Taipei Medical University Institutional Repository:Item 987654321/4224
53
0
0
Tam metin
(2) 2.
(3) 誌 謝 在李文森老師實驗室裏學習，對於大學時期完全沒有研究經驗 的我來說，是非常珍貴的人生歷程。從完全不懂 bench work 的純臨 床醫師，到可以獨立完成細胞培養、各種實驗分析，甚至在到日本大 阪大學進修時，可以幫助那兒的研究生做 Western Blot、參與論文的 發表。各種的研究概念、解決問題的方法，都是在這兒學的。謝謝蓓 茵、碩珍、松柏、莉菁及文彬學長等研究室伙伴對我的各項指導與建 議，很多實驗的技巧，是書本裏查不到的。參與實驗室定期舉辦的 Lab Meeting 也學習到了許多 data 的呈現及分析的方法。尤其是李老 師對於思考的邏輯、演說的訓練、slide 的製作等等的要求，讓我在這 方面有長足的進步。另外，如研究計畫的撰寫、實驗室的運作概念等 等，都是從李老師那兒學來的，非常感恩。 我的碩士論文可以順利的完成，除了基於實驗室的學姐劉媛及 李老師在 DPTH-N10 研究結果的延伸之外，要感謝藥學系吳建德老師 實驗室定期地為我們合成藥品，供給實驗之用。感謝醫技系梁有志老 師幫忙完成 Kinase Activity Assay 的實驗。特別感謝醫技系何元順老 師、新光醫院廖朝聖主任對論文初稿的耐心閱讀，並給我許多修改的. 3.
(4) 建議與指導。 最後感謝我的臨床恩師鄭成國醫師、我的父母以及內子甄蔚， 多次在我陷入臨床工作及研究學習的兩難時，給我督促與鼓勵。沒有 他們的幫助與輔導，早就沉沒在憂鬱的深淵之中。 但願將來能應用我在北醫實驗室所學，繼續參與研究，解決臨 床上碰到的各種命題。. 李東昇. 謹誌. 2009 年 1 月於台北市. 4.
(5) 目錄 誌謝……………………………………………………………3 目錄……………………………………………………………5 摘要……………………………………………………………8 Abstract……………………………………………………….10 壹、 緒論.................................................................................12 一、癌症對人類健康的衝擊與大腸癌.........................................12 二、DPTH-N10...............................................................................14 三、細胞週期..................................................................................14 四、研究目的..................................................................................17. 貳、 實驗材料及方法..............................................................19 一、 常用藥品及試劑.............................................................19 二、細胞培養 (cell culture)………………………………………23 三、3H-Thymidine Incorporation Assay..........................................24 四、細胞毒性測試(MTT assay)...................................................... 24 五、西方墨點法(Western Blot Analysis)........................................25 六、免疫沉澱法(Immunoprceipitation)..........................................28 七、蛋白激酶活性測定(kinase assay)...........................................29. 5.
(6) 參、 實驗結果分析..................................................................31 一、 DPTH-N10 抑制人類大腸癌細胞 COLO-205 的增殖......... 31 二、 DPTH-N10 對 COLO-205 細胞內細胞週期調控蛋白的影 響..............................................................................................32 三、 DPTH-N10 促進 COLO-205 細胞內 p21 與 CDK 2 的蛋白結 合..............................................................................................34 四、 DPTH-N10 抑制 COLO-205 細胞的 CDK2 激酶活性......... 34. 肆、 討論..................................................................................36 伍、 參考文獻..........................................................................40 陸、 附圖..................................................................................44 圖一、Phenytoin (5,5-diphenylhydantoin,DPH)、 5,5-diphenyl-2-thiohydantoin(DPTH), 及 2(naphthalen-2-ylmethylsulfanyl)-5,5-diphenyl-1,5-dihydro-imidazol -4-one (DPTH-N10)的結構式..........................................................44 圖二、細胞週期................................................................................45 圖三、[3H]-thymidine incorporation 的量隨著 DPTH-N10 的濃度上 昇而減少。.......................................................................................46 圖四、移除藥物 DPTH-N10 之後細胞數目會有回昇（reverse）的 現象................................................................................................. 47 圖五、DPTH-N10 在 30 µM 的濃度內不會引發明顯的細胞死亡 6.
(7) .................................................................................. 48 圖六、以 DPTH-N10 處理 COLO-205 細胞 24 小時，西方墨點法 的結果。p21 蛋白的表現量較對照組上昇.................................. 49 圖七、以 DPTH-N10 處理 COLO-205 細胞 24 小時，CDK2 及 CDK4 的西方墨點法分析結果。............................................................ 50 圖八、以 DPTH-N10 處理 COLO-205 後，細胞內的 cyclins A、E、 D 及 D3 的西方墨點法分析............................................................ 51 圖九、DPTH-N10 會促進 p21 與 CDK 2 的結合.......................... 52 圖十、DPTH-N10 抑制 CDK 2 的激酶活性................................53. 7.
(8) 摘要 5,5-diphenyl-2-thiohydantoin-N10 (DPTH-N10) 是 癲 癇 藥 物 phenytoin (5,5-diphenylhydantoin)的合成衍生化合物。先前的研究結果 顯示，DPTH-N10 可以抑制新生血管的生成。本研究的目的，則是探 討 DPTH-N10 對 癌 細 胞 的 直 接 抑 制 作 用 及 其 分 子 機 制 。 [3H]-Thymidine incorporation 的實驗結果顯示，DPTH-N10 可以抑制 大腸癌細胞株 COLO-205 的 DNA 合成作用，且此抑制作用隨著 DPTH-N10 的濃度增加而有加強的現象。西方墨點法（Western Blot Analysis ） 的 實 驗 結 果 則 顯 示 ， 以 DPTH-N10 (10-30 µM) 處 理 COLO-205 細胞 24 小時，細胞週期的抑制蛋白 p21 有顯著增加；而 CDK2、CDK4、與 Cyclins A、D1 及 D3 蛋白的表現量則無明顯變化。 免 疫 沈 澱 法 （ Immuno-precipitation Assay ） 的 實 驗 結 果 則 顯 示 DPTH-N10 能增加 p21 蛋白與 CDK2 的結合量。利用蛋白激酶活性試 驗（Kinase Activity Assay）結果顯示 DPTH-N10 處理後，COLO-205 細胞的 CDK2 激酶活性會有顯著的降低現象。綜合上述實驗結果顯 示，DPTH-N10 可藉由增加 p21 蛋白的表現量，增加 CDK2 與 p21 的 結合，而降低 CDK2 的激酶活性，並進而抑制大腸癌細胞的細胞週期 之進行。由於 DPTH-N10 可以直接抑制癌細胞的增生，又同時具有抑 制腫瘤新生血管（tumor angiogenesis）的雙重作用，非常有機會發展 8.
(9) 成為新一代的抗癌藥物。. 9.
(10) Abstract 5,5-diphenyl-2-thiohydantoin-N10 (DPTH-N10) is a synthetic derivative. compound. of. anti-epileptic. medicine. phenytoin. (5,5-diphenylhydantoin). Previously, we have shown that DPTH-N10 exerts an anti-angiogenesis activity. The aim of this study is to study the anti-proliferation effect of DPTH-N10 in colon cancer cells and its molecular mechanisms underlying.. [3H]-Thymidine incorporation. analysis demonstrated that DPTH-N10 at a range of concentrations (10-30 µM) dose-dependently inhibited DNA synthesis in human colon cancer cell line (COLO-205). Western blot analysis showed that the p21 protein, a cell cycle inhibitory protein, increased significantly after treatment of COLO-205 cells with DPTH-N10 for 24 hours. In contrast, the protein levels of CDK2, CDK4, and Cyclins A, D1 and D3 were not changed significantly.. Immuno-precipitation assay revealed that the. protein-protein association between p21 and CDK2 was increased after DPTH-N10 treatment.. Moreover, treatment of the COLO-205 with. DPTH-N10 caused a decrease of the CDK2 kinase activity.. Taken. together, in COLO-205, DPTH-N10 up-regulates the expression of p21 protein, which in turn increases the CDK2/P21 association and decreases 10.
(11) the CDK2 kinase activity, and finally causes cell cycle arrest at the G0/G1 phase. Due to the dual effects, including anti-angiogenesis and a direct inhibition of cancer cell proliferation, DPTH-N10 has a great potential to be developed as a new medicine for cancer treatment.. 11.
(12) 壹、緒論 緒論 一、癌症對人類健康的衝擊與大腸癌 根據衛生署公佈的十大死因，癌症已連續二十幾年蟬聯第一位。 因此，了解癌症的成因與治療，已成為醫學研究的當務之急。目前癌 症的治療方法，有手術切除、化學治療及放射線治療等。近年來，已 有 針 對 特 殊 癌 症 的 荷 爾 蒙 治 療 、 針 對 腫 瘤 新 生 血 管 (Tumor Angiogenesis) 的 抗 血 管 內 皮 生 成 因 子 抗 體 (Anti-VEGF antibody, anti-vascular endothelium growth factor)治療等新療法。. 大腸癌是世界上最普遍的惡性腫瘤之一。根據統計資料顯示， 大腸癌是世界癌症死亡原因的第二大主因。在西方國家，譬如美國， 大腸癌亦僅次於肺癌佔美國十大癌症第二位，每年就有十三萬三仟五 佰個新病例，每年死於大腸癌的人也有五萬四仟九佰人。大腸癌在亞 洲較西方國家少，可能和傳統飲食有關，例如日本雖然已經極度工業 化，但大腸癌數目仍遠低於胃癌，這可能是和日本人的飲食習慣較少 油脂有很大關聯。台灣近年來老年人口增加，同時因為油脂的攝取量 增加、食物中纖維的攝取量減少、飲食習慣逐漸西化，不但心臟血管 疾病增加，大腸癌的患者數目也持續的增加。 根據行政院衛生署的. 12.
(13) 統計資料，八十七年國人十大癌症排行榜中，無論男女大腸直腸癌都 佔第三位。. 大腸直腸上的任何部位都有可能發生癌變，但主要還是來自最 內層的表皮細胞的腺癌，佔了所有大腸直腸癌的百分之九十五以上。 一般而言大腸癌的發生通常需要好幾年的時間，在癌細胞出現之前會 有癌前病灶發生，如息肉或腺瘤。大腸上皮細胞轉變成為癌細胞的過 程 為 : 上 皮 細 胞 發 生 APC 基 因 突 變 形 成 早 期 腺 瘤 (early adenoma/dysplastic crypt) ，接著發生 K-RAS 或其他 oncogene 的突 變，產生後期腺瘤(late adenoma) ，之後發生 p53 基因突變使腺瘤轉 型成惡性腫瘤，這段過程必須花上好幾年的時間 (Fodde et al., 2001)。. 大腸癌發生的原因尚未完全了解，一般推測和飲食習慣有關，如 肉類、脂肪的攝取及蔬菜與纎維質不足有關。治療方式以外科手術治 療及放射治療為主，在早期癌症患者身上成功率較高，若早期發現尚 未轉移，病患的五年存活率可達 75%左右。化學藥物治療是已轉移患 者的輔助療法，但是若晚期才發現並已轉移，預後並不理想，五年存 活率大約只有 5~10% (Ries et al., 2000)，所以積極的發展新的療法是 需要努力的方向。. 13.
(14) 二、DPTH-N10 DPTH (5,5-diphenyl-2-thiohydantoin) 為 抗 癲 癇 藥 物 phenytoin (Dilantin; 5,5-diphenylhydantoin)之相似物(analogue)。本實驗室之前的 研究發現 DPTH 可以使人類臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cell; HUVEC)停止生長，並藉由增加 p21 蛋白的表現量而 使細胞週期停止在 G0/G1 期(Shih et al., 2004)。而之後的研究更進一 步合成出一系列的 DPTH 的衍生物，並發現其中 DPTH-N10(圖一)抑 制 HUVEC 生長的作用最強，高達 DPTH 的 5 倍之多(Cheng et al., 2008)。實驗發現 DPTH-N10 除了可以使 p21 蛋白增加、降低 CDK2 的 kinase 活性而抑制 HUVEC 生長，而且也初步發現對大腸癌細胞 COLO-205 的 DNA 合成有抑制作用(Liu et al., 2008)。. 三、細胞週期 一個真核細胞的生活週期是一種有條理的過程，細胞週期的進 行，是為了使 DNA 在 S 時期正確的複製，在 M 時期將複製過的染色 體平均分配至兩個子細胞中。這些過程的進行，都有不同的分子機制 在調控，並使細胞在受到非致命性傷害時能自行修復遺傳物質。 細 胞內各種調控機制能確保細胞的基因不產生突變、缺失或過度表現而 成為癌細胞(Sherr, 1996)。一個完整的細胞週期會經歷 G1 (Gap1). 14.
(15) phase, S (Synthesis) phase, G2 (Gap2) phase, M (Mitosis) phase, 最後分 裂成兩個子代細胞。而癌細胞與正常細胞相反，其特徵就是不受調控 的生長與分裂。細胞進入細胞週期時，主要由不同的 Cyclins 及 CDKs (Cyclin-dependent kinases)在特定的 check point 共同調控及作用來決 定是否進入下一個階段，或停留在目前的階段(Hunter and Pines, 1994)。而癌細胞內調控細胞週期的機制會產生突變，導致癌細胞往 往不受調控而開始失去秩序，不停地生長。. CDKs 主要促進細胞週期的進行，而 CDKs 蛋白需要 Cyclin 蛋白 來調控活性。不同的 Cyclin/CDKs complex 調控不同時期的細胞週 期。目前至少有九種不同的 CDK 及 12 種以上的 Cyclin 在調控細胞 週期，其中主要負責細胞週期進行的蛋白有: Cylin D/CDK4、Cyclin E/CDK2、Cyclin A/CDKS 及 Cyclin B/CDK1(CDC2) 。另外有些蛋白 質則是會抑制 CDKs 及 Cyclin 的作用使細胞週期停頓下來，如 APC、 p21、p27 及 p53 等。而癌細胞則因為某些突變使原本能抑制細胞週 期進行的蛋白質失去功能，如大腸癌細胞被發現往往會有 APC 與 p53 基因的突變導致細胞週期失控，使細胞不停的分裂生長。. G1 時 期 主 要的 調控 蛋 白 是 CDK2, CDK4, CDK6, CyclinD1,. 15.
(16) CyclinD3 及 CyclinE; 早期及中期由 D type Cyclins/CDK4 及 CDK6 調 控; 晚期由 D type Cyclins/CDK4、CDK6 及 Cyclin E/CDK2 共同調 控。CDKs 和 Cyclins 結合後結構改變，使 CDKs T-loop 的位置具有被 磷 酸 化 及 受 質 結 合 的 能 力 (Kelly et al., 1998) 。 其 受 質 是 tumor suppressor gene RB 製造的 Rb 蛋白。研究指出，不同的 CDKs 可將 Rb 不同位置磷酸化，磷酸化後釋放 E2F。E2F 調控負責 DNA 合成基 因的表現(Weinberg, 1995)。Rb 磷酸化是細胞通過 restriction point 的 關鍵。有研究指出，Rb 過度表現的細胞不需要 Cyclin 和 CDK 的活 性就能進行細胞週期，顯示 Rb 在細胞週期的調控非常重要(Lundberg and Weinberg, 1999)。當細胞決定由 G1 期進入 S 期, 會停留在 checkpoint 檢查一下，確定細胞已經為分裂做好準備，如果基因受到 化學或物理損害、spindle 不正常糾結，或是促進細胞週期進行的機制 受到抑制，細胞會停下來進行檢查和修復，再繼續進行細胞週期。p53 蛋白在細胞 DNA 受損 30 分鐘之後表現量便會增加，DNA 受損時會 活化 ATM/ATR 或 DNA PK 以促進 p53 的穩定度，此時 p53 當作 transcription factor，活化其下游基因 p21 蛋白的表現。p21 可以藉由 和 Cyclin/CDKs 形成 ternary complex 抑制 CDKs 活性而抑制細胞週期 的進行(Xiong et al., 1993)。至於 p27 在 G1 時期會結合在 CDK2 的 AT 位置上導致 Cyclin E/CDK2 無法作用，使細胞停留在 G1 期無法進入. 16.
(17) 到 S 時期，一直到 p27 被分解之後，Cyclin E/CDK2 會恢復活性，細 胞繼續進入 S 時期(Coats et al., 1996)。. S 時期早期調控的蛋白是 Cyclin E/CDK2。Cyclin E/CDK2 主要和 centrosome 的複製有關，CDK2 的活性則和 DNA 複製相關。S 時期 的晚期 Cyclin A 和 CDK2 形成複合物，再和 CDC2 形成複合物，此 複合物一直持續到 G2/M 時期 Cyclin B 出現和 CDC2 形成複合物，推 動一系列細胞進行分裂所必需的機制為止。. DNA 複製完成後進入 G2/M 時期，此時的 mitotic CDK complex 包括 Cyclin A/CDC2 及 Cyclin B/CDC2, 活化之後造成染色體聚集， 核膜破裂，細胞質分離產生兩個子細胞。. 四、 研究目的 在全世界，大腸癌已是因癌症而死亡的主要原因之一，有將近 20%的病人在診斷出大腸癌時已出現轉移現象。而在過去 10 年中， 因為各種化療藥物的發展，使得病人對藥物的反應及存活率獲得改 善。除了經美國 FDA 核可關於細胞毒素的藥物(cytotoxic agents): irinotecan (Camptosar)、oxaliplatin (Eloxatin)及 capecitabine (Xeloda). 17.
(18) 之外，由於近年來，有關於細胞週期、細胞凋亡(apoptosis)及血管新 生（angiogenesis)等分子調控途徑的了解，在癌症治療上發展出許多 新 的 標 靶 治 療 。 Bevacizumab (Avastin) 可 抑 制 血 管 內 皮 生 長 因 子 (vascular endothelial growth factor)的作用而達到抑制血管增生的效果; cetuximab (Erbitux)及 panitumumab (Vectibix)兩者皆為上皮生長因子 (epidermal growth factor)接受器的抗體，以上幾種藥物已在臨床上證 明了它們的療效(Pohl et al., 2008)。如何發展更有效的抗癌藥物是目 前的研究趨勢。. 本研究的目的是在探討 DPTH-N10 直接抑制大腸癌細胞增殖現 象及其分子作用機制。由於血管新生（angiogenesis)對癌細胞的生長 及轉移之重要性已被廣泛的接受 (Folkman, 1971; O'Reilly et al., 1994)，因此臨床上持續在尋找針對抑制血管新生來幫助惡性腫瘤的 治療方式。根據本實驗室的先前研究及本計畫之研究結果顯示 DPTH-N10 具有抑制血管新生及直接抑制癌細胞增殖的雙重機制，因 此非常有希望發展成為新一代的抗癌藥物。. 18.
(19) 貮、實驗材料與方法 一、 常用藥品及試劑 (一) 常用溶液 1. Phosphate Buffer Saline (PBS) 0.14M NaCl, 2.7mM KCl, 1.5mM KH2PO4, 8.1mM NaHPO4 2. SDS-PAGE electrophoresis buffer (running buffer) 25mM Tris-HCl, 250mM glycine, 0.1% SDS, ddH2O, 調整至 PH 值 8.3 3.Towbin transfer buffer (for Western blotting) 25mM Tris base, 192mM glycine, 20% methanol, dd H2O, 調整至 PH 值 8.3 4.TBS-T buffer 10mM Tris (PH7.5), 100mM NaCl, 0.1% Tween-20 5.Western sample buffer (loading eye) 100mM Tris(PH6.8), 200Mm DTT, 4% SDS, 0.2% bromophenol blue, 20% glycerol 6.protein lysis buffer (Gold buffer) 137mM NaCl, 10mM NaF, 5mM EDTA, 1mM EGTA, 20mM Tris(PH7.9), 10%(v/v)glycerol, 1% triton X-100, 1mM sodium. 19.
(20) orthovanadate(Na3VO4),1mM. sodium. pyrophosphate. (Na2H2P2O7-NaPP), 1mM PMSF, 10µg/ml leupeptin ( 或 以 proteinase inhibitor cocktail 取代上述 proteinase inhibitors) 7.Immunoprecipitation buffer (I.P. buffer) 10mM Tris PH7.4, 150mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.5%NP-40, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 0.2mM sodium orthovanadate, 0.2mM PMSF, 10µg/ml aprotinin, 1µg/ml leupeptin 8.Kinase buffer 50mM HEPES PH7.4, 10mM MaCl2, 2.5mM EDTA, 10mM β-glycerophosphate, 1mM NaF, 1mM DTT(dithiothreitol), 10mM PNPP(p-nitrophenylphosphate), 300µM. sodium orthovanadate,. 1mM benzamidine, 10µg/ml aprotinin, 1µg/ml leupeptin. (二) 藥品試劑 DPTH-N10（由臺北醫學大學藥學系吳建德老師實驗室合成）、 40% acrylamide (購自 Bio-Rad)、95% ethanol (購自美美科技) 、 Ammonium persulfate (購自 Bio-Rad)、BSA 蛋白質濃度測定組(購自 SIGMA) 、DMEM medium (購自 GibcoBRL) 、Fetal bovine serum (購 自 Hyclone) 、Isotone(購自 BECKMAN COULTER) 、RPMI 1640. 20.
(21) medium powder ( 購 自 GibcoBRL) 、 [Methyl-3H]-thymidine ( 購 自 DuPont/NEN) 、MTT (購自 SIGMA) 、Scintillation cocktail solution (購 自 National diagnostics) 、TEMED (購自 Bio-Rad)、Trichloroacetic acid (購自 SIGMA) 、Trypsin-EDTA (購自 GibcoBRL) Alkaline phophatase-conjugated goat anti-mouse IgG(H+L) (購自 Jackson)、Alkaline phophatase-conjugated goat anti-rabbit IgG(H+L) (購 自 Jackson)、Anti-alpha tubulin mouse immunoaffinity purified IgG (購 自 2YMED laboratories) 、Anti-cdk2 mouse immunoaffinity purified IgG (購自 Transduction laboratories) 、Anti-cdk4 mouse immunoaffinity purified IgG (購自 Transduction laboratories) 、Anti-cyclin A rabbit immunoaffinity purified IgG ( 購 自 Transduction laboratories) 、 Anti-cyclin D1 mouse immunoaffinity purified IgG (購自 PharMingen International) 、Anti-cyclin D3 mouse immunoaffinity purified IgG (購自 Transduction laboratories) 、Anti-cyclin E rabbit immunoaffinity purified IgG (購自 upstate biotechnology) 、Anti-G3PDH mouse immunoaffinity purified IgG ( 購 自 Biogenesis) 、 Anti-p21 mouse immunoaffinity purified IgG ( 購 自 Transduction laboratories) 、 Anti-p21 mouse immunoaffinity purified IgG (購自 Transduction laboratories) 、Anti-p27 mouse immunoaffinity purified IgG (購自 Transduction laboratories) 、. 21.
(22) Anti-p53 mouse immunoaffinity purified IgG (購自 Santa Cruz) (三) 常用儀器 倒立式相位差顯微鏡: OLYMPUS 細胞培養盤: IWAKI 75mm BD tube: FALCON 離心管: NUNC Brand Products 細胞培養箱(Incubator): Nuaire CO2 water-jacketed incubator 無菌操作台(Laminar Flow): 海天 4BH-24 振盪器: Vortex-2 genin 乾浴槽: Multi-Block Heater(Lab-Line) 水浴槽: YIHDERN BT-150 烘箱: Cherng Huei 高轉速離心機: Kubota 1820; Kubota 中型離心機: Digisystem laboratory instrument, INC. 垂直式電泳槽: Hoefer SE400(Bio-Rad) 電源供應器(Power Supply): OWL OSP-105 電轉印槽(electrotransfer tank): Hoffer TE 42 酸鹼測定儀(PH meter): Radiometer Copenhagen PHM 210 高壓殺菌斧: Tomin. 22.
(23) 加熱板: corning stirrer/hot plate 天平: AND EK-120A 分光光度計(Spectrophotometer): Hitachi 超低溫冷凍櫃: Puffer Hubbard(Harris Manufacturing Company) Shacker: Digisystem laboratory instrument, INC. DSR2800V 閃爍計數器（Scintillation Counter）: BD Incorporation Beta-counter. 二、 細胞培養 (cell culture) 以 RPMI1640 medium (內含 10% FBS 及 1% kanamycin) 培養大 腸癌細胞株 COLO-205 於 10 cm 直徑的培養皿之中（約 20,000 顆細 胞/盤）, 並將培養皿放置在細胞培養箱(溫度 37℃、溼度 9.8%、CO2 含量 5%)中培養。每二到三日更換培養液。約 3 到 4 天細胞密度會達 到細胞與細胞相接觸的程度（confluence） 。即到達繼代（passage）的 時機。. 繼代時，將培養液吸乾，以 5 mL 的 1X PBS 清洗並吸除，加入 1 mL 的 0.05% Trypsin-EDTA, 放入培養箱中維持 37℃約 3 分鐘，並適 度地敲擊培養皿底部，使細胞從培養皿分離。此時加入 4 mL 的 RPMI 1640 medium 終止 Trypsin-EDTA 的作用。離心除去上清液，留下細 胞丸團（pellet）。以適度地機械性拍打振動使細胞丸團與試管分離 23.
(24) 後，再加入 10% FBS-RPMI 1640 培養液，將細胞打散成單一細胞, 均 勻分布於培養液中, 可繼代至四到六盤的培養皿。. 3. 三、 H-Thymidine Incorporation Assay 將細胞種在 24-well 培養盤（約 2,000 顆細胞/well）中，待細胞 長至 6~7 分滿時，加入 0.04 % FBS 的 medium 培養 24 小時，使大部 份細胞停滯在 G0/G1。將培養液中的 FBS 增加至 10 %並同時予以加 藥處理，在收實驗的時間點前 3 小時加入[methyl-3H]- Thymidine 0.5~1µCi/mL，再放回培養箱繼續培養。到時間點時，以冰的 PBS 沖 洗後，加入 10% TCA (trichloroacetic acid)在 4℃作用一個晚上，倒掉 TCA 後以 95%酒精沖洗一次，並待酒精自然揮發乾燥，最後加入 0.2N NaOH，在室溫輕微振盪作用 1 小時。從每個 well 中取出 200 mL 加 入 3 mL 的 scintillation cocktail solution(閃爍計數液)充分混合均勻後 放隔夜至透明，即可利用 beta counter 測量其 DPM 值。. 四、 細胞毒性測試(MTT assay) MTT (Methylthiazoletetrazolium)是一種水溶性的 tetrazolium 鹽 類，溶在不含 phenol red 的溶液中呈現黃色。MTT 的 tetrazolium ring 會被細胞內的 dehydrogenase 切除，轉為紫色不溶性沉澱物。使用. 24.
(25) DMSO 將細胞打破後，此沉澱物溶解所產生顏色的深淺，代表細胞內 酵素活性的強弱，可當作細胞存活的指標。. 人類大腸癌細胞 COLO-205 培養於 6 well 培養盤（約 10,000 顆 細胞/盤）中，生長 24 小時後加入所要試驗的藥物，經特定時間培養， 測試時，在每一 well 中加入 1/10 原有培養液體積的 MTT stock solution (5 mg/ml)作用 4~6 小時，此時若在顯微鏡下觀察，會出現許多深紫色 的針狀結晶。接著以高濃度 DMSO（原液）將細胞打破，再以 ELISA reader 分別測試各組在波長 550 nm 下的吸光值 。. 五、 西方墨點法(Western Blot Analysis) I.萃取細胞蛋白質與蛋白質定量 II.蛋白質分析：SDS-PAGE 電泳 III.蛋白質轉印（Protein transfer） IV.免疫墨點法（immunoblot）. I.萃取細胞蛋白質與蛋白質定量 將大腸癌細胞(COLO-205)養在 10 公分的培養皿中，當細胞長至 約 6~7 分滿時，改以用以不含 FBS 的 RPMI1640 來培養細胞，24 小. 25.
(26) 時後，再以 10% FBS 的 RPMI1640 含不同濃度的藥物或溶劑（如 DMSO 等）處理特定時間。當達到處理時間時，將培養皿放置冰上， 將原本的培養液倒掉，用 1X PBS wash 一次後，在加入適量的 PBS， 用細胞刮取器(cell lifTer)收集細胞至 15 mL 離心管中，重複三次，將 離心管以 3000 rpm 離心約 5 分鐘，去除上清液後，加入適量 Gold 與 細胞均勻混合，放在冰上作用 1 小時，再以 12000 rpm、4℃離心 30 分鐘，取上層溶液即所萃取的蛋白質樣品。準備 4X 的 Protein assay dye 以去離子水稀釋成 1X，將 BSA 標準樣品(0.125、0.25、0.5、1、及 2 mg/mL)與蛋白質樣品分別和 Protein assay dye 容易混合均勻，以分光 光度計(spectrophotometer) 595 nm 測定其吸光值，將 BSA 標準樣品之 吸光值經過計算，作成一條標準回歸曲線，並求得線性方程式，將欲 求蛋白質樣品吸光值帶入公式中，即可求得蛋白質樣品的濃度，最後 將蛋白質樣品保存於-80℃冰箱中備用。. II.蛋白質分析：SDS-PAG 電泳(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) 凝膠配方 Resolving Gel：ddH2O、3M Tris-HCl (PH8.9)、40% Acrylamide、10% SDS、10% Ammonium Persulfate (APS)、TEMED. 26.
(27) Stacking Gel： ddH2O、1.5M Tris-HCl (PH6.8)、40% Acrylamide、10% SDS、10% Ammonium Persulfate (APS)、TEMED 先將雙層玻璃洗淨架好，把依照配方泡好的 resolving gel 加入玻 璃中約 2/3，待其凝固後再把上層 1/3 部分加入 stacking gel 並插上 comb 製造凹槽(well)。凝固後將夾有 gel 的玻璃放置在電泳槽中，內 外注入電泳緩衝溶液(PAGE running buffer)，將欲分析的蛋白質樣本 加入 4X SDS/protein loading dye，均勻混合並於 95℃作用 5 分鐘，再 迅速至於冰上冷卻，冷卻後將蛋白質分別加入凝膠上的 well 中，接 上電源進行電泳分析，觀察 maker 或 loading dye 跑至適當位置時停 止，便可進行準印。. III.蛋白質轉印（Protein transfer） 將硝化纖維膜(Hybond-PVDF transfer membrane)裁成適當大小， 泡在甲醇活化，再浸在 towbin transfer buffer 中待用。轉印夾中夾入 海棉及濾紙先放入 towbin transfer buffer 中浸濕，將跑完的 gel 小心去 除上半 stacking gel 的部分，剩下 resolving gel 放入 towbin buffer 中， 取出轉印夾操作轉印步驟，轉印夾由負極到正極依序為海綿→濾紙 →gel→PVDF membrane→濾紙→海綿，確定濾紙和 gel 之間與 gel 和. 27.
(28) membrane 之 間 沒 有 氣 泡 存 在 ， 將 裝 置 好 的 轉 印 夾 放 入 轉 印 槽 (transfer-tank) 中 ， 以 75mA/25V 轉 印 需 時 18 小 時 以 上 ， 或 以 400mA/100V 轉印需時約 1~3 小時。. IV.免疫墨點法（immunoblot） 轉印完成後，將 membrane 取出至於 1%BSA/0.02%NaN3 中 1 小 時，之後以 TBST wash 5 分鐘，再放入已固定比例稀釋的初級抗體 (Primary Ab)於室溫下均勻作用搖一個小時，至於 4℃作用 overnight， 要換次級抗體前先以 TBST 清洗 5 分鐘 3 次，接著加入次級抗體於 室溫下作用一個小時，最後以 TBST 清洗 5 分鐘至 1 個小時，待作 用完成後加入 ECL 拍照。. 六、 免疫沉澱法(Immunoprceipitation) 取 200 µg 的蛋白質萃取液，加入欲抓取蛋白質的抗體(濃度為 2 mg/mL)，於 4℃均勻作用一個晚上。次日在加入 1/10 總體積的 protein A Sepharose，同樣於 4℃均勻作用一個晚上。之後以 4℃、8000 rpm 離心 5 min，去除上清液，重複此步驟 2~3 次。最後留下體積約 20 λ 的 beads 與 buffer。加入 loading dye 後於 95℃加熱 5 分鐘，接下來的 步驟與西方墨點法相同，電泳分離、轉印、免疫墨點法。. 28.
(29) 七、 蛋白激酶活性測定(kinase assay) (a) Immunoprecipitation 準備蛋白質萃取液(200~500 µg)添加欲抓取的抗體(1~2 µg)，再加 入 protein A/G-PLUS agarose(15~20 µg)，於 1mL I.P. buffer 中 4℃均勻 搖晃作用一個晚上。. (b) Wash 以 1000~7000 rpm 離心 30 秒，吸掉上清液，添加 1mL I.P. buffer 上下搖晃幾下，在吸取掉上清液，重複此動作約 3 次，接下來將 I.P. buffer 換成 kinase buffer，同樣步驟清洗 3 次，最後一次清洗後留下 beads 和 kinase buffer 體積約 20 λ。. (c) kinase reaction 加著加入 20 λ 泡製好的 kinase buffer 內含 1~5 µM cold ATP， 0.1~0.5λ fresh [γ-32P]ATP(5000Ci/mmol) ， 1µg GST fusion protein (Histone 或 RB)當作受質，於 30℃或室溫下均勻作用 20~30 分鐘。. (d)Stop reaction & Separation 之後添加 8 λ 6 倍濃度的 Laemmli’s loading buffer 來終止反應，. 29.
(30) 以 100℃加熱 10~20 分鐘，然後同樣以西方墨點法 SDS-PAGE 跑電泳。 (e)Autoradiography 以乾燥機將膠去水分乾燥，以 Autoradiography 顯影呈色。. 30.
(31) 參、實驗結果分析 一、 DPTH-N10 抑制人類大腸癌細胞 COLO-205 的增殖 甲、DPTH-N10 抑制 COLO-205 的[3H]-thymidine incorporation 先 以 含 有 低 濃 度 胎 牛 血 清 （ 0.04% FBS ） 的 細 胞 培 養 液 對 COLO-205 細胞進行培養 24 小時（starvation 或 quiescence），使大部 份 細 胞 停 滯 在 細 胞 週 期 G0/G1 。 再 以 含 有 0 µM （ 僅 含 有 溶 劑 DMSO）、10 µM、20 µM 及 30µM 等不同濃度的 DPTH-N10 及高濃 度胎牛血清（10 % FBS）的細胞培養液進行細胞培養 24 小時。在培 養的最後的三小時加入以[3H]標定的 thymidine 於細胞培養液中，觀 察 DPTH-N10 對 COLO-205 細胞 DNA 合成的影響。結果顯示 DPTH-N10 對於 COLO-205 細胞的 DNA 合成具有抑制作用，且隨著 DPTH-N10 劑量的增加，有漸強的抑制效果（圖三） 。同時 COLO-205 的細胞數目也受到 DPTH-N10 的影響而減少，而此抑制作用為可逆 性，當 DPTH-N10 由培養液中移除時則其所造成的生長抑制作用會有 恢復的現象。（圖四）. 乙、 DPTH-N10 不會明顯影響 COLO-205 細胞的存活率 由於 DPTH-N10 造成 COLO-205 的[3H] thymidine incorporation. 31.
(32) 的量減低，有可能是因其使細胞週期的進行發生停滯現象，或是因為 DPTH-N10 影響造成細胞死亡所引起，因此我們以 MTT cell viability assay 來評估 DPTH-N10 對 COLO-205 的細胞存活率的影響。結果如 圖五所顯示，DPTH-N10 在抑制 COLO-205 細胞生長的濃度並不會明 顯影響 COLO-205 細胞的存活率。. 綜合甲、乙兩點，DPTH-N10 抑制 COLO-205 細胞的[3H] thymidine incorporation，主要是使細胞週期停滯於 G0/G1 期，而達到抑制細胞 週期的進行，進而阻礙細胞的增殖。. 二、 DPTH-N10 對 COLO-205 細胞內細胞週期調控蛋白表現 的影響 細胞週期的運行主要是受到一些蛋白質(CDK)的調控。為了瞭解 DPTH-N10 對細胞週期調控蛋白表現的影響，先以含有低濃度胎牛血 清（0.04% FBS）的細胞培養液對 COLO-205 細胞進行培養 24 小時 （starvation 或 quiescence），使大部份細胞停滯在細胞週期 G0/G1。 再以含有 0 µM （僅含有溶劑 DMSO） 、10 µM、20 µM、及 30 µM 濃度的DPTH-N10 及高濃度胎牛血清（10 % FBS）的細胞培養液 進行細胞培養 24 小時後，再以西方墨點法（Western Blot Analysis）. 32.
(33) 分析調控細胞週期的蛋白質變化結果如下：. 以 DPTH-N10 及 10 % FBS 處理 24 小時之後的 p21 及 p27 蛋白 的西方墨點法分析結果如圖六。細胞週期的抑制蛋白(CKI) p21 的量 相較於控制組有明顯增加，p27 蛋白質的量雖時有增加，但重現性較 差。 以 DPTH-N10 及 10 % FBS 處理 24 小時之後，CDK2 及 CDK4 的西方墨點法分析結果如圖七。相較於對照組，CDK 2 及 CDK 4 的 表現量並無明顯的變化。 以 DPTH-N10 及 10 % FBS 處理 24 小時之後 Cyclins 的西方墨點 法分析結果如圖八。細胞內的 cyclins A、D1 及 D3 的表現量相較於 對照組並無明顯的變化。Cyclin E 的量則在 20-30 µM 的 DPTH-N10 的處理下，有減少的現象。. 綜合以上西方墨點法的分析結果，以 DPTH-N10 處理 COLO-205 細胞 24 小時之後，會引發細胞內的 p21 蛋白的表現量增加，CDK 2、 CDK 4、與 cyclins A、D1 及 D3 的表現量則沒有明顯變化。p27 蛋白 的表現量雖然時有增加，但重現性較差。Cyclin E 的表現量在高濃度 DPTH-N10 的處理下，會有減少的現象。因此，DPTH-N10 抑制. 33.
(34) COLO-205 細胞增殖，可能是藉由調控細胞內 p21 蛋白（p27 蛋白或 許也有關聯）的表現量，來抑制細胞週期的進行。另外，因為 Cyclin E 也參與了 G1/S check-point 的調控（如圖二），cyclin E 表現量的減 少，可能也會減緩細胞週期的進行。. 三、 DPTH-N10 促進 COLO-205 細胞內 p21 與 CDK 2 的蛋 白結合 p21 及 p27 對於細胞週期運行的調控，是藉由結合到 CDK，而抑 制 CDK 與 cyclin 的結合，進而降低了 CDK 的活性。為了進一步瞭解 p21 及 p27 在 細 胞 內 的 作 用 狀 況 ， 我 們 以 免 疫 沈 澱 （Immuno-precipitation, IP）的方法，將 quiescence 過後的細胞以 DPTH-N10 及 10 % FBS 處理 24 小時之後，打破細胞抽取蛋白質，再 以 CDK 2 或 CDK 4 的抗體連接至 Protein A Sepharose 的 beads，抓取 連結在 CDK 2 或 CDK4 上的相關蛋白質，再以 immunoblot 的方法來 觀察 p21 及 p27 蛋白在細胞內與 CDK 2 及 CDK 4 蛋白的結合量的變 化。結果如圖九，DPTH-N10 會促進 p21 與 CDK 2 的結合，但 p27 與 CDK 2 的結合，以及 p21 及 p27 與 CDK 4 的結合則無顯著的變化。. 四、 DPTH-N10 抑制 COLO-205 細胞的 CDK2 激酶活性 34.
(35) 為了驗證細胞內 p21 蛋白質量的增加，對 CDK 2 及 CDK 4 激酶 活性的影響，我們先以免疫沈澱法的方式抓取細胞內的 CDK 2 及 CDK 4 蛋白，再分別加入的 CDK 2 及 CDK 4 的受質(substrate)，並以 放射性標定的磷（32P）來作用，以對其受質磷酸化的作用觀察 DPTH-N10 對 CDK 2 及 CDK 4 的激酶活性的影響。其結果如圖九， DPTH-N10 會抑制 CDK 2 的激酶活性，但對 CDK 4 的激酶活性則無 明顯的影響。. 35.
(36) 肆、討論 細胞週期的進行，是受許多細胞內蛋白質的調控。其目的在於確 保細胞增殖的每一個步驟能正確地進行。目前已知的重要細胞週期調 控蛋白，包括了各類的 cyclin、cyclin-dependent kinase (CDK)、及 cyclin-dependent kinase inhibitory proteins (CKI, p21 及 p27 為其中的兩 種)，來提供正向及負向的調控。在細胞中，CDK 的活性會受到 cyclins 及 CKIs 的調控;當 cyclins 結合到 CDK 時會促使其活性增加。相反的， 當 CKIs 結合到 CDK 時會阻礙 cyclins 與 CDK 的結合進而抑制了 CDK 的活性。因此，若 p21 或 p27 過度表現，則會抑制細胞的增殖(Xiong et al., 1993)。. 我們的研究結果顯示，DPTH-N10 可以抑制人類大腸癌細胞的增 殖，而此抑制作用具可逆性，當 DPTH-N10 由培養液中移除時則其所 造成的生長抑制作用會有恢復的現象(圖四) 。DPTH-N10 對於人類大 腸癌細胞的增生抑制作用是藉由調控 p21 蛋白質的表現量上昇，使細 胞內 p21 蛋白與 CDK 2 的結合量增加，而抑制 CDK 2 的激酶活性， 進而使細胞週期停滯。此結果與本實驗室先前的研究結果：DPTH-N10 抑制人類血管內皮細胞增殖的機轉主要是藉由增加 p21 蛋白質的表 現量上昇而使細胞週期停滯的情形相類似(Liu et al., 2008)。 36.
(37) 在已轉型（transform）的癌細胞，p21 常與 Cyclin/CDK 複合體 脫離，造成其細胞週期的調控不同於正常細胞，而有不斷的增生現 象。在本實驗中，COLO-205 細胞株（已轉型的癌細胞株），受到 DPTH-N10 的處理之後，細胞內 p21 的表現量有顯著的增加，而使癌 細胞的細胞週期進行有延緩遲滯的現象。這結果同時顯示 COLO-205 內的 p21 仍具有正常功能，只是因為不清楚的原因使其表現量下降而 使癌細胞的細胞週期調控逃脫了正常的管控。. 至於 DPTH-N10 藉由什麼樣的機制來增加 p21 蛋白的表現，在本 實驗中並未探討，仍需要進一步的研究才能有答案。然而本實驗室先 前的研究中發現中草藥厚朴所提煉出來的主要成份 Magnolol 對大腸 癌細胞 COLO-205 生長抑制作用的機轉探討中發現，Magnolol 會藉 由影響 Ras/Raf-1/ERK 所調控的途徑來增加大腸癌細胞內 p21 蛋白的 表現量，進而使細胞週期停滯在 G0/G1 期(Hsu et al., 2007)。DPTH-N10 造成 p21 蛋白在 COLO-205 大量的表現，是否也是經由同樣的機制， 則需要進一步去探討。過去的研究指出 p21 是 p53 的下游分子，p21 在細胞內的表現也往往受到 p53 的調控。然而本實驗室先前在血管內 皮細胞的實驗結果顯示 HUVEC 內的 p53 表現並不受到 DPTH-N10 的影響，顯示 DPTH-N10 在 HUVEC 細胞內造成 p21 表現的增加可能. 37.
(38) 不受 p53 的影響。在 COLO-205 內 p21 表現的增加是否也不受 p53 的 影響，則有待進一步證實。 p27 蛋白的表現量雖然時有增加，但重現性較差。DPTH-N10 的 前驅物 DPTH 抑制 HUVEC 細胞週期時，也有類似的現象（Shih et al, 2004）。但由於 p27 與 CDK2、CDK4 的細胞內結合量（圖九）並沒 有明顯增加，因此 p27 蛋白參與 DPTH-N10 抑制大腸癌細胞週期的調 控可能與 p21 蛋白比較起來，較不重要。另外，由於 cyclin E 在 20 – 30 µM 濃度的 DPTH-N10 處理之下有下降的情形，而 cyclin E 會與 CDK 2 結合來調控 G1/S check point，因此，cyclin E 的下降，可能為 DPTH-N10 抑制大腸癌細胞增殖的另一分子機制。. 雖然在本實驗室先前的研究已經證實 DPTH-N10 對於血管內皮 增生、類似微血管的生成作用(capillary-like tube formation)及血管的生 成都具有抑制作用(Liu et al., 2008) ，而本實驗也證實 DPTH-N10 對 於 COLO-205 的生長也有抑制作用，然而當藥物要應用於動物體內的 治療時仍需面對藥物的輸送、代謝及濃度等問題。值得注意的是當 DPTH-N10 濃度高於 30 µM 時，對於 COLO-205 及血管內皮細胞都 會造成死亡的現象(數據沒有顯示)。因此進行動物實驗來解決這些問 題是我們下一步該努力之處。在動物模式上證明 DPTH-N10 之抑癌 作用，可以利用在裸鼠（Nude mice）的皮下種植癌細胞，同時在腹 38.
(39) 腔內注射 DPTH-N10 的方式來研究藥物的實際抗癌效果。. 先前有文獻報導，某抗癲癇藥物對癌症具有療效，並對細胞週期 的進行產生影響(MacKinney et al., 1988; Olsen et al., 2004; Tittle and Schaumann, 1992)。抗癲癇藥物的合成類似化合物 DPTH 已在本實驗 室的研究下被證明有抗血管增生的効果(Shih et al., 2004)。經過改變 各種取代基的嘗試，DPTH-N10 在 DPTH 的衍生化合物之中，具有最 強的抗血管增生效果(Cheng et al., 2008)，相較於 DPTH，約有 5 倍的 抗血管增生作用。本研究顯示，DPTH-N10 在具有抗血管增生作用的 濃度之下，同時具有抑制大腸癌細胞增生的作用。因此，DPTH-N10 同時具有直接抑制癌細胞的增殖及抑制腫瘤新生血管的雙重作用，應 極有潛力被發展為新的抗癌藥物。. 為能早日應用在臨床治療上，未來的研究方向，除了以動物實驗 來驗證 DPTH-N10 的抗癌效果之外，也應探討藥物動力學及給藥途 徑。大腸癌的臨床治療上，已有多種化學治療的藥物及抗腫瘤新生血 管藥物。DPTH-N10 與這些藥物的交互作用及療效比較，及該如何在 不同的病患給予治療上的選擇，將是未來臨床應用上的重要課題。. 39.
(40) 伍、參考文獻 Cheng, C. K., J. Wu, Y. Liu, T. S. Lee, S. J. Kang, M. T. Sheu, and W. S.. Lee,. 2008,. Structure. and. anti-proliferation. function. of. 5,5-diphenyl-2-thiohydantoin (DPTH) derivatives in vascular endothelial cells: Vascul Pharmacol, v. 48, p. 138-42. Coats, S., W. M. Flanagan, J. Nourse, and J. M. Roberts, 1996, Requirement of p27Kip1 for restriction point control of the fibroblast cell cycle: Science, v. 272, p. 877-80. Fodde, R., J. Kuipers, C. Rosenberg, R. Smits, M. Kielman, C. Gaspar, J. H. van Es, C. Breukel, J. Wiegant, R. H. Giles, and H. Clevers, 2001, Mutations in the APC tumour suppressor gene cause chromosomal instability: Nat Cell Biol, v. 3, p. 433-8. Folkman, J., 1971, Tumor angiogenesis: therapeutic implications: N Engl J Med, v. 285, p. 1182-6. Hsu, Y. F., T. S. Lee, S. Y. Lin, S. P. Hsu, S. H. Juan, Y. H. Hsu, W. B. Zhong, and W. S. Lee, 2007, Involvement of Ras/Raf-1/ERK actions in the magnolol-induced upregulation of p21 and cell-cycle arrest in colon cancer cells: Mol Carcinog, v. 46, p. 275-83. Hunter, T., and J. Pines, 1994, Cyclins and cancer. II: Cyclin D and. 40.
(41) CDK inhibitors come of age: Cell, v. 79, p. 573-82. Kelly, B. L., K. G. Wolfe, and J. M. Roberts, 1998, Identification of a substrate-targeting domain in cyclin E necessary for phosphorylation of the retinoblastoma protein: Proc Natl Acad Sci U S A, v. 95, p. 2535-40. Liu, Y., J. Wu, P. Y. Ho, L. C. Chen, C. T. Chen, Y. C. Liang, C. K. Cheng,. and. W.. S.. Lee,. 2008,. Anti-angiogenic. action. of. 5,5-diphenyl-2-thiohydantoin-N10 (DPTH-N10): Cancer Lett, v. 271, p. 294-305. Lundberg, A. S., and R. A. Weinberg, 1999, Control of the cell cycle and apoptosis: Eur J Cancer, v. 35, p. 531-9. MacKinney, A. A., Jr., L. Knobeloch, and D. Norback, 1988, The effect of diphenylhydantoin and cortisol on the cell cycle: Proc Soc Exp Biol Med, v. 188, p. 173-6. O'Reilly, M. S., L. Holmgren, Y. Shing, C. Chen, R. A. Rosenthal, M. Moses, W. S. Lane, Y. Cao, E. H. Sage, and J. Folkman, 1994, Angiostatin: a novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma: Cell, v. 79, p. 315-28. Olsen, C. M., E. T. Meussen-Elholm, L. S. Roste, and E. Tauboll, 2004, Antiepileptic drugs inhibit cell growth in the human breast cancer. 41.
(42) cell line MCF7: Mol Cell Endocrinol, v. 213, p. 173-9. Pohl, A., W. Zhang, Y. Ning, P. C. Manegold, G. Lurje, and H. J. Lenz, 2008, Targeting metastatic colorectal cancer in 2008: a long way from 5-FU: Oncology (Williston Park), v. 22, p. 456-62; discussion 462-3, 467-8, 474 passim. Ries, L. A., P. A. Wingo, D. S. Miller, H. L. Howe, H. K. Weir, H. M. Rosenberg, S. W. Vernon, K. Cronin, and B. K. Edwards, 2000, The annual report to the nation on the status of cancer, 1973-1997, with a special section on colorectal cancer: Cancer, v. 88, p. 2398-424. Sherr, C. J., 1996, Cancer cell cycles: Science, v. 274, p. 1672-7. Shih, C. R., J. Wu, Y. Liu, Y. C. Liang, S. Y. Lin, M. T. Sheu, and W. S. Lee, 2004, Anti-proliferation effect of 5,5-diphenyl-2-thiohydantoin (DPTH) in human vascular endothelial cells: Biochem Pharmacol, v. 67, p. 67-75. Tittle, T. V., and B. A. Schaumann, 1992, Effect of antiepileptic drugs on growth of murine lymphoid tumor cells in single-cell culture: Epilepsia, v. 33, p. 729-35. Weinberg, R. A., 1995, The retinoblastoma protein and cell cycle control: Cell, v. 81, p. 323-30.. 42.
(43) Xiong, Y., G. J. Hannon, H. Zhang, D. Casso, R. Kobayashi, and D. Beach, 1993, p21 is a universal inhibitor of cyclin kinases: Nature, v. 366, p. 701-4.. 43.
(44) 陸、附圖. 圖一、Phenytoin (5,5-diphenylhydantoin,DPH)、 5,5-diphenyl-2-thiohydantoin(DPTH), 及 2(naphthalen-2-ylmethylsulfanyl)-5,5-diphenyl-1,5-dihydro-imidazol-4one (DPTH-N10)的結構式. 44.
(45) 圖二、細胞週期進行的分子調控 (節錄自 Donovan and Slingerland Breast Cancer Res 2000 2:116). 45.
(46) DPTH Conc. (µ µM). 圖三、COLO-205 細胞[3H]-thymidine incorporation 的量隨著 DPTH-N10 的濃度上昇而有減少的現象。. 46.
(47) 圖四、以 DPTH-N10 (10 µM)處理三天後，移除藥物以溶劑培養，細 胞數目會有回昇（reverse）的現象。. 47.
(48) MTT cell viability assay. OD550. 0.12 0.08 0.04 0 0. 10. 20. 30. DPTH-N10 conc. (µ µM). 圖五、DPTH-N10 在 30 µM 的濃度內不會引發明顯的細胞死亡. 48.
(49) DPTH-N10 (24 hr). 圖六、以 DPTH-N10(0-30 µM)處理 COLO-205 細胞 24 小時候，以西 方墨點法分析的結果顯示 p21 蛋白的量較對照組有顯著上昇的現 象。然而 p27 蛋白的量雖時有上昇，但重現性較差。. 49.
(50) DPTH-N10 (24 hr). 圖七、以 DPTH-N10 (0-30 µM)處理 COLO-205 細胞 24 小時候，以西 方墨點法分析的結果顯示 CDK 2 及 CDK 4 的量，相較於對照組無明 顯的變化。. 50.
(51) 圖八、以 DPTH-N10(0-30 µM)處理 COLO-205 細胞 24 小時候，以西 方墨點法分析的結果顯示細胞內的 cyclin A、cyclin D1 及 cyclin D3 並無明顯的變化。Cyclin E 的量則在 20-30 µM 的 DPTH-N10 的處理 下，有減少的現象。. 51.
(52) DPTH-N10 0. 30. (µ µM). IP:CDK2 IB:p21 IP:CDK2 IB:p27. IP:CDK4 IB:p21 IP:CDK4 IB:p27. 圖九、以 DPTH-N10 (30 µM)處理 COLO-205 細胞 24 小時後，發現 p21 與 CDK 2 的結合量有增加的現象，而 p21 與 CDK4、p27 與 CDK 2、及 p27 與 CDK 4 的結合量則無顯著的改變。. 52.
(53) kinase activity assay DPTH-N10 (24hrs) C. 10. 20. 30. (µ µM). CDK2. 32. P-H1. CDK4. 32. P-Rb. 圖十、以 DPTH-N10(0-30 µM)處理 COLO-205 細胞 24 小時候，CDK 2 的激酶活性有顯著的受到抑制，而 CDK4 的活性則無明顯的變化。. 53.
(54)
Benzer Belgeler
Bu makale o zaman bile mem lekette büyük bir gürültü ko parmış; başta Hamdullah Sup hi Bey olmak üzere birçok mü nevverler Cenap Şahabeddin Beye
İstanbul özlemiyle yanıp tutuşan vagon, mü zeden çıkarıldığında çocuklar gibi sevinse de, kursağında kalır hevesi!. İçini Alman ve Fran sız generaller, devlet
Biz ise Pertev Naili'ye bir şeyler etmek huyumuzdan bu kadar sene sonra bile ' vazgeçemedik, ve geçen yıl yine bir işler yaptık Pertev Naili'ye: Bir banka, onun tam yarım
OLTP kapsamında iliĢkisel veri tabanında tutulan veriler ve bu veriler üzerinde çalıĢan raporlar ile OLAP kapsamında veri ambarında ve çok boyutlu küplerde tutulan
Böylece dokuma işlemi sırasında yükleme elastik sisteminde çözgü deformasyonunun belirlenmesi üzerine önerilmiş yeni metot yalnız söz konusu amaçla değil, dokuma
規則量血壓並記錄血壓值，配合規律服用降 血壓藥物。各種降壓藥物均能有效降低腦中風的發
Bu durumda adım kırılma indisli yarıiletken simetrik tekli dalga kılavuzunda aktif bölgede yer alan elektrik alanının genel durumda ve rezonans
懷抱「星夢」：希望藉由美麗的影像以獲得星探青睞，期望有進入演藝圈的機會。
