL VE YÖNTEM
2.1. Bitkisel Materyal
A. Vineale bitkisi Erek Dağından (Van) toplandı ve Doç.Dr. Fevzi Özgökçe (Biyoloji Bölümü, Yüzüncüyıl Üniversitesi, Van) tarafından teşhis edilerek bir numunesi depolandı (155628).
2.2. Kullanılan çözücü, reaktifler
Çalışmada kullanılan çözücüler: hekzan, etil asetat, kloroform ve metanol; teknik kalitede satın alındı ve literatürde verilen tekniklere göre destillenerek kullanıldı. Kolon dolgu maddesi olarak Silika jel (70-230 Mesh, Merck), ince tabaka işlemlerinde 20x20 Silika jel GF254 (Merck) tabakalar (Merck), TLC belirteci olarak Amonyum Serik sülfatın sülfürik asit içinde hazırlanmış çözeltisi kullanıldı. Çalışma boyunca değişik cam malzemeler, ısıtıcılar, analitik terazi, evaporatör vb. cam malzemeler ve aletler kullanılmıştır.
2.3. Cihazlar
NMR: Bruker Avence II 400 MHz UV: Jasco V350 (Japan)
HPLC: Perkin Elmer Series200 HPLC-UV HPLC-LC-TOF
Gc-MS
2.4. Ekstraksiyon
Kurutulmuş bitki örneklerinden en az 600 g tartılarak iki saat boyunca mutfak tipi düdüklü tencere (≈120 ºC, 2 bar) kullanılarak kaynatıldı ve oda sıcaklığına kadar soğuldu. Bitki posası tülbent ile süzüldükten sonra elde edilen konfizyon (dem) etil asetat ile (her seferinde 500 mL konfizyon 500 mL etil asetat ile 3’er defa) ekstrakte
edilerek organik fazlar birleştirilerek çözücüleri evaporatörde (40 ºC, 0,25 atm) kuruluğa kadar uzaklaştırıldı. Bitki konfizyonlarının, sıvı-sıvı ortamda etil asetatla ekstrakte edildiğinde, bitkide mevcut olan flavonoid türevlerinin yüksek oranda elde edildiği yapılan ön denemeler sonucunda tespit edildi. Sulu fazlar da toplanarak, aynı teknik ile bütanol ile de ekstrakte edilmiş ve organik fazlar birleştirilip kuruluğa kadar evaporatörde (70 ºC, 0,25 atm) kurutulmuştur.
2.5. Ayırma ve Saflaştırma Basamağı: Kolon Kromatografisi
Bu çalışmada bitkinin sekonder metabolitlerinin ayrılması ve saflaştırılması basamağında, 50x120 cm uzunluğunda cam kolon kullanıldı. Hekzandan başlayarak polarite hekzan-Etilasetat, Etil asetat ve Etilasetat-Metanol sistemi ile polarite arttırıldı. Aynı Rf değerine sahip fraksiyonlar birleştirildi. Saf maddeleri ayırmak için tekrar tekrar kolon kromatografisi gerçekleştirildi. İTK da tek spot elde edildiğinde spektroskopik yöntemlerle yapıları belirlendi. HPLC ile saflık dereceleri ortaya kondu.
Şekil 2. 1. Kolon kromatografisi görüntüleri
Toplanan fraksiyonlar, İTK kontrolü ile (gerektiğinde UV lambası gerektiğinde Serik sülfat belirteci ile) birleştirildi. Birleştirilen fraksiyonlar kristallendirme/çökme olayları için oda ortamında beklemeye alındı.
Şekil 2. 2. İTK gözlemleri
2.6. İzole Edilen Bileşiklerin Yapılarının Tayini
Doğal kaynaklardan izole edilen bileşiklerin tam yapılarının belirlenmesinde en büyük yardımcı NMR’dır. Proton ve karbon NMR spektrumları molekülün yapısının belirlenmesinde önemli bilgiler sağlar. Ancak bazen NMR verileri yapının aydınlatılmasında yeterli olmayabilir. Bu durumda kütle spektroskopisi (MS), infrared spektroskopisi (IR), ultraviyole spektrofotometrisi (UV), ve elementel analiz gibi yöntemlere başvurulur. Bu çalışmada, moleküllerin yapıları NMR ile büyük ölçüde aydınlatılabilmiştir. Saflaştırılan moleküllerden 5-20 mg arası tartılarak uygun dötero çözücüler ile çözülmüş (CDCl3-D1, CD3OD-D4, DMSO-D6) ile çözülerek 1D ve 2D NMR spektrumları kaydedilmiştir.
2.7. Antioksidan Aktivitenin Belirlenmesi
Bitki türevli yenilebilir/yenilemez ürünler büyük oranda antioksidan özelliğe sahip fenolik bileşikler (örneğin; fenolik asitler, flavanoidler, antosiyaninler, taninler, lignanlar ve kateşinler) içerir. Bu fenolikler, kalp hastalıkları, bazı kanser türleri ve oksidatif strese bağlı diğer hastalıklara yakalanma riskini arttırdığı bilinen zararlı serbest radikalleri engeller. Bu bileşiklerin antioksidan özellikleri temelde onların hidrojen atomu vericisi veya indirgeme ajanı olarak davranmalarından dolayı indirgeyebilme yeteneklerinden kaynaklanır. Bu doğal antioksidanlar; serbest radikal toplayıcısı, zincir kırıcı, proantioksidant metal iyonlarını kompleksleştiricisi olarak davranır.
Meyvelerin, sebzelerin ve diğer bitki türevli ürünlerin antioksidan aktivitesini bir tek testle kesin olarak tespit etmek zordur. Doğal kaynaklı ürünlerin antioksidan aktivitesini değerlendirmek/tahmin etmek için birçok test önerilmiştir. Doğal ürünlerin antioksidan aktivitesinin belirlenmesi için en azından iki test uygulanmalıdır.
2.7.1. Serbest Radikal Giderme Aktivitesi
Serbest radikal (DPPH·) giderme aktivitesi Liyana-Pathirana’nın özetlediği metotta bazı modifikasyonlar yapılarak değerlendirildi (Liyana-Pathirana ve Shaihidi, 2005). DPPH·(2,2-difenil-1-pikril hidrazil) 0,26 mM’lik etanol çözeltisin 1 mL si üzerine değişik konsantrasyonlarda (40-80-160 g/mL) numune çözeltisi ilave edildi. Son hacim etanol ile 4 mL’ye tamamlandı. Karışım şiddetli şekilde vortekslenerek oda sıcaklığında ve karanlıkta inkübe edildi. Spektrofotometrik ölçüm (Jasco V-530, Japan Servo Co. Ltd., Japan) oda şartlarında, 517 nm’de yapıldı. Denemeler üç tekrarlı olarak yapıldı. Numunelerin % serbest radikal giderme aktivitesi aşağıdaki formülle hesaplandı.
% SRG = [ (Abskontrol-Absnumune)/Abskontrol]x100
Abskontrıol: etanol + DPPH çözeltisinin absorbansı, Absnumune= etanol + DPPH + ekstrakt /standart absorbansı
2.7.2. İndirgeme Gücü Aktivitesi
İndirgeme gücü Oyaizu metoduna göre değerlendirildi (Oyaizu, 1986). Standart ve numunelerin etanol içindeki farklı derişimlerine (2.5, 5, 10 ve 20 µg/mL) fosfat tamponu (2.5 mL, 0.2 M, pH 6.6) ve potasyum ferrik siyanür [K3Fe(CN)6] (2.5 mL, %1) ilave edildi. Bu karışım 50 ºC’de 20 dakika inkübe edildi. İnkübasyondan sonra, bu karışıma TCA (2,5 mL, % 10 ve FeCl3 (0.5 mL, % 0.1) ilave edildi. Elde edilen son karışımın absorbansı 700 nm’de kaydedildi. Yüksek absorbans yüksek indirgeme olarak değerlendirildi. Ölçümler üç tekrar olarak yapılmış sonuçlar absorbans ± standart sapma olarak verilmiştir.
2.7.3. Total Antioksidan Aktivite Testi
Ekstrelerin total antioksidan aktiviteleri ferrik tiyosiyanat metoduna göre yapılacaktır (Mitsuda et al., 1996). Bu metodun esası, linoleik asit emülsiyonunun oksidasyonu sonucu oluşan peroksit, Fe+2’ü Fe+3’ye yükseltger. Oluşan Fe+3
ise SCN- ile kompleks oluşturarak, 500 nm’de maksimum absorbans gösterir. Sonuçlar antioksidan etkiye sahip olan butillenmiş hidroksi toluen (BHT), butillenmiş hidroksi anisol (BHA) ve α-tokoferol gibi standart antioksidan maddelerle karşılaştırılacaktır.
2.7.4. Metal Şelat Oluşturma Aktivitesi
Metal şelatlama aktivitesi Carter tarafından belirlenen metotla yapılacaktır (Carter, 1971). Her bir ekstrakt çözeltisinden 0,2 mL alınır ve bunun üzerine 0,1 mL 2 mM demir(II) klorür çözeltisinden ve 0,9 mL metanol ilave edilir. Karışım vortexlendikten sonra 5 dakika bekletilir ve sonra 0,4 mL ferrozin ilave edilir. 10 dakika sonra 562 nm deki absorbans spektrofotometrede ölçülür. Kontrol olarak ekstarkt içermeyen reaksiyon ortamı kullanılır.
3. BULGULAR
3.1. Bitkinin Özütlenmesi: ekstraksiyon
Bitki örneği suda kaynatıldıktan sonra oda sıcaklığına kadar soğutuldu ve bitki posası süzülerek uzaklaştırıldı. Ekstraksiyon işlemi Bölüm 3.4’de özetlendiği gibi yapıldı. Etil asetat ve bütanol fazları ayrı ayrı birleştirilerek çözücüleri tamamen uçuruldu. Etil asetat ekstraktı kolon kromatografisine uygulanarak flavonoidler izole edildi.
3.2. Ekstraktların kolon kromatografiye hazırlanması
Tamamen kurutulan ekstraktlar minimum miktarda metanol ile çözüldükte sonra 1:1 (g ekstrakt: g silika jel) oranında silika jel ile karıştırılarak tamamen homojen olana kadar bir baget yardımı ile karıştırıldı. Karışım tamamen kuruduktan sonra direkt olarak kolon kromatografisine uygulandı.
3.3. Bitki Bileşenlerinin Ayrılması ve saflaştırılması
Ayırma ve saflaştırma basamağında ilk olarak kolon kromatografisi uygulandı. Etil asetat ekstraktı Bölüm 3.5’te anlatıldı gibi hazırlanan ve şartlandırılan kolona uygulandı. İlk aşamada hekzan diklormetan karışımı kullanıldı. Bu aşamda fraksiyon toplama işlemi yapılmadı. 6 L %100 diklormetan sisteminde 25 fraksiyon toplandı. Bu aşamadan sonra kullanılan çözücü sistemin polaritesi adım adım arttırılarak son basamakta % 100 metanol ile kolon işlemi bitirildi. %100 metanol sisteminde de fraksiyon toplama işlemi yapılmadı. Toplamda 125 fraksiyon elde edildi ve bu fraksiyonlar İTK kontrolü ile birleştirildi.
3.4. Bileşenleri Yapı Tayini
Kromatografik çalışmalar sonucu üç flavonoid izole edilerek yapıları belirledi.
Şekil 3. 2. İzole edilen flavonoidler: Chrysoeriol-7-O[2''-O-E-feruloyl]-β-D-glucoside (1), Chrysoeriol (2), Isorhamnetin-3-β-D-glucoside (3). 1 2 3 O O HO OH OH OCH3 O O O OH OH OCH3 O O O HO HO OH OCH3 OH O O HO OH OH OCH3 O O OH OHOH HO
Şekil 3. 3. Chrysoeriol-7-O-[2''-O-E-feruloyl]-β-D-glucosid 1H-NMR Spektrumu Spektrum incelendiğinde; 12.83 ppm’de sinyal 5-OH protonuna aittir. 6.84 ppm de singlet, 6.46 ppm’de dublet (j=1.54 Hz) ve 6.21 ppm’de dublet olarak (j=1.54 Hz) gözlenen pikler yapının bir flavon olduğunu ve flavon iskeletinin A halkasının 5,7-sübtitüe olduğunu gösterdi. 7.06 ppm’de 8.14 Hz lik dublet ve 6.70 ppm’de yine 8.14 Hz’lik etkileşeme ile dublete yarılan pik ve 7.20 ppm’deki singlet flavon iskeletinin B halkasının 3',4'-sübstitüe olduğunu gösterdi. 7.48 ve 6.45 ppm’deki 15 Hz’lik dubletler α,β-doymamış sisteminin varlığını göstrtmektedir.
Yine proton NMR spektrumunda 5.13 ppm’de 6.8 Hz’lik etkileşme ile gözlenen dublet moleküle bağlı glukoz grubunun β-konfigürasyonunda olduğunu ve bu protonun HMBC spektrumunda 162.6 ppm’deki karbonla etkileşimi şeker grubunun flavon halkasına 7-konumundan bağlı oduğunu göstedi. HMBC spektrumundaki 73.5-6.45 ve 73.5-7.48 etkileşimleri ferloil grubunun glukoza 2’’-konumundan bağlandığının kanıtıdır. Yukarıda bahsedilen spektroskopik veriler, yapıyı doğrulamaktadır.
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 ppm 1.908 2.510 3.353 3.586 3.760 3.882 4.220 4.367 5.145 5.315 5.429 5.519 6.214 6.420 6.466 6.704 6.724 6.846 7.056 7.075 7.227 7.254 7.473 7.512 7.567 12.883 4.67 4.06 1.71 1.65 1.18 1.27 1.20 1.15 1.07 1.64 1.00 0.88 1.00 2.27 1.12 2.17 0.50 O O O O O OCH3 HO OH O OH OCH3 OH HO HO
Şekil 3. 4. Chrysoeriol-7-O-[2''-O-E-feruloyl]-β-D-glucosid 13C-APT NMR Spektrumu Şekil 3’teki APT spektrumu incelendiğinde; negatif olarak gözlenen, 18 sinyal (16 CH ve 2 CH3), pozitif olarak gözlenen 14 sinyal (13 C ve 1 CH2 ) yapının 32 karbonlu olduğunu göstermektedir ki bu da yapının doğruluğuna kanıttır. Molekülde bulanan iki metoksi grubu; 56.09 ve 56.44 ppm’de negatif olarak ve yapıdaki tek CH2 grubu ise 63.59 ppm’de pozitif olarak rezonans olmuştur.
60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 ppm 56.097 56.442 63.595 70.265 73.472 74.227 76.951 94.610 99.384 99.771 104.219 104.535 110.614 111.401 114.621 115.576 115.942 120.173 123.614 124.708 125.900 145.713 148.374 149.586 149.776 149.831 157.797 161.822 163.534 164.686 166.984 182.200
Şekil 3. 5. Chrysoeriol-7-O-[2''-O-E-feruloyl]-β-D-glucosid HETCOR NMR Spektrumu Çizelge 1’de verilen C-H korelasyonları HETCOR spetrumunda elde edilen veriler ile hazırlanmıştır.
Şekil 3.6. Chrysoeriol-7-O-[2''-O-E-feruloyl]-β-D-glucosid UV Spektrumu
ppm 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150 ppm 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0
Şekilde moleküle ait UV spektrumu verilmiştir. 290 nm’deki absorsiyon bantları aromatik halkanın varlığının bir göstergesidir.
Şekil 3. 6. Chrysoeriol-7-O-[2''-O-E-feruloyl]-β-D-glucosid HPLC kromatogramı (280 nm)
Chrysoeriol (2) beyaz kristaller şeklinde elde edildi. MicroTOF-Q (m/z 301.0722) ile molekül formülü C16H13O6 olarak belirlendi. 1H NMR VE 13C NMR spektrumları 3 nolu bileşik ile benzerlik göstermektedir fakat 3 nolu bileşik şeker grubu içermektedir. Spektral verileri literatür ile karşılaştırıldığında yapının Chrysoeriol olduğu belirlendi (Peng et al, 2009) (Çizelge 1).
Isorhamnetin-3-β-D-glucoside (3) bileşiği beyaz iğne kristalleri şeklinde elde edildi. Molekül formülü TOF-Q (m/z 501.1028) spektrumuna göre C22H22NaO12 olarak belirlendi. IR spektrumundan molekülde, hidroksil grubu (3320 cm-1), bir karbonil grubu (1683 cm-1) ve aromatik halkanın varlığı (1600, 1518 ve 1465 cm-1) belirlendi. 1H NMR spektrumu 3.85 (3H, s) metkosi grubunu göstermektedir. 1H NMR ve 13C NMR değerleri literatür verileriyle uyum içerisindedir (Peng et al, 2009) (Table 1).
Çizelge 3. 1. Karbon ve proton NMR değerleri (flavonoidler 1, 2, 3). Compound 1 Compound 2 Compound 3
C/H δCppm δH ppm (Hz) C/H δCppm δH ppm (Hz) C/H δCppm δH ppm (Hz) 2 163.1 2 164.6 2 164.6 3 104.7 6.87 s 3 94.6 6.89 s 3 121.5 4 182.3 4 182.2 4 177.8 5 157.1 5 151.1 5 149.8 6 94.6 6.48 d (1.54) 6 99.7 6.20 d (1.37) 6 94.2 6.45 d (2.01) 7 162.6 7 157.8 7 156.8 8 95.0 6.23 d (1.54) 8 103.6 6.52 d (1.37) 8 99.2 6.45 d (2.01) 9 156.9 9 148.5 9 147.3 10 104.2 10 104.1 10 104.5 1' 124.2 1' 122.0 1' 121.5 2' 2' 110.5 7.54 d (1.49) 2' 113.8 7.94 d (1.95) 3' 3' 161.9 3' 156.8 6.93 4' 4' 164.2 4' 161.6 5' 5' 116.3 6.94 d (8.1) 5' 115.7 6.92 d (8.52) 6' 6' 120.8 7.56 dd(8.1/1.49) 6' 122.4 7.49 dd (8.52/1.95)
4'-OH O-CH3 56.9 3.88 s OCH3 56.2 3.85 s
5-OH 5-OH O-CH3 56.1 3.76 8-OH Glucose Glucose 1'' 99.8 5.13 d (6.9) 1'' 101.2 5.57 d (7.31) 2'' 73.5 3.55 2'' 77.8 3.13 3'' 70.3 3.29 3'' 70.2 3.11 4'' 76.9 3.30 4'' 76.8 3.27 5'' 74.2 3.73 dd (7.2/2.0) 5'' 74.8 3.22 6'' 63.6 4.15 dd (12.0/7.2) 6'' 61.1 3.41 dd (11.58/4.11) 4.46 dd (12.0/2.0) 3.60 d (8.1) Isoferulic acid 1''' 2''' 114.7 6.44 d (15.95) 3''' 145.6 7.50 d (15.95) 4''' 5''' 113.3 7.23 d (1.15) 6''' 7''' 8''' 115.9 6.71 d (8.12) 9''' 123.6 7.1 dd (8.12/1.15) O-CH3 56.4 3.87 s
3.5. Antioksidan Aktiviteleri
Gıda sanayinde, antioksidan kapasitesi önemli bir parametre olarak kullanılmaktadır. Bu çalışmada ham ekstrakte ve izole edilen üç flavonoide antioksidan aktivite testleri yapıldı ve BHA, BHT, trolox ve α-tocopherol positif kontrol için standart olarak belirlendi. Literatürde flavonoidlerin antioksidan mekanizmaları yeterince tartışılmasına rağmen bu mekanizma tam olarak anlaşılmış değildir (Seymoum, Asres ve El-Fiky, 2006). Polifenolik bileşikler olarak flavonoidler, serbest radikal giderme mekanizmasıyla daha az reaktif flavonoid fenoksi radikali oluşturmakta ve böylece flovonoidler antioksidan kapasitesine sahip olmaktadırlar. Serbest radikal giderme aktivite potansiyeline sahip flavonoidlerin bu özellikleri hidroksil grublardaki hidrojeni radikale vermesine atfedilebilir. Sebest radikallerle flavonoidler arasındaki tepkimeden flavonoid fenoksi radikali ve kararlı bir molekül oluşmakta bud a paylaşılmamış elektronları aromatik halkaya katarak rezonans kararlılık kazanmaktadır. Böylece flavonoid fenoksi radikali diğer fenol radikalinden daha kararlı olmaktadır.
3.6. Toplam antioksidan aktivitesi
Ham ektraktın ve izole edilen üç flavonoidin 1,2,3, trolox ve α-tocopherol standartları kullanılarak ferric tiyosiyanat metodu kullanılarak toplam antioksidan aktivite testi gerçekleştirildi (figure 3A). ham ekstrakt, flavonoid 1,2,3, troloks ve α-tocopherolun aktiviteleri sırasıyla yüzde olarak 64.8, 79, 75.6, 82.2, 75.7, 31.4 olarak belirlendi. Ham ekstraktenin ve flavon 1,2,3 un aktivite değerleri α-tocopherolden daha yüksel olduğu gözlendi. Flavon 3 bütün konsantrasyonlarda en yüksek aktivite gösterdi. Sonuç olarak ham ekstrakte ve izole edilen üç flavonoidin yüksek antioksidan gösterdiği belirlendi.
3.7. İndirgenme gücü aktivitesi
Değişik çalışmalar, elektron verme kapasitesinin indirgeme gücüne sahip olduğunu göstermektedir. Bu da antioksidan aktivitesiyle alakalıdır (Siddhuraju, Mohan, & Becker,
2002). Antioksidan maddeler gibi indirgeme kapasitesinin varlığı, Fe+3/ferrisiyanür kompleksini Fe+2 indirgemekte bu durum UV de 700 nm takip edilmektedir. Bir molekülün indirgeme gücünün olması o molekülün o derece antioksidan kapasitesine sahip olduğunu göstermektedir.
Ham ekstrakt, isole edilen flavonlar, BHT ve α-tocopherol indirgeme gücü aktivitesi göstermektedirler. Konsantrasyon arttıkça bu bileşiklerin aktiviteleri artmaktadır. Bu bileşiklerin aktivite sırası şu şekildedir: BHT > ham ekstrakt > α-tocopherol > bileşik 3 > bileşik 1 = bileşik 2. Bu sonuçlar bize ham ekstraktın radikale elektron vererek daha kararlı hale geldiğini göstermektedir.
3.8. Metal Şelat Oluşturma Aktivitesi
Organizmalarında Ferrius iyon gibi (Fe +2) geçiş metal grupları ROS oluşumunu kolaylaştırır. Bir maddenin demiri şelatlama kapasitesi antioksidan kapasitesiyle doğru orantılıdır (Halliwell & Gutteridge, 1984). Ekstrakt ve flavonoidler 1,2,3 metal şelat oluşturma aktivitesi gösterdiler. Bununla beraber ekstrakt, flavonoidler (1,2,3) ve EDTA aynı konsatrasyonda sırasıyla yüzde olarak 90.6, 24.4, 88.5, 43.9, 95.6 aktivite gösterdiler. Bu sonuç ekstrakt ve falovon 2 yüksek aktivite göstermektedir ve glikozit grup aktiviteyi azaltma etkisi olabilmektedir.
3.9. Serbest Radikal Giderme Aktivitesi
Serbest radikal zincir reaksiyonu lipit peroksidasyon için yaygın kabul gören mekanizmadır. Radikal gidericiler peroksi radikal ile direk reaksiyona girerek peroksit zincirleme reaksiyonu tamamlarlar ve gıda maddelerinin kalitesini ve kararlılığını arttırırlar. Radikal giderme aktivitesi, yapılan testlerde şu şekilde sıralanmaktadır: Ekstrakt > BHA > BHT > α-tocopherol > bileşik 2 > bileşik 3 > bileşik 1 dır ve değerleri sırasıyla (%) 86.7, 76.2, 75.1, 74.3, 26, 12.2, 8.5 dır. Ayrıca ekstraktın aktivitesi konsantrasyon arttıkça artığı gözlendi.
Şekil 3. 7. Toplam antioksidan aktivitesi
Şekil 3. 9. İndirgenme gücü aktivitesi
4. TARTIŞMA ve SONUÇ
Allium vineale L. Bitkisinden üç flavonoid izole edildi ve yapıları belirlendi. İzole edilen flavonların ve ekstraktın antioksidan aktivite çalışmaları ortaya kondu. Gerek ham ekstraktın ve gerekse izole edilen flavonların yüksek antioksidan gösterdikleri ortaya kondu. Allium vineale L. bitkisi ve izole edilen flavonlar doğal antioksidan olarak gıda sanayinde kullanılma potansiyeline sahiptirler.
KAYNAKLAR
Block, E. (1985). The chemistry of garlic and onions. Scientific America, 252, 114–119. Carter, P. 1971. Spectrophotometric determination of serum iron the submicrogram level
with a new reagent (ferrozine). Analytical Biochemistry. 40, 450-458.
Corea, G., Fattorusso, E., & Lanzotti, V. (2003). Saponins and flavonoids of Allium triquetrum. Journal of Natural Products, 66, 1405–1411.
Fenwick, G. R., Hanley, A. B., & Whitaker, J. R. (1985). The Genus Allium-Part 1, Part 2 and Part 3. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 22–23, 1–377.
Fritsch, R. M., & Keusgen, M. (2006). Occurrence and taxonomic significance of cysteine sulphoxides in the genus Allium L. (Alliaceae). Phytochemistry, 67, 1127– 1135.
Halliwell, B., & Gutteridge, J. M. C. (1984). Oxygen toxicology, oxygen radicals, transition metals and disease. Biochemical Journal, 219, 1–4.
Mitsuda, H., Yuasumoto, K., & Iwami, K. (1996). Antioxidation action of indole compounds during the autoxidation of linoleic acid. Journal of Japan Society of Nutrition and Food Sciences, 19, 210214.
Najjaa, H., Ammar, E., & Neffati, M. (2009). Antimicrobial activities of protenic extracts of Allium roseum L., a wild edible species in North Africa. Journal of Food Agriculture & Environment, 7, 150–154.
Oyaizu, M. (1986). Studies on product of browning reaction prepared from glucose amine. Japanese Journal of Nutrition, 44, 307315.
Parry, R. j., & Sood, G. R. (1989). Investigations of the biosynthesis of trans-(+)-S-1- propenyl-L-cysteine Sulfoxide in Onions (Allium Cepa). Journal of The American Chemical Society, 111, 4514–4515.
Peng, C., Liang, Y., Wang, X., Xie, H., Zhang, T., & Ito, Y. (2009). Preparative isolation and purification of flavonoids from the chinese medicinal herb belamcanda by high-speed countercurrent chromatography. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, 32(16), 2451–2461.
Reuther, H. D. (1995). Allium sativum and Allium ursinum. 2. Pharmacology and medicinal application. Phytomedicine, 2, 73–91.
Sagun, E., Durmaz, H., Tarakci, Z., & Sagdic, O. (2006). Antibacterial Activities of the extracts of some herbs used in Turkish herbs cheese against listeria monocytogenes serovars. International Journal of Food Properties, 9, 255–260.
Seyoum, A., Asres, K., & El-Fiky, F. K. (2006). Structure-radical scavenging activity relationships of flavonoids. Phytochemistry, 67, 2058–2070.
Siddhuraju, P., Mohan, P. S., & Becker, K. (2002). Studies on the antioxidant activity of Indian Laburnum (Cassia fistula L.): A preliminary assessment of crude extracts from stem bark, leaves, flowers and fruit pulp. Food Chemistry, 79, 61–67.
