PCR
Herhangi bir organizmaya ait genomik DNA içerisinde yer alan, dizisi bilinen iki segment arasındaki özgün bir bölgeyi enzimatik olarak
çoğaltmak için uygulanan bir yöntemdir. Polimeraz Zincir Tepkimesi (PZT) olarak adlandırılır. PCR işleminde kullanılan cihaza thermal cycler (ısıl döngü cihazı) denir.
İlk olarak Kary Mullis tarafından 1985' te bulunmuştur.
PCR Kullanım Alanları:
•DNA’ nın dizi analizi ve DNA haritalamasında
•Genetik hastalıkların teşhisinde
•DNA parmak analizinde
•Allellik dizi varyasyonlarının gösterilebilmesi ile doku transplantasyonu için doku tipinin belirlenmesinde
•Adli tıp örneklerinin genetik tiplendirilmesi
•Zirai araştırmalarda
•Moleküler biyolojik çalışmalarda (klonlama vb.)
PCR- Temel Bileşenler
•Kalıp DNA molekülü
•Hedef bölgeye özgü DNA primerleri (forward ve reverse primer)
•DNA polimeraz enzimi
•dNTP’ler (dATP, dTTP, dGTP, dCTP)
•Tampon
• Mg++ iyonu
•Ultra saf su
PCR- Temel Bileşenler
PCR 3 aşamadan oluşmaktadır.
1.Aşama: Denatürasyon
Bu aşamada çift zincirli DNA 95̊ C’de tek zincirli hale gelir.
PCR- Temel Bileşenler
2. Aşama: Anneling (Bağlanma)
Denatürasyondan sonra sıcaklık primer uzunluğuna bağlı olarak 55-60 ̊C düşürülür ve primerler birbirlerinden ayrılmış olan hedef DNA zincirlerine spesifik olarak bağlanır
Forward primer (ileri primer), hedef DNA’nın 5’ ucuna bağlanır.
Reverse primer (geri primer) de 3’ kısmına bağlanır.
Bağlanma ısısı genellikle primerlerin erime ısısının altında bir
değer olarak seçilir.
PCR- Temel Bileşenler
3.Aşama: Extension (Uzama)
Primerlerin bağlandığı bölgeden başlayarak, Taq polimeraz enzimi ile DNA çoğaltılır.
Taq polimeraz enziminin en iyi çalıştığı sıcaklık 72̊C’dir.
Taq polimeraz enzimi, 5’-3’ yönünde ortamdaki nükleotidleri
kullanarak, primerlerin 3’ ucuna nükleotidleri yerleştirir. Böylece
hedef DNA’nın kopyası elde edilir.
PCR- Temel Bileşenler
Primerler normal koşullarda en az 18-20 baz çifti olarak tasarlanır.
Bu sayede primerlerin hedef DNA’da tek bir bölgeye bağlanması sağlanır.
Taq polimeraz enzimi kofaktör olarak magnezyum kullanır. Dolayısıyla magnezyum konsantrasyonu PCR için son derece önemlidir.
Taq polimeraz enzimi Thermus aquaticus isimli termofilik bir bakteriden elde edilir.
