DENİZLİ BÖLGESİNDE YETİŞEN ÜZÜMLERDEN ELDE EDİLEN ÇEŞİTLİ ŞARAPLARDAKİ BİYOJEN AMİNLER

(1)

i

T.C.

PAMUKKALE ÜNİVERSİTESİ

FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI

DENİZLİ BÖLGESİNDE YETİŞEN ÜZÜMLERDEN ELDE

EDİLEN ÇEŞİTLİ ŞARAPLARDAKİ BİYOJEN AMİNLER

YÜKSEK LİSANS TEZİ

ANDAÇ IŞIK

(2)

ii

T.C.

PAMUKKALE ÜNİVERSİTESİ

FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI

Ç

DENİZLİ BÖLGESİNDE YETİŞEN ÜZÜMLERDEN ELDE

EDİLEN ÇEŞİTLİ ŞARAPLARDAKİ BİYOJEN AMİNLER

YÜKSEK LİSANS TEZİ

ANDAÇ IŞIK

(3)

(4)

iv

Bu tez çalışması PAUBAP tarafından 2011FBE047 nolu proje ile

(5)

(6)

vi

ÖZET

DENİZLİ BÖLGESİNDE YETİŞEN ÜZÜMLERDEN ELDE EDİLEN ÇEŞİTLİ ŞARAPLARDAKİ BİYOJEN AMİNLER

YÜKSEK LİSANS TEZİ ANDAÇ IŞIK

PAMUKKALE ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI

(TEZ DANIŞMANI:PROF. DR. RACİ EKİNCİ) DENİZLİ, AĞUSTOS - 2015

Bu çalışmada şaraplardaki biyojen amin varlığı tespit edilerek oluşumunun şarap yapım aşamalarındaki hangi faktörlere bağlı olabileceği incelenmiştir. Piyasadan temin edilen Denizli Bölgesi üzümlerinden yapılmış 18 şarap örneği OPA (ortofitaldialdehit) ile türevlendirilerek HPLC (Yüksek Performans Sıvı Kromatografisi) cihazında 340 nm (uyarma) ve 420 nm (emisyon) dalga boylarında fluoresans detektör ile biyojen amin analizi gerçekleştirilmiştir. Araştırılan biyojen aminlerden histamin, putresin ve kadaverin tespit edilirken tiramin ve feniletilamin tespit edilememiştir. Bulunan biyojen aminlerin konsantrasyonları ve bundaki değişikliklerin şarap yapım altyapısı, şarap yapım uygulamaları, yıllanma, tortu üzerinde bekletme ve malolaktik fermantasyon faktörlerinden kaynaklandığı değerlendirilmiştir.

(7)

vii

ABSTRACT

BIOGENIC AMINES IN THE WINES MADE FROM GRAPES GROWN IN DENİZLİ REGION

MSc THESIS ANDAÇ IŞIK

PAMUKKALE UNIVERSITY INSTITUTE OF SCIENCE FOOD ENGİNEERİNG

(SUPERVISOR:PROF.DR. RACİ EKİNCİ) DENİZLİ, AUGUST 2015

In this work it was determined presence of biogenic amines and it was researched parameters of winemaking process that affects formation of biogenic amines. 18 bottles of samples derivated by o-phytaldialdehyde (OPA) and then analyzed at HPLC 340 nm (excitation) ve 420 nm (emission) wavelenght via fluourescence detector. Histamine, putrescine and cadaverine was detected and phenylethylamine and tyramine was not detected. It is evaluated that biogenic amines’ concentaration and changes of it depends on winemaking conditions (site’s infrastructure), winemaking practices, aging, batonnage and malolactic fermentation.

(8)

viii

İÇİNDEKİLER

Sayfa ÖZET ... i ABSTRACT ... ii İÇİNDEKİLER ... viii ŞEKİL LİSTESİ ... x

TABLO LİSTESİ ... xii

SEMBOL LİSTESİ ... xiii

ÖNSÖZ ... xiv 1. GİRİŞ ... 1 2. LİTERATÜR ÖZETİ ... 6 2.1 Şarap Üretimi ... 6 2.1.1 Kırmızı Şarap Üretimi ... 6 2.1.1.1 Malolaktik Fermantasyon... 7

2.1.2 Beyaz Şarap Üretimi ... 8

2.1.3 Roze Şarap Üretimi ... 9

2.2 Biyojen Aminler ... 9

2.2.1 Biyojen Aminlerin Kimyası ... 10

2.2.2 Biyojen Aminlerin Toksikolojik Etkileri ... 12

2.2.2.1 Histamin ... 12

2.2.2.1.1 İnsan Vücudunda Sentezi ve Metabolizması ... 12

2.2.2.1.2 Fizyolojik Görevi ... 13

2.2.2.1.3 Toksik Etkileri ... 13

2.2.2.2 Tiramin, Feniletilamin ve Triptamin ... 14

2.2.2.3 Putresin ve Kadaverin ... 15

2.2.2.4 Biyojen Aminlerin Toksik Potansiyelleri ... 16

2.2.2.5 Biyojen Amin Hassasiyetini Arttıran Faktörler ... 16

2.2.2.6 Biyojen Aminlerin Detoksifikasyonu ... 17

2.2.3 Şarapta Biyojen Aminlerle İlgili Yasal Düzenlemeler ... 17

2.2.4 Biyojen Aminler ve Mikroorganizmalar ... 19

2.2.4.1 Laktik Asit Bakterileri... 19

2.2.4.1.1 Histamin Üreten Laktik Asit Bakterileri ... 19

2.2.4.1.2 Tiramin ve Feniletilamin Üreten Laktik Asit Bakterileri . 20 2.2.4.1.3 Putresin ve Kadaverin Üreten Laktik Asit Bakterileri ... 20

2.2.4.1.4 Laktik Asit Bakterilerinin Biyojen Amin Üretimiyle İlgili Çalışmalar ... 20

2.2.4.2 Asetik Asit Bakterileri... 22

2.2.4.3 Mayalar ... 22

2.2.4.4 Küfler ... 24

2.2.5 Biyojen Amin Oluşumunu Etkileyen Faktörler ... 24

(9)

ix

2.2.5.2 Alkol Fermantasyonu ... 27

2.2.5.3 Maserasyon ... 27

2.2.5.4 Şarabın Fizikokimyasal Kompozisyonu ... 28

2.2.5.5 Yıllandırma ... 29

2.2.5.6 Tortu Üzerinde Bekletme ... 30

2.2.5.7 Malolaktik Kültür Kullanımı... 31

2.2.5.8 Durultma Uygulamaları ... 32

2.2.6 Şarapta Biyojen Amin Varlığını Azaltma Yolları ... 33

2.2.6.1 Bağcılık Önlemleri ... 34

2.2.6.2 Hasat Önlemleri ... 34

2.2.6.3 Şaraphanedeki Önlemler ... 34

2.2.6.3.1 Fermantasyon Öncesi ... 34

2.2.6.3.2 Fermantasyon ve Malolaktik Fermantasyon ... 35

2.2.6.3.3 Durultma, Berraklaştırma ve Olgunlaştırma ... 35

3. MATERYAL VE YÖNTEM ... 36 3.1 Örnekler ... 36 3.1.1 Kırmızı Şaraplar ... 36 3.1.2 Beyaz Şaraplar ... 37 3.2 Analitik metotlar ... 37 3.2.1 Alkol analizi ... 37 3.2.2 pH Analizi ... 38 3.2.3 Uçucu Asitlik ... 38 3.2.4 Genel Asitlik ... 38 3.2.5 Toplam Kükürtdioksit ... 39 3.3 Kullanılan Kimyasallar ... 39

3.4 Kullanılan Standart Biyojen Aminler ... 39

3.5 Kullanılan Cihazlar ... 40

3.6 HPLC ile Yapılan Analiz Yöntemi ... 40

3.7 Tespit Limiti ... 42

3.8 Biyojen aminler için Geri Kazanım Testi ... 42

3.9 İstatistiksel Analiz ... 43

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA ... 44

4.1 Şarap örneklerine ait bazı önolojik parametreler... 44

4.2 Şarap örneklerinde biyojen aminler ... 45

4.2.1 Histamin ... 45 4.2.2 Putresin ... 49 4.2.3 Kadaverin ... 54 4.2.4 Feniletilamin ... 58 4.2.5 Tiramin ... 58 5. SONUÇ VE ÖNERİLER ... 59 6. KAYNAKLAR ... 61 7. EKLER ... 68

EK A Biyojen Amin Konsantrasyonlarını Gösterir Özet Tablo ... 68

EK B Biyojen Aminlere Ait Kalibrasyon Tablosu ve Grafikleri ... 69

EK C Biyojen Aminlere Ait Kromatogramlar... 71

(10)

x

ŞEKİL LİSTESİ

Sayfa

Şekil 1.1 : 2013’ de dünya ülkelerinde bağ alanlarının durumu ... 1

Şekil 1.2 : 2000-2013 yılları arasında dünya ülkelerinin üzüm üretim miktarları 2 Şekil 2.1 : Kırmızı şarap üretimi akış şeması ... 7

Şekil 2.2 : Beyaz şarap üretimi akış şeması ... 9

Şekil 2.3 : Biyojen amin oluşumu ... 10

Şekil 2.4 : Şaraplarda sıklıkla görülen bazı biyojen aminlerin kimyasal formülleri 11 Şekil 3.1 : Alkol analizinde kullanılan cihazlar (a) Gibertini Alcomat 2, (b) Gibertini DEE distilasyon ünitesi ... 38

Şekil 3.2 : Uçucu ve toplam asitlik ile toplam kükürtdioksit analizinde kullanılan Gibertini Quick Analyzer cihazı ... 39

Şekil 4.1 : Yıllara göre Shiraz örneklerinin histamin konsantrasyonları ... 45

Şekil 4.2 : Yıllara göre Chardonnay örneklerinin histamin konsantrasyonları .. 46

Şekil 4.3 : Yıllara göre Merlot örneklerinin histamin konsantrasyonları ... 47

Şekil 4.4 : Yıllara göre Cabernet Sauvignon örneklerinin histamin konsantrasyonları ... 48

Şekil 4.5 : Yıllara göre Shiraz örneklerinin Putresin konsantrasyonları ... 49

Şekil 4.6 : Denizli iline ait yıllık alansal yağışlar ( Anonim 2014) ... 50

Şekil 4.7 : Yıllara göre Chardonnay örneklerinin Putresin konsantrasyonları ... 51

Şekil 4.8 : Yıllara göre Merlot örneklerinin Putresin konsantrasyonları ... 52

Şekil 4.9 : Yıllara göre Cabernet Sauvignon örneklerinin Putresin konsantrasyonları ... 53

Şekil 4.10 : Yıllara göre Shiraz örneklerinin Kadaverin konsantrasyonları ... 55

Şekil 4.11 : Yıllara göre Chardonnay örneklerinin Kadaverin konsantrasyonları 56 Şekil 4.12 : Yıllara göre Merlot örneklerinin Kadaverin konsantrasyonları ... 57

Şekil 4.13 : Yıllara göre Cabernet Sauvignon örneklerinin Kadaverin konsantrasyonları ... 58

Şekil B.1 : Biyojen amin standartlarına ait kalibrasyon tablosu ... 69

Şekil B.2 : Biyojen amin standartlarına ait kalibrasyon eğrileri ... 69

Şekil B.2 : Biyojen amin standartlarına ait kalibrasyon eğrileri (devam) ... 70

Şekil C.1 : Chardonnay 2002 örneğine ait kromatogram ... 71

Şekil C.5 : Cabernet Sauvignon 2002 örneğine ait kromatogram ... 73

Şekil C.9 : Merlot 2007 örneğine ait kromatogram ... 75

Şekil C.10 : Merlot 2009 örneğine ait kromatogram ... 75

Şekil C.11 : Shiraz 1999 örneğine ait kromatogram ... 76

Şekil C.14: Shiraz 2003 örneğine ait kromatogram ... 77

(11)

xi

Şekil C.17 : Shiraz 2010 örneğine ait kromatogram ... 80 Şekil C.18 : Shiraz 2011 örneğine ait kromatogram ... 79

(12)

xii

TABLO LİSTESİ

Sayfa Tablo 1.1 : Şarap üreten ülkeler ve üretim miktarları ... 2 Tablo 3.1: Biyojen aminlerin tespitinde kullanılan HPLC cihazının özellikleri

ve kromatografi koşulları ... 40

Tablo 3.2 : Biyojen aminlerin tespit limitleri ... 42 Tablo 3.3 : Biyojen aminlerin geri kazanım tespit çalışmaları ... 43 Tablo 4.1 : Örneklere ait Alkol, pH, Toplam SO2, Genel Asitlik ve Uçucu

Asitlik değerleri ... 44

Tablo 4.2 : Değişik yıllarda Shiraz üzümünden yapılan şaraplarda Histamin

konsantrasyonları (ppm), alkol (%v/v) ve pH değerleri ... 45

Tablo 4.3 : Değişik yıllarda Chardonnay üzümünden yapılan şaraplarda

Histamin konsantrasyonları (ppm), alkol (%v/v) ve pH değerleri ... 46

Tablo 4.4 : Değişik yıllarda Merlot üzümünden yapılan şaraplarda Histamin

Tablo 4.5 : Değişik yıllarda Cabernet Sauvignon üzümünden yapılan şaraplarda

Histamin konsantrasyonları (ppm), alkol (%v/v) ve pH değerleri ... 48

Tablo 4.6 : Değişik yıllarda Shiraz üzümünden yapılan şaraplarda Putresin

Putresin konsantrasyonları (ppm), alkol (%v/v) ve pH değerleri .... 51

Tablo 4.8 : Değişik yıllarda Merlot üzümünden yapılan şaraplarda Putresin

Tablo 4.9 : Değişik yıllarda Cabernet Sauvignon üzümünden yapılan şaraplarda Putresin konsantrasyonları (ppm), alkol (%v/v) ve pH değerleri .... 53

Tablo 4.10 : Değişik yıllarda Shiraz üzümünden yapılan şaraplarda Kadaverin

Kadaverin konsantrasyonları (ppm), alkol (%v/v) ve pH değerleri . 56

Tablo 4.12 : Değişik yıllarda Merlot üzümünden yapılan şaraplarda Kadaverin

Tablo 4.13 : Değişik yıllarda Cabernet Sauvignon üzümünden yapılan

şaraplarda Kadaverin konsantrasyonları(ppm), alkol (%v/v) ve pH değerleri ... 57_Toc421712199

Tablo A.1 : Örneklereaithistamin, putresin, kadaverin, feniletilamin ve tiramin konsantrasyonları (ppm) ile alkolve pH değerleri… 69

(13)

xiii

SEMBOL LİSTESİ

AB : Avrupa Birliği

ABD : Amerika Birleşik Devletleri CHY : Chardonnay

CS : Cabernet Sauvignon

DAO : Diamin Oksidaz

EFSA : European Food Safety Authority

FEA : Feniletilamin

GA : Genel Asitlik

HDC : Histidin dekarboksilaz

HIS : Histamin

HPLC : Yüksek Performans Sıvı Kromatografisi

H2SO4 : Sülfirik asit KAD : Kadaverin kg : Kilogram L : Litre MER : Merlot MLF : Malolaktik Fermantasyon

MAO : Mono Amin Oksidaz

MT : Metil transferaz

nm : Nanometre

OIV : L'Organisation Internationale de la Vigne et du Vin

OPA : Ortofitaldialdehit PUT : Putresin PVP : Polivinilproliden R.G. : Resmi Gazete SHZ : Shiraz SO2-t : Toplam Kükürtdioksit TGK : Türk Gıda Kodeksi TIR : Tiramin TS : Türk Standardı UA : Uçucu Asitlik UV : Ultraviole v/v : Hacimce oran ˚C : Celcius derecesi µ : Mikro

(14)

xiv

ÖNSÖZ

Uzun yıllar boyunca araştırılırsa bir veri bankası oluşturacak bu konuda projeyi destekleyen PAUBAP’a,

Tezimin her aşamasında bilgi ve tecrübeleriyle bana yol gösteren ve daha önce araştırılmış bir konudan özgün bir çalışma ortaya çıkartılmasını sağlayan hocam Sayın Prof. Dr. Raci EKİNCİ’ye,

Araştırmam süresince yardımlarını hiçbir zaman esirgemeyen Sayın Doç. Dr. Çetin KADAKAL’ a ve laboratuvar çalışmalarımdaki desteğinden ötürü Sayın Dr. Mustafa OTAĞ’ a

Gösterdiği sabırdan ötürü eşim Ayşegül TUŞ IŞIK’a teşekkürü bir borç bilirim.

(15)

1

1. GİRİŞ

Şarap yapımı gıda muhafaza tekniği olarak medeniyet tarihiyle yaşıt bir uğraştır (Zoecklein ve diğ. 1995). Büyük bağcı ülkelerin birçoğunda bağ ekonomisinin temeli üzümün şarap olarak değerlendirilmesine dayanır (Aktan 2000).

Şekil 1.1’de dünyada bağ alanlarının durumu gösterilmiştir.

Şekil 1.1 : 2013’ de dünya ülkelerinde bağ alanlarının durumu (Aurand 2014)

OIV’nin 2014 verilerine göre Türkiye dünyada bağ alanı açısından beşinci büyük, üzüm üretimi açısından ise altıncı büyük üreticidir. Üzümün değerlendirilmesi açısından bakılırsa, yaş üzüm tüketiminde sırasıyla Çin ve Hindistan’dan sonra üçüncü sırayı alır. Kuru üzüm olarak ise ABD’den sonra ikinci büyük üretici ve ikinci büyük tüketicidir (Aurand 2014). Şekil 1.2’de 2000 ve 2013 yılları arası önde gelen üretici ülkelerin üretim miktarları gösterilmiştir.

(16)

2

Şekil 1.2 : 2000-2013 yılları arasında dünya ülkelerinin üzüm üretim miktarları

(Aurand 2014)

Tablo 1.1 : Şarap üreten ülkeler ve üretim miktarları (milyon hektolitre) (Aurand 2014)

mhl mhl mhl mhl mhl TAHMİN ÜLKELER 2010 2011 2012 2013 2014 FRANSA 44.381 50.757 41.548 42.004 46.151 İTALYA 48.525 42.772 45.616 52.429 44.424 İSPANYA 35.353 33.397 31.123 45.650 37.000 ABD 20.890 19.140 21.740 23.500 22.500 ARJANTİN 16.250 15.473 11.780 14.984 15.200 AVUSTURALYA 11.420 11.180 12.269 12.310 12.560 ÇİN 13.000 13.200 13.810 11.780 11.780 GÜNEY AFRİKA 9.327 9.725 10.568 10.980 11.420 ŞİLİ 8.844 10.464 12.554 12.846 10.029 ALMANYA 6.906 9.132 9.012 8.409 9.725 PORTEKİZ 7.148 5.622 6.327 6.238 5.886 ROMANYA 3.287 4.058 3.311 5.113 4.093 YENİ ZELANDA 1.900 2.350 1.940 2.480 3.200 YUNANİSTAN 2.950 2.750 3.115 3.343 2.900 BREZİLYA 2.459 3.460 2.967 2.710 2.810 MACARİSTAN 1.762 2.750 1.776 2.666 2.734 AVUSTURYA 1.737 2.814 2.125 2.392 2.250 BULGARİSTAN 1.224 1.237 1.442 1.755 1.229 İSVİÇRE 1.030 1.120 1.000 840 900 HIRVATİSTAN 1.433 1.409 1.293 1.249 874 264.372 267.243 256.222 287.600 270.864

(17)

3

Üzümün şarap olarak değerlenmesinde ise Fransa, İtalya ve İspanya başı çekerken şarap tüketiminde sırasıyla ABD, Fransa, İtalya, Almanya ve Çin en başta gelir (Aurand 2014). Tablo 1.1.’de dünyanın önde gelen şarap üreticisi ülkeleri ve son yılllara göre şarap üretim miktarları gösterilmiştir.

Dünyada kişi başına en fazla şarap tüketilen ülke Fransa’dır. Konu hakkında düzenli araştırmalar yürüten Wine Institute adlı kuruluşun 2012 yılı verilerine göre Fransızlar yılda ortalama 44,2 litre şarap tüketmektedir. Sıralamada Fransa’nın ardından ilk 5’te sırasıyla Slovenya (43,27 litre), Hırvatistan (42,59 litre), Makedonya (41,54 litre) ve Portekiz (40,93 litre) yer almaktadır.

Müslüman nüfusun çoğunlukta olduğu ülkelere gelince; Bosna kişi başına 10,71 litrelik tüketimle 39’uncu sırada yer almaktadır. Sıralamada Azerbaycan 41, Tunus 46, Arnavutluk 48, Lübnan 56, Özbekistan 59, Cezayir 67, Kazakistan 69, Fas 78, Katar 87, Bahreyn 90, Kosova ise 114’üncü sırada gösterilmektedir.

Türkiye ise toplam 171 ülkedeki şarap tüketimin mercek altına alındığı listede 116’ıncı sırada görülmektedir. Türkiye’de nüfusa orantılı olarak kişi başına yıllık şarap tüketiminin sadece 0,18 litre olduğu belirtilmektedir. Geçen yıl 4,01 milyon ton üzüm üreten Türkiye, bu rekoltenin sadece yaklaşık yüzde 2’sini şarap üretiminde kullanmaktadır. Türkiye’de şarap büyük ölçüde ülkenin üç büyük kentinde (İstanbul, Ankara, İzmir) ve turistik merkezlerde tüketilmektedir. Türkiye’de 2013 yılında 62,8 milyon litre şarap tüketilirken bunun yüzde 97’sini yerli şaraplar oluşturmaktadır (Karaca 2014).

Yöre (Denizli, Muğla, Aydın) Türkiye’de üzüm üretimi yapılan alanların % 10’una sahiptir ve 368.371 ton olan üzüm üretimiyle Türkiye toplam üzüm üretiminin % 8,6’sını, Ege Bölgesi üretiminin % 18,6’sını oluşturmaktadır. Bölgedeki toplam üzüm üretiminin % 41,8’i sofralık çekirdeksiz üzümdür. Bölgede yetiştirilen üzümlerin yaklaşık % 92’si Denizli’de üretilmekte ve Buldan ile Çal ilçeleri sahip oldukları % 23 ve % 22 oranlarındaki paylarıyla öne çıkmaktadır. 2009 yılı verilerine göre üzümden şarap üretimine yönelik bölgede 23 işletme faaliyet göstermekte ve bu işletmelerin 21’i Denizli’de yer almaktadır (Akar 2015).

(18)

4

Denizli’de bağcılık elverişli iklim koşulları ve toprak özellikleri sayesinde özellikle Çal, Bekilli ve Güney ilçelerinde gelişme göstermiş olup, bu ilçelerde birincil gelir kaynağı konumundadır. Çiftçilerin geçmişten gelen yöntemlerle sınırlı miktarlarda yaptıkları üretim, profesyonel ve büyük şirketlerin bu bölgedeki kaliteli üzümlerden istifade etmeleri ve modern üretim tekniklerinin kullanımıyla endüstriyel üretime dönüşmüştür (Akar 2015).

Şarapta kalitenin yanı sıra güvenilirlik (içerdiği kimyasallar ve metaller) açısından da birçok problemle karşılaşılmaktadır. Bu alanda üzümlerin tarladan toplanmasından yeni ürünün dağıtımına kadar üretimin her aşamasında problemlerin tespit edilip nedenlerinin bulunması ve ürünün nitelik ve güvenilirliğinin sağlanabilmesi için çaba sarf edilmektedir (Christaki 2002). Şaraplarda biyojen aminlerin varlığı ve bunların toksikolojik etkileri sağlık açısından önemli bir sorun oluşturabilmektedir. Biyojen aminlerin neden olduğu zehirlenmelerden en sık görüleni, histamin ve tiramin zehirlenmesidir. Biyojen aminlerin toksikolojik etkileri düşünüldüğünde, şaraplardaki biyojen aminlerin belirlenmesinin önemi de anlaşılmaktadır (Anlı ve diğ. 2004).

Tüketicilerin daha iyi ve sağlıklı ürünlere olan talebi biyojen aminler üzerine yapılan çalışmaların devam etmesine sebep olmaktadır (Funel 2001). Dünyadaki pek çok şarap üreticisi ülke ticari olarak üretilen şaraplarında biyojen amin varlığı ve konsantrasyonu ile ilgili çalışmalar yapmaktadır. Yunanistan, İspanya, Macaristan, ABD, Güney Afrika, Portekiz, Kanada, İtalya bunlardan bazılarıdır. Tüketicilerin güvenli ve sağlıklı gıdalara olan talebi insan sağlığına zararlı olabilecek bileşiklerin daha sıkı takip edilmesini teşvik etmektedir (Smit 2007). Bu sebeple biyojen aminlerin tespit edilmesi için de birçok analitik metot geliştirilmiştir. Günümüzde ise doğru ve güvenilir bir yöntem olan Yüksek Performans Sıvı Kromatografisi pek çok gıdada ve özellikle de şarap analizi için kullanılmaktadır (Funel 2001).

Özdestan ve diğ. (2006)’ nin yaptığı çalışmada piyasadan temin edilen 9 farklı şarap (4 kırmızı ve 5 beyaz) örneğinde biyojen amin analizleri gerçekleştirilmiştir. Türevlendirme reaktifi olarak ortofitaldialdehit (OPA) kullanılmış, 340 nm (uyarma) ve 420 nm (emisyon) dalga boylarında fluoresans dedektör ile yüksek performans sıvı kromatografisi (HPLC) cihazında biyojen amin analizleri gerçekleştirilmiştir. Analizler sonucunda kırmızı şaraplarda ortalama 11,81

(19)

5

mg/l etanolamin, 2,48 mg/l histamin, 0,65 mg/l metilamin, 2,17 mg/l etilamin, 10,17 mg/l tiramin, 4,99 mg/l putresin, 0,32 mg/l kadaverin bulunmuştur. Beyaz şaraplarda ise ortalama 10,75 mg/l etanolamin, 0,41 mg/l histamin, 0,93 mg/l metilamin, 1,27 mg/l etilamin, 6,62 mg/l tiramin, 0,38 mg/l triptamin, 0,14 mg/l β-feniletilamin, 1,87 mg/l putresin, 0,22 mg/l kadaverin tespit edilmiştir.

Anlı ve diğ. (2004) tarafından yapılan çalışmada dansil klorür türevlendirme ajanı olarak kullanılmış, 30 farklı kırmızı şarapta analizler gerçekleştirilmiş ve 9 farklı biyojen amin belirlenmiştir. Bu analizler sonucunda histamin düzeyi 0-1,965 mg/l arasında bulunmuştur. Putresin en fazla 1,85 mg/l, kadaverin ise en fazla 5,92 mg/l olarak bulunmuştur. Bu çalışmada kırmızı şaraplarda histamin 0-6,67 mg/l arasında bulunurken en fazla 9,25 mg/l putresin ve 0,51 mg/l kadaverin bulunmuştur. Agmatin ise kırmızı ve beyaz şarapların hiçbirinde rastlanmamıştır.

1998’de Rioja kırmızı şaraplarında biyojen amin analizleri OPA türevleri kullanılarak HPLC cihazında Vazquez-Lasa ve arkadaşları tarafından gerçekleştirilmiştir. Ortalama 8,72 mg/l histamin, 4,98 mg/l tiramin, 32,97 mg/l putresin, 0,61 mg/l kadaverin bulunmuştur (Özdestan ve diğ. 2007).

1996’da Lehtonen tarafından hazırlanan çalışmada beyaz şaraplardaki ortalama histamin konsantrasyonu 0,26 mg/l, tiramin 0,6 mg/l, putresin 1,1 mg/l ve kadaverin 0,3 mg/l olarak belirtilmiştir (Özdestan ve diğ. 2007).

Çalışmanın temel amacı potansiyel sağlık riskleri ve hijyen indikatörü olması sebebiyle Denizli İli üzümlerinden yapılan şaraplarda biyojen amin varlığının Yüksek Performans Sıvı Kromatografisi (HPLC) cihazıyla saptanmasıdır. Şaraplarda biyojen amin varlığının belirli mikroorganizmaların varlığı ile ilişkili olmasının yanı sıra başka faktörlere de bağlı olup olmadığının bu tez konusu içinde tartışılması hedeflenmektedir.

(20)

6

2. LİTERATÜR ÖZETİ

2.1 Şarap Üretimi

2.1.1 Kırmızı Şarap Üretimi

Kırmızı şarap üretimi temelinde üç ana işlem basamağından oluşur; alkol fermantasyonu, ekstraksiyon ve malolaktik fermantasyon. Bu işlemler ise dört safhada gerçekleşir:

1. Mekanik İşlemler: sap ayırma ve ezme

2. Alkol Fermantasyonu: alkol fermantasyonu ve ekstraksiyon (maserasyon) 3. Ham şarabı cibreden ayırma: presleme

4. Son dönüşümler: şeker kaldıysa alkol fermantasyonu ve malolaktik fermantasyon

Üzümler şaraphanelere değişik tipte taşıyıcılarla getirilir. Önemli olan üzümün bağdan işletmeye en kısa sürede getirilmesidir. Basit bir havuza boşaltılan üzümler genellikle bir sonsuz vida yardımıyla işleme alınır. Sap ayırıcıda üzümün danesi ve odunsu kısımları ayrılır ve üzüm danesi ezme işlemine alınır. Burada amaç danenin kabuğunun bütünlüğünü bozarak şıra çıkışını kolaylaştırmaktır. Üzümlerin alkol fermantasyonunun gerçekleşeceği kaplar çeşitlidir. Bunlar değişik hacim ve formlarda; açık, kapalı, ahşap, betonarme veya paslanmaz çelik olabilir. Tüm bu değişik form ve hacimde tanklarda fermantasyon da aynı şekilde yürümez. Ancak havalandırma, karıştırma, temizlik ve sıcaklık kontrolünün yapılabilir olması önemlidir. Fermantasyon başladıktan sonra bunu yönetmek de gerekir ki bu; mayaların şekerin tamamını alkole çevirebileceği şartları sağlamakla beraber şekerli ortamda bakteriyel gelişmenin önlenmesi demektir. Ürün kükürtlenir ve soğutmayla beraber kontrollü bir fermantasyon gerçekleşmesi sağlanır. Kırmızı şarap üzümün şırasının yanı sıra katı kısımlarından da bir takım maddeler ekstrakte edilerek yapılır. Şarap yapımındaki maserasyon terimi de kısmi bir ekstraksiyonu ifade eder.

(21)

7

Çekirdek ve kabuktan istenilen lezzet ve renk elde edildiğinde ekstraksiyon biter. Bu işlem kırmızı şaraba renk, tanen ve aromadan oluşan spesifik karakterini verir. Ham şarabın bir kısmı kaptan kendiliğinden ayrılır. Bir kısmı ise cibre tarafından tutulur. Presleme işlemi cibrenin tuttuğu şırayı ayırmak içindir (Peynaud 1984). Şekil 2.3 ‘de kırmızı şarap yapımı için genel bir iş akım şeması gösterilmiştir.

Şekil 2.1 : Kırmızı şarap üretimi akış şeması

2.1.1.1 Malolaktik Fermantasyon

Kırmızı şarap fermantasyon tankından alındıktan sonra genellikle henüz bitmemiştir. Şekerin alkole göreceli olarak hızlı bir dönüşümünden sonra daha yavaş fakat kalite için önemli bir aşamaya geçilir. Sakin geçen bir süreden sonra şarap yapımcılarının deyimiyle “tekrar çalışmaya başlar”. İkincil fermantasyon süreci düzgün yürütüldüğünde kalite ve biyolojik stabilizasyona büyük katkısı vardır (Peynaud 1984).

(22)

8

Malolaktik fermantasyon aslında terim olarak doğru değildir. Çünkü malolaktik fermantasyon sırasında gerçekleşen malik asidin laktik aside dönüşümü fermantatif bir yol olmayıp, dekarboksilasyondur. Bu isim yalnızca alkol fermantasyonuna benzetmek için verilmiştir. Çünkü her iki aşamada da gaz (CO2) çıkışı meydana gelir (Geredeli ve Anlı 2005). Malolaktik fermantasyonda en önemli olay; laktik asit bakterileri tarafından dikarboksilik asit olan bir molekül L-malik asidin, mono karboksilik asit olan bir molekül L-laktik aside ve 1 molekül CO2'e dönüştürülmesi sonucunda asitliğin biyolojik olarak azalmasıdır. Malolaktik fermantasyon süresince malik asidin tamamı indirgenir ve bu da şarabın pH’ının yükselmesi ve tadının değişmesine yol açar (Demiray 2006). Laktik asit bakterilerinin metabolizmalarında kullandıkları ana substratlar malik asit, sitrik asit ve mayalardan arta kalan şekerlerdir (heksozlar ve pentozlar). Şekerler (glukoz, fruktoz, ksiloz ve arabinoz) laktik asit, asetik asit, etil alkol ve CO2'e katabolize olurken, sitrik asit ise asetik asit ve karbonil maddelere, özellikle tereyağı tadına sahip diasetile dönüşür. Ayrıca bakterilerin şarap fenol bileşenleri (tanen, antosiyan) üzerindeki aktiviteleri sonucu, şarabın tadı ve rengi de değişikliğe uğrar (Geredeli ve Anlı 2005).

2.1.2 Beyaz Şarap Üretimi

Beyaz şarap ekstraksiyon işlemi olmadan üzümün şırası fermantasyona uğratılarak yapılır. Ekstraksiyon istenmediği için kırmızıdan farklı olarak presleme ve şıranın ayırılması sonda değil en başta yapılır. Mekanik işlemler kırmızı ile aynı olsa da şarap yapımcıları ürünün hassasiyetinden dolayı beyaz üzümün mekanik işlemlerinde daha özenli davranmak zorundadırlar. Preslemeden sonra şırada çözünmeyen maddelerin yüksek konsantrasyonundan dolayı bir ön çöktürme ya da durultma ajanıyla muameleden sonra fermantasyona geçilir. Bu arada geçen sürede oksidasyonu engelleyici tedbirler almak önemlidir (Peynaud 1984). Şekil 2.4 ‘de beyaz şarap yapımı için genel bir iş akım şeması gösterilmiştir.

(23)

9

Şekil 2.2 : Beyaz şarap üretimi akış şeması

2.1.3 Roze Şarap Üretimi

Roze şarapları sadece rengiyle tanımlamak doğru olmaz. Bu, ekstraksiyonla yapılan kırmızı ve cibreyle hiç teması olmayan beyaz arasında bir stildir. Kırmızıya benzerliği bir miktar antosiyanin içermesi, beyaza benzerliği ise hafifliği, meyvemsiliği ve biraz benzer bir yapım tekniği olmasıdır. Kırmızı üzümlerin beyaz gibi işlenmesiyle yapılabildiği gibi çok kısıtlı bir maserasyonla da elde edilebilirler. Şıra elde edildikten sonra alkol fermantasyonu beyaza yakın sıcaklık bölgelerinde yani 20 0C altında yapılır (Peynaud 1984).

2.2 Biyojen Aminler

Üzümden şarap yapılırken temel olarak iki fermantasyon adımından söz edebiliriz. İlki Saccharomyces cerevisiae şarap mayası tarafından üzüm şekerinin alkol ve CO2’ye dönüşümüyle gerçekleşen alkol fermantasyonu; ikincisi ise laktik

(24)

10

asit bakterilerince L-malik asidin L-laktik aside dönüşmesiyle ortamda asitlik azalmasına neden olan malolaktik fermantasyondur. Bu ikincisi çoğu kırmızı şaraba ve bazı beyazlara uygulanır ve şarabın mikrobiyal stabilitesine katkı yapar. Bu iki fermantasyonda da temel metabolik ürünlerin yanında bir de ikincil ürünler ortaya çıkar. Bunlardan kükürt dioksit, okratoksin-A, etil karbamat ve biyojen aminler insan sağlığına etki edenlerdir. Bu bölümde biyojen aminlerin özellikleri, oluşumu ve oluşumuna etki eden faktörler irdelenecektir.

2.2.1 Biyojen Aminlerin Kimyası

Biyojen aminler yüksek konsantrasyonları hayvan ve insanlarda dolaşım ve merkezi sinir sistemini etkileyen, biyolojik olarak aktif; bitkisel ya da mikrobiyal enzimler ile öncülü olan aminoasitlerin dekarboksilasyonu sonucu oluşan, düşük molekül ağırlıklı moleküllerdir (OIV 2011).

Biyojen aminler temel olarak aminoasitlerin dekarboksilasyonu veya aldehit ve ketonların aminasyonu ve transaminasyonu sonucu oluşmaktadırlar (Yeğin 2006). Şekil 2.3’de biyojen aminlerin oluşum reaksiyonları gösterilmiştir.

Şekil 2.3 : Biyojen amin oluşumu (Yeğin 2006)

Aminoasitlerden karbondioksitin ayrılmasıyla söz konusu aminoasidin amini oluşmaktadır. Aminoasitlerden karbondioksitin ayrılmasına dekarboksilasyon, ayrılmasını katalizleyen enzime de dekarboksilaz adı verilir. Dekarboksilasyondan

(25)

11

sorumlu dekarboksilazlar, hem hayvansal ve bitkisel dokular hem de mikroorganizmalar tarafından oluşturulabilirler. Çeşitli bakteri türlerinin aminoasitleri dekarboksile etme kabiliyetleri de farklıdır. Bazı türler birçok aminoasidi dekarboksile ederken bazıları ise substrata özel dekarboksilaz aktivitesine sahip olup yalnız bir tek aminoaside etki ederler (Yerlikaya ve Gökoğlu 2002). Şekil 2.4’de şaraplarda sık görülen bazı biyojen aminlerin kimyasal formülleri gösterilmiştir.

Şekil 2.4 : Şaraplarda sıklıkla görülen bazı biyojen aminlerin kimyasal formülleri

(EFSA 2011)

Biyojen aminler üç gruba ayrılırlar:

1) İnsan sağlığı için toksikolojik etkileri bilinen histamin, tiramin, 2-feniletilamin, triptamin gibi aromatik ve heterosiklik aminler,

(26)

12

2) Varlığı, mikrobiyal aktivitenin artmasına sebep olan düşük sanitasyon koşullarında yapılan üretimle bağdaştırılan etanolamin, putresin, kadaverin, agmatin, spermidin, spermin gibi alifatik mono, di- poliaminler,

3) İnsan vücudunda toksik etkisi olmayan fakat gıdanın duyusal karakterine katkı yapan etilamin, metilamin ve isoamilamin gibi alifatik uçucu aminler (Galgano ve diğ. 2009).

2.2.2 Biyojen Aminlerin Toksikolojik Etkileri

Yüksek konsantrasyonda biyojen amin içeren yiyecek ve ya içecekler vücuda alındığında bu bileşiklerin doğrudan toksik etki göstermesi, bazı medikal uygulamalarla ilişkileri nedeniyle insan sağlığına zarar vermesi, kalite indikatörü olarak düşünülmesi ve bazı gıdaların kabul edilebilirliğinin bir belirleyicisi olması nedeniyle biyojen aminler gıda güvenliği açısından birinci derece öneme sahiptirler (EFSA 2011).

Biyojen aminler yiyecek ve içeceklerde istenmezler çünkü çok yüksek konsantrasyonlarda absorbe edilirlerse baş ağrısı, solunum bozuklukları, çarpıntı, düşük ya da yüksek tansiyon ve bir dizi alerjik reaksiyona sebep olurlar (Funel 2001).

2.2.2.1 Histamin

2.2.2.1.1 İnsan Vücudunda Sentezi ve Metabolizması

Histamin L-histidin dekarboksilaz aktivitesi sonucu histidin aminoasidinden sentezlenir. Diaminoksidaz (DAO) aktivitesiyle de oksidatif deaminasyona uğrayarak metabolize olabilir. Beslenmeyle yüksek dozda alınan histamin ve DAO’ın düşük aktivite göstermesi kanda yüksek histamin seviyelerine neden olur. Bazı ilaçlar ve alkol DAO aktivitesini azaltabilir (EFSA 2011).

(27)

13

2.2.2.1.2 Fizyolojik Görevi

Histamin insan vücudunda düşük seviyelerde bulunur. Nörotransmisyon ve vasküler geçirgenlik gibi kilit fonksiyonlara katılır. Biyojen aminlerin vücut sıcaklığının dengelenmesi, mide hacmi, mide pH’ı ve beyinsel aktivitelerin düzenlenmesi ile ilgili de görevleri vardır (Smit 2007). Buna ilave olarak alerjik reaksiyonların başlamasında da rol oynar (EFSA 2011).

2.2.2.1.3 Toksik Etkileri

Beslenme ile alınan histamin, zayıf etkili olmakla birlikte hangi dozunun toksik olabileceği belirsizlik taşımaktadır. Hayvanlar üzerinde yapılan çalışmalarda özellikle alkollü içkilerde, alkolün histamin absorbsiyonunu hızlandırması nedeniyle tehlikeye yol açtığı ortaya konulmuştur. Ayrıca alkol ve bunun metabolizma ürünü olan aldehit, Monaaminoksidaz-inhibitörü (MAO-inhibitörü) olarak bilinmekte olup, doku içinde biyojen aminlerin indirgenmesini zorlaştırdığı da ifade edilmektedir. İnsan vücudunun kontrol mekanizması, aminlerin oluşturduğu tehlikeleri önlemede ihtiyaca cevap verebilmektedir. Histaminin kontamine kırmızı şarap tüketimi ile fizyolojik problemlere sebep olabilen önemli bir etken olduğu ifade edilmektedir (Gürbüz 2002).

Sağlıklı kişilerde besinler yoluyla alınan histamin amin oksidaz aktivitesi sonucu hemen detoksifiye edilir fakat bazı balık türleri ya da olgun peynirler gibi gıdalar ile yüksek miktarlarda alınırsa histamin intoksikasyonunun şiddetli belirtileri görülebilir. Diaminoksidaz (DAO) aktivitesinin genetik, gastrointestinal hastalık ya da DAO inhibitörü içeren ilaç kullanımı sonucu bozulması, histamin fazlalığı ile küçük miktarlarının bile alerjik reaksiyona sebep olduğu histamin intoleransına yol açar. İntoksikasyonun karakteri birkaç dakikadan saatlere kadar uzayabilen bir inkübasyon periyodunun olması ve semptomların sadece birkaç saatliğine görülmesidir (EFSA 2011).

(28)

14

Histamin zehirlenmesinin semptomları baş ağrısı, burun akıntısı, bronş spazmı, taşikardi, düşük tansiyon, ödem, ürtiker, kusma ve astım olabilmektedir (EFSA 2011).

Gıdalarla alınan histamin DAO yetersizliği nedeniyle hassas olan bünyelerde migrenin de sebeplerinden biridir. Histamin bakımından zengin olan gıdalar migren hastalarının baş ağrısını tetiklerken histamin içermeyen diyetler ise migren ağrılarını sakinleştirmektedir (EFSA 2011).

Histamin ve diğer biyojen aminler şarap intoleransının en önemli nedenidir. Menne ve diğ. (2001) yaptığı çalışmada 20 mg/l histamin içeren köpüklü şaraptan 0,2 litre tüketerek alınan 4 mg histaminin hassas bünyelerde histamin intoleransını tetiklediği belirtilmiştir (EFSA 2011).

2.2.2.2 Tiramin, Feniletilamin ve Triptamin

“İz aminler” olarak da bilinen bu aminler insan vücudunda ilgili aminoasitlerinden (sırasıyla; tirosin, fenilalanin ve triptofan) dekarboksilasyon yoluyla sentezlenirler (EFSA 2011).

İz aminlerin şizofreni, depresyon, dikkat eksikliği ve Parkinson hastalığı gibi rahatsızlıklarda rol oynadığı düşünülmektedir. İz aminlerin aksiyon metabolizması nerede bulunduğuyla ilgilidir. İz aminler beyinde, vazokonstrüksiyon ve geçici yüksek tansiyona sebep olan noradrenalin salgılanmasında görev alırlar (EFSA 2011).

(29)

15

Tiramin, feniletilamin ve triptaminin vazokonstrüksiyon etkisi yüksek tansiyona yol açmaktadır. Baş ağrısı, hızlı solunum, kusma ve benzeri etkileri de kaydedilmiştir (EFSA 2011). Klinik semptomlar 30 dakika ile birkaç saat içinde kendini gösterirken tamamen kaybolması 24 saati bulmaktadır (EFSA 2011).

2.2.2.3 Putresin ve Kadaverin

Hayvanlarda ve mikroorganizmalarda putresin oluşumu için ornitin aminoasidi ve ornitin dekarboksilaz enzimi gereklidir. Alternatif olarak agmatin ve karbamilputresin yolu üzerinden argininden de üretilebilir (EFSA 2011).

Lisin aminoasidi ise lisindekarboksilaz ile dekarboksile olarak kadaverin meydana getirir (EFSA 2011).

Putresin; spermidin ve spermin gibi fizyolojik poliaminlerin öncülü rolündedir ve bunlar hücre büyümesi, hücre bölünmesi ve tümör oluşumunda yer alırlar. Kadaverinin görevleri hakkında daha az bilgimiz olsa da diamin ve poliaminlerin oluşumuna katkısı vardır. Bazı sistemlerde pasif difüzyon yoluyla putresin ile yer değiştirebildiği bildirilmiştir (EFSA 2011).

Putresin ve kadaverinin farmakolojik etkileri histamin ve tiramine göre çok düşük seviyededir. Bilinen etkileri düşük tansiyon, düşük kalp ritmi ve çene kilitlenmesidir. Putresin ve kadaverinin gıdalarla alımının en önemli etkisi başta histamin olmak üzere diğer aminlerin toksisitesini arttırmasıdır. Bunun yanında bu

(30)

16

aminler nitrit ile reaksiyona girerek karsinojen olduğu bilinen nitrosaminlere dönüşebilirler (EFSA 2011).

2.2.2.4 Biyojen Aminlerin Toksik Potansiyelleri

Biyojen aminlerin toksik etkilerini değerlendirirken alınan gıdanın miktarı, toplam biyojen amin konsantrasyonu, etanol ve uyuşturucu kullanımı da göz önünde bulundurulmalıdır (Funel 2001).

Monoaminoksidazlar ve diaminoksidazlar birden fazla biyojen amini metabolize edebilirler. Bundan dolayı gıdalarla alınan biyojen aminlerin parçalanması bunların sayısı ve konsantrasyonu ile ilgilidir. Bununla beraber tüketicinin hassasiyeti ve sağlık durumu da önemli bir konudur (EFSA 2011).

2.2.2.5 Biyojen Amin Hassasiyetini Arttıran Faktörler

Biyojen aminlere karşı yüksek hassasiyet genellikle enzimatik amin parçalanmasının zayıflığından ileri gelmektedir. Gıda alerjisine sahip kişilerin bağırsaklarındaki ortalama DAO aktivitesinin sağlıklı kişilere göre daha düşük olduğu saptanmıştır. Histamin intoleransı olan hastalarda da DAO aktivitesinin ve/veya DAO enziminin düşüklüğünden dolayı histaminin yıkımının daha zayıf olduğu belirtilmiştir. Nüfusun %1’inde histamin intoleransı görülmekle beraber bu sayının %80’ini orta yaşlı kadınların oluşturduğu tahmin edilmektedir. Kronik ürtiker, egzama, solunum ve dolaşım yolu problemi, hipertansiyon veya B6 vitamini eksikliği olan kişilerin de düşük biyojen amin dozlarına karşı hassasiyet riski olduğu, bunun yanında gastrointestinal problemi olan hastaların da bağırsaklarda oksidaz enzimi aktivitesinin düşüklüğünden dolayı risk altında olabileceği belirtilmiştir (EFSA 2011).

Aminlerin eliminasyonunu engelleyen MAO ve DAO baskılayıcı içeren ilaçlar kullanan stres, depresyon, Alzheimer ve Parkinson hastaları etkileri geçici olsa da biyojen aminlerden etkilenirler. Sigara kullanımı da MAO seviyesini %40’a

(31)

17

kadar azaltmakta ve ayrıca sigaradaki bazı maddelerin MAO enzim aktivitesini engelleyici olduğu bilinmektedir (EFSA 2011).

2.2.2.6 Biyojen Aminlerin Detoksifikasyonu

Biyojen aminler önemli fizyolojik süreçlere dahil olmasına rağmen yüksek seviyeleri insan sağlığı için tehdit oluşturur. Burada önemli olan bunların birikimini önlemesi için detoksifikasyon sisteminin doğru çalışmasıdır. Biyojen aminlerin katabolik yolu genellikle MAO ve DAO enzimleri ile düzenlenir. Alternatif olarak histamin ve triptamin spesifik amin metiltransferazlar (MT) ile uzaklaştırılır.

Fermente içecekler gıda maddeleri arasında belirgin miktarda biyojen içermesi açısından önemli bir kategoridir. Alkol monoaminoksidazlar için inhibe edici özellikte olduğundan biyojen aminlerin fermente içeceklerdeki kontrolü tüketici sağlığı açısından önem arz etmektedir. Şaraptaki biyojen aminler ise aynı zamanda ticari olarak ithalat ve ihracat işlemlerinde bazı zorlukları beraberinde getirmektedir (Russo ve diğ. 2010).

Memelilerde biyojen aminlerin detoksifikasyon sistemi, ilgili aldehit amonyak ya da hidrojen peroksidi oluşturacak aminlerin oksidatif deaminasyonunu katalizleyen aminooksidazlarla düzenlenir. Bu aldehitler hücre içi aldehidrojenazlar ile derhal aminoasit ve laktama dönüştürülür. Bu iz yolu “bitirici iz yolu” olarak adlandırılır çünkü meydana gelen maddelerden hiçbirisi tekrar poliaminlere dönüşemez. Bu aşamadan sonra poliaminlerin tüm türevleri ürinin bileşimine girerler (Wunderlichova ve diğ. 2014).

2.2.3 Şarapta Biyojen Aminlerle İlgili Yasal Düzenlemeler

İnsanlarda biyojen aminlerin neden olduğu intoksikasyon düzeyini belirlemek oldukça güçtür. Çünkü bu durum kişilerin duyarlılığına ve diğer aminlerin varlığına bağlıdır. Öğün başına 40 mg biyojen amin alımı potansiyel toksik olarak rapor edilmiştir. Tüm biyojen aminler aynı toksik etkiye sahip olmadıklarından histamin, tiramin ve 2-feniletilamin düşünülerek bu genelleme yapılmıştır. Bu nedenle ABD,

(32)

18

İsveç, Avusturya ve Hollanda gibi ülkeler çeşitli gıdalarda biyojen aminler özellikle histamin için maksimum limit değerlerini içeren düzenlemeler yapmıştır (Özdestan ve Üren 2012).

23/09/2002 tarih ve 24885 sayılı Resmi Gazete’de yayımlanan “TGK Gıda Maddelerinde Belirli Bulaşanların Maksimum Miktarlarının Belirlenmesi Hakkında Tebliğ” de şaraplarda bozulma indikatörü olarak açıklanan histamin için 10 mg/kg sınır degeri vardır (Anonim 2002). 17/05/2008 tarih ve 26879 sayılı Resmi Gazete’de yayımlanarak yürürlüğe giren “TGK Gıda Maddelerindeki Bulaşanların Maksimum Limitleri Hakkında Tebliğ (2008/26) ile bu değer mevzuattan kaldırılmıştır (Anonim 2008).

Türkiye’de konuyla ilgili tek yasal düzenleme 29/12/2011 tarih ve 28157 sayılı Resmi Gazete’de yayımlanarak yürürlüğe giren TGK Mikrobiyolojik Kriterler Tebliği olup balık ve balık ürünlerinde histamin için limitleri belirtmektedir (Anonim 2011).

Gıdalarda biyojen aminlerle ilgili düzenlemelere bakıldığında histamin için sınır değeri olarak m (histamin) / m (gıda) = 100 mg/kg ve m (histamin) / V (alkollü içecek)=2 mg/l olarak önerilmektedir (Özdestan 2009).

Günümüzde Avrupa Birliği (AB) de şarap endüstrisinde biyojen aminlerle ilgili bir düzenleme yapmamıştır ancak “güvenli eşik değerleri” önermiştir (Milicevic ve diğ. 2014). EFSA (2011)’ e göre toksik olan biyojen aminlerin gıdalarla alınan miktarları için eşik değerler; histamin için kırmızı şaraplarda 50 mg/ kg gıda, beyaz şaraplarda 33 mg/kg gıda ve tiramin için kırmızı şarapta 600 mg/kg gıda , beyaz şarapta 400 mg/kg gıda’dır. AB’de gıdalardaki biyojen aminlerle ilgili mikrobiyal kriterleri de içeren tek spesifik düzenleme balık ürünlerinde histamini kapsamaktadır Daha önce çeşitli gıdalarla yapılan çalışmalarda 100-800 mg/kg değeri tiramin için esik doz olarak rapor edilirken, 1000 mg/kg seviyesinde toplam biyojen amin içeren gıda maddelerinin vücuda alınmasının insan sağlığı için tehlike taşıdığı ifade edilmiştir. Diğer taraftan bazı çalışmalarda, gıdalarda üst sınır olarak 100-200 mg/kg aralığında toplam biyojen amin konsantrasyonunun kabul edilebilir olduğu bildirilmektedir (Yeğin 2006).

(33)

19

2.2.4 Biyojen Aminler ve Mikroorganizmalar

Mikroorganizmaların metabolik aktivitesi fermente yiyecek ve içecek ürünlerinin doğal saklanabilmesi, hijyenik güvenliği, duyusal özellikleri ve besin değerini arttırılması gibi istenen özelliklerin yanı sıra biyojen aminler gibi arzu edilemeyen bazı maddelerin oluşumuna da neden olabilmektedir (Romano ve diğ. 2007).

2.2.4.1 Laktik Asit Bakterileri

Laktik asit bakterileri genellikle güvenilir kabul edilen meyve suyu ve şarapta da gelişebilir ve metabolik aktivitesiyle biyojen amin oluşumunda bir artışa neden olabilir (Arena ve Manca de Nadra 2001).

Laktik asit bakterileri sağlıklı üzümlerde az sayıda bulunur ve alkolik fermantasyon süresince popülasyonu önemli oranda düşer. Bunun yanında laktik asit bakterileri şaraphanedeki ekipmana da bulaşır ve buralarda ciddi seviyelerde bulunabilir. Oenococcus oeni alkolik fermantasyonun sonuna kadar varlığını sürdüren ve malolaktik fermantasyona da neden olan baskın türdür. Ne var ki eğer şarapta pH 3,5’den büyük ise adı genellikle bozulma ile beraber anılan Pediococcus ve Lactobacillus türleri de canlılıklarını sürdürür (Smit ve diğ. 2008).

2.2.4.1.1 Histamin Üreten Laktik Asit Bakterileri

Şaraplarda yüksek histamin seviyeleri Pediococcus ile ilişkilendirilmektedir. Pediococcus şarapta genellikle çok düşük oranda bulunur. Son yıllarda bazı Oenococcus oeni suşlarının şarapta histamin birikimine neden olduğu belirlenmiştir. (Guerrini ve diğ. 2002). Şarabın bakteri popülasyonu değişik laktik asit bakterisi türlerinin (Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus ve Oenococcus) kompleks bir karışımıdır. Oenococcus oeni malolaktik fermantasyon sonrasında en baskın türdür. Landate ve diğ. (2005) yaptıkları çalışmada Oenococcus oeni, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus mali, Leuconostoc mesenteroides ve Pediococcus parvulus’un şarapta histamin sentezine katılabildiğini fakat yüksek histamin

(34)

20

konsantrasyonundan (>10 mg/l) sorumlu olan ana türün Lactobacillus hilgardii ve Pediococcus parvulus olduğunu belirtmiştir.

2.2.4.1.2 Tiramin ve Feniletilamin Üreten Laktik Asit Bakterileri

Şaraptaki laktik asit bakterileri arasında tiramin ve feniletilamin oluşturma yeteneği fazla yoktur. Yapılan çalışmada şaraptan izole edilen Lactobacillus brevis ve bazı Lactobacillus hilgardii suşlarının tiramin ürettiği belirlenmiştir. Ayrıca Oenococcus oeni, Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus plantarum ve LACTOBACİLLUS casei suşlarının şarapta tiramin üretemediği görülmüştür. (Landate 2007).

2.2.4.1.3 Putresin ve Kadaverin Üreten Laktik Asit Bakterileri

Putresin ve kadaverin üretimi temel olarak bozulma indikatörü olarak anılan Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae ve Shewanellaceae ailesinden gram-negatif bakterilere bağlıdır. Citrobacter, Klebsiella, Escherichia, Proteus, Salmonella ve Shigella gıdalarda fazla miktarda putresin ve kadaverin üretebilmektedirler (EFSA 2011).

Spontane malolaktik fermantasyona uğrayan kırmızı şaraplardaki temel biyojen amin olan putresin toksik etkisi ve şarap lezzetini değiştirmesi nedeniyle ekonomik kayıplara ve sağlık sorunlarına yol açmaktadır (Beneduce ve diğ. 2010).

Putresin, malolaktik fermantasyonda baskın tür olan Oenococcus oeni ve alkolik fermantasyon sırasında Lactobacillus hilgardii ve Lactobacillus plantarum türlerinin bazı suşlarınca üretilmektedir (EFSA 2011).

2.2.4.1.4 Laktik Asit Bakterilerinin Biyojen Amin Üretimiyle İlgili Çalışmalar

Şaraptaki biyojen amin üretimi ile şarap yapım prosesindeki laktik asit türleri ilişkiyi saptamak için ileri araştırmalar da yapılmıştır. Geçmişte, bozulma etmeni

(35)

21

bakteriler; özellikle de Pediococcus cerevisiae şaraptaki histamin üretiminin sorumlusu olarak görülmekteydi (Smit ve diğ. 2008). Landete ve arkadaşları tarafından yürütülen son araştırmalar Pediococcus türlerinin yüzdesinin histamin üretme kapasitesi düşük gözükse de bazı suşlar en yüksek histamin konsantrasyonlarını ürettiğini göstermiştir (Landate ve diğ. 2008). Genellikle Lactobacillus, Leuconostoc ve Oenococcus türlerinin şaraptaki biyojen amin üretimine katıldıkları bilinir. Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus brevis ve Lactobacillus mali’nin değişik suşları şarapta çeşitli biyojen aminler meydana getirmiştir (Smit ve diğ. 2008; Landate ve diğ. 2008). 2003 senesine gelinceye kadar Leuconostoc suşlarının şaraptaki biyojen aminlerin oluşumundaki rolüne dair bir bulgu bulunmamaktadır. Moreno-Arribas ve arkadaşları Leuconostoc mesenteroides’in yüksek oranda tiramin üretme potansiyeli olduğunu göstermiştir (Moreno-Arribas ve Polo 2009). Landete ve arkadaşları aynı türün şaraptan izole edilen bir başka suşunun göreceli olarak yüksek oranda histamin ürettiği tespit edilmiştir (Landate ve diğ. 2008).

Ticari Oenococcus oeni suşları aminoasit dekarboksilazın olmamasının da dahil olduğu önolojik parametreler göz önünde tutularak seçilir. Moreno-Arribas ve arkadaşlarının yürüttüğü çalışmalar göre incelenen dört malolaktik starter kültürden hiçbirisi histamin, tiramin ve ya putresin üretmediği rapor edilmiştir (Moreno-Arribas ve Polo 2009).

Martín-Álvarez ve arkadaşları starter kültür inokule edilmiş ve spontane olarak malolaktik fermantasyon gerçekleştirmiş 224 İspanyol şarabını karşılaştırmış ve Laktik asit bakterisi inokule edilen şarapların spontane malolaktik fermantasyon gerçekleştirenlere oranla daha az biyojen amin içerdiğini saptamışlardır. Starter kültür kullanımı doğal florayı elimine edip istenmeyen suşların ürettiği biyojen aminleri en aza indirdiği belirtilmiştir (Moreno-Arribas ve Polo 2009).

Moreno-Arribas ve arkadaşları 2003’de yaptıkları çalışmada HPLC kullanarak 39 suşu denemiş ve biyojen amin üretimi gözlememişlerdir. Benzer sonuçları Straub ve arkadaşları 1995’de 88 Oenococcus oeni suşu üzerinde çalışarak elde etmişlerdir. Costantini ve arkadaşları 2006'da 92 farklı suşla denemiş ve besiyerinde biyojen amin üretimi olmadığı tespit edilmiştir (Moreno-Arribas ve Polo 2009).

(36)

22

Tersine olarak Guerrini ve arkadaşları 2002’de yaptıkları çalışmayla O.oeni’nin değişik suşlarının şarapların toplam biyojen amin içeriğine belirgin katkı yaptığını ortay koymuşlardır. 44 farklı suştan 26 sının optimum büyüme koşullarında 33 mg/L üzerinde histamin üretme yeteneğine sahip olduğu görülmüştür. Putresin ve kadaverin de bazı suşlarca üretilmiştir (Moreno-Arribas ve Polo 2009).

Guerrini ve arkadaşları Fransa’nın güneybatısından 118 şarabı test etmiş ve neredeyse yarısının değişen miktarlarda histamin ve Oenococcus oeni türüne ait histidin dekarboksilaz pozitif bakteriler içerdiğini saptamışlardır. Buradan hareketle laktik asit bakterilerinin amin üretimi suşa bağımlı görünmekte ve türe ait spesifik bir özellik olmadığı görülmektedir. Dekarboksilaz aktiviteleri Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus ve Oenococcus’un değişik türleri arasında rastgele dağılmış olabilir. Bazı laktik asit bakteri suşları simultane olarak değişik aminler üretme yeteneğine sahiptir (Moreno-Arribas ve Polo 2009). Literatüre göre sadece histidin-, tirosin- ve ornitin –dekarboksilaz aktiviteleri olan laktik asit bakteri suşları şaraptan izole edildiği gözlenmiştir (Funel 2001).

2.2.4.2 Asetik Asit Bakterileri

Şıra ve şaraptan izole edilen asetik asit bakterilerinin 40 suşu Landete ve arkadaşları yaptıkları çalışmada histamin, tiramin, feniletilamin, putresin, kadaverin ve triptamin oluşturma kabiliyetleri açısından sentetik besiyeri ve şarapta incelenmiş fakat pozitif sonuçlar elde edilmemiştir (Landate ve diğ. 2008).

2.2.4.3 Mayalar

Endüstriyel S. cerevisiae suşları yanında çok geniş çeşitlilikteki endojen maya türleri de şarapta gelişebilir ve alkol fermantasyonunu gerçekleştirebilir. Mayaların biyojen amin oluşturmasıyla ilgili bazı çalışmalar yapılmıştır ve bunların çoğu değişik maya türlerini birbiriyle karşılaştırmış ve histamine odaklanmışlardır (Smit 2007).

(37)

23

2005 yılında Granchi ve arkadaşları spontane ve maya inokule edilmiş endüstriyel vinifikasyon da dahil olmak üzere mayaların alkol fermantasyonunu domine ettikleri aşamada başta putresin olmak üzere biyojen aminlerin azaldığı saptamışsa da çalışmacılar alkolik fermantasyonla biyojen amin konsantrasyonunda kayda değer bir artış olmadığını rapor etmişler ve sonuçta ticari amaçlı üretilen endüstriyel şaraplardaki biyojen aminlerin kaynağının mayalar olmadığı vurgulamışlardır (Marcobal ve diğ. 2006).

Mayaların biyojen amin üretimine katkısı dolaylı yoldan olabilmektedir: Mayalar şıranın bileşimini alkol fermantasyonu ve otoliz sırasında ortama aminoasitler ve bazı diğer maddeler vererek değiştirmekte, böylece şarapta ilerleyen fermantasyon adımlarında diğer mikroorganizmalarca kullanılabilecek aminoasitlerin ön maddelerinin konsantrasyonları değişmektedir (Smit 2007).

2001 yılında Goñi ve Ancín Azpilicueta farklı S. cerevisiae suşlarıyla roze şaraplarda oluşan biyojen amin konsantrasyonlarını incelemişlerdir. Suşa bağlı olarak biyojen amin (putresin, spermin, spermidin, feniletilamin ve tiramin) miktarında hafif bir artış bulmuşlardır. Bu çalışmada biyojen amin konsantrasyonlarında görülen değişim mayaların azot kaynağı olarak aminleri kullanmasından kaynaklanmıştır. 2002’de Torrea ve Ancín çalışmayı ileriye taşıyarak inokule şıralardan yapılan şaraplardaki biyojen amin konsantrasyonunun spontane fermantasyonla yapılanlara göre daha yüksek olduğu tespit etmiştir. Bu sonucu fermantasyon sırasında aminoasit öncüllerinin endüstriyel mayalarca daha fazla tüketilmesine ve spontane fermantasyonlardaki düşük maya konsantrasyonlarına bağlamışlardır. 2002’de Caruso ve arkadaşları tarafından yürütülen bir çalışmada üzümlerden izole edilen 5 farklı çeşitten 50 maya suşu biyojen amin üretimlerine bakılmak üzere gözlenmiştir. S.cerevisiae ve takiben B. bruxellensis en yüksek konsantrasyonda toplam biyojen amin üretmiştir (Smit 2007).

S. cerevisiae’nın biyojen amin oluşturma yeteneği suşa bağlı gözükmekte ve türün sabit bir karakteristiği olmadığı görülmektedir. S. cerevisiae’nın bazı suşları özellikle de spontane alkolik fermantasyonlarda yer alanlar biyojen amin üretme yeteneklerinden dolayı şarabı bozan mikroorganizma olarak kabul edilmektedirler (Smit 2007).

(38)

24

S. cerevisiae sadece istenilen teknik özelliklerin kazandırılması için değil, insan sağlığına potansiyel olumsuz etkileri önlemek için de tercih edilir. Bu ikinci özellik düşük amin üretimi gibi ilave suş karakterlerini de maya seçim programına dahil etmeye teşvik eder. Sonuç olarak tüketici sağlığını korumaya katkı sağlamak için S. cerevisiae suşlarının biyojen amin oluşumuyla ilgili karakterizasyonu starter kültür seçiminde uygulanabilir (Caruso ve diğ. 2002).

2.2.4.4 Küfler

Asmada Botrytis cinerea gibi küflerden kaynaklı biyotik stres üzüm danesinde amin içeriğinin artmasına sebep olabilir. B. cinerea Macar Tokay şarabının ününün sebebidir. Üzüm danesinin kabuğundan geçer ve üzüm kompozisyonunu belirgin şekilde değiştirir; daneden su uzaklaşırken aminoasit ve karbonhidrat konsantrasyonu artar ve üzüm kuru üzüme benzer. Bu şaraplardaki amin konsantrasyonu normal şaraplara göre yüksektir. 2007’de Marques ve arkadaşları yaptıkları çalışmada carbendazym, iprodione ve procymidone fungisitlerinin biyojen amin varlığına olan etiklerini araştırmış, fungisit uygulanmayan kontrol şarabının malolaktik fermantasyon sonunda en yüksek konsantrasyonda biyojen amin içermekte olduğunu görerek fungal metabolik aktivitenin doğrudan biyojen amin oluşumunda katkı sağladığı ve sağlıklı üzüm florasında olmayan bakterilerin faaliyetine yol açtığı sonucuna varmışlardır (Smit 2007).

2.2.5 Biyojen Amin Oluşumunu Etkileyen Faktörler

Şaraplarda aminoasit ve biyojen amin içeriği üzüm danesinden kaynaklanabildiği gibi dekarboksilaz pozitif mikroorganizmaların istenmeyen aktivitesi sonucu fermantasyon prosesi, yıllandırma ya da depolama sırasında da oluşabilir (Leitao ve diğ. 2005). Şarapta üretilen biyojen amin seviyesi aminoasit öncüllerinin ortamdaki varlığına bağlıdır. Aminoasit seviyesindeki artış biyojen amin konsantrasyonunu da arttırmaktadır (Smit 2007; Moreno-Arribas ve Polo 2009). Azotlu gübreleme, sağlıksız üzümler, yüksek şıra pH’ı, alkol fermantasyonu

(39)

25

sırasında değişik mayaların gelişimi orta düzeyde biyojen amin seviyesi için yeterli olmaktadır. Bunun üstüne MLF sırasında bazı bakterilerin faaliyeti şaraptaki biyojen amin içeriğini belirgin şekilde arttırmaktadır. Uzun maserasyon da aynı sonuca yol açabilmektedir. (OIV 2011).

Aminoasit içeriği ayrıca vinifikasyon yöntemleri, üzüm çeşidi, coğrafi bölge ve hasat yılından da etkilenmektedir (Smit 2007; Moreno-Arribas ve Polo 2009).

2.2.5.1 Bağcılık Uygulamaları

Biyojen aminler asmada ısı, tuz, susuzluk gibi stres faktörleri etkisiyle üretilirler. Buradan hareketle bağda aminsiz üzüm yetiştirilebilir (Grossman ve diğ. 2007).

Yoğun azot gübresi kullanımı özellikle Botrytis enfeksiyonu bağlamında biyojen amin konsantrasyonun belirgin şekilde arttırır. Anahtar amin olarak histamin 2mg/L seviyelerine kadar yükselebilir. 2003’de Nicolini ve arkadaşları Trentino bölgesindeki değişik kırmızı ve beyaz üzüm çeşitlerinden çeşitli aminlerin konsantrasyon incelenmiştir. Çalışmaya göre; biyojen aminler üzüm danesinde daima bulunur ve değişik çeşitlerde değişik konsantrasyonlarda vardır. Fosfoetanolamin ve etanolamin sadece minör çeşitlilikler göstermiştir (Grossman ve diğ. 2007).

Putresin ve diğer poliaminler gibi bazı aminler üzüm danesinde de bulunabilirler. Örneğin Cabernet Sauvignon danesinin perikarp bölgesinde yüksek konsantrasyonda putresin, kadaverin ve spermidin bulunabilir. Bu aminler aynı zamanda danenin çekirdeğinde de yüksek konsantrasyonlarda bulunabilir. O halde putresin konsantrasyonu coğrafi koşullar ve çeşide şarap yapım uygulamalarından daha çok bağlıdır denebilir (Landate ve diğ. 2008). Biyojen aminler köken belirleme ve şarap teknolojisini ayırt etme konusunda rekolte ve çeşitten daha güvenilir belirleyicilerdir. Üzümün yetiştiği bölge özellikle putresin konsantrasyonlarını etkilemektedir. Dolayısıyla biyojen aminler polifenoller ve bazı kimyasal maddelere ilaveten köken işareti olarak kullanılabilir (Galgano ve diğ. 2011). Topraktaki potasyum eksikliği bitkideki putresin konsantrasyonunun artmasıyla bağlantılıdır. Bununla beraber kuraklık biyojen amin miktarını danede ve bitkide etkilemez.

(40)

26

Üzümün olgunluk derecesi son üründeki biyojen amin konsantrasyonu üzerine bir miktar etkili olmaktadır (Marcobal ve diğ. 2006).

Biyojen aminler çeşit ve asmanın beslenme derecesine de bağlıdır ki bunlar aminoasit öncüllerinin şaraptaki miktar ve kompozisyonunu maya metabolizması ile beraber belirleyen faktörlerdir. Azotlu gübre uygulamaları aminoasit ve amin konsantrasyonunda artışa neden olur. Asimile edilebilir aminoasit konsantrasyonu yüksek çeşitler son üründe yüksek biyojen amin konsantrasyonuna sebep olurlar (Marcobal ve diğ. 2006).

2005’de Cecchini ve arkadaşlarının yürüttüğü bir çalışmada kırmızı üzüm çeşitlerinin şaraptaki biyojen amin içeriği üzerinde etkili olduğunu öne sürülmüştür. Merlot, Syrah, Sangiovese, Cesanese d’Afflile ve Cabernet Franc çeşitlerinden alınan şıralardan yapılan farklı karakter ve farklı toplam amin içeriğindeki şaraplar arasında belirgin bir fark göze çarpmıştır. Cabernet Franc en yüksek toplam amin içeriğine sahip çeşit olurken Pinot Noir çeşidinin Cabernet Sauvignon’dan yüksek biyojen amin içeriğine sahip olduğu görülmüştür. Diğer araştırmacılardan Ough 1971’de Kaliforniya’da Pinot Noir’in Cabernet Sauvignon’a göre çok yüksek biyojen amin içeriğine sahip olduğunu gözlemlemiş; 1998’de Glória ve arkadaşları ABD-Oregon’da yetişen Pinot Noir çeşidinin Cabernet Sauvignon'la karşılaştırmış ve toplam amin içeriğinin Cabernet Sauvignon’a göre çok yüksek olduğunu gözlemlemiş; 1999’da Soleas ve arkadaşları Kanada-Ontario’daki Pinot Noir çeşidinin tüm diğer kırmızılara göre yüksek amin konsantrasyonlarında olduğunu göstermiştir.

Hasat yılı ve bölge, serbest aminoasit ve amin içeriği üzerine etkilidir (Marcobal ve diğ. 2006). Aminoasit öncüllerinin konsantrasyonu seneden seneye değişiklik göstermektedir. Hasat yılının biyojen amin içeriğine etkisi şarap mikroorganizmalarının doğal seçilimine bağlanabilir. Örneğin seneden seneye pH değiştiği için mikroorganizma içeriği de değişmektedir (Moreno-Arribas ve Polo 2009). Bu araştırmacılar belirli bölgede üretilen İspanyol Tempranillo şaraplarında biyojen amin içeriğinin 2001’de 2002’den belirgin derecede yüksek olduğunu bulmuşlardır. Aszu şaraplarındaki amin seviyeleri de 1993, 1997 ve 1998 senelerinde diğer yıllara göre belirgin derecede farklı bulunmuştur. Aksi yönde bir çalışmada ise

(41)

27

1998’de Glória ve arkadaşları araştırdıkları 1991 ve 1992 yılları arasında amin konsantrasyonu açısından bir fark bulamamıştır (Smit 2007).

Marques ve diğ. (2008) tarafından gerçekleştirilen çalışmada üzüm çeşidi, üzümün yetiştirildiği bölge, üzüme uygulanan anti-fungal ilaçlar, fermantasyon aktivatörleri, malolaktik fermantasyonda kullanılan starter kültür ve depolama koşullarının şaraplarda biyojen amin oluşumu üzerine etkisi irdelenmiştir. Sonuç olarak üzüm çeşidi ve üzümün yetiştirildiği bölgenin biyojen amin oluşumunu etkilediği bulunmuştur. Ayrıca malolaktik fermantasyonda uygun starter kültürün kullanımının şarapta biyojen amin oluşumunu azalttığı belirtilmiştir. Depolamanın ise az miktarda biyojen amin artışına yol açtığı belirlenmiştir. Anti-fungal ilaçların kullanımının ise biyojen amin oluşumunu azalttığı belirlenmiştir (Özdestan ve Üren 2010).

2.2.5.2 Alkol Fermantasyonu

Genel düşünce şarapta biyojen amin oluşumunun bakteri faaliyeti sonucu malolaktik fermantasyon sırasında gerçekleştiği yönünde olsa da yapılan çalışmalar alkol fermantasyonu ve mayaların da biyojen amin birikiminin nedenlerinden olduğunu göstermiştir. Mayalar temel biyojen amin olan histamin oluşumuna katılmasa da diğer biyojen aminlerden değişen miktarlarda üretmektedir. Bunlardan diğer poliaminler gibi histaminin toksik etkilerini arttırdığı bilinen agmatin mayalar tarafından üretilir ve şarabın sağlık açısından kalitesine negatif etki yapar (Romano ve diğ. 2007).

2.2.5.3 Maserasyon

Vinifikasyon sırasında üzüm kabuklarının maserasyonu fenolik maddeler, proteinler, aminoasitler ve polisakkaritler gibi bileşiklerin ekstraksiyonunu sağlar. Maserasyon genel olarak kırmızı şarap yapımında kullanılırken; soğuk maserasyon (alkol fermantasyonu öncesi soğuk daldırma), üzüm kabuklarıyla fermantasyon (geleneksel yöntem), alkolik fermantasyon sonrası uzun maserasyon gibi teknikler uygulanmaktadır. Pektolitik enzimler şıra verimini artırmak, şırayı durultmak,

(42)

28

ekstraksiyonu kolaylaştırmak, kolay presleme ve filtrasyona uygun hale getirmek için eklenebilmektedir. Karbonik maserasyon ve termovinifikasyon ise daha az kullanılan ekstraksiyon metotlarıdır (Smit ve diğ. 2013).

Soğuk maserasyon sırasında şıra ve kabuk alkolik fermantasyona kadar düşük sıcaklıklarda temas halindedir. Birçok kırmızı şarap maserasyon sırasında alkolik fermantasyonunu da tamamlar. Alkolik fermantasyon sonrasında maserasyon uzatılırsa tekrar düşük sıcaklık uygulaması gerekli olur (Moreno-Arribas ve Polo 2009).

Bazı araştırmacılar maserasyon uygulamaları ve şaraptaki biyojen amin seviyeleri arasındaki ilişkiyi araştırmışlar ve doğrudan bir ilişki bulamamışlardır. 1999’da Soleas ve arkadaşları uzun maserasyon ve biyojen amin konsantrasyonu arasında bir ilişki bulamazken 2006’da Martín Álvarez ve arkadaşları 2 g/100 kg dozunda pektolitik enzim ilavesi ile aynı çalışmayı yapmış ve bunun biyojen amin konsantrasyonuna etkisi olmadığını görmüşlerdir (Moreno-Arribas ve Polo 2009).

Bazı araştırmacılar ise maserasyonun biyojen amin konsantrasyonunda çok önemli bir değişken olduğunu, maserasyon süresi uzadıkça biyojen amin üretiminin arttığını öne sürmüşlerdir (Moreno-Arribas ve Polo 2009).

2.2.5.4 Şarabın Fizikokimyasal Kompozisyonu

Biyojen amin üretimi bakterilerin asitli ortamlarda geliştirdiği bir korunma mekanizmasıdır. Dolayısıyla ölçülen ortam pH’ı laktik asit bakterilerince üretilen aminlerle ilgili tatmin edici bir bilgi verebilmektedir (Arena ve Manca de Nadra 2001).

pH, sıcaklık ve kükürt dioksit gibi şarabın fizikokimyasal durumunu etkileyen faktörler şaraptaki mikroorganizma çeşitliliği ve konsantrasyonunun yanında dekarboksilaz enzimi aktivitesine de etki eder (Smit 2007).

Yapılan çalışmalarda, malolaktik fermantasyon ürünü olan laktik asidin HDC (histidin dekarboksilaz) aktivitesini inhibe ettiği öne sürülürken (Funel 2001; Smit 2007) başka bir çalışmada bunun önemli olmadığı sonucuna varılmıştır (Smit 2007).