A. Ü. Veteriner Fakültesi Farmakoloji ve Toksikoloji Kürsüsü Prof. Dr. M. Şahin Akman
KRONİK TOKSİSİTE ve EMİN DOZUN TAVİNİ
Dr. Nevzat Öğüş Ötedenb~ri hekimler, laboratuvar teknisyen ve işçileri meslekleri icabı olarak çeşitli şimik ve biyolojik maddelerle uğraşagelmektedirler. Endüs-tride ve günlük hayatta işçiler ve halk farkında olarak veya olmayarak bazı maddelerin devamlı tesirlerine maruz k<tlmaktadırlar. Bu maddelere son yıllarda besin maddelerine renk, aroma ve lezzet vermek veya bunları bozulmaktan korumak için ilave edilen şimik maddeleri de ekleyebiliriz. İrisanları bu maddelerin tesirlerjnden yüzde yüz kat'iyetle korumaya imkan yoktur. Bu maddelerin devamlı olan etkileri ise başlangıçta hesap ve tahmin edilemiyen zehirlenmelere yol açmaktadır. Sentez kimyasındaki ürküntü veren hızlı gelişme bu sebebten endüstri hijien uzmanlarını derin' derin düşündürmektedir.
Bir maddenfn zararsız imiş gibi gorunen miktarlarının hakikaten zararsız olup olmadığını ve zararlı ise emin olan doz seviyesini tayin et-menin gerekliliği ve önemi kendiliğinden meydana .çıkmaktadır: İşte bu hususların anlaşılması için kronik toksisite denemeleri. düzenlenir.
Kronik toksisite denemelerinden, denemeye verilen emek ve deneme için harcanan zaman ve paranın değerince iyi sonuçlar alınabilmesi bahse konu olan .maddenin met!lbolizmasının bilinmesine bağlıdır. Ne yazık ki bu husus,.o maddenin insanoğlunun hizmetine girişinden çok sonra aydın-latdabilmektedir.
Toksisite denemelerinde hesaba katılması gereken bir sıra faktörler • vardır. Bu faktörlerin deneme sonucunda hasıl edeceği nisbi değişiklikler önceden hesaba katılmalıdır.
Denemelerle ilgili teorik düşünceler
Kronik toksisite denemeleri hakkındaki görüşlere geçmezden önee akut ve sub akut toksisite denemelerine bir göz atmak faydalı olacaktır.
Bir akut toksisite denemesinden sonuç olarak şu noktalardan biri elde edilmek istenir :
N, Oğiiş
i - LD50 Deneme hayvanlarının %50 sini öldürmesi beklenen doz. 2 - Kantitatif bir tesir,
3 Negatif veya pozitif bir
,
tesir.Gaddum (5) bu noktaları şöyle sıralamaktadır i - Direkt tesir,
2 - Ölçülcobilen tesir, 3 - Quantal tesir.
Direkt tesirde, drog herbir deneme hayvanına belli bir tesir mesela ölüm husule gelinceye kadar verilmektedir. Bu suretle Bireysel Etkin Doz (İndividua! Effective Dose) un doğı u ve açık olarak elde ed{lmesi sağlan-maktadır.
Ölçülebilen tesirde, bir vücyt fonksiyonunun veya dokular muhte-vasından olan bir maddenin azalması veya artması ölçülür.
Negatif veya pozitif tesir veyahut Quantal dediğimiz tipte ise tesİı ya görülür yahut ,hiç görülmez; tesirin yarım olması bahis konusu değildir. Bu tip olaylara istatistiçiler Mutuaııy excIusive yani birbirine karşılıklayın imkansızlaştıran olay, boyolojistler ise All or none yani ya hep ya hiç tar-zındaki olay diye isimlendiriyorlar. Yazı-Tura ve ölüm ve Canlılık kom-binezonları bu tip olaylara iyi misaller teşkil ederler (I 6).
Denemelerde cins, yaş, antidot veya koruyucu maddenin (AŞı, Serum) değeri, diyetin tesiri, çevre ısısı ve drogun veriliş yolu gibi faktörlerin nc-ticeye etkisi ve etkin dozun bu faktörleriı~ d~ğişik seviyeIeri muvacehesin-deki tesirleri mukayese ve münakaşa e'dilir.
Uzun süreli denemeierde ise çoğu zaman gaye maddenin spesifik et-kisinin tespiti değildir. Bilakis spesifik tesiri husule getiremiyen emin bir doz seviyesini tespit amaç edinilmiştir. Bazan denemecinin denel).en madde' hakkındaki bilgisi öylesjne azdır ki, denemeci' deneme sonunda hangi or-ganları veya vücut, slVllarını terkip, aktivite değişikliği veya harabiyet yön-lerinden inceIenmesi gerektiğini bile bilmez. Bazan ise karsinojen bir tesir olup olmadığını veya mineral madde noksanlığına sebeb olup olmayacağı gibi özel bir maksat önceden tespit cdilir.
Thiourea'nın Thyroid bez i üstündeki tesiri veya Organik fosfatların Cholinesterase aktivitesi üzerindeki tesirleri gibi ölçüleb~len tesirlerin tes-piti phinlanmış olabilir. Kısaca, kronik toksisite denemeieri sub akut tok-sisite denemeierine. benzerler. Ancak denemeci 5artların (Hayvana, droga ve çevreye ait) her birisi için her canı istediğinde denemeyi tekrarlayamaz. Çünkü bu denemeler çok hayvana, zamana, emeğe, maharete ve paraya ihtiyaç gösterirler. Şu halde deneme pıanı önceden çok iyi tertiplenmeIidil.
Kronik Tobi,ile
,
.
Hemen herhangi maddenin kafi derecede az miktarları zararsızdır yani emindir. Fakat az miktarın tarifi kolay değildir. "Çstelik tarife droğun takdim edildiği şartları' da katmak gerekir. Emin doz genç, yaşlı, gebe, emzikli ve süt emenlerde de zararsız olmalıdır. Emin doz tam gıda alanlara olduğu gibi ancak yeteri kadar gıda alabilenlere de zararsız olmalıdır. Hastalık ve yetersizliklere zemin hazırlamamalı, soğuk, sıcak, fazla' mesai, geçici açlık ve susuzluk gibi tabii güçlüklere karşı mukavemeti kırmamalı-dır. Bundan da şartlalin bir ikisini gerçekleştirmenin bile ne derece zor olduğu anlaşılır.
Derlemelerin düzenlenmesi hakkında tavsiyeler
Denemeleı-in çoğu bahseo konu şimik maddenin gıda ilc verilmesi tar-zında uygulanır. İn~alation ve diğer yollar özel halleri teşkil ederler.
Lehman (I!) kronik toksisite' denemesinqen önce şu hususların gerçek-I<"ştirilmcsini -şart saymaktadır :
a- Denenecek maddenin fizik ve şimik vasıfları, yapısı, saflığı, daya-. nıklılığı, türevierinin beraber olup olmadığı, erime kabiliyeti, buhar basıncı
ve mikro analiz metOdları hakkında kafi bilg;. toplanmalıdır. .
b- Bir akut toksisite denemesi yapılmalıdır. LD50 nin tayini için ağız yolu ve damar içi yollarla sudaki eriyikler kullanılmalı, farmasötik şekiller denemeye iştirak etmeli ve denemede birisi kcmirgen olmayan en az üç tür kullanılmalıdır. Bu denemeler iyi fikir v<."'rirlersede bazan gıdalara il~.ve edilen bir maddenin akut zehirlenmeye veya müşahade edilebilecek dere-cede ileri bir bozukluğa sebeb olamaması. ihtimali vardır.
Bir sub akut toksisite denemesi y<ı.pılmalıdır. Bu deneme .kronik toksi-site denem~sine yol göstersin diye yapılır. Deneme 2-4 ay sürer. Büyüme, gıda ve su sarfiyatı, bazal metabolizma, üreme ölüm, genel görünüş ve davranış ve vü~utsıvıları üzerindeki araştırmalar deneme süresince yapılır ve neticede otopsi ve histolojik bakı ile deneme tamamlanır.
d- Bu bilgileıin ve denemelerin ışığında kronik toksisite denemesine girişilir. Denemeler ekseriya ratlar üzerinde ömür boyu (2 yıl) ve köpek veya domuzda bir yıl devam eder. Denemeler ~üresinde ve sonunda eş-. leme metodu gibi istatistik metodlarla türler arası farklar varsa belirtilir.
Kümülatif tesirler ve metabolik yollar radyo izotoplar kullanılarak aydın-latılılabilir.
Planı iyi hazırlanmış bir denemede bile denemenin uygunlanmasını ve deneme sonucunun değerlendirilri1esini güçleştiren bir srra faktörler vardır. Şimdi bu faktörleri sırasıyle gözden geçirelim :
1 - Deneme hayvanına ait olanlar
a- Tür seçimi ve hayvan say~sı: Ratlar, ucuz, kolay bulunur, kolay üretilir ve beslenir, üniformitesi kolay sağlanan hayvanlardır. Ancak
kü-N. Öğiiş.
çük oluşları, gıda terkibine ilave edilen eseri miKtardaki yabancı madde-leri hissetmeleri, kan nümunesi alma güçlüğü ve akciğer hastalıklarına dispoze oluşları gibi mahzurları vardır. Ratlarla ancak kobay ve tavşan kolay temin edilme ve büyütme cephesinden mukayese edilebilir.
Kemirgen olmayan ikinci bir tür olarak köpek, domuz ve maymun kullanılmaktadır. Maymunlar ormandan yakalanıp getirildiklerinden
hiç-•
,bir vasıf bakımından üniformite beklenmez: En. kıymetli vasıfları insana benzer yaratık oluşlarından ibarettir. Üstelik denemeden önce sağlık kon-troluna tabi .tutulma mecburiyeti, zaptu rabt güçlüğü, sıcak iklimIerde bile insan elinde çabucak ölmeleri ve ne yeyip ne içtikleri hakkında bilgi-mizin pek az olması gibi mahzurlar gösterirler.
Köpek te göründüğü kadar kolay temin edilen bir deneme hayvanı , değildir. Variasyonları pek çoktur. Bir denemede ratların yanı sıra bir kaç
köpek kullanılması denemeye çok şey katmaz; bilakis neticenin değerlen-dirilmesini güçleştirir. Hele 30 rat, 20 kobay, '10 tavşan, 7 maymun ve 3 köpekgibi bir kombinasyonun neticesi hiç bir şey ifade etmez.
Bu sebeplerden kronik toksisite denemelerinde çeşitli türleri n kuBa- . nılması bı:ı ~sulü teklif edenl~r tarafından bil~ sevilerek uygulanmamaktadır. Hangi hayvanın insana daha çok benzer tarzda reaksiyon göstere~eğini bildiren teorik metodla.r yoktur. İnsanlar üzerinde deneme normalolarak yapılamıyacağına göre bilgilerimiz normal tedavi süreleri sonu ortaya Çı-kan cansıkıcı olaylara veya kazalara ve nadir kasdi olaylara dayanır. De-. neme hayvanı ile insanın değişik droglara değişik hassasiyet göstermeleri
ayrıca bir güçlük teşkil etmektedir. Bir misalolmak üzere,aşağıdaki tabloya değişik elementlerin rat ve insanın birim beden ağırlığına göre .toksik doz-larının oranları çıkarılmıştır.
Tablo i.
BAZI ELEMENTLERİ1\" RAT VE İNSANıN BİRİM BEDEl\'
AGIRLIKLARINA GÖRE TOKSİK DOZLARı ORANLARI
Toksisite
Element Birim B. ağırlığına
Tok-sik dozları oranı Doz Rat / Doz İnsan --_. __ .__..._--- -- ._--Arsenik Akut i / 5 Barium Akut i / iO Bakır ' Akut i / S Kurşun Akut i / 2S Kurşun Kronik i fl50 Cıva Akut 1
i
3 Radium Kronik i /150 Selenium Kronik i / 60 __ T_h_o_ri_u_m A_k_u_t2_/_5__ ._
Kronik Toksisile
Bunu; yanısıra bazı zehir tesirleri bir türde diğerinden başka türlü bir araz ile meydana çıkabilir. Demek oluyor ki ikinci tür kullanma zorun-luluğu duyuluyorsa bu tür de kafi sayıda kullanılmalı ve denemeciye is-tatistik mukayeseye imkan vermelidir.
İstatistik bir değer taşıyabilmesi için denemelerin çok sayıda hayvan üzerinde yapılmış olması arzu edilir. Fakat denemecilerin çoğu C%50) toplamları 30 u geçmeyen iO ar hayvanlık gUl'uplarla denemelerini yü-rütmüşlerdir. Erkek ve dişi farklarının bahis konusu olduğu denemelerde ıse toplamı 15 civarında olan 5 er hayvanlık gruplar kullanılmıştır.
b- Genetik faktör : Teorik olarak variasyonun tesirini. yok etmek ıçın homozigot hayvanlar kullanmak gerekir. Pratikte bu imkansız olduğundan .her hayvan grubuna eşit sayıda yaşta ve değişik kafeslerdendenemehayvanı
alınarak variasyonun tesiri azaltılmak çabasında bulunulur. Bununla be-raber ayni kafesteki bireyler arasında önemli variasyonlar olduğunu gös-teren denemeler olduğu gibi heterojen gruplarda asgari variasyona ula-şıldığını gösteren denemeler de vardır.
•
c- Deneme hayvanının cinsi : Biyolojik denemelerde cinsin çok önemi vardır. Erkek ve dişiler droglara önemli derecede farklı reaksiyon göster-diklerinden karma denemelerin değerlendirilmesi güçtür. Denemeleri eşit sayıda erkek ve dişi hayvan üzerinde yapmanın konu hassaten bu far-kın belirtilmesi değilse_pratik faydası yoktur.
2-
lv! adde ve veriliş şekline ait faktörlera- Saflık: Teorik olarak saf madde yoktur, fakat denemenin mümkün mertebe saf olan madde .ile yapılması şüphesiz ilmi bir değer ifade eder. Ancak bahis konusu madde diğer maddelerle birlikte veya özel bir farma-sötik şekildeinsan organizmasına dahil ol~caksa denemeyi bu yeni kom-binasyon veya farmasötik şekille yapmak mantıki olur.
b- Dozlar : Bir kronik toksisite denemesinde, denemenin 3-5 inci ayında, uygulanagelmekte olan dozların isabetsiz olduklarını saptamanın pratik faydası yoktur. Deneme planı yapılırken bu husus çok dikkatle tes-pit edi~melidir. Muhtelif araştırıcılar muhtelif doz seviyelerinin kullanıl-masını tavsiye etmektedirler :
i .- Dozlar tesir hasıl etmeyen seviyeden belirgin araza sebeb olan viyeye kadar değişmelidir (I 7).
2 - Tesir hasıl etmeyen dozdan başlanarak bunun 2,4,8 gibi üslü katlarının 3. veya 4. derecesine kadar çıkılmalıdır ,(14).
3 - Beden ağırlığı esasına göre asgari üç doz seviyesi kullanılmalıdır. İlk doz insanın maruz kalması muhtemel dozun iO katı olmalı, ikinci doz
,
toksik reaksiyona sebeb olmalı, üçüncü doz ise ilk iki doz seviyesi arasında denemecinin seı,:eceği bir doz olmalıdır (II).
4 - İnsanların maruz kalmaları muhtemel dozun i00 katı deneme hayvanların verilmelidir (4).
Doz katlarnalarında aritmetik veya geometrik diziler kullanıldığı gibi bazı denemelerde hiçbir kuralı olmayan doi dizileri de kullanılmışıtr. -En iyisi ön de.ıemderin ışığı altında ve Smith'in (15) tavsiyelerine uyarak planı hazırlamaktır.
Denemesi yapılan m.addenin yeme ilave edilerek verilmesi hallerinde ekseriya doz mi.lyonda kısım olarak bildirilir. Yeme
%
i maddeilave edil-diği hallerde ratlarda alınan madde miktarı 0,6 gr./Kg. beden ağ./Gün olarak hesaplanır. İçme s,uyunda%
i madde ise 0,8 gr. /Kg. beden ağ. /Güri'ü karşılamaktadır. Bununla beraber alınan madde miktarı yemin iştiha açıcılık ve suyun içilebilirlik derecesine bağlıdır.İnhalasyon tarzında uygulanan denemelerde doz teneffüs edilen ha-vadaki madde konsaıttrasyonu ile ifade edilir: Denemeler mesai saat ve günlerini takliden günde 6-8 saat üzerinden haftada 5-6 gün şeklinde devam eder.
Dozlariçin genel çözüm kaideleri yoktur. En uygunu önceki yayın-ların ve ön denemelerin ışığı altında zaman kayb~ttirmeyecek olanı bul-maktır.
c- Droğun veriliş yolu
c. i - Oral yol: Maddenin gıdaya ilave edilmek suretiyle verilmesi en kolay, en az maharet. isteyen yoldur. Madde, gıdaya kuru olarak toz halinde ilave edilebileceği gibi bir eritkende eritildikten sonra da karış-tırılabilir. Bu durum tesiri değiştirebileceği gibi başka mahzurları da davet edebilir. Şöyle ki:
Gıda, hayvanların hoşlanmadığı bir hal<; gelebilir. Maddenin muhak-kak surette verilebilmesi için mide tüpü kullanma zorunluluğu kendisini gösterebilir. Kedi ve. tavşanlar fena lezzetli gıdaları kat'iyyen yemezler, . köpeklerse yedikten sonra kusarlar. Böyle olmasa bile alınan gıda miktarı alışıncaya kadar az olur ve denemenin ilk günlerinde pek şaşırtıcı sonuçlar
alınır. .
Gıda sarfiyatı normalolarak gençlerde fazladır. Ratlarda 6. haftadan 18. haftaya kadar gıda sarfiyatı gr./Kg. Bed. Ağ./Gün olarak 150 den 75 e düşer. Eğer aynı miktar maddenin denemeboyunca verilmesi is~eniyorsa 9-12. aylar arasında madde miktarını iki misline çıkarmak gerekmektedir. Gıdanın ilk aylarda fazla alınışı, ölümlerin ve toksik arazın neden ilk üç ayda fazla görüldüğünü izah eder. Cinsiyet te bu hususta roloynar. Bir
Kronik Toksİsİıe
denemede dişi radar D.D.T. ye erkek ratlardan daha hassas bulunmuş fakat dişilerin erkeklerden %20 ~azla yem yedikleri tesbit edilince bulunan neticenin hatalı olduğu anlaşılabilmiştir.
İnsanın maruz kalması muhtemeı'dozun LOveya yüz katının deneme hayvanlarına verilmesi gereken hallerde, yeme bazı selüloz derivatlarının, an tioksidanların veya yüzey gerilimi azaltan maddderin % iO gibi yüksek miktarlarda ilavesi hem yemin yenilmeyecek hale gelmesine sebeb olmakta hem de bu yem yeniIse bile hazma uğratılacak kısmı %10 noksan olduğun-dan beden ağırlığı kayoı görülmektedir. Bu bize- gıda sarfiyatını ölçmenin ve eşIerne metodları kullanarak denemeden ileri gelen hatanın mümkün mertebe giderilmesi gerektiğini anlatmaktadır.
Test maddesİ besin değeri olan maddeleri' bozabilir. Mayi parafinin yağda eriyen vitaminIerin emilmesine mani olması, sülfonamidicrin ve antibiyotiklerin bağırsak florasını bozması ve bazı madenIerin besin mad-deleriyle kimyasalolarak birleşerek onları emilmez hale getirmeleri birer misal teşkil eder.
Denemeye konu olan maddenin içme suyuna ilavesi halinde de sar-folunan su miktarını ölçmek gerekmektedir. Suda eriyen maddeler içme suyuna ilave edilmişlerse su sarfıyatı normalin % 60 şına kadar düşer ve beqen ağırlığı kaybına sebeb olur ki bu kayıp denenen maddenin spesifik tesiri değildir.
c.2.- İnhalasyon : Endüstride işçilerin zehirli maddenin tesirne tenief-füs yoluyla maruz kaldıkları hallerde deneme inhalasyon tarzında yapılır. Tesir lokal olarak teneffüs yollarında ve -akciğerlerde olabileceği gibi sis-temik te olabilir. Teneffüs işi beden ağırlığı ile değil beden yüzeyi ile ilgili olduğundan hesaplamaların buna göre yapılması gerekmektedir. Kapalı bir yerde deneme yürütülürse bir müddet sonunda h~vadaki madde konsa-trasyonu değişeceğinden sonuç yanlış olur. Bu sebeble denemenin madde konsantrasyonunu sabit tutabilen tesisatı haiz bir yerde- yapılması uygun olur. Teneffüs edilen zehirli madde partiküllerinin boyutları da önemlidir .. Bu partiküllerin çapları 0,5 mikrondan daha küçük ise alınan maddenin çoğu ekspirasyon havası ile geriye atılır. 5 mikrondan daha büyük parti-küller ise üst teneffüs yollarında birikerek yutulur ve mutad olm~yan mi-dese! araza sebeb olur.' Hayvanlarda ayrıca derinin ve tiiylerin yalan-ması suretiyle de bir miktar zehirin ağızdan alınacağı ve üst sindirim yolları ile midede bozukluklara sebeb olacağı hatırlanmalıdır. Denemeler günde 6-8 saat üzerinden haftada 5-6 gün süre ile yapılır.
c.3.- Diğer yollar : özel haller için, mesela insektisid veya insekt re-pellent'ler için deri yolu, plazma yerine kullanılan haddcler için damar içi yol, antibiyotik ve hipnotikler için periton içi yol kullanılabilir.
N. Öğüş
Droğun verilmesinde güçlük olunca, droğu kapsül içinde veya tüple vermek mümkündür. Ancak bu gibi ha!lerde zehirlenme kronik yerine sub akut bir seyir takip ederek neticeyi bozabilir. üstelik bu usuller hayvanın fazla ellenmesini gerektirdiğinden. eroğun akciğere kaçması ve mutad ol-mayan lezyonlar 'doğurma;'ı mümkündür.
d - Besleme rejimi
Besleme rejimi neticeye çok etkilidir. Bunu bir iki misalle anlatalım: Yağlar, 2.4.6. Trinitrotoluene'in zehirliliğini arttırdığı halde Cyani-de'lerin zehirliliğini azaltır. Keza Ca ve P da Pb ve As'in zehirliliklerini önemli derecede değiştirirler.
. En iyisi hayvanlara optimal büyüme sağlayan endüstriyel yemlerin verilmesidir. Gıdanın kalori değerinin düşük oluşu ömrü bir miktar uzat-tığı gibi bazı hastalıklara mukavemeti arttırmaktadır. Hatta bu gibi hal-lerde protozoon, bakteri ve viruslardan ileri gelen hastalıklar daha seyrek görülmektedir. Protein seviyesi normal fakat kalori değeri düşük besin alan-larda tumor büyümesi daha yavaş olmaktadır.
e - Denemenin süresi
Denemenin süresi hakkında görüşler değişiktir. Baziarı insan sağlı-ğının bahis konusu olduğunu ve denemenin en az i,5-2 yıl sürmesi gerek-tiğini, üstelik birçok patolojik bozuklukların 2 yıllık sürenin son 1/3 - 1/4 ünde meydana çıktığ~ll.l' diğer bazıları ise bahsedilen bozukl ukların pek ala daha erken ortaya çıkabileceğini bildirmekteelirler (I i) (13).
Denemenin uzunluğu endişe verici noktaların azalması bakımından gereklidir. Fakat ratlarda ortalama ömür 2-3 yıl kadar olup 2. yıl sonunda normal ölüm %70-90 kadardır. 20 hayvan ile denemeye başlanmış bir gurupta 2 yıl sonunda sağ kalan 2-3 hayvanın ne derece'Cle hakikate uygun bir deneme zemini olacağı aşikardır. Kontrollarda da ayni ölüm görüle-'ceğindcn mukayese imkanı büsbütün elden gitmektedir. Denemelerin en
verimli olduğu devre ilk 3-6 aylık devredir.
Şu halde, 'deneme gereği kadar uzun ve bütün deneme hayvanlarının biz-e istatistik değer taşıyan bilgi verebilecek bir kısmı sağ kalıncaya kadar_
devam etmelidir.
-3 - NeticeleI'in değerlendirilmesine ait güçlükler
Bu bölümde Ölüm, Büyüme, Patolojik bulgular, Organ ağırlıkları ve :\Iegatif bulguların önemi konuları incelenecektir.
• a- Ölüm: Ölüm kesin oluşu dolayısiyle en iyi işlenen işarettir. Ancak ölümün toksik madde dolayısiyle husule geldiği iyice tesbit edilmelidir.
Kronik Toksisite
Ratlarda
ı.
yıl sonunda %15,18. ay sonunda %50 ve 2. yıl sonunda %70-90 nisbetlerinde normal ölüm görülmektedir. 'Ayrıca enfeksiyonlardan ileri gelen ölümler de hesaba katılmalıdır. Toksik maddenin sebeb olduğu ile'-.
normal ölümlerin karışımını gösteren rakkamlar, yatayeksen zamanı gös-termek suretiyle bir grafik kağıdına geçirilirse U charfi şeklinde bir eğri ele geçer. tık aylarda ölümçoktur. Bu ölümler denenen maddenin toksik tesiri ile izah edilebilir. Ortada ölüm azalır. Zamanı ilerledikçe ölüm bu defa yaşlılık sebebi ile yine artar. Ancak C harfinin sağ bacağını teşkil eden bu bölgede toksisitenin de az veya çok bir rolü olabilir. Bu rolü tesbip etmek yani denemenin son aylarındaki ölümlerin sadece yaşlılıktan mı yoksa ayni zamanda droğun zehir etkisinden mi olduğunu söylemek zordur. Bu sebeplerden ölüm, tespiti kolay ve manası 3-4 ay lardan sonra az olan bir belge telakki edilmektedir.
b- Büyüme: Bu da en çok kullanılan belgelerden biridir. Yemin az yenilmesi veya yeme denenen maddenin ilavesi ile fiziksel veya kimyasal değişikliklerin vukuu hallerinde neticeler pek sıhhatli olmaz. Normal bü-yümede, beden ağırlığının logaritmaları, bu ağırlıklara tekabül eden yaş-ların resiprokallerine karşılık olarak kaydedilirse düz bir hat meydana çıb.r. Ratlarda epifiz kapanmadığı için büyüme ömür boyunc.a devam eder ve belli bir grafik çizer (L~) (8). Sülfonamid ve antibiyotiklerin bağır-sak florasına etkiyerek büyümcyi dolaylı olarak azalttığını da hatırda tutmak gerekmektedir. i
c- Patoh~jik bulgular Burada dikkat edilecek husus yaşlılığın sebeb oldl.ğ,ı değişiklikleri, ,dencncn maddeden ileri gelen değişikliklcrle karış-tırmamaktır. Patologların histelojik muayenede aynı manzara yı değişik, şekilde izahetmeleri ihtimali de her an mevcuttur Muayenelerde kullanılan boyama ve işleme teknikleri hatta hüyütme nispeti bile değişcn Iıükümlerin \erilme5ine yol açabilmektedir.
d- Organ ağırlığında dq~işme : Çok kullanılan bir belgcelir. Genel inanç, Hormon - Uterus, Hormon - Thyroid bez i gibi özel kombinezon-lar bahis konusu değilse, organ ağırlığındaki normalden ayrılışııı, o organa ait fonksiyO!lların gereği şekilde yürüdüğü hallerde toksik tesir telakki edil-mcmesidir.
e- Negatif bulguların önemi : Kegatif bulgular daima şüphelidir. Bir araştıncının tespit edemediği bir değişikliği diğer birisi daha hassas bir metod kullanarak veya sırf şanslı olduğu için tespit edebilir. Bir çok toksisite denemeleri zararsız maksimal dozun tayinini hedef tutar. Ancak genel inanç şudur ki, doz kari derecede küçüldüğü halde bundan mütees-sir olacak süjeler bulunabilir ve bu hüküm doğrudur. Şu halde ihmal edi-lebilecek müteessir süjelerin nispcti önceden tespit edilmelidir. Bu nispet
N. Öğüş
küçüldükçe müteessir süjelerin tespiti güçleşir ve çok sayıda deneme hay-vanı kullanmak zorunluluğu ortaya çıkar. Bunu bir misalle izah edelim:
Bir droğun belli bir dozu ortalama % i ölüme sebeb olsun. Droğun bu dozu na maruz kalaıi her bir bireyin sağ kalma şansı p = 0,99 dur.
f'
Şimdi ayni droğun ayni dozunun 100 deneme hayvanına tatbik edildiğini farzedelim. 100 hayvanın hepsinin birden sağ kalmaşansı P = 0,99 100
=0,3631 dir. Bu demektir ki bahse konu droğun ortalama %iölüme sebeb olan dozunu 100 deneme hayvanında denesek %36,3 i ihtimalle ölüm ola-yını gözden kaçırabiliriz. Ayni hesaplamayı değişik ortalamalara uygular-sak aşağıdaki tablo meydana çıkar :
Tablo II.
ORTALAMA OLARAK BELLİ NİsPETLERDE VUKUA GELEN
BIR OLAYIN 100 DEI\EME HAYVANLIK BİR GRUPTA TESPİT EDİLEMEMESİ İHTİMALLERİ
Olayın ortalama 100 hayvanlık gurupta tespit
vukuu ihtimali .edilememe ihtimali
% LO % 0,00265 %
:>
% 0,5916 % 4 % 1,68%
3 % 4,75%
2 0/ 12,3 /0%
i % 36,31%
0,1 % 90,57%
0,01 % 99Görülüyor ki olayın ortalama vukuu ihtimali
%
O,i ve % 0,01 nis~ petlerinde ise olayı i00 deneme hayvanlık grupta tespit edemememiz he-men hehe-men muhakkak gibidir. Halbuki ist~tistik çalışmalarda bir olayın gözden kaçırılması nispeti olarak azamı%
5 olmak. üzere ekseriya % i ve%
O,i nispetleri kullanılmaktadır. Şu halde kaç deneme hayvanı kullanalım ki ortalama vukuu % i oları bir olayı%
5 fena şansla tespit edelim?0,99x =0,05denklemindeki X = 295 bulunur.
Kronik Tok.i.ile
Tablo III.
Ortalama oluş nispeti bilinen bir olayın tespit edilebilmesi için gerekli asgari hayvan sayıları
LLS 182 273 295 455 670 0,05 0,01 0,001 0,05 0,01 0,001 Olayın ortalama oluş nispeti 1:20=%5 Olayı tespit edememe nispeti 0,05 0,01 0,001 Denemede gerekli
asgari hayvan sayısı 58 90 134
1:40,-,,%2,5 1:100
. Tablonunun tetkikinden de anlaşılacağı üzere, paha biçilmez bir varlık olan insan için çok yüksek bir risk olan
%
inispetindeki ortalama ölüm veya cansıkıcı olay, ~sgari 670 kişilik her grupta binde 999 ihtimalle karşımıza çıkacaktır. Üstelik, ortalama%
i nispetinin sabit kalması için hcl' 670 ki. şilik grupta olay birden fazla sayıda da görülebilir. Bu, ölüm veya can sıkıcı olay nispeti insan için çok yüksektir.1931 yılında Gray ve arkadaşları (9) aşağıdaki formülü yazılı (I O) olan Gauss hata eğrisinde, ortalamadan 3 standard deviasyon aşağıda bulunan hata ihtimalinin risk olarak kabulünü teklif ettiler.
Gauss hata egrisinin fomülü 12
2
Yx ----e dir.
Bu bir droğun 740 kişide bir kişiyi öldüren dozunun emin sayılması demektir ki bu nispetin insan için kabulü imkansızdır. Ortalamadan 4 standard deviasyon aşağıdaki hata 30 000 de bir kişinin ölümüne göz yur.n-mak demek olyur.n-maktadır. Bugün ilmı çevrelerce risk, imilyar kişide bir kişinin tesadüfen ölebileceği tarzında kabul edilmekdir ki bu da ortalamadan 6 standard deviasyon aşağıdaki hata ihtimaline eşittir (7). Maamafih 100.000 de bir ölüm ihtimali olan çiçek aşısı gibi bazı biyolojik maddeler emin telakki edilerek kullanılagelmişlerdir.
Kronik toksisite denemelerinin en az tatmin edici ve en çok sukutu hayale uğratıcı kısmı tartışma ve neticedir. Şöyle ki :
a- Yanlış bulg~lardan sakınmak hemen imkansız olduğu gibi pozitif bulguların değerlendirilmesi de güçtür. Büyüme ve üreme gibi olaylar
o kadar çok sayıda faktörlerin tesirialtındadır ki bu olayların normalden sapmaları halinde, bu sapmanın hangi nispettetoksik maddenin tesirinden ileri geldiği tespit edilemez. Pozitif bulgunun denenen madde-den ileri geldiği tespit edilse bile önemli olup olmadığını hemen söylemek mümkün değildir. Mesela yağ dokuda toplandığı tespit edilen D.D.T. çok defa süje için tehlikesiz bulunmuştur.
Pozitif bulgu, denenen maddenin özel şartlar altında husu!c gelmiş, spesifik olmayan veya dolaylı bir tesiriyle şekillenmiş olabilir. Böyle hal-lerde hemen genel hükme varmamak gerekmektedir.
b- Emin dozun bulunması : İdeal bir toksisite denemesinde bir doz-seviyesinde pozitif, bu doz seviyesinden küçük diğer bir doz seviyesinde negatif bir tesir tespitedilmelidir.
Bir denemeden bu sonucu çikarmak çok zordur. Tesiri doza karşılık işaretliyerek elde edilen grafiklerde maksimalin
%
5 inin altındaki kayıt-lara hemc;) hiç rastlanmaz. Bu böfgede tesir öyle intizamsızdır ki bir grafik çizmek hemen imkansızdır. Barnes (I) .. Hemmingsen'in bir denemede 10000 hayvan kullanıclığını, fakat %5 ten aşağı ve % 95 ten yukarı tesirlein iın-tizamsızlığı karşısında bu bölgelere ait değerleri kayıtlarından çıkardığını anla.tmaktadır. Hal böyle oluhca Emin Doz'u bu yolla aramanın fayda-sızlığı ortaya çıkmaktadır.c- Hayvandan insana ekstrapolasyon : Bütün hesaplar insanların droglara hayvanlara benzer tarzda reaksiyon gösterecekleri esasına istinat etmektedir. Halbu ki bu hareket noktası yanlıştır. İnsan pek ala daha az veya daha çok hassas olabilir. Bu sebebten bazı araştırıcılar, hiç olmazsa çalışma yeri zehirlenmelerine ait denemelerin buralarda çalışan insanlar üzerinde, sağlık kontrolü ve vücut sıvıları kontrolü tarZ,ında yapılmasını uygun, görmektedirler.
d- Negatif bulgular: II ve III numaralı tablolarda verilen bilgilcfin ışığı altında negatif bulgulara pek itimat etmememiz gerektiği anlaşılmak-' tadır.
Hulasa olarak kronik toksisite denemelerinin, kıymetli bilgi v,erdiğini fakat emin dozun tayini için yeter olmadığını ve bulunacak neticenin bir tahminden pek ileri gidemiyeceği anlaşılmaktadır. ılmin ilerlemesi ile daha ciddi ve mükemmel araştırmalar yapılmakta ve bu araştırmalar deneme sonucuna etkiyen bir sıra yeni faktörlerin de var olduğunu ortaya koymak-tadır. Bilim adamı bunlardan hangilerinin esas, hangilerinin ihmal edi-lebilecek teferruat olduğunu kestirmektc bile güçlüğ.e uğramaktadır. Şu halde emin dozun tayini içi ne yapılabilir ?
Kronik Tok.i.ile
Önceden bahsedildiği üzere /';'; 1 nispetinde vlIkuu beklencn bir olayı /';';5 emniyet hudutları içinde muha:kkak tespit etmek için 295 deneme hayvanına ihtiyaç vardır. l'vlilyarda hir nispetinde vukuu muhtemelolayı deneyselolarak tespit için kullanılacak hayvan sayısı belki de dünyadaki bütün deneme hayvanlarının daha çok olacaktır. Başka bir yol bulunması gerekmektedir. Emin dozun tayini hızlı yapılabilcn ve az hayvan üzerinde uygulanan bir akut veya sub akut denemenin sonucundan ekstrapolas-yonla elde edilebilir. Ekstrapolasyon iyi bir metod değildir. Fakat meveudun en iyisidir. Hiç olmazsa kronik toksisite denemelerinin sonucu gibi tahmine değil, hesaba dayanır.
Bu tarz lıesaplamalar, bir Doz - Tesir denemesinde c1uzlar logaritma-larının normal dağılışı hipotezine istinat etmektedir. Deneysel bulgular bu hipotezin doğruluğunu ortaya koymaktadır.' Böyle hallerde dozlar logaritmaları tesire karşı grafiğe kaydedilirlerse, elde edilcn şekil maksimal - tesirin /';'; 5 ile % 95 ini temsil eden hudutlar arasında bir doğrudur. Eğer
tesiri n kendisi kullanılarak doğru elde edilemezsc, tesir dcr~eeleri maksi-mal tesirin yüzdeleri olarak veyahut ta probit (x) veya logit (n) transfor-masyonları kullanılarak doğru elde edilir. estelik bu son transformasyon-lar kullanılınca % 5 in altındaki ve ~~ 95 in üstündeki tesirleri temsil eden bölgeler de doğruya uyarlar. Dozların logaritmaları normal bir dağılış gösterdiklerinden bu dağılışın standard deviasyonu hesaplanabilir.. Bu hesaplı;nınea median dozun logaritmasından, 6 standard deviasyon geriye gidilerek Errün Doz'un logaritmasna ulaşılır. Bunu l:>irmisaıle izah edelim:
Perry (1950) Neoarsphenarnine'in bir solüsyonunu ratlara şırınga etmiş ve şu netieeleri almıştır :
0,3 mL.damar içi 6/20 = % 30 ölüm, 0,36 mL. ayni yolla i2/20 yani %60 ölüm tespit edilmiştir. Bu ölüm nispetlerine tekabül eden dozların loga-ritmaları sırasiyle :
i
log 0,30,= 0,47712 - i ve log 0,36 = 0,55815 - i dir.
Buradan interpolasyonla log LD50 = 0,530 - iolarak bulunur. Doz-lar logaritmalarının standard deviasyonu ise I,
=
O,iO18 dir. Burada lamda klasik deviasyon hesabiylebulunabilir (3U 16). Şimdi log LD50 den 6), çıkarılırsa emin dozun logaritması bulunur.t
Probit, tesirin, tesir standart deviasyonu cinsinden ifadesidir.* *
Logit transformasyonunda, tesir, maksimal tesirin yüzdesi olarak idafde edilir. llu yüzde, kendisini bire tamamlayan sayıya bölünür ve bölüinün tabii log:ıritması alınır.Blln\! formülle ifade edersek :
. Y = L03 (pJl-p) Burada p tesirin maksimalin yüzdesi cinsinden ifadesidir. I.ogarit-~ ma (Log) tarzında kısaltıimış ise tabanın (c) sayısı olduğu yani tabii logaritma olduğu anlaşılır. (log) tarzında kısaltma 10 tabanına göre bayağı logaritmayı ifade eder.
-.._--_._---
._---l'i. Üğiiş
0,530-1 - ( 6 X 0,1018 )
=
0,919 - 20,919 -2 nin antilogaritması olan, 0,083 doz birimi olan mL. ilc ifade edilirse Emin Doz
=
0,083 mL. hesaplanır.Burada emin doz qı - 6)" olarak bulunmuştur. (qı), log LD50 yi temsil etmektedir.
Gaddun (7) dozlar logaritmalarının standard deviasyonunu başka bir yoldan hesaplanmaktadır. Müellif ayrıca emin dozun, X ı = Eşik dozdan 6), veya X o Etkisiz dozdan 4 ), geriye gidilerek hesapanlmasını tavsiye etmektedir.
Emin Doz = X 1-6).. veya X 0-4), Bu formüllerde Xi ve xo'sıra ile eşik dozun ve etkisiz dozun logaritmasını temsil etmektedirler.
M üellif , ortalama tesiri n iki tesir standard' deviasyonu altındaki tesiri Eşik Tesir ve buna tekabül eden dozu da Eşik doz olarak tarif etmektedir. Tesirin probit cinsinden ifade edildiği bir grafikte grafiğin dozlar eksenini kestiği noktada bulunan doz da :Etkisiz doz diye isimlendirilmiştir. Pratikte etkisiz doz'un tespiti çok güç olmaktadır.
Şimdi ).. nın nasıl hesaplandığına gelelim. Eğer tesir probit cinsinden ka~dedilerek log doz -' Tesir doğrusunun eğimi (b) olarak bulunmuşsa
)..=
ifb dir. Bu tarz hesaplama ancak "ya hep ya hiç" tarzında olaylara uygulanabilir ki yukarıda anlattığımız misalde bu ölüm ve sağ kalma şek-lindedir.Halbuki gaye saqece hayat kurtarmak değildir. Bireyin en küçük zarara dahi uğratılmamasıdır. Bazı denemelerde drogla ölüm husule gc-tirilemez, belki ölçülebilsn bir tesir görillebilir. Bu gibi hallerde log doz-tesir eğrisinin eğimi pozitif olan kısmından instifade edilir. Kullanılan metod, tesirlerin de normal bir dağIlış gösterdiği esasına dayanır. Yani hem doz-lar logaritmadoz-ları hem de tesirler normal dağılıştadır. Başka bir deyimle tesiri bir tesir standard deviasyonu kadar. arttırabilmek için dozu i ),kadar arttırmak gerekmektedir. Tesirin, standard deviasyonu probit olarak i birim ifade eder. Şu halde tesiri probit birimin (k) katı arttırabilmek için dozu).. nın (k) katı arttırmalıyız (Şekil 1.)
b
=
Tga=
k.sk.A
s s -- Buradan da A=
b bulunur.Şu halde A yı hesaplamak için tesir standard deviasyonu, doğrunun eğimine bölünür. Bu hesabedildikten sonra Emin Doz önceden de bahse-dildiği üzere qı - 6A veya Xi - 6).. olarak hesaplanır.
.
'i D t..f_,
", Kronik Tobisite/le ~
:
-
---.,...
..
i .1,
i i..
-.
Şekilde görüldüğü üzere doğrunun eğimi
Log Eşik doz, yani xı'i bulmak için grafik üzerinde ortalama tesırın iki tesir standard deviasyonu altındaki tesire tekabül eden log doz okunur
Bu metodda ı:p.,b, s ve A için hata hesaplaması yapılamaz.
Litchfield ve arkadaşları (I 2) elde edilen kayıtları Logaritmik ihti-mal kağıdına kaydederek neticeye daha kısa bir yoldan gitmektedirler. Şekil 2. de logaritmik ihtimal kağıdı ve I,nın nasıl hesaplanacağı şematik olarak gösterilmiştir. Kağİdın yatayekseni logatritmik taksimatlıdır. Dü- ~ şeyeksen ise Gauss integraline göre bölünmüştür;. yani ıJu ekscnde tesirler probit birimi cinsinden kaydedilmektedir.
Burada evvela doğrunun konumunun uygun olup olmadığı (Chi)2
metodu ile yoklanır. Konum uygun ise,
s
ED84/ED5o
+
ED5o/EDI62
değeri hesaplanır.
Araştırı-cılar bu değere eğim fonksiyonu ismini vermişlerdir. Bu değer Gaddum'un
A ve Bliss 'in (2) (s) ile gösterdiği değerin antilogaritmasıdır. Bundan sonra yine bir önceki metoddaki tarzda hareket olunur. Burada metodun tefer-ruatına girmiyeceğiz. Yalnız bu metod bir yaklaşık değer metodu olduğu halde ı:p.,A için hata hesabı yapılabilir. Perry'nin Arpshenamine denemesine ait bilgileri bu metodla işleyerek emin dozu 0,081 mL. buldum ki bu ilk
X. Öğüş
hesaplama ile iyi bir uygunluk ifade etmektedir. U.mda (/,), log ED69 - log ED 31 olarak ta hesaplanabilir (6).
r
J .~~
I.
iQ..,
.: ~ ~ ~ i> i L 1 LO ~J:A _<----2.A __ :;.,
ij
[7
---
-------
.._---
--- ---_
....---
... --- --
--.j
-
/
V --- ---
.. -- --- -- - -...---
- -_.
-•.--I
-0-, ...- -..V
/
V
i
-
/
,1
/
~
...J
!/
C._ ---_
.. -_
... -.. -- ... L .. -... ... --
..J..
-..._. -.. -i ii
i
i
/
---
-_
...__ .----1/.___
-_..
...- -- -- ---- -- --- '-' ._-- -.. ....i
i
iLL
s
7(J Şekil 2.6" nın antilogaritmasına Emniyet faktörü (Safety factor) denilmekte-dir. E~in, doz, eşik dozu emniyet faktörüne bölerek te bulunabilir.
Bütün istatistik güçlükler yeni metodların geliştirilmesiyle halloluna bilecektir. Fakat elde edilen neticelerin insana emniyetle tatbik edilip edil-lemiyeceği hususu karanlıklığını muhafaza etmektedir. En çıkar yol, dene-meleri ayrı ayrı çeşitli hayvan türleri üzerinde yapmak ve insanı bunlardan en hassas olandan daha çok hassas telakki etmemektir.
Kronik Tok"isi!"
LİTERATURE
- BARNES, J. M. and DENZ, F. A. : Experimental methods used in De-terminig chronic toxiciry. Pharmacol. Rev. 6: 191-242, 1954.
, 2 - BLİSS,
c.
i. : The Statistics ol' Bioassay Academic Press, New York,1952 '. .
3 - BURN, J. H.; Fİ:\NEY, D.J. and GOODWIN, L.G. : Biological Standardisation 2nd Ed. London, 1950.
4 - FRAZER, A. C. : Synthetic Chelmicals and the Food lndustry. J. Seİ. Food Agri. 2. : 1-7, 1951.
5 - GADDUM, J. H. : Bioassays and "-fathematics. Pharmaeol. Rev. 5: 87-134, 1953.
6 GADD.UM, J.H. : Pharmacology 4th Ed. (hford University Press, London :'-J'ew 'Xôrk Toroııto, 1953, P : 501.
7 - GADDUM, J. lL.: Estimation of Safe Dose. Brit. J. Pharmaeol. ii: 156, -1956.
8 - GRA Y,H. and ADDİS, T. : Rat Colony Testings by <ucker's Weight-Age Relation. Am.J. PhysioL. 153 \ 35-40,
ı
94R.9 - GRAY,W.H., TREVAN, J.\V., BAIBRIDGE, H.W. and A1'T-WOOD, A. P. : Proc. Roy. Soc. B. 108: 54, 1931.
LO - Handbook of Chemistıy and Physics 12nd Ed. Chem. Papers Pııbl. CO. Cleveland, Ohio, 1960-196 i.
II - LEHMAN,A.J.,. LAUG,E.P., WOODARD, G., DRAIZE,j.H., FİTZHUGI-I, O.G. and NELSO:\', A.A. : Procedures for the Apprai-sal of the Toxiciryof ehemicals in Food. Food, Drııg, Cosmetic Law
Qııarterly 4 : 4
ı
2-434, 1945. ,.12 - LİTCFİELD, J.T. Jr. and WiLCOXON, F.1\-. : A Symplified Met-hod for the Evaiuatian of Dose-Effect experiments. Repr. from J. Phar-macol and Exp. 96, J ııne 1949.
13 - MORRİS, I-LJ., l'\ELSON, A.A. and CALVERY, H.O. : Obser-vation on The Chronic Toxiciry oj Propylene glycol, Ethylene glycol, Dietlzy-lene glycol, Ethylene glycolmrJlloethyletlzer and Diethylene glycolmonoethylether. J. Pharmacol. and. Exp, 74 : 266-273, 1942.
14 - SMITH, H.F. Jr. and CARPENTER,
d.p. :
Further Rxperience with Range Finding Test in the İnduslrial Toxicology Laboralory. j. İnd. H yg. and Toxicol. 30 :63-68, 1948.15 - SMITH, C.C. :-A Short Term Chronic Toxiciry Test. J. Pharmacol. and Exp. 100: 408-420, 1950.
16 - STEEL, R.G.D. and TORRY,j.H. : Principle and Procedure of Sta-tistics. ~cGrow Hill Book Co. l\'ew York, Toranto; London, 1960. 17 - WOODARD,G. and CALVER Y, II. O. : Acutc and Chronic
Toxi-ciry; Pııblic Health Aspects. İndııst . Med. 12: 55-59, 1943 .• 18 - ZUCKER,T.F., HALL, L., YOUNG, M. aııd ZUCKER, L. :
The Growth Curve of the Albino Rat in.Relation to Diet. J. Nutrİtion 22: 123-138, 1941.
