Turk Noro~iriirji Dergisi 11: 83 - 86, 2001 UIl/U: Optik Sillir Rejcllcrnsyollu
Optik
Sinir Rejenerasyonu
Optic nerve regeneration
ACAHAN
UNLU, GUL$AH BADEMCt ZAFER AYDIN, BERMANS iSKANDAR
Ankara Universitesi TIP Fakultesi, Noro~irurji Anabilim Oah, (AU, GB, ZA), Wisconsin Universitesi TIP Fakultesi, Noro~irurji Anabilim Oah, (Bi)
Geli~ Tarihi: 01.11.2000<=:> Kabul Tarihi: 19.02.2001
Ozet: Optik sinir rejenerasyonu Santral Sinir Sistemi rejenerasyon <;ah~malan i<;erisinde, santral noronlann rejeneratif kapasitelerinin ara~tHIlmasl amaCl ile kullamlmaktadlr. Noron govdesinin kolayca ula~llabilecek ~ekilde goz kuresinde bulunmasl, etkilenebilir olmasl kullamm nedenlerindendir. Rejenere olan aksonun <;evre ozellikleri de bu deneylerde kolayca incelenebilir durumdadlr. Rejenerasyon yetenegine etki eden, noron ya da aksonun <;evresel yapllardan etkilenmeleri ve bu <;evre yapllarm degi~tirilebilir olmasl da avantajdlr. Buradan elde edilecek sonu<;lar Santral Sinir Sisteminin diger yerlerindeki rejenerasyon <;ah~malanna l~lk tutacakhr. Bu ama<;la 12 sl<;anda optik sinir kesilerek aksonal hasar olu~turulmu~ ve siyatik sinir anastomozu yapIlarak rejenere olmasl saglanml~tlr. Hucrelerin %1.02'sinde rejenerasyon gorUlmu~tUr.
Anahtar Kelimeler: Santral Sinir Sistemi, Rejenerasyon, Optik sinir
CiRi$
Santral Sinir Sisteminin rejenerasyon yeteneginin ara§tmlmasl amaCl ile uzun suredir <;ah§malar yapllmaktadH(5,7)4)5). Periferik Sinir Sisteminden tamamen farkl1 olarak rejenerasyon yeteneginin olduk<;a smlrh olmasl ak1l1arda bir <;ok soru yaratml§tir. A ynca bir <;okinsanm travma, inme ve santral sinir sisteminin dejeneratif hastahklannm
Abstract: Optic nerve regeneration model has been used for exploring the regenerative capacity of central type neurons. The accessibility and affectability of the neuron body which is situated in eye globe are reasons for selections in regeneration experiments. The environment which influence the regenerative capacity of the neuron is also easily investigated in optic nerve model. The environment has been changed in order to search the effects of different factors. The results collected would promote the future experiments in other parts of Central Nervous System. In 12 rats, axonal injury has been done by cutting the optic nerve and regeneration has been induced by grafting sciatic nerve. Regeneration has been detected in 1.02% of cells.
Key words: Central Nervous System, Regeneration, Optic nerve
ortaya <;lkardlgl sosyal ve ekonomik sorunlar bu konudaki <;ah§malan hlzlandlrml§tir.
Optik Slmr rejenerasyonu, Santral Sinir Sisteminin rejenerasyonu hakkmdaki <;ah§malarda bir ornek olarak kullamlmaktadu(6)6,17). Bu modelin kullamlmasmm nedenlerinden biri, kolayca ula§Ilabilecek goz kuresinde bulunan noron govdesinin rejenere olup olmadlgmm basit
Tiirk Niiro~iriirji Dergisi 11: 83 - 86, 2001
yontemlerle ara:;;tmlabilir olmasldlr. A ynca rejenere olan aksonun yada aksonu <;evreleyen glial dokunun kola yea incelenebilir yerlerde olmasl da diger se<;im nedenlerindendir. Bu noronal govdenin dl:;; ortamdan ula:;;llabilir olmasl da degi:;;ik maddelerin optik sinir rejenerasyonuna etkisinin ara:;;tmlmasma yardlm eder.
Bu ama<;la, optik sinirleri kesilmi:;; sl<;anlarda siyatik sinir greftleri somasmda rejenerasyon olup olmadlgl ara:;;tmlml:;;tlr. Optik sinirde rejenerasyonun olmasl hem Santral Sinir Sisteminin rejenerasyon yetenegi hakkmda bilgi verecek hemde ileride yapllacak deneyler i<;inyol gosterici olabilecek temele katklda bulunacaktlr.
MATERYAL VE METOD
Bu <;ah:;;mada aglfhklan 200-250 gram arasmda degi:;;en 12 adet di:;;i Spraque Dawley sl<;an (Harlan Spraque Dawley, Indiana) Wisconsin Universitesi TIP FakUltesi Hayvan Baklm Unitesi ile yapllan protokole gore kullamlml:;;tlf. Hayvanlar Ketamin-HCl ve Xylazin kan:;;lml ile uyutulduktan soma burun kokunden geri parietal bolgeye kadar uzanan orta hat kesisi ile girilmi:;;ir. Periorbita ortaya konmu:;;, adale ve yag dokulan ekartmam sonucunda optik sinir klhfl ile birlikte diseke edilmi:;;tir. Klhf orta hattan a<;llml:;;, sinir klhftan aynldlktan soma goz kuresine 2-3 mm. uzakhktan kesilmi:;;tir. Kesilme i:;;lemi slfasmda klbf i<;inde bulunan arteriyel dola:;;lmm bozulmamasl saglanml:;;hr. Hayvanlar iki gruba aynlml:;;tlf.
$ekil1: Optik sinirin goz kiiresi arkasmdan kesilmesinden soma floresan boya (TR) ile boyanml;; retinal gangliyon hucreleri. Hiicre govdesi ve retinanm sinir lifi tabakasmdaki akson demetleri ok ile i;;aretlemi;;tir.X400
Un/ii: Optik Sillir RejellerasyollII
Birinci gruptaki 5 adet sl<;anda, optik sinir kesilmesinin hem en ardmdan kesik uca 10 ml floresan boya Texas klfmlzlsl (TR) (Absorbsiyonl Emisyon Max.:595/615) (D-1863, Molecular Probes, Eugene,OG) uygulanml:;;hr. Operasyon sonunda cilt kapahlml:;; ve 3 gun somasmda hayvanlar yuksek doz sedatifler ile uyutulmu:;; ve 60 cc soguk fosfat tamponlu salin (PBS) , 250 cc %4 paraformaldehit (PFA) ile perfuze edilmi:;;tir. Goz kureleri <;lkartlhp 6 saat %30 Sukroz i<;inde, 10 saat %4 paraformaldehit (PFA) i<;inde inkube edilmi:;;tir. Cerrahi mikroskop altmda optik kureler limbus seviyesinden kesilmi:;; ve retinalan diseke edilmi:;;tir. Bu retinalar daha soma lam uzerine yaYllnll:;;, lamel ile kapatlldlktan soma uygun floresan filtreler kullamlarak floresan mikroskop (Axioskop, Zeiss, Almanya) altmda incelenmi:;;tir. Optik sinirde kesilmi:;; aksonlar araClhgl ile retrograt olarak i;;aretlenen retinal gangliyon hucreleri ($ekil1) bir skala (alan=625mm2) yardlml ile retina uzerindeki dart kadranda ve retinal yan <;apm u<;e aynlmasl ile elde edilmi;; u<; degi;;ik <;aptaki toplam 12 alanda saYllml:;;hr. Gene aym skala yardlml ile retinal alan da hesaplanml;;tlr.
ikinci gruptaki 7 hayvanda kesik optik sinir ucuna floresan boya uygulanmaml;; ancak sol siyatik sinirden alman uygun <;aptaki 15 mm uzunlugundaki dab optik sinire 2 ad et, 1010 monofilaman naylon sutur ile u<;-u<; anastomoz yapllml:;;tlf ($ekil 2). Greft distal ucu, daha soma bulunmasml kolayla;;tlfmak amaCl ile frontal periosteuma tespit edilmi;;tir. insizyonlar kapandlktan soma 2 ay beklenilmi;;tir. Sl<;anlar tekrar uyutulmu;;, insizyonlan a<;llml;; ve greft ucu bulunmu:;;tur. U<;tan 1mm. lik bir par<;a <;lkanlmasmdan soma graft ucuna 10ml floresan boya (TR) uygulanml;; ve insizyon kapatllml;;hr. '0<;
$ekil2: Optik SlnIr kesildikten sonra siyatik Slnlr anastomozu. 10/0 naylon ile dikilmi;; anastomoz hattl gorUlmektedir.
T!irk Noro~iriirji Dergisi 11: 83 - 86, 2001
gunun
sonunda
diger gruptaki
gibi perfuzyon,
fiksasyon ve yayma a9amalan tamamlanml9tIr. Bu
retinalann turn alam aym skala yardIml ile gozden
ge<;irilmi9ve floresan hucreler sayllml9tIr( ~ekiI3).
$ekil 3: Rejenere olmu;;retinal gangliyon hucresi, govde
ve akson ok ile i;;aretlenmi;;tir.X400
Sonu<;lar
Sigma
Stat
(SPSS),
program I
kullamlarak
degerlendirilmi9tir.
Oegerler
ortalama±SO olarak verilmi9tir.
SONU(:LAR
Creft
yapIlmadan
once floresan
boya ile
boyanan hucrelerin saYIlmasl ile elde edilen total
retinal gangliyon hucre sapsI103922.4±7176.4 olarak
bulunmu9tur.
En yuksek saYI 111456 ve en dU9Uk
saYI 94540 olarak bulunmu9tur.
Bu orneklerde
ol<;tilenretina alam 65.8±8
mm2olarak bulunmu9tur.
Creft yaplldIktan
soma rejenere olan retinal
gangliyon hucreleri saYIldlgmda 1060.6±86 hucre
saptanml9tIr. Bu grupta en yuksek deger 1219 ve en
dU9Ukdeger ise 972 hucredir.
Her iki grup goz onune almdlgmda
retinal
gangliyon
hucrelerinin
%1.02'sinin
optik sinir
kesilmesinden soma rejenere olarak greft i<;erisinde
15mm
kadar
ilerledigi
gosterilmi9tir.
Sonu<;lar
Tablo 1'de ozetlenmi9tir.
TARTI$MA
Santral
Sinir
Sisteminin
rejenerasyonu
uzerindeki ara9tIrmalar ozellikle son YIllarda, genetik
dalmdaki geli9melere paralel olarak artmI9 ve umut
vermeye
ba9laml9tu.
Burada
ama<; kaYIplarm
UIlIii: Optik Si/lir Reje/lernsyo/lll
giderilmesi,
yada en azmdan
fonksiyonlann
geri
dondurulmesidir.
Rejenerasyonun
olu9abilmesi
i<;in gerekli
9artlardan biri hucrenin ya9amIm surdurmesidir.
Hucre hasanndan soma, hucrede bir <;okdegi9iklikler
olu9maktadu(2).
Hucrenin
rejenere
olup
olamayacagml,
ya da olumiinii
bu degi9iklikler
belirler. Bu degi9ikliklerde
bir sekonder
mesajcI
sistem elemam olan kalsiyumun
etkileri olduk<;a
fazladlrOO). Kalsiyum
hucrenin
olumune
neden
olabilecegi gibi, gen yapIml, bazl yaplsal elemanlann
yapIml ya da aktivasyonu
gibi bir <;ok olaya da
katIlarak hucrenin
tejenerasyonuna
da etki eder.
Ba9langl<;ta yamt alUm ve rejenerasyon
i<;inde
aymdu. Oaha somaki seyir ek faktorlerce belirlenir.
Bir klsIm hucrelerde bu degi9iklikler ortaya <;Ikamaz
ve hucreler oltir. Yapllan <;ah9malarda goz kuresinin
hemen arkasmdan
yapllan
aksotomi
ile ilk bir
ayda
hucrelerin
yakla9Ik
%90'mm
oldugu
gosterilmi9tir(8).
Hiicre
olUmu ilk 2 haftada
olduk<;a belirgin
iken izleyen
haftalarda
azalsa
da devam
etmektedir(4).
Bizim <;ah9mamIzda
hucrelerin yakla9Ik %12'si ya9amlanm surdurmu9tur
(Yaymlanmaml9 bulgular); bu oranda yapIlan greftin
de etkisi vardu. Bazl yazIlarda bu tip greftlerin(3)
ve Schwann hucrelerinin(2)
hucre ya9ayabilirligini
artIrdlgl gosterilmi9tir.
Hucrenin rejenere olabilmesi i<;inbazl hucresel
faktorler
de gereklidir.
Aksotomi
ile uyanlmI9
intranoronal
mesajCllar, hucreyi bazl ek <;evresel
faktorlerle birlikte duzenlenecek gekilde olume ya da
rejenerasyona
gotiirurler.
Hucrenin
<;evresel
faktorlere
yamtlm
duzenleyen
transkripsiyonel
faktorler bu devrede gene kalsiyumun rol aldlgl baZl
olaylardan soma olu9turulur ve etkinle9tilirler(11).
Cen olu9umu, yaplsal faktor sentezi, reseptorlerin
organizasyonu
gibi
fenotipik
ve
genotipik
degi9iklikler
hucre i<;i destekleyici
faktor olarak
saYIlabilecekler ozelliklerdir(8).
Tablo 1: Retinada
bulunan
gangliyon
hiicre
ve
rejenere
olan
gangliyon
hiicrelerinin
sayllan.
Hucre sayllan
Total retinal gangliyon
103922.400±7176.385
hiicre saYIsI
Rejenere olan retinal
1060.571±85.998
gangliyon hucre saYIsI
Degerler ortalamatSD olarak verilmi;;tir.
Turk Noro$irurji Dergisi 11: 83 - 86, 2001
Her nekadar hucrenin bu rejenerasyon yetenegi bir klsIm rejenerasyon olu;;tursa da rejenerasyonun devam edebilmesi i<;in bazl dl;; faktorler de onemlidir. Hucrenin ya da rejenere olacak aksonun i<;inde bulundugu ortam bunlardan biridir. Ortamm inhibitor ozellikleri, rejenere olabilecek hucre ya da akson un rejenerasyon ozelligini ortadan kaldlrabilir(13). Bu ozellik en belirgin olarak santral sinir sisteminde gorUlmektedir, periferik sinir sistemi destekleyici ortaml rejenerasyonu destekleyecek ;;ekilde iken santral sinir sisteminin glial destek ortaml rejenerasyona izin vermez(1). Ortamm rejenerasyona etkisi santral sinir sisteminin i<;inde bile farkhhklar gosterir, beyaz cevher inhibitor ozellikte iken gri cevherde inhibiyon yoktur(9). Hucre <;evresindeki astrositlerin dizilimi yada hasardan etkilenmeleri de noronun rejenerasyonuna engelleyici ;;ekilde etki eder. Hucrenin <;evresindeki ekstraselluler matriksin yaplsl da rejenerasyonu engelleyici olabilir(9).
YapIlan deneyde aksonun rejenere olacagl ortam bir periferik sinir olan siyatik sinir anastomozu ile degi;;tirilmi;; ve aksonun rejenerasyonunun bu ortam i<;erisinde olmasl saglanml;;hr. Periferik sinir greftleri hem i<;erdikleri bazl destekleyici elemanlar nedeni ile hem de ortamm engelleyici durumunu ortadan kaldlfmalan nedeni ile daha once de kullamlml;;lardlr( 6).
Yapllan <;al1;;mada retinal gangliyon hucrelerinde yakla;;lk % 1 oranmda da olsa rejenerasyon oldugu gosterilmi;;tir. Bu aksonlar rejenere olup siyatik sinir grafti i<;erisinde yakla;;lk 15 mm kadar ilerlemi;;lerdir. Eger 2 ay sonunda ya;;ayabilmi;; hucrelerin turn retinal gangliyon hucrelerinin %12'si oldugu dii;;iiniilUrse bu oramn bile olduk<;a onemli oldugu soylenebilir. Her nekadar rejenere olabilen hucre saYIsI kii<;iik bir oran olu;;tursa da bu oranm artmlmasl i<;in yapllacak <;ah;;malan cesaretlendirmektedir.
ileri donemlerde degi;;ik kimyasallarm kullamlmasl ile bu oramn arhnlmaya <;ah;;llmasluygun olacakhr. Bu hiicrelerin bir diger onemi de rejenere olabilen hucrelerin genetik yapIlanm i<;ermesidir. Bu genetik yapmm ortaya <;lkanlmasl da ileride yapIlacak <;ah;;malara aynca 1;;lktutabilecektir.
YaZl~ma Adresi: Dr. Agahan Unlii Tel: 3122236042
Tusso Bloklan N-1 Blok No:14 E-mail: agahan@hotmail.com 10. Cadde Emek / Ankara 06510
86
Un/U: Optik Sinir Rejenerasyollu
KAYNAKLAR
1. Aguayo AJ, David S, Bray GM : Influences of the glial environment on the elongation ofaxons after injury: transplantation studies in adult rodents. J Exp BioI 95: 231-240, 1981
2. Ambron RT, Zhang XP, Gunstream JD, Povelones M, Walters ET: Intrinsic injury signals enhance growth, survival, and excitability of Aplysia neurons. J Neurosci 16(23): 7469-7477, 1996
3. Bahr M, Eschweiler GW, Wolburg H: Precrushed sciatic nerve grafts enhance the survival and axonal regrowth of retinal ganglion cells in adult rats. Exp Neurol 116(1): 13-22, 1992
4. Berkelaar M, Clarke DB, Wang YC, Bray GM, Aguayo AJ: Axotomy results in delayed death and apoptosis of retinal ganglion cells in adult rats. J Neurosci 14(7): 4368-4374, 1994
5. Bray GM, Vidal-Sanz M, Aguayo AJ: Regeneration of axons from the central nervous system of adult ra ts. Prog Brain Res 71: 373-379, 1987
6. Bray GM, Villegas-Perez MP, Vidal-Sanz M, Carter DA, Aguayo AJ: Neuronal and nonneuronal influences on retinal ganglion cell survival, axonal regrowth, and connectivity after axotomy. Ann N Y Acad Sci 633:214-228, 1991
7. Clark RG: Central nervous system regeneration. Can scientists implement functional regrowth? J Clin NeuroophthalmoI2(4): 261-270, 1982
8. Desmadryl G, Hilaire C, Vigues S, Diochot S, Valmier J: Developmental regulation of T-, N- and L-type calcium currents in mouse embryonic sensory neurones. European Journal of Neuroscience 10(2): 545-552, 1998 9. Fawcett JW: Astrocytic and neuronal factors affecting axon regeneration in the damaged central nervous system. Cell Tissue Res 290(2): 371-377, 1997 10. Ghosh A, Greenberg ME: Calcium signaling in neurons:
molecular mechanisms and cellular consequences. Science 268(5208):239-247, 1995
11. Herdegen T, Skene P, Bahr M: The c-Jun transcription factor-bipotential mediator of neuronal death, survival and regeneration. Trends Neurosci 20(5): 227-231, 1997 12. Maffei L, Carmignoto G, Perry VH, Candeo P, Ferrari
G: Schwann cells promote the survival of rat retinal ganglion cells after optic nerve section. Proc Natl Acad Sci USA 87(5): 1855-1859, 1990
13. Schwab ME : Myelin-associated inhibitors of neurite growth and regeneration in the CNS. Trends Neurosci 13(11): 452-456, 1990
14. Schwab ME, Brosamle C: Regeneration of lesioned corticospinal tract fibers in the adult rat spinal cord under experimental conditions. Spinal Cord 35(7):469-473,1997 15. Schwaiger FW, Hager G, Raivich G, Kreutzberg GW : Cellular activation in neuroregeneration. Prog Brain Res 117: 197-210, 1998
16. So KF,Yip HK: Regenerative capacity of retinal ganglion cells in mammals. Vision Res 38(10): 1525-1535,1998 17. Thanos S, von Boxberg Y: Factors influencing
regeneration of retinal ganglion cell axons in adult mammals. Metab Brain Dis 4(1): 67-72, 1989
18. Villegas-Perez MP, Vidal-Sanz M, Rasminsky M, Bray GM, Aguayo AJ : Rapid and protracted phases of retinal ganglion cell loss follow axotomy in the optic nerve of adult rats. J Neurobiol 24(1): 23-36, 1993
