NKUBAP.00.10.AR.15.01 nolu proje MYRMELEOTETTİX MACULATUS- TÜR GRUBUNUN (ORTHOPTERA; CAELİFERA;
ACRİDİDAE) MİTOKONDRİAL BİR GEN OLAN COI ILE GENETİK ÇEŞİTLİLİĞİNİN BELİRLENMESİ
Yürütücü: Doç.Dr. Deniz ŞİRİN 2016
i
TEŞEKKÜRLER
Bu çalışmanın gerçekleşmesini sağlayan Namık Kemal Üniversitesi Araştırma Projeleri Yönetim Birimi’ne (Proje no: NKUBAP.00.10.AR.15.01), Laboratuar çalışmalarına verdiği desteklerden ötürü Bölümümüz Doktora öğrencisi Gürkan AKYILDIZ’a ve PZR reaksiyonları için verdikleri destekten ötürü Doç.Dr. Rıfat BİRCAN ve Doç. Dr. Türker BİLGEN’e teşekkürlerimi sunarım.
ii ÖNSÖZ
T.C. Namık Kemal Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından desteklenen “Myrmeleotettix maculatus-tür grubunun (Orthoptera; Caelifera;
Acrididae) mitokondrial bir gen Olan COI ile genetik çeşitliliğinin belirlenmesi” isimli, NKUBAP.00.10.AR.15.01 numaralı projemize ait sonuç raporudur.
iii ÖZET
Myrmeleotettix maculatus-tür grubunun (Orthoptera; Caelifera; Acrididae) mitokondrial bir gen Olan COI ile genetik çeşitliliğinin belirlenmesi
Myrmeleotettix ethicus türü (Antalya) ve M. maculatus (Avrupa, Marmara ve Karadeniz populasyonları) türlerinin oluşturduğu Myrmeleotettix maculatus tür grubuna ait yedi populasyon COI geni ile moleküler genetik yöntemler kullanılarak çalışılmıştır. Bu türlerden M. ethicus türü lokal yayılışa sahip bir Anadolu endemiği iken, M. maculatus ise batı Palearktikte yayılış göstermektedir. Filogenetik analizler M. maculatus türünün Avrupa populasyonlarını bazal kola, Karadeniz populasyonları ile Marmara populasyonlarını ise farklı kollara yerleştirmiştir. Ayrıca bu kladlardan Karadeniz populasyonlarının daha yüksek genetik çeşitliliğe sahip olduğu ve atasal haplotipleri içerdiği saptanmıştır. M. ethicus türü ise filogenetik ağaçlarda M.
maculatus türü içerisinde yer alan Marmara populasyonlarının yer aldığı klada en yakın kola yerleşmiştir.
iv ABSTRACT
Identification of genetic diversity by using mitochondrial COI gene of Myrmeleotettix maculatus (Orthoptera: Acrididae: Gomphocerinae) species
group
Seven populations of Myrmeleotettix maculatus species group, M. ethicus and M. maculatus species, were studied by using molecular genetic methods with COI gene. M. ethicus is an Anatolian endemic species with local distribution and M.
maculatus is distributed in western Palearctic. Phylogenetic analyzes have placed the European populations of M. maculatus in the basal arm, the Black Sea populations and the Marmara populations in the different arms. It was also found that the Black Sea populations had higher genetic diversity and contained ancestral haplotypes.M.
ethicus species are located in the phylogenetic trees to the nearest arm of the Marmara populations in M. maculatus species.
v
İÇİNDEKİLER
ÖZET…. ... iii
ABSTRACT…. ... iv
İÇİNDEKİLER ... v
SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ ... vi
ŞEKİLLER DİZİNİ ... ix
ÇİZELGELER DİZİNİ ... x
1. GİRİŞ ... 1
2. GEREÇ ve YÖNTEM ... 5
2.1. Verilerin oluşturulması ... 5
2.2. Verilerin Değerlendirilmesi ... 9
3. BULGULAR ... 9
3.1. Populasyonlarda Genetik Çeşitlilik ve Gen Karakterizasyonu ... 11
3.2. Filogenetik ve Filocoğrafik Analizlerin gerçekleştirilmesi ... 16
4. TARTIŞMA ve SONUÇ ... 22
5. KAYNAKLAR ... 24
vi SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ
Simgeler
oC Santigrat derece
γ Gama
m dizi sayısı mA Miliamper mg Miligram Ml Mililitre mM Milimolar ms Milisaniye mv Milivolt
l Mikrolitre nM Nanomol ng Nanogram Pmol Pikomol
pH Potens Hidrojen
rpm Revolutions per minute W/V Ağırlık/Hacim
Kısaltmalar
A Adenin
ABD Anabilim Dalı
AIC Akaike Information Criterion
vii
C Sitozin
dH2O Distile su
DNA Deoksiribo Nükleik Asit dNTP Deoksiribonükleotit Trifosfat EDTA Etilen Diamin Tetra Asetikasit
EtBr Etidyum Bromid
G Guanin
Gr Gamma rate
GPS Global Positioning Sistem I Proportion of Invariable Sites
MEGA Molecular Evolutionary Genetics Analysis MgCl2 Magnezyum Klorür
ML Maximum Likelihood
MP Maksimum Parsimoni
N Birey Sayısı
NaCl Sodyum Klorür
NJ Neighbor-Joining
ort Ortalama
P Olasılık Seviyesi
PAUP Pylogenetic Analysis Using Parsimony Program PZR Polimeraz Zincir Reaksiyonu
R Ratio
r Pearson Korelasyon Katsayısı
viii
S Ayrılan Dizi Sayısı
SDS Soyum Dodesil Sülfat
SPSS Statistical Package for Social Sciences
T Timin
ti Transisyon
TBE Trise-Borat EDTA
TrN Tamura Nei 1993
Tris-Base Tris (hidroksimetil) Aminometan-Hidrıjen Klorür
tv Transversiyon
UV Ultra Viole
ix ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil 2.1 %1’lik agaroz jel içerisinde total DNA içeriğinin görüntülenmesi ... 7 Şekil 2.2 COI geninin PZR ile çoğaltılması sonucu oluşan ürünler ... 8 Şekil 2.3 COI genine ait ileri primer dizileme sonucu oluşan kromatogram. ... 9 Şekil 3.1. M. maculatus tür grubu populasyonlarının COI genine ait haplotiplerinin
network analizi.. ... 15 Şekil 3.2. M. maculatus tür-grubunun NJ (Neighboor Joining) ağacı. ... 17 Şekil 3.3. M. maculatus tür-grubunun populasyonlarından ML (Maksimum-Likelihood)
opsiyonuyla oluşturulan filogenetik ağaç. Ml içerisinde evrimsel model olarak HKY+I+G kullanılmıştır... ... 18 Şekil 3.4. MP opsiyonuyla oluşturulan ağaç . ... 19 Şekil 3.5. Bayesian analizi sonucu elde edilen %50 Majority rule consessus ağacı..
... 20 Şekil 3.6. Myrmeleotettix maculatus tür grubunun Anadolu’da sahip olduğu haplo
gurupların ve kladların harita üzerinde gösterimi ... 21
x ÇİZELGELER DİZİNİ
Çizelge 2.1 Myrmeleotettix maculatus gurubuna ait verilen tüm kayıt bilgileri...5
Çizelge 3.1. M.maculatus tür gurubuna ait çalışılan 7 populasyondan gerçekleştirilen 74 dizi içerisinde saptanan 32 haplotip ve bunları paylaşan diziler ... .12
Çizelge 3.2. Çalışılan 7 populasyon ve 1 dış gruba ait 32 haplotipin varyasyonel baz pozisyonları (par. İnf: parsimoni olarak bilgi verici bazlar) ... 14
Çizelge 3.3 Populasyonlara ait Haplotip ve Nükleotid çeşitlilik indeksleri.. ... 14
Çizelge 3.4 Populasyonlara ait pairwise FSTs değerleri.. ... 14
Çizelge 3.5 Populasyonlara ait genetik çeşitlilik sonuçları. ... 14
Çizelge 3.6 Populasyonlara ait TAJIMA'S D ve FU'S FS test sonuçları. ... 15
1 1. GİRİŞ
Türkiye biyolojik çeşitlilik yönüyle dünyanın en önemli gen merkezlerinden biridir. Sahip olduğu doğal zenginliğin korunması amacıyla çeşitli uluslararası sözleşmelere taraf olmuş ve gereklerini yerine getirmek için önemli planlar ve birimler oluşturmaya başlamıştır. Bu konuda en kapsamlı plan 2007 yılında hazırlanan
‘‘Ulusal Biyolojik Çeşitlilik Stratejisi ve Eylem Planı’’’dır. Bu planda katılımcılar tarafından belirlenen 10 temel amaç içerisinde “Hassas, tehdit ve tehlike altında olan türlere ve ekosistemlere, üzerinde çok az çalışma yapılmış sınıflandırma gruplarına, yüksek düzeyde çeşitliliği olan alanlara, vb. bölgelere öncelik verilerek, özel koruma tedbirleri geliştirilmesi” ve ”Kendine özgü, hassas dağ ekosistemlerinin, diğer biyolojik çeşitlilik sıcak noktalarının ve bunlara eşlik eden türlerin belirlenmesi ve korunması”
amaçları yer almaktadır.
Bu amaçlar doğrultusunda IUCN kriterlerine göre (Uluslar arası Doğal Hayatı ve Doğal Kaynakları Koruma Birliği) düşük riskli (LC=Least Concern), tehlikede (EN=Endangered) veya kritik seviyede tehlike altında (CR=Critically Endangered) bulunan ve ülkemizde dağılım gösteren farklı omurgalı türleri üzerine yürütülmüş projeler bulunuyor olsa da, böcekler açısından bu durum oldukça sınırlı sayıdadır.
Ortoptera takımı Türkiye’de 12 familya, 34 altfamilya, 144 cins ve yaklaşık 700 tür ile temsil edilmektedir (Karabağ 1958; Ünal 2012). Buna karşın Orthoptera takımı ile ilgili 2007 yılından itibaren desteklenen toplam proje sayısı dört olarak gözükmektedir (Ulusal Akademik Ağ ve Bilgi Merkezi-2013) ve bu projelerden hiçbiri yaklaşık 98 tür ile temsil edilen ve çok büyük oranda yüksek dağların subalpin zonunu tercih eden Gomphocerinae (Insecta:Orthoptera:Caelifera) alt familyası türlerini (Şirin ve ark 2010) kapsamamaktadır. Bu durum 2007 yılında hazırlanan raporda belirtilen amaçlar düşünüldüğünde Orthoptera takımı bazında oldukça geri kalındığını göstermektedir.
Sahip olduğu topografik, iklimsel ve çeşitli bariyerler nedeniyle Anadolu’nun biyolojik çeşitlilik yönüyle dünyanın en önemli gen merkezlerinden biri olmasını tetiklemiştir. Anadolu’nun biyolojik çeşitliliğine en önemli katkılardan birini Akdeniz bölgesinde yer alan Toros Dağları yapmaktadır. Bunun önemli bir nedenini, Toros hattında çok değişken bir topoğrafya ve buna bağlı olarak farklı iklim ve vejetasyon tipleri barındırmasıdır. Bunun sonucu olarak Akdeniz bölgesinin hem tür bazında hem de populasyon bazında farklı gen havuzlarına sahip canlı formlarına barınak teşkil etmiş ve etmektedir. Topoğrafik, iklimsel ve habitat çeşitliliğine ek olarak Anadolu jeolojik süreç içerisinde bir çok kez Tetis okyanusu içinde izole kaldığı gibi değişik dönemlerde Asya, Avrupa ve Afrika ile bağlantıya geçmiş ve bugün hala bu bağlantılar Kafkasya ve Mezopotamya şeklinde devam etmektedir (Steninger ve Rögl, 1985; Rögl, 1999). Bu nedenle Anadolu farklı kökenli canlı formlarının yayılışına maruz kalmış ve de çeşitliliği sürekli artmıştır. Daha önemlisi Anadolu’nun bulunduğu kuzey yarımkürede etkili olan dört büyük buzul dönemi olan Günz, Mindel, Riss ve Würm (De Lattin, 1967; Web ve Bartlein, 1992; Demirsoy, 1999; Çıplak, 2004; Cox ve Moore, 2005; Çıplak, 2008) dönemlerinde 52. Enlem ve üstünde kalan bölgelerde yok olma riskiyle karşı karşıya olan canlılar için Anadolu en önemli sığınaklardan biri olmuştur. Son buzul devrinden sonra bu alanların canlı bileşimi çoğunlukla Anadolu‘dan köken alan atasal populasyonlar tarafından oluşturulmuştur (Cooper ve ark., 1995; Hewitt, 1996, 1999; Taberlet ve ark., 1998). Buzul devirleri ile
2
güneye inen formlar buzullar arası dönemde Akdeniz Bölgesinin ve özellikle Torosların habitat çeşitliliğinde farklılaşarak (belki de türleşerek) bu bölgenin çeşitliliğini artırmıştır (Çıplak, 2000; Demirsoy, 1999)
Araştırma konusu olan Myrmeleotetix cinsinin yer aldığı Gomphocerinae (Orthoptera: Acrididae) alt familyası dahil olduğu Acrididae familyanın en kalabalık altfamilyalarından biridir ve tüm Holoarktik biyocoğrafik bölgede ve özellikle bölgenin kuzey kesimlerinde yayılış göstermektedir (Bei-Bienko ve Mistshenko, 1951;
Karabağ, 1958; Harz, 1975; Demirsoy, 1977; Salman, 1978; Soltani, 1978; Otte, 2013; Ünal, 2012). Gomphocerine (Orthoptera) alt familyası soğuk iklim tercih eden ve bundan dolayı da Anadolu gibi güneyde yer alan sığınak alanlarda özellikle yüksek rakımlara yayılış gösteren türlerden oluşmaktadır (Uvarov, 1921; Weidner, 1969; Demirsoy, 1977; Chernyakhovskii ve Ravina, 1997; Şirin ve ark., 2010; Şirin ve ark., 2011). Bu alt familyaya ait Myrmeleotettix Bolivar, 1914 cinsi yaklaşık tüm Palearktik te toplam 11 tür ile temsil edilmektedir (Bei-Bienko ve Mistshenko, 1951;
Harz, 1975; Xiang-chu ve Kai-ling, 2003; Şirin ve ark., 2011; Otte, 2013). Bunlardan üçü özellikle Batı Palearktiğin Avrupa ve Anadolu sınırlarında yayılışa sahiptir:
(i) Myrmeleotettix maculatus (Thunberg, 1815), (ii) M. ethicus Şirin & Çıplak 2011
(iii) M. antennatus (Fieber,1853).
Geriye kalan sekiz tür ise özellikle Doğu Palearktik’ten bilinmektedir:
(i) M. zaitzevi Mistshenko, 1968, (ii) (ii) M. angustiseptus Liu, 1982, (iii) (iii) M. brachypterus Liu, 1982, (iv) (iv) M. pluridentis Liang, 1987, (v) (v) M. palpalis (Zubovski, 1900),
(vi) (vi) M. pallidus (Brunner von Wattenwyl, 1882), (vii) (vii) M. kunlunensis Huang, 1987
(viii) viii) M. longipennis Zhang, 1984.
Yukarıda belirtilen 11 türden Myrmeleotettix maculatus ve M. ethicus türleri Anadolu’da bulunmaktadır. Yakın zamanda proje yürütücüsü tarafından yapılan çalışmada Myrmeleotettix cinsine ait literatürde verilen ve olası tüm alanlarda örneklemeler yapılmış ve bu populasyonlar hem morfometrik hem de çiftleşme öncesi izolasyona neden olan akustik karakterleri bakımından detaylıca incelenmişlerdir (Şirin ve ark., 2011). Çalışma sonucunda daha önceden ülkemizde sadece tek bir tür ile bilinen cinsin iki türe sahip olduğu ve bu türlerden birinin güneyde Toroslarda lokal endemik olarak bulunduğu saptanmıştır (Şirin ve ark., 2011). Aynı çalışmada diğer tür olan Myrmeleotettix maculatus’un ise Anadolu’nun kuzeyinde Karadeniz ve Maramara bölgelerinde yayılım gösterdiği saptanmıştır. Her ne kadar yapılan çalışmada bu yakın akraba iki tür morphometrik ve ses karakterleri ile birbirlerinden ayırt edilebilmiş olsa da genetik çeşitlilikleri üzerine herhangi bir çalışma yapılmamıştır. Bu çalışma ile literatürde eksik olan bu kısım tamamlanmaya çalışılmıştır.
Myrmeleotettix cinsi moleküler anlamda en az bilinen Gomphocerinae alt familyasına ait cinslerinden birisidir. Yaptığımız literatür taraması neticesinde bu cinsin hiçbir türünün moleküler anlamda bir değerlendirmeye tabi tutulmadığı görülmüştür. Bununla birlikte Myrmeleotettix maculatus, M. antennatus ve M. palpalis
3
türlerine ait bireyler Gomphocerinae alt familyası cinslerinin genel olarak değerlendirildiği ve filogenetik ilişkilerin anlaşılmaya çalışıldığı sayılı çalışmada yer almışlardır (Vedenina ve Mugue 2011; Contreras ve Chapco 2006; Nattier ve ark.
2011; Nai-Xei ve ark. 2008). Diğer taraftan Orthoptera içerisinde de özellikle son yıllarda genetik çeşitliliğin saptanması hem türler arası hem de tür içi ilişkilerin açıklığa kavuşturulması bağlamında yaygınlaşan bir alan olmuş ve değerli bilgiler edinilmiştir (Chapco ve ark. 2001; Contreras ve Chapco 2006; Vedenina ve Mugue 2011; Bugrov ve ark. 2005; Berger ve ark. 2010; Lunt ve ark. 1998; Nattier ve ark.
2011; Çıplak ve ark. 2010; Korkmaz ve ark. 2010; Kaya ve Çıplak 2011; Kaya ve ark.
2013; Taylan ve ark. 2013).
Bu bağlamda proje yürütücüsü tarafından morfolojisi ve davranışsal özellikleri iyi bilinen ve lokal endemik olan M. ethicus türü ile yakın akrabası olan Myrmeleotettix maculatus türleri çalışma konusu olarak belirlenmiş ve M. antennatus türüde dış gurup olarak seçilmiştir. Bu türlerden Anadolu’da yayılış gösteren M.
ethicus türü Batı Toroslada bulunan Akdağlar grubunun İkiz göl mevkiinde lokal endemik olarak bulunmaktadır (Şirin ve ark., 2011). Bu tür proje yürütücüsünün çalışmaları neticesinde IUCN içerisine CR (Critically Endangered) kategorisine dahil edilmiştir (http://www.iucnredlist.org/details/16757672/0). M. maculatus türünün Anadolu’da yayılışı Karadeniz ve Kuzey-batı (Marmara) hattında bulunmaktadır (Şekil 1; Şirin ve ark., 2011). Bu projede kullanılması düşünülen bu iki türe ait örnekler büyük oranda 2011-2013-2015 yılları arasında toplanmış ve bunlar %99’luk saf alkole alınarak -20 derece buzdolabında saklanmışlardır. Ayrıca çalışmada kullanılmak üzere Almanya’dan M. maculatus örneklerimiz mevcuttur. Elimizde bulunan bu türlere ait populasyonlardan genetik çeşitliliklerini anlamak amacıyla benzer çalışmalarda yoğun olarak kullanılan mt COI geni seçilmiştir (Chapco ve ark., 2001; Contreras ve Chapco, 2006; Vedenina ve Mugue, 2011; Bugrov ve ark., 2005;
Berger ve ark., 2010; Lunt ve ark., 1998; Nattier ve ark., 2011). Bu gen çalışmamızda kullanılacak M. maculatus ve M. antennatus türlerinin Avrupa populasyonlarından 1-2 bireyin dahil olduğu ve Gomphocerinae alt familyasında bulunan cinslerin birbirleriyle olan akrabalık ilişkilerinin saptanmasında kullanılarak verimli sonuçlar alınmış olan bir gendir (Chapco ve ark., 2001; Contreras ve Chapco, 2006; Vedenina ve Mugue, 2011; Bugrov ve ark., 2005; Lunt ve ark. 1998; Nattier ve ark. 2011). Bu nedenle COI genine ait yaklaşık 650 baz çiftlik bölgenin dizileri çıkarılarak uygun analiz programları ile tür grubunun akrabalık ilişkileri anlaşılmaya çalışılmıştır. Elde edilen veriler Anadolu’nun sığınak olarak üstlendiği rol ve bu rolde hangi coğrafik alanların ne kadar etkili olduğunu ve bu alanlarda var olan türlere ait populasyonların genetik çeşitliliklerini ortaya koymuştur.
Araştırma ekibimizin çalışmalarının büyük bir kısmını Gomphocerinae (Insecta: Orthoptera: Caelifera: Acrididae) alt familyası içerisinde yer alan taksonlar oluşturmaktadır. Hem biyolojisi hem de biyocoğrafyası hakkında bilgi sahibi olunan ve bu çalışmada önerilen Myrmeleotettix cinsinin Anadolu ve Avrupa’da yayılış gösteren türleri (M. maculatus, M. ethicus ve M. antennatus) morfolojik ve/veya akustik özelliklere dayalı olarak tanımlanmışlardır (Şirin ve ark., 2011). Ancak son yıllarda yapılan uluslararası çalışmalarda morfolojik ve davranışsal veriler ile tanımlanmış türler moleküler veriler ile oluşturulan filogenetik ağaçlar ile sınanmaktadırlar (Berger ve ark., 2010; Bugrov ve ark., 2005; Ustinova ve Mayer, 2006). Önerilen bu proje bugüne kadar sadece morfolojik ve akustik veriler ışığında
4
sınıflandırılan Myrmeleotettix cinsine ait M. maculatus-tür grubunun ilk kez moleküler veriler kullanılarak oluşturulan filogenetik ağaçlar ile sınıflandırılması yeniden test edilecektir. Filogenetik ağaçtaki dallanma noktaları ve bu noktaların oluşumuna muhtemel etki eden geçmiş jeolojik olaylar ve büyük iklimsel değişimler arasındaki ilişkiler anlaşılabilecektir. Ayrıca metapopulasyon özelliği gösteren M. maculatus türüne (Şirin ve ark., 2011) ait Karadeniz, Marmara ve Avrupa alt populasyonları arasındaki tür içi genetik çeşitliliği ve buna bağlı olarak akrabalık ilişkileri anlaşılmaya çalışılacaktır. Böylelikle Karadeniz, Marmara ve Avrupa’da bulunan populasyonların nereden ve ne zaman dağılım gösterdiği saptanarak bu türe ait bir dağılım örüntüsü ortaya konmaya çalışılmıştır.
Biyolojik zenginliğimizin yüksek dağ zonunda dar bir alana sıkışmış olmasından dolayı nadir elemanlarından olan Myrmeleotettix ethicus (IUCN, CR) türünün de dahil olduğu Myrmeleotettix cinsi üzerine yaptığımız önceki çalışmalarda elde ettiğimiz bulgular ışığında bu grubun sistematiğinin moleküler olarak da yapılmasının gerekliliği ortaya çıkmıştır. Proje yürütücüsünün önceki çalışmalardan toplamış olduğu örnekler üzerine yapılacak olan bu moleküler çalışma ile M.
maculatus-tür grubunun morfoloji-davranış temelli taksonomik durumu filogenetik ağaçlar kullanılarak test edilmiştir.
5 2. GEREÇ ve YÖNTEM
Son yıllarda genetik çeşitliliğin analizi türler arasındaki filogenetik ilişkilerin saptanması, evrimsel yeniden yapılandırma, populasyonların ve yakın akraba türlerin biyocoğrafik geçmişleri gibi araçlarla daha kuvvetli hale gelmiştir. Her ne kadar mtDNA’sı kullanılarak yapılan filogenetik analizler son yıllarda akrabalık ilişkilerini anlamak için sıklıkla kullanılıyor olsa da, Mrymeleotettix maculatus grubu ile ilgili moleküler çalışmalara dayalı literatür bir lokaliteden 2 bireyinin Gomphocerinae alt familyasını moleküler filogenetik anlamında değerlendiren Mayer ve ark. (2010) tarafından yapılan çalışma ile sınırlıdır. Yapılan bu çalışma ile endemik ve IUCN içerisinde VU kategorisinde yer alan türün detaylı ilk moleküler değerlendirmesi olmuştur. Bu amaçla gruba ait mitokondrial gen olan ve DNA barcoding olarak kullanılan CO I genine ait dizi analizleri agerçekleştirildi. Çalışma için kullanılan örnekler 2013-2014-2015 yıllarında toplanan örneklerden oluşmaktadır (Çizelge 2.1) 2.1. Verilerin Oluşturulması
Daha önceki çalışmalarımızda alkole (%90-99’luk saflıkta) alınmış bireylerin arka femurundan DNA izolasyonu gerçekleştirildi. Total DNA izolasyonu tuz- extraksiyon yöntemi izlenerek yapıldı.
Tuz-extraksiyon yönteminde ilk olarak homojenizatör veya lam üzerinde bistüri yardımıyla arka femurun kitin tabaka içerisindeki kas kütlesi parçalanarak homojenize hale getirildi. Bu homojenat 2 ml’lik ependorf tüpüne 374 l ayrıştırma tamponu TNE (100 mM NaCI, 100 mM Tris-HCI, 2 mM EDTA; pH 8,0) ile birlikte konularak blok ısıtıcısında (Block-Temperature) 37 oC’de 1 saat bekletildi. Ardından her bir örnek tüpüne 1 M DTT (1-4 Dithiothreit) 21 l, % 10’luk SDS 100 l ve Proteinaz K 10 l eklendi ve blok ısıtıcıda 37 oC’de bir gece bekletildi. Isıtıcıdan alınan örneklere 250 l NaCl eklenerek 10 dakika yavaşça karıştırılır. Karıştırılmış olan örneklerin üzerine 750 l Chloroform-Isoamilalkol (24:1) ilave edildi. Örnekler oda sıcaklığında 10 dakika 7500 rpm’de santrifüj edildi. Santrifüj sonrası tüpün dibinde kalan pelet atıldı ve üstünde kalan süpernatant kısmı yeni bir tüpe alındı. İçerisinde DNA olduğu var sayılan sıvının üzerine DNA’yı çöktürmek amacıyla izoproponol eklenerek -20 oC'de bir gece bekletildi. Bekleme işleminden sonra örnekler 13000 rpm’de 30 dakika santrifüj edildi. Tüpün içerisindeki süpernatant boşaltıktan sonra DNA nın yıkama işleminin gerçekleşmesi için 600 l %70 etanol eklendi ve 13000 rpm’de 5 dakika santrifüj edildi. Dikkatli bir şekilde tüplerdeki alkol boşaltıldıktan sonra dipte kalan alkolün uzaklaştırılması için 40 oC'ye ayarlı etüv içerisinde 1 saat kurutuldu. Kurutma işleminden sonra her bir örnek yavaşça 25 l steril dH2O ile çözülerek 4 oC’de saklandı. Uzun süreli saklamalar için DNA’lar -20 oC’de muhafaza edildi.
6
Çizelge 2.1 Myrmeleotettix maculatus gurubuna ait verilen tüm kayıt bilgileri
Ülke Lokalite Kaynak KullanılanTakson
Türkiye Bursa, UluDağ Mt., 3.IX.1955, 5 ♂♂, 9 ♀♀ / 30.VIII.1964, 6 ♂♂, 17 ♀♀, leg.: Dr. H. Gall
Weidner 1969 Myrmeleotettix maculatus Türkiye Rize, Altiparmak, 30.V.1965, leg.: Dr. H. Gall Weidner 1969 Myrmeleotettix maculatus Türkiye Bursa: Uludağ (Bithyn. Olymp.), ca 1600 m.,
(Werner) Werner 1901;
Karabağ 1958 Gophocerus maculatus Türkiye Uludağ, (Bithyn. Olymp.), 15.vııı.1910, 1200-1900
m., Ebner 1910;
Karabağ 1958 Gophocerus maculatus Türkiye Çankırı, Ilgaz dağı, 6500 ft., 12.VIII. 1931 Uvarov 1934 Myrmeleotettix maculatus
Türkiye Bursa, leg.: T. Karabağ Demirsoy
1977
Myrmeleotettix maculatus
Türkiye Trabzon, Zigana dağı, leg.: T. Karabağ Demirsoy 1977
Myrmeleotettix maculatus
Türkiye Asia Minor Bei-Bienko &
Mishchenko 1951
Myrmeleotettix maculatus
Türkiye Bithyn. Olymp; Ak Dagh (Sibashi-Jaila), 2000 m., VII. 1938, (Schwarz)
Ramme 1951 Myrmeleotettix maculatus Türkiye Bithynicher Olymp, Bursa bis 2000m. Harz 1975 Myrmeleotettix maculatus Türkiye N.W. Anatolian, Bithyn. Olymp b. Brussa,
15.VIII.1937, leg.: Ramme
HUZOM Myrmeleotettix maculatus Türkiye Uludagh, Mt. Olympus, 1700-2000m., 3 ♀♀, det. T.
Karabağ
HUZOM Myrmeleotettix maculatus Türkiye Mt. Uludagh, 1944 Pnt:Koswig, B.M. 1948-294, 1
♂♂, det. T. Karabağ 1950
HUZOM Myrmeleotettix maculatus Türkiye Trabzon, Zigana dağı, 2500 m., 8. IX. 1956, 2 ♂♂, 2
♀♀, leg.: T. Karabağ
HUZOM Myrmeleotettix maculatus Türkiye Kastamonu, Devrek Oak moorland, 22. VIII. 1963, 1
♀♀, leg.: M. Şişli
HUZOM Myrmeleotettix maculatus Türkiye Bursa, Uludagh, 9.VIII. 1967, 2 ♀♀ HUZOM Myrmeleotettix maculatus Türkiye Trabzon, Gümüş maden plateau, 2000 m., 6. VIII.
1965,1 ♂♂
HUZOM Myrmeleotettix maculatus
Almanya Hellerberg, Parkplatz Wiese, N 47°58.205, E
11°11.761, 679 m., 13.VII.2014 leg.: D. Berger Bu çalışmada Myrmeleotettix maculatus Türkiye Antalya, Gömbe, Akdağ, İkiz göl civarı, N
36°34.643, E 029 35.155, 2440 m N.N., 27.
VII.2013, leg.: D. Sirin & M. Kılınç
Bu çalışmada Myrmeleotettix ethicus
Türkiye Bursa, Uludağ, Oteller-2 mevkii, 1709 m, N: 40 07 354 E: 29 08 614, 19.VII.2013, leg.: D. Şirin
Bu çalışmada Myrmeleotettix maculatus Türkiye Balıkesir, Kazdağları, Milli park, 1780 m., N
39°42.211, E 26°52.028 . 01.VII.2014, 7♂♂, 5 ♀♀, leg.: D. Şirin.
Bu çalışmada Myrmeleotettix maculatus
Türkiye Ordu, Çambaşı yaylası, 1891 m, N: 40 36 865 E: 37
56 050, 04.VII.2013, leg.: D. Şirin & A. Mol Bu çalışmada Myrmeleotettix maculatus Türkiye Giresun, Eğribel Geçidi, 1988 m, N: 40 27 898 E: 38
22 954, 03.VII.2013, leg.: D. Şirin, A. Mol & M.S.
Taylan
Bu çalışmada Myrmeleotettix maculatus
Türkiye Trabzon, Zigana Dağı, 2095 m, N: 40 38 758 E: 39 24 215, 03.VII.2013, leg.: D. Şirin, A. Mol & M.S.
Taylan
Bu çalışmada Myrmeleotettix maculatus
7
İzolasyon sonrasında steril dH2O ile çözülen pelet içerinde DNA’nın olup olmadığı miktarı ve saflık tayini spektrofotometrik olarak belirlendi daha sonra jel elektroforezi ile görüntülendi (Şekil 1). Bu yöntemde TAE tamponu kullanarak (Tris- Base 24.2 gr, Asetik asit 5.71, 500 mM EDTA (pH: 8.0) dH2O 500 ml) hazırlanan
%0.6’lık agaroz jelde bulunan kuyucuklara 2 l izolat ve 2 l Brom-Fenol-Blue (BFB) DNA boyası eklenerek 60 mv ve 125 mA’de 30 dakika yürütüldü. Sonra jel 20 dakika
% 2’lik EtBr içersine bırakıldı ve UV görüntüleme cihazında görüntülenerek izolatlarda DNA’ların var olup olmadığı tespit edildi (Şekil 2.1).
Şekil 2.1 %1’lik agaroz jel içerisinde total DNA içeriğinin görüntülenmesi
İzole edilen her bir DNA örneği toplandığı yer, çekirge türü, örnek alınma tarih ve diğer önemli bilgilerini içeren bilgiler daha önceden hazırlanmış olan Excel formatına işlendi ve tüplerin üzerine örnek kodu (Çekirge türü, örnek alınma tarihi ve örneğin alındığı bölge) yazılarak distile saf su veya Tris-Edta (TE) tamponu içeren vida kapaklı tüplerde -20 ºC’ de özel dondurucuda saklanarak tüm bilgiler Excel de oluşturulmuş olan bilgi paketine tek tek işlendi. Bu yolla ileride yapılacak olan sorgulamaların hızlı bir şekilde gerçekleştirilmesine olanak sağlandı.
İzole edilen total DNA’lardan PZR (Polimeraz zincir reaksiyonu) olarak bilinen DNA materyalinin istenilen kısmının farklı sıcaklık işlemlerine tabi olması ve bu sıcaklığa dayanan polimeraz enzimleri kullanılması ile yapılan çoğaltma işlemi gerçekleştirildi. Yaklaşık 650 baz uzunluğunda olan Cytochome Oxidase altünite I (CO I) geni için ise evrensel primerlerden LCO1490 (Baz dizisi: 5' GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G 3') ve HCO2198 (Baz dizisi: 5' TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA 3') (Folmer vd 1994) kullanılarak DNA dizileme için çoğaltma işlemi yapıldı. Her bir PZR reaksiyon tüpüne izolat DNA’dan değişen hacimlerde 1–3
l, 10X buffer 2.5 l, 1% BSA buffer 5 l, 25 mM MgCl2 2 l, her bir primerden (100 pmol/l) 1.25 l, 10 mM dNTP (deoksiriboknükleotit trifosfat) mix 0.5 l, Taq polimeraz (Promega) 0.25 l katılır ve geri kalan hacim 25 l olacak şekilde dH2O ile tamamlandı konuldu.
DNA dizi analizi için yeterli ve temiz DNA eldesi için PZR koşulları optimize edildi. Bu işlemler sonrasında CO I için protokol 35 döngüden oluşup başlangıç (initial) sıcaklığı 95oC’de 5 dakika, ayrılma (denaturation) 94 oC’de 40 saniye, birleşme (annealing) 48 (50) oC’de 45 saniye, uzama (elongation) 72 oC’de 90 saniye ve son uzama (final extension) 72 oC’de 5 dakika olarak uygulandı. Bu şekilde PZR uygulaması ile çoğaltılan bölgenin CO I’e ait olup olmadığı, 3000–100 baz çifti uzunluğunda belirteç (marker) DNA (Favorgen's DNA Ladder) kullanılarak jel
8
elektoroforezinde ürünlerin yürütülmesi ile saptandı. TBE tamponuyla hazırlanan
%1’lik agaroz jele (W/V) 2 l PZR ürünü ve 1 l belirteç DNA 2 l BFB DNA boyası eklenerek 60 mv ve 125 mA’de 30 dakika yürütüldü. Sonra jel 20 dakika % 2’lik EtBr içersine bırakıldı ve UV görüntüleme cihazında görüntülendi.
Elde edilen PCR ürünleri %2'lik agoroz jelde yürütülüp varlıkları UV transillüminatörde kontrol edildikten sonra (Şekil 2.2.) DNA dizileme reaksiyonunda kullanılmak üzere PCR ürünlerinin temizlenmesi Rosenthal ve arkadaşlarınca (2011) belirlenen pürifikasyon metoduna (PEG çöktürme) göre gerçekleştirildi. Bunu takiben pürifiye edilen PCR örnekleri %2'lik agoroz jelde yürütülüp fotodensitometrik metodlarla marker DNA miktarına karşı PCR ürünlerinin miktarları tespit edildi. DNA dizileme analizi ise üniversitemiz merkezi araştırma laboratuarı bünyesinde bulunan Beckman Coulter marka GenomeLab GeXP model sanger metodu ile çalışan otomatik DNA dizileme cihazı üzerinde gerçekleştirildi. Bu amaçla DNA dizi analizi reaksiyonu her bir örnek için 10 µl total hacimde 50ng PCR ürünü 5 pmol primer ve 1,5 µl dizileme miksi içerecek şekilde kuruldu ve reaksiyon Techne TC Plus marka ısı döngü cihazı kullanılarak 96°C'de 2 dakikalık ön denatürasyonu takiben 30 döngülük 96°C'de 20 sn denatürasyon , 50°C'de 20 sn bağlanma, 60°C'de 4 dakika sentezden oluşan bir protokol ile gerçekleştirildi. Cihaza yüklemeden önce dizileme reaksiyonu sonrası pürifikasyon üretici firma tarafından verilen uygulama kitapçığına uygun olarak sodyum asetat (CH3COONa) ve ethanol kullanılarak gerçekleştirildi. Pürifiye dizi analizi ürünleri üre ve formamid içeren SLS tamponu içerisinde çözülüp cihaza yüklendi. Kapiler elektroforez üretici firma tarafından verilen yönteme göre gerçekleştirilecek elde edilen dizi analizi sonuçları ilk olarak GenomeLab GeXP Genetic Analysis System Version 10.2 DNA dizi analizi programı kullanılarak değerlendirildi.
Şekil 2.2 COI geninin PZR ile çoğaltılması sonucu oluşan ürünler
Dizileme işlemleri tamamlandıktan sonra, her bir örneğe ilişkin İleri ve geri primerler ile elde edilen DNA dizi analizi sonuçları GenomeLab GeXP Genetic Analysis System Version 10.2 değerlendirildikten sonra Geneious 9.1.5 programı ile eşleştirilerek her bir örnek için tekli diziler haline dönüştürüldü ve FASTA formatında kaydedildiler.
9
Şekil 2.3 COI genine ait ileri primer dizileme sonucu oluşan kromatogram 2.2. Verilerin Değerlendirilmesi
Populasyonun Genetik Çeşitliliği ve Gen Karakterizasyonu: Populasyon içi ve arası nükleotid çeşitliği Pi (Nei 1987) ve θπ (Tajima, 1983), ikili nükleotid farklılıklarının ortalama sayısı k (Tajima 1983), haplotip çeşitliliği (Hd), haplotip sayısı (H) ve populasyonlara özgün haplotip sayısı (HU) COI gen bölgesi için hesaplandı (Tajima 1983; Nei 1987). Aynı zamanda mitokondri DNA belirtecinde nükleotid çeşitliliğinde nötral süreçlerden bir uzaklaşma olup olmadığını (nükleotid polimorfizminin seçilim tarafından etkilenip etkilenmediği) ortaya koyabilmek amacıyla Tajima’nın D (Tajima, 1989) ve Fu’nun Fs (Fu, 1997) değerleri hesaplandı.
Tajima’nın D ve Fu’nun Fs değerlerinin istatistiksel anlamlılığı seçilimsel nötralite ve populasyon denge koşulları altında test istatistiklerine dair beklenen dağılımı oluşturmak üzere simüle edilen 1000 değer üzerinden ortaya kondu. Anlamlılık derecesi olarak 0.05 seviyesi kabul edilmiştir. Yukarıda belirtilen analizlerin tümü DnaSP 5.0 ve ARLEQUIN version 3.5 (Excoffier and Lischer, 2010) programı altında gerçekleştirilmiştir. Ayrıca elde edilen haplotiplerin birbirleriyle olan ilişkisini daha yakından anlamak amacıyla Median-Joining algoritması (Bandelt vd 1999) bağlamında Network-4.5 programı kullanıldı.
Filogenetik ve Filocoğrafik Analizlerin gerçekleştirilmesi:
Çalışmamızda kullanılan her bir tür ve o türlerin populasyonlarında tespit edilen özgün haplotipler filogenetik analizlerde terminal takson olarak kullanıldı.
Filogenetik ağaç oluşturmada kullanılan yöntemler genel olarak iki başlık altında değerlendirilirler (i) Mesafe temelli yöntemler ve (ii) Karakter temelli yöntemler.
Çalışmamızda Mesafe temelli yöntemlerden Neighbour Joining (NJ)-Komşu Birleştirme Metodu ve Karakter temelli yöntemlerden Maximum Parsimony (MP) Farklılıkları En Aza İndirme metodu, Maximum Likelihood (ML) En Yüksek İhtimal Metodu ve Bayes Metodu kullanıldı.
Uygun Modellerin Belirlenmesi
MacClade 4.08 (Madison ve Madison, 2000) programında oluşturulan indel (insersiyon ve delesyon) bölgeleri çıkarılmış DNA veri matrisi önce dış grup dahil edilmeden sonrada dahil edilerek MODELTEST sürüm, 3.06 (Posada & Crandall, 1998) adlı programda analiz edildi. Akaike Information Criterion (AIC) (Akaike, 1974)
10
model seçim taslağının önerdiği TrN+I+G DNA veri matrisine en iyi uyan baz değişim modeli olarak belirlendi.
Minimum evrim prensibi kullanımına dayalı komşu-bağlama (NJ) yönteminde çoklu substitüsyonları göz önüne alabilmek için Kimura 2-Parametre (K2-P) modeli (Kimura 1980) kullanılarak ağaç oluşturuldu.
-
Bu modellerin saptanmasından sonra veri matrisi PAUP* sürüm 4.0b10 (Swofford, 2003) programına aktarılarak belirlenen baz değişim modellerine göre mesafe temelli yöntemlerden olan NJ ağaçları oluşturuldu. Diğer taraftan belirlenen modellerle ağaçtaki soy hatlarının istatistiksel olarak ne kadar desteklendiğini göstermek amacıyla 10 000 replikasyon analizi ile bootstrap gerçekleştirilmiştir.
Maksimum likelihood (ML) analizi PAUP* versiyon 4.0b10 (Swofford, 2003) programında heuristic araştırma algoritması kullanılarak gerçekleştirlmiştir. Yine aynı programda bootstrap değeri heuristic araştırma algoritması kullanılarak, 1000 bootstrap tekrarı ve 10 rastgele tekrarla oluşturdu ve ML ağacı üzerinde gösterilmiştir. Bootstrap değeri Branch-swapping algoritması: tree-bisection- reconnection (TBR) araştırma algoritması kullanılarak 10 rastgele tekrar ve 1000 bootstrap tekrarı ile hesaplanmıştır.
(Tutumluluk) Analizi MacClade programında indel bölgeleri çıkarılarak oluşturulacak DNA veri matrisleri PAUP* versiyon 4.0b10 (Swofford, 2003) programına aktarılarak gerçekleştirilmiştir. Branch-and-bound algoritması ve 10 000 rastgele tekrar seçenekleri kullanılarak Parsimoni analizi yapılmıştır. Birden fazla eşit olasılıkta kısa ağaç elde edilme durumunda PAUP* kullanılarak elde edilen bu kısa ağaçların hepsini özetleyen strict ve %50 majority rule konsensus ağaçları üretilmiştir. Elde edilen ağacın istatistiksel olarak ne kadar desteklendiğini görmek amacıyla Branch- swapping algoritması: tree-bisection-reconnection (TBR) algoritması kullanılarak bootstrap analizi 100 rastgele tekrarlama ve 10000 replikasyon kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Elde edilen bootstrap değerleri strict konsensus ağacı üzerinde gösterilmiştir.
T
Bayesiyan çıkarsamalı ve Markov Chain Monte Carlo (MCMC) temelli filogenetik analizler MrBayes 3.1.2 (Huelsenbeck ve Ronquist 2001; Ronquist ve Huelsenbeck 2003) programı kullanılarak geçekleştirilmiştir.
Analizler haplotiplerin nükleotid dizileri ve populasyonlarda bulunup bulunmaması (alan analizi) şeklinde toplamda iki farklı analiz uygulanarak gerçekleştirilmiştir. Dizi verilerine dayalı analizlerde ML analizinde model olarak kullanılan baz değişim modeli kullanılarak gerçekleştirilecektir. Bayesiyan posterior olasılıkları son 750 örneklenen ağaç arasından (Örneklemelerin %25 yani 250 örneklem ön deneme yani burn-in olarak uzaklaştırılmıştır) Çoğunluk- Kuralı Konsensüs Ağacı (Majority-Rule Consensus Tree) oluşturulmuştur.
11
Çalışmamızın filogenetik kısmında Myrmeleotettix maculatus tür gurubunun populasyonlarının değerlendirmesinde cinsin içerisinde yer alan Myrmeleotettix antennatus türüne ait NCBI ‘dan alınan HQ738954.1 aynı bölgeye ait dizi kullanılmıştır.
11 3. BULGULAR
Myrmeleotettix maculatus tür grubu içerisinde yer alan M. maculatus türüne ait Marmara Bölgesinden (Bursa, Balıkesir), Karadeniz Bölgesinden (Ordu, Giresun, Trabzon) ve Avrupa’dan (Berlin) Myrmeleotettix ethicus (Antalya) populasyonlarının COI genine ait sonuçlar hem populasyon genetik çeşitliliği hem de filogenetik temeldeki hipotezlerin test edilmesine imkan verecek nitelikte elde edilmiştir. Bu nedenle 7 farklı populasyondan toplam 74 bireye ait elde edilen sonuçlar bu analizler için kullanıldı.
Veriler öncelikle Geneious 9.1.5 programı yardımıyla alignment (DNA dizilerinin karşılaştırılarak sıralanması) yapıldı. Sonrasında MEGA v.6.0 ve MacClade v.4.03 programları kullanılarak NEXUS formatında veri matrisine dönüştürüldü. Oluşturulan veri matrisinde genin 610–645 baz çifti uzunluğundaki bölgesinin dizileri tüm örnekler için elde edildi ve bu bölgenin 546 baz uzunluğundaki bölgesi analizler de kullanıldı.
MacClade v.4.03 programı kullanılarak, Myrmeleotettix maculatus tür gurubuna ait 7 populasyondan 74 birey ve Fransadan 1 örneğe ait dizlerden toplam 31 haplotip saptanmış (Çizelge 3.1) ve dış grup olarak belirlenen Myrmeleotettix antennatus türüne ait 1 bireyin katılmasıyla toplam 32 haplotipin var olduğu saptandı (Çizelge 3.1). Toplam 76 dizinin 546 bazlık bölgenin 508 bazı korunmuş (conservative), 38 bazı değişken (polimorfik) ve 21 bazı parsimonik anlamda bilgi verici olarak saptandı (Çizelge 3.2).
Haplotiplerin dağılımına bakıldığında 32 haplotipin 1 tanesi dış grup olarak kullanılan Myrmeleotettix antennatus’ a geri kalan 31 tanesi de Myrmeleotettix maculatus tür gurubunun populasyonlarına aittir.
Türe ait populasyonların sahip olduğu haplotip dağılımına bakıldığında sadece 5 haplotipin farklı populasyonlarca paylaşıldığı gözükmektedir. Bu haplotiplerden: Hap_03;
Balıkesir ve Bursa populasyonlarınca, Hap-09; Giresun, Trabzon, Hap-10; Ordu ve Giresun, Hap-11; Giresun ve Trabzon ve Hap-17; Ordu ve Trabzon populasyonlarınca paylaşılmaktadır. Geriye kalan 27 haplotipin her biri sadece saptandığı populasyona özgü, fikse haplotipler şeklindedir ve diğer populasyonlarda belirlenmemiştir.
3.1 Populasyonlarda Genetik Çeşitlilik ve Gen Karakterizasyonu
Çalışılan örneklere ilişkin DNA dizilerinin A-T bakımından zengin oldukları (A=0.307, C=0.187, G=0.182, T=0.324) saptanmıştır. Sekanslar arasında 21’i parsimonik olarak bilgi verici olmak üzere toplam polimorfik bölge sayısı 38’dir.
Populasyonlar içerisinde en fazla substitüsyon 16 ile M. maculatus türüne ait Almanya ve Fransa populasyonlarında iken en az ise 2 ile Ordu populasyonunda saptanmıştır.
Populasyonların sahip olduğu diziler arasındaki nükleotid çeşitliliği ve haplotip çeşitliliği bakımından en yüksek değerler Ordu, Giresun ve Trabzon populasyonlarında saptanmıştır (Çizelge 3.3, Çizelge 3.5). Ayrıca ikili farklılıkların ortalama sayısı olan Pi değerinde de Trabzon populasyonu en yüksek değere sahip çıkmıştır (Çizelge 3.6).
Diziler arasındaki farklılaşmada nötral süreçlerden bir uzaklaşma olup olmadığını
12
Çizelge 3.1. M.maculatus tür gurubuna ait çalışılan 7 populasyondan gerçekleştirilen 74 dizi içerisinde saptanan 32 haplotip ve bunları paylaşan diziler
Haplotip Adı Paylaşılan
Haplotip Sayısı Paylaşan Bireyler
Hap_01 14 A.Ethicus_52-66
Hap_02 2
Balikesir_05,10
Hap_03 10
Balikesir_03,04,13,14; Bursa_03,04,29,32,34,36,37,39
Hap_04 1
Balikesir_15,
Hap_05 1 Bursa_33
Hap_06 1
Bursa_40
Hap_07 1 Bursa_41
Hap_08 1
Giresun_67
Hap_09 8
Giresun_68,72,73,75; Ordu_42,44,50; Trabzon_02
Hap_10 2
Giresun_70; Ordu_46
Hap_11 2 Giresun_74; Trabzon_24
Hap_12 1
Giresun_76
Hap_13 1
Giresun_80
Hap_14 5 Hellerberg_82,84,86,91,93
Hap_15 8
Hellerberg_85,87,88,89,90,92,94,96
Hap_16 1
Hellerberg_95
Hap_17 2 Ordu_43; Trabzon_26
Hap_18 1
Ordu_45
Hap_19 1 Ordu_47
Hap_20 1
Ordu_48
Hap_21 1
Ordu_49
Hap_22 1
Ordu_51
Hap_23 1 Trabzon_01
Hap_24 1 Trabzon_18
Hap_25 1 Trabzon_20
Hap_26 1 Trabzon_21
Hap_27 1 Trabzon_23
Hap_28 1 Trabzon_25
Hap_29 1 Trabzon_27
Hap_30 1 Trabzon_28
Hap_31 1 Myrm_maculatus (Fransa)
Hap_32 1 Myrm_antennatus
* Paylaşılan haplotipler
13
belirleyebilmek için Tajima’nın D ve Fu’nun Fs değerleri hesaplanmıştır. Her iki değer açısından da nötraliteden anlamlı derecede bir uzaklaşma tespit edilememiştir (D = 0.57124 P = 0.80824; Fs = -2.36584 P = 3.19682) (Çizelge 3.6).
Çizelge 3.2. Çalışılan 7 populasyon ve 1 dış gruba ait 32 haplotipin varyasyonel baz pozisyonları (par. İnf: parsimoni olarak bilgi verici bazlar)
M. maculatus tür gurubuna ait populasyonları içerisinde elde edilen 31 haplotipin birbirleriyle olan ilişkisini daha yakından anlamak amacıyla Network-5.0 programı kullanıldı. Network analizi eldeki haplotipleri değerlendirdiğinde, üç farklı haplotip
14
grubunun varlığına işaret etmiştir. Bunlardan ilki M. maculatus türünün Karadeniz populasyonları tarafından paylaşılan haplotiplerden olan ve en fazla populasyon tarafından paylaşılan 9 nolu haplotipin olduğu gruptur. Bu ana guruba (20 Haplotip bulunmaktadır) bağlanan iki gurup daha bulunmaktadır. Bunlardan M. maculatus türünün Bursa ve Balıkesir populasyonlarında bulunan haplotipler ile oluşan gurup M.
ethicus türünün 14 bireyinin tümünden saptanan tek bir haplotip olan Hap-01 ile ana haplotip gurubuna bağlanmaktadır (Şekil 3.1). Diğeri ise M. maculatus türünün Avrupa örneklerine ait haplotipler ile oluşan gurup program tarafından oluştrulan hipotetik haplotip olan Mv10 ile ana haplotip gurubuna bağlanmaktadır (Şekil 3.1). Network analizi M. maculatus tür gurubunun populasyonlarını kendi içerisinde üç farklı gruba bölmüştür ve oluşan bu gruplar coğrafik olarak “Karadeniz” (Ordu, Giresun, Trabzon),
“Marmara” (Bursa ve Balıkesir) ve “Avrupa” (Almanya ve Fransa) şeklinde oluşmuştur.
Çizelge 3.3 Populasyonlara ait Haplotip ve Nükleotid çeşitlilik indeksleri
Statistics Antalya Balıkesir Bursa Giresun Hellerberg Ordu Trabzon Haplotip
çeşitliliği(Hd)
0.00000 0.80000 0.49091 0.83333 0.58242 0.93333 1.00000
Haplotip sayısı (h)
1 3 4 6 3 8 11
Nucleotide çeşitliliği (pi)
0.00000 0.00183 0.00206 0.00519 0.00123 0.00330 0.00646
Çizelge 3.4 Populasyonlara ait pairwise FSTs değerleri.
Statistics Antalya Balıkesir Bursa Giresun Hellerberg Ordu Trabzon Antalya 0.00000
Balıkesir 0.83234 0.00000
Bursa 0.68868 0.07821 0.00000
Giresun 0.70997 0.58295 0.64808 0.00000
Hellerberg 0.98085 0.95807 0.95273 0.88754 0.00000
Ordu 0.76721 0.66589 0.70404 -0.02466 0.91976 0.00000
Trabzon 0.68681 0.58036 0.64082 0.06021 0.84390 0.17472 0.00000
Çizelge 3.5 Populasyonlara ait genetik çeşitlilik sonuçları
Statistics Antalya Balıkesir Bursa Giresun Hellerberg Ordu Trabzon Mean s.d.
No.Of transitions
0 2 3 6 1 4 7 3.286 2
No.of
transversions
0 0 1 0 1 0 0 0.286 0
No.of substitutions
0 2 4 6 2 4 7 3.571 2
Pi 0.000 1.000 1.127 2.833 0.670 1.800 3.527 1.56546 1.1
Theta_S 0.00000 0.96000 1.36567 2.20762 0.62890 1.41394 2.38992 1.28087 0.78216 s.d. Theta_S 0.00000 0.75803 0.82480 1.22807 0.47365 0.86125 1.25102 0.77097 0.40239 Theta_pi 0.00000 1.00000 1.12727 2.83333 0.67033 1.80000 3.52727 1.56546 1.15108.
s.d. Theta_pi 0.00000 0.93095 0.89301 1.86677 0.61211 1.27958 2.19182 1.11061 0.68982
15
Çizelge 3.6 Populasyonlara ait TAJIMA'S D ve FU'S FS test sonuçları
Statistics Antalya Balıkesir Bursa Giresun Hellerberg Ordu Trabzon Mean s.d.
TAJIMA'S D TEST Sample
size
14 5 11 9 14 10 11 10.57143 2.87139
S 0 2 4 6 2 4 7 3.57143 2.25877
Pi 0.00000 1.00000 1.12727 2.83333 0.67033 1.80000 3.52727 1.56546 1.15108 Tajima's D 0.00000 0.24314 -
0.63919
1.23657 0.17874 1.04827 1.93116 0.57124 0.80824
Tajima's D p-value
1.00000 0.71200 0.29100 0.89600 0.86000 0.86000 0.98300 0.77114 0.22930
FU'S FS TEST Real no. of alleles
1 3 4 6 3 8 11 5.14286 3.18158
Orig. no. of alleles
1 3 4 6 3 8 11 5.14286 3.18158
Theta_pi 0.00000 1.00000 1.12727 2.83333 0.67033 1.80000 3.52727 1.56546 1.15108 Exp. no. of
alleles
0.00000 2.28333 3.20033 4.45782 2.65345 3.85225 5.39351 3.12010 1.61038
FS 0.00000 -0.47542 -
0.48572
-1.29808 0.05541 - 5.51940
-8.83767 -2.36584 3.19682 FS p-value N:A 0.18600 0.25000 0.16400 0.42600 0.00000 0.00000 N.A. N.A.
Şekil 3.1. M. maculatus tür grubu populasyonlarının COI genine ait haplotiplerinin network analizi
M. maculatus (Avrupa)
M. maculatus (Karadeniz)
M. maculatus (Marmara)
M. ethicus (Antalya)
16
3.2 Filogenetik ve Filocoğrafik Analizlerin gerçekleştirilmesi
Dizileri elde edilen COI genine en uygun substitüsyon modelini belirlemek amacıyla MODELTEST v.3.6 programı kullanıldı. Kullanılan program 32 haplotip için en uygun modeli Akaike Information Criterion (AIC) HKY+I+G olarak ortaya koymuştur.
Testin sonuçlarına göre -lnL=1273.921, ti/tv=3.7125, baz frekansları adenin (A)=0.307, sitozin (C)=0.187, guanin (G)=0.182, timin (T)=0.324 ve korunan bölgelerin oranı ise (I)=
0.8300 olarak belirlendi. Substutisyon modelinin önerdiği baz değişim oranları R(a) [A-C]
= 1.0000, R(b) [A-G] =68.1841, R(c) [A-T] = 18.0032, R(d) [C-G] = 18.0032, R(e) [C-T] = 12.1563, R(f) [G-T] = 1.0000 ve değişken bölgelerin oranı olan Gama değeri (γ) tüm bölgeler için aynı olarak hesaplandı. Önerilen model ve parametreler doğrultusunda PAUP v.4.0b10 ve deneme aşamasında olan alfa sürümü kullanılarak filogenetik olarak analiz edildi. Farklı algoritmalar kullanılarak yapılan analizler bazı düğümlerde tamamen, bazılarında büyük oranda uyuşurken bazılarında uyuşmayan ağaçlar ortaya koymuştur.
Distance opsiyonuyla AIC’nin önerdiği HKY+I+G modeli kullanılarak yapılan NJ analizi, Şekil 3.2’de verilmiştir. NJ ağacı M. maculatus tür gurubun populasyonlarına ait haplotipleri üç ana filogenetik klada ayırmıştır (Şekil 3.2). Birinci filogenetik klad, M.
maculatus türünün Avrupa popülasyonlarına ait bireyleri içermekte ve diğer hiçbir populasyona ait bireyler yer almamaktadır. İkinci filogenetik klad M. maculatus türünün Karadeniz populasyonlarına ait bireyleri içermektedir. İkinci kladı oluşturan popülasyonlar arasındaki ilişkiler tam olarak çözümlenememiştir. Üçüncü klad ise M.
maculatus türünün Marmara popülasyonları ile M. ethicus türünü içermektedir (Şekil 3.2).
Klad-1, klad-2 ve klad-3 soy hatlarının hem haplotip dağılımına hem de ağaçtaki substitusyon/site uzaklıklarına bakıldığında, klad-2’nin içerdiği 20 haplotip ile 4 haplotip içeren klad-1’den ve 7 haplotip içeren klad-3’den, hem daha fazla genetik çeşitliliğe hem de farklılaşma oranına sahip olduğu görülmektedir. Benzer şekilde ağaçtaki farklılaşma basamakları da klad-2 içerisinde daha fazladır.
Maksimum likelihood algoritması altında yapılan 10 000 tekrarlı seç-bağla (bootstrap) ağacı distance algoritmalarına bağlı olarak yapılan NJ ağacına oldukça benzer bir ağaç topolojisi önermiştir (Şekil 3.3). ML seç-bağla ağacı bazal dallarda distance NJ ağacı ile tam olarak uyuşmuş ve üç ana klad oluşturmuştur. Klad-1’i oluşturan M. maculatus türünün Avrupa popülasyonları klad-2 ve klad-3’den bazal kolda ayrılmıştır. Klad-2’yi oluşturan M. maculatus türünün Karadeniz popülasyonları arasındaki ilişki tam olarak çözülememiş ve polytomi göstermektedir. Diğer taraftan Klad-3 içerisinde yer alan M. maculatus türünün Marmara popülasyonları ile M. ethicus türünün arasındaki ilişki tam olarak çözümlenmiştir (Şekil 3.3).
MP analizi çalışılan gen için eşit parsimonik uzaklıkta tek ağaç hesaplamıştır (CI=0.543, HI=0,457, RI=0,752, AC=0.408). Bu analizin 1000 tekrarlı full-heuristic ağaç taramalı seç-bağla (bootstrap) dal destek değerleriyle birlikte Şekil 3.4’de verilmiştir. MP ağacı yine M. maculatus türünün Avrupa popülasyonlarını bazalda ayırmıştır. Diğer taraftan klad-2 ve klad-3 tam olarak Avrupa popülasyonlarından ayrılmış olsa da kendi
17
içerisinde çözümlenme sorunları gözükmektedir. Bu noktada özellikle M. maculatus türünün Karadeniz popülasyonları olan Ordu, Giresun ve Trabzon popülasyonlarının paylaştıkları ortak haplotiplerden dolayı tam bir ayırım söz konusu olmamıştır. Ancak Klad-3 bu anlamda tam olarak çözümlenmiştir. M. ethicus türüne ait örnekler M.
maculatus türünün Marmara popülasyonlarından tam olarak ayrılmıştır.
Şekil 3.2. M. maculatus tür-grubunun NJ (Neighboor Joining) ağacı
18
Şekil 3.3. M. maculatus tür-grubunun populasyonlarından ML (Maksimum-Likelihood) opsiyonuyla oluşturulan filogenetik ağaç. Ml içerisinde evrimsel model olarak HKY+I+G kullanılmıştır.
19 Şekil 3.4. MP opsiyonuyla oluşturulan ağaç
20
Mitokondriyal COI verilerine uygulanan filogenetik analizlerden elde edilen ağaçların topolojilerine bakıldığında dış grup olarak kullanılan M. antennatus türü belirgin olarak M. maculatus tür gurubuna ait populasyonlardan farklı olduğu tüm ağaçlar tarafından desteklenmiştir. M. maculatus tür gurubuna ait populasyonların arasında var olduğu düşünülen filogenetik ilişkiyi saptamak amacıyla oluşturulan ağaçlar, kendi aralarında büyük oranda uyuşan sonuçlar vermiştir. Bu sonuçlara göre M. maculatus türüne ait olan Avrupa popülasyonlarının kökende yer aldığını, M. maculatus Karadeniz popülasyonlarının M. maculatus Marmara popülasyonları ve M. ethicusun bireylerinden ayrıldığını net bir şekilde göstermiştir.
Şekil 3.5. Bayesian analizi sonucu elde edilen %50 Majority rule consessus ağacı.
21
Bayesian analizi (Huelsenbeck ve Ronquist, 2001), HKY85+G baz değişim modeli kullanılarak Geneious porramı içerisinde plugini buluanan MrBayes 3 (Ronquist ve Huelsenbeck, 2003) programında yapılmıştır. Analiz sonucu elde edilen ağaçlardan %50 Majority rule konsensus ağacı yine Geneious 9.1.5 programı içerisinde yer alan kullanılarak elde edilmiştir (Şekil 3.5). Bayesian analizi ile elde edilen tek bir ağaç da diğer analizlerde elde edilen NJ, MP ve ML ağaçlarında olduğu gibi üç farklı soy hattını işaret etmektedir (Şekil 3.5). Ağaç üzerinde yer alan olasılık değerleri de bu durumu oldukça desteklemektedir. Bu analizde de ortaya çıkan soy hatları populasyonlar bazında değerlendirildiğin de diğer analizlerde olduğu gibi M. maculatus türüne ait olan Avrupa popülasyonlarının kökende yer aldığını, M. maculatus Karadeniz popülasyonlarının M. maculatus’un Marmara popülasyonları ve M. ethicus’un bireylerinden ayrıldığını net bir şekilde göstermiştir.
Şekil 3.6. Myrmeleotettix maculatus tür grubunun Anadolu’da sahip olduğu haplo gurupların ve kladların harita üzerinde gösterimi.
22 4. TARTIŞMA ve SONUÇ
Çalışma kapsamında Myrmeleotettix maculatus tür-gurubuna ait M. maculatus türünün Avrupa (Almanya), Karadeniz (Ordu, Giresun ve Trabzon) ve Marmara (Bursa ve Balıkesir) olmak üzere 6 populasyonu ve grubun diğer türü olan M. ethicus (Antalya) populasyonları çalışılmıştır. Çalışmamızın hedefleri olan populasyon genetiği ve filogenetik ilişkilerini anlama bağlamında başarılı bir sonuç vermiştir. Filogenetik ilişkilerini anlamak için genelde en yakın tür dış grup olarak seçilmektedir. Bu türlerden gerek morfolojik gerekse davranışsal olarak en yakın olduğu akraba türü olan M.
antennatus türü yapılan analizlerde uygun dış grup olduğu belirlenmiştir.
Myrmeleotettix maculatus tür-gurubuna ait en geniş çalışma yukarıda belirtilen populasyonların hem morfometrik hemde akustik anlamda değerlendirdikleri çalışma Şirin ve ark. tarafından 2011 yılında gerçekleştirilen çalışmadır. Yapılan çalışmada akustik anlamda M. maculatus türünün tüm populasyonlarının büyük oranda birbirine benzedikleri ancak Avrupa (Almanya) populasyonunun kısmi farklılıklarının olduğu gösterilmiştir. Diğer taraftan morfometrik analizlerde ise tüm populasyonların varyasyon limitleri biraz geniş olmakla birlikte birbirine benzer oldukları gösterilmiştir (Şirin ve ark.
2011). Yine aynı çalışmada Myrmeleotettix maculatus tür-gurubunun ikinci üyesi olan M.
ethicus türünün hem ses hemde morfometrik olarak M. maculatus türünden farklı olduğu ortaya konmuştur. Bu çalışmanın populasyonlar arası genetik çeşitlilik indekslerinin tümü (Çizelge 3.4) M. maculatus türünün Avrupa populasyonu olan Hellerberg (Almanya)’in Anadolu’da bulunan M. maculatus türünün tüm populasyonundan ve M.
ethicus türünden farklı olduğunu göstermektedir. Ayrıca M. ethicus türünün de Anadolu’da bulunan M. maculatus türüne ait olan Marmara ve Karadeniz populasyonlarından farklı olduğu gözlenmektedir. Yine bu tabloda yer alan indeksler Marmara populasyonlarının (Bursa ve Balikesir) kendi içinde ve Karadeniz populasyonlarının ise kendi için de (Ordu, Giresun ve Trabzon) birbirlerine en bezer populasyonlar olduğu gözlenmiştir (Çizelge 3.4). Diğer taraftan Network programı ile gerçekleştirilen Median joining algoritması kullanılarak yapılan analizde de M. maculatus türüne ait olan Avrupa, Marmara ve Karadeniz populasyonları sahip oldukları haplotiplere bağlı olarak ayrı haplo guruplar oluşturmuşlardır(Şekil 3.1). M. ethicus türünün (14 bireyden yapılan dizilemeye bağlı olarak) tek bir haplotipinin olduğu saptanmış olup bu haplotipin ise M. maculatus türünün Marmara populayonlarının haplo gurubu ile Karadeniz populasyonlarının haplo gurubu arasında yerleştiği belirlenmiştir (Şekil 3.1).
Çalışmanın filogenetik analiz kısmında yer alan hem mesafe temelli yöntemler (Neighbour oining (N )-Komşu Birleştirme) hem de karakter temelli yöntemler (Ma imum arsimony (M ) Farklılıkları n Aza ndirme metodu, Ma imum ikelihood (M ) n Yüksek htimal Metodu ve Bayes Metodu) ile oluşturulan ağaçlar analiz edilen tüm populasyonları üç klada ayırmıştır (Şekil 3.2-3.5). Bu kladalardan ilki M. maculatus türünün Avrupa’da yayılış gösteren populasyonlarına ait iken, Klad-2 yine bu türün Karadeniz’de yayılış gösteren populasyonlarına aittir. Klad-3 ise kendi içinde iki ayrı kola ayrılmıştır ve bu kollardan birisi M. maculatus türünün Marmara populasyonlarından oluşmakta diğeri ise M. ethicus türünün bireylerinden oluşmaktadır.
23
Çalışmamız Anadolu’da iki farklı coğrafik alanda bulunan (Marmara ve Karadeniz populasyonları) M. maculatus türünün iki farklı klad halinde soy hatlarını devam ettirdiklerini ortaya koymuştur (Şekil 3.2-6). Ayrıca gerek Marmara gerekse Karadeniz kladlarının kendi içlerinde genetik çeşitlilik indekslerine bağlı olarak birbirlerine daha yakın oldukları ve kladların kendilerine has haplotiplere sahip oldukları belirlenmiştir.
Karadeniz populasyonlarının daha fazla genetik çeşitliliğe ve haplotip sayısına sahip olduklarını ve haplotiplere bağlı olarak yapılan Network analizi atasal genetik örüntünün Karadeniz populasyonlarında bulunduğunu göstermiştir. Her ne kadar M. maculatus tür grubunun diğer üyesi olan M.ethicus türünün M. maculatus türünün Marmara kladına daha yakın olarak gözükse de paylaştıkları herhangi bir ortak haplotip bulunmamaktadır.
Sonuç olarak bu çalışma Batı alearctik’te (özellikle Avrupa’da) yayılışı olan (Bei- Bienko & Mistshenko 1951; Harz 1975) M. maculatus türünün Anadolu’da yer alan Marmara ve Karadeniz populasyonlarının gerek Avrupa populasyonlarından gerekse birbirlerinden farklılaştıklarını göstermiştir. Ayrıca M. ethicus türünün ise M. maculatus türünün Marmara populasyonları ile genetik olarak daha benzer olduğu ve muhtemelen bu türün Marmara bölgesinden köken aldığı belirlenmiş oldu. M. ethicus türünün tek bir haplotipe sahip olması bu türün çok yakın zamanda gerçekleşen bir dağılımın sonucu olduğunu işaret etmektedir. Bu durumdan yola çıkılarak çalışmanın bir sonraki aşaması ise Marmara ve Karadeniz populasyonları arasında yapılacak olan çiftleşme denemeleri ile bu populasyonların türleşme yolunda hangi aşamaya geldiklerinin belirlenmesi şeklinde olabilir. Ayrıca phylogenetik ilişkinin daha net saptanması bir çekirdek DNA’sına ait genin (ITS-grubu benzeri) analiz edilmesi ve COI verilerini artırarak moleküler saat uygulaması gerçekleştirmek olmalıdır.
