Değişik Konsantrasyonlarda ve Sürelerde
Phorbol-12-Myristate-13-Acetate ile Uyarılan İnsan
THP-1 Lösemi Hücrelerinin Sitokin ve Midkin
Yanıtlarının Araştırılması
Investigation of Cytokine and Midkine Responses of Human
THP-1 Leukemia Cells Induced by
Phorbol-12-Myristate-13-Acetate (PMA) at Different Concentrations and Times
Derya BİRİKEN1, Nuray YAZIHAN2, Şükran YILMAZ31 Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Ankara.
1 Ankara University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Ankara, Turkey. 2 Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi, Fizyopatoloji Bilim Dalı, Ankara.
2 Ankara University Faculty of Medicine, Department of Pathophysiology, Ankara, Turkey. 3 Şap Enstitüsü, Hücre ve Virüs Bankası, Ankara.
3 Screed Institute, Cell and Virus Bank, Ankara, Turkey.
ÖZ
Makrofajlar doğal immün yanıtı başlatan ve patojenle ilk temasta bulunan hücre olarak kabul edilmektedir. Hem hücreler arası ilişkiler hem de enflamatuvar mediyatörlerin salınımı yoluyla doğal immün ve enflamatuvar yanıtta etkin rol oynamaktadırlar. İnsan THP-1 lösemi hücreleri, makrofajların in vitro olarak fonksiyonlarını, mekanizmalarını ve sinyal yollarını araştırmak için en yaygın olarak kullanılan hücre dizisidir. Phorbol-12-Myristate-13-Acetate (PMA) monositik hücre dizilerinde makrofaj farklılaşmasını başlatmak için yaygın olarak kullanılan uyarıcılar arasında yer almaktadır, ancak primer doku makrofajlarına kıyasla farklılaşma derecesi belirsizdir. Midkin bir sitokin ve büyüme faktörü gibi davranır, çoğalmayı, farklılaşmayı, hayatta kalmayı, adezyonu, hücrelerin migrasyonunu düzenlemekte ve organize etmektedir. Bu çalışmada, THP-1 monosit hücreleri farklı doz ve uygulama süreleri ile PMA ile uyarılarak hücrelerin makrofaja farklılaşmaları sonucunda, hücrelerden midkin, TNF-α, IL-10 ve IFN-γ salınımındaki değişikliklerin in vitro koşullarda gözlenmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla süspanse olarak üreyen THP-1 monosit hücreleri 10 ng/ml, 20 ng/ml, 40 ng/ml, 60 ng/ml konsantrasyonlarda PMA ile 24, 48 ve 72 saat inkübasyona bırakılmıştır. Kuyucuklardan inkübasyon süreleri sonunda toplanan süpernatanlarda midkin,
Geliş Tarihi (Received): 05.12.2017 • Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 09.04.2018
TNF-α, IL-10 ve IFN-γ sitokin düzeyleri ELISA yöntemi ile ölçülmüştür. PMA uyarıları hücre morfolojisinde farklılaşmayı gösteren değişiklikler başlatmıştır. PMA ile hücrelerin farklılaşması, en düşük dozda (10 ng/ ml) bile monositik hücrelerde midkin, TNF-α, IL-10 ve IFN-γ salınımlarına neden olmuştur. Bununla birlikte doz arttıkça PMA (> 20 ng/ml) hücrelerde sitotoksisiteye yol açmıştır. THP-1 hücreleri bazal midkin sekresyonuna sahiptir ve PMA uyarımı ile doza bağımlı olarak artmaktadır. Midkin sekresyonu doz ve zamana bağlı değişim göstermiştir. Farklı dozlarda PMA ile uyarılan hücrelerin sitokin profilinde de bir farklılık gözlenmiştir. Sonuçlarımızin vitro makrofaj modellerinde gerçek in vivo fizyolojik şartları tam olarak gösterebilmek için THP-1 monositlerin makrofaja farklılaşmasının optimize edilmesi gerekliliğini göstermektedir. Sonuç olarak bulgularımız, modifiye edilmiş PMA ile farklılaşma protokolünün (20 ng/ ml ve 48 saat inkübasyon) hücre ölümünü (canlılık %92.2) uyarmadan THP-1 hücrelerinin makrofaj farklılaşmasını artırabileceğini, ayrıca sitokin salınımı ve midkin yanıtlarının makrofaj farklılaşmasında önemli ayırt edici faktörler olduğunu göstermektedir.
Anahtar sözcükler: Monosit; makrofaj farklılaşması; PMA; TNF-α; IL-10; IFN-γ; midkin.
ABSTRACT
Macrophages are accepted as cells that initially contact with the pathogens and initiate the innate immune response. They play effective roles in innate immune and inflammatory responses by intercellular relations and inflammatory mediator secretion. Human THP-1 leukemia cells are frequently used for the in vitro determination of the signal pathways, and the functions of macrophages. Phorbol-12-Myristate-13-Acetate (PMA) is commonly used to induce macrophage differentiation of monocytic cell lines but the extent of differentiation in comparison to primary tissue macrophages is unclear. Midkine acts as a cytokine and growth factor which organizes proliferation, differentiation, survival, adhesion and migration of immune cells. The aim of this study was to observe the differences in the secretion of midkine, TNF-α, IL-10 and IFN-γ of macrophages differentiated from monocytes when stimulated with different doses of PMA for different durations. For this purpose, THP-1 monocytic cells were proliferated by PMA at 24, 48 and 72 hours by using the concentrations of 10 ng/ml, 20 ng/ml, 40 ng/ml and 60 ng/ ml. Midkine, TNF-α, IL-10 and IFN-γ cytokine levels were determined by ELISA in the supernatants of the cells collected at the end of incubation times. PMA stimuli initiated changes that were indicative of differentiation in the cell morphology. Differentiation of cells by PMA induced midkine, TNF-α, IL-10 and IFN-γ secretions in monocytic cells even at the lowest dosage (10 ng/ml). PMA caused cytotoxicity in the cells when the dosages were increased (> 20 ng/ml). THP-1 cells have a basal secretion of midkine and are increased by dosage dependent with PMA stimulation. Midkine secretion has shown changes dependent with dosage and time. A difference was also observed in the cytokine profile of PMA stimulated cells at different doses. The results indicated that the differentiation of THP-1 monocytes to macrophages requires optimization to ensure that this in vitro macrophage model more precisely reflects real in vivo physiologic conditions. As a conclusion the results have shown that a modified PMA differentiation protocol (20 ng/ml and 48 hours incubation) might enhance macrophage differentiation of THP-1 cells without induced cell death (viability 92.2%) and cytokine secretion and midkine responses were the important discriminators of the level of macrophage differentiation.
Keywords: Monocyte; macrophage differantiation; PMA; Midkine; TNF-α; IL-10; IFN-γ.
GİRİŞ
Doğal ve kazanılmış immün sistemin en önemli hücrelerinden birisi makrofajlardır1.
başka bir deyişle fagositoz başlıca fonksiyonları arasındadır2. Makrofajların in vitro olarak
fonksiyonlarını, mekanizmaları, sinyal yollarını araştırmak için en yaygın olarak kullanılan primer periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC’ler) ve farklı derecelerde farklılaşma gösteren THP-1, U937, ML-2, HL-60 ve Mono Mac 6 gibi monosit hücre hatları bu-lunmaktadır3-6. İlk defa akut monositik lösemili bir yaşındaki erkeğin periferik kanından
elde edilmiş olan insan monositik hücre dizini THP-15, monosit/makrofaj farklılaşmasını
ve fonksiyonunu incelemek için kullanılan immün modellerde yaygın olarak kullanılan bir hücre dizisidir7-9. Bu hücre dizisi kolaylıkla makrofajlara dönüşüm veya olgunlaşma
göstermekte ve phorbol esterleri (PMA) ve 1,25-dihidroksi vitamin D3 (vit D3) ile sti-müle edildiklerinde hücre kültürü flasklarına tutunmaları artmaktave morfolojik olarak değişim başlamaktadır. Bu hücre dizisi enfeksiyöz ve enflamatuvar hastalık modellerin-de yaygın olarak kullanılmaktadır5-7,10,11. İn vivo olarak insan makrofajlarını temsil eden
THP-1 hücrelerinin yaygın şekilde kullanılmasına rağmen, PMA kullanılarak monositlerin makrofajlara farklılaştırılması için belirlenmiş standart bir protokol bulunmamaktadır. Bu konuda yapılan çalışmalarda kullanılan PMA konsantrasyonun, hücrelerin PMA’ya maruz kalma süresinin ve başlangıçta kullanılan hücre miktarında farklılıklar olduğu görülmek-tedir6-9,12-15. Çalışmamız kapsamında proenflamatuvar etkisi belirgin olan TNF-α,
an-tienflamatuvar fonksiyonu olan IL-10 ve immünmodülasyonda önemli rolü olan IFN-γ farklı immün yanıtların başlangıcını simgeleyecek şekilde seçilmiştir. Büyüme faktörleri ve sitokinler hücresel aktivitelerin düzenlenmesinde ve çeşitli patolojik süreçlerde temel rol oynamaktadır. TNF-α proenflamatuvar özellikte bir sitokin olup çoğunlukla makrofajlar tarafından üretilmekte ve enflamatuvar reaksiyonlarda rol oynamaktadır. IFN-γ immün aktivasyonu artıran proenflamatuvar bir sitokindir. IL-10 ise aktif makrofajlar tarafından enflamatuvar sitokinlerin ekspresyonunu baskılayarak güçlü antienflamatuvar etkiye sa-hip bir sitokindir1. Midkin ise immün hücrelerin çoğalması, farklılaşması, hayatta kalması,
adezyonu ve migrasyonunu organize eden bir sitokin ve büyüme faktörü olarak görev yapmaktadır. Midkin, enflamatuvar yanıtın kontrolünde rol oynayan mitojenik, antiapo-pitotik, göç eden, kemotaktik, anjiyojenik ve fibrinolitik bir moleküldür16. İn vitro
sistem-lerde araştırma modeli olarak kullanılmak üzere THP-1 monosit hücrelerinden makrofaj hücreler elde edilmesinde farklı uyaranlar kullanarak doz ve canlılık optimizasyonunu daha önceki bir çalışmamızda gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada THP-1 monosit hücrele-rinin farklı doz ve uygulama süreleri ile PMA yardımıyla uyarılarak hücrelerin makrofaja farklılaşmaları sonucunda, bu hücrelerden midkin, TNF-α, IL-10 ve IFN-γ salınımındaki değişikliklerin in vitro koşullarda gösterilmesi amaçlanmıştır.
GEREÇ ve YÖNTEM
Bu çalışmada kullanılan insan lösemi monosit hücre kültürü (THP-1) Avrupa Kültür Ko-leksiyonu Organizasyonuna bağlı olan Almanya Kültür KoKo-leksiyonundan (DSMZ, ACC-16) temin edildi. Hücre kültürü vasatıyla sulandırılan monosit hücreleri 800 rpm’de, 4ºC’de 10 dakika santrifüj edildi, %10 FCS içeren RPMI 1640 içerisinde 1 x 105 hücre/ml
olacak şekilde süspanse edilerek, 25 cm2 yüzeyli hücre kültürü şişelerinde üretildi5,10,17.
Süspanse olarak üreyen THP-1 monosit hücreleri altı kuyucuklu plaklarda 2 x 105 /ml
(Sig-ma, Co, ABD) bulunan %10 FCS içeren RPMI 1640 ile 24, 48 ve 72 saat inkübasyona bırakıldı. PMA ile muameleden sonra 24, 48 ve 72. saatlerde kültürlerden elde edilen süpernatantlar toplandı. Farklılaşma, hücrelerde yapışma ve fenotipik değişiklikler invert doku kültürü mikroskobunda gözlemleyerek doğrulandı. Farklı miktarlarda ve farklı za-manlarda PMA ile uyarılmış ve uyarılmamış kontrol hücrelerinin midkin, TNF-α, IL-10 ve IFN-γ seviyeleri ELISA kit (Cytolab/PeproTech, Rehovot, İsrail) prosedürüne göre ölçüldü. Absorbans değerleri spektrofotometrik olarak 450 nm’de belirlendi ve protein seviyeleri pikogram cinsinden hesaplandı. Deneylerin düşük algılama sınırları TNF-α, IL-10, IFN-γ sitokinleri için 16 pg/ml midkin için 150 pg/ml olarak kabul edildi.
İstatistiksel Analiz
PMA ile muamele değerleri muamele edilmemiş kontrollerle tek yönlü ANOVA ile kar-şılaştırıldı ve ardından SPSS 13.0 kullanılarak çoklu karşılaştırma testi yapıldı. < 0.05 olan bir p değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Veriler ortalama ± standart hata (SEM) olarak ifade edildi.
BULGULAR
PMA ile uyarılmamış hücreler yuvarlak şekilli ve kültür plaklarının plastik yüzeylerine yapışmadan süspanse şekilde üremiştir (Şekil 1A). Monosit hücre dizisi THP-1, PMA ile muamelesinde tüm konsantrasyonlarda farklılaşmış ve hücreler kültür plaklarının plastik yüzeylerine yapışmıştır. Yüzeye tutunmuş hücreler, şekil olarak yassı ve amöboid bir hal almış ve hücre yüzeyinde bulunan birçok mikrovillus kaybolmuştur (Şekil 1B).
Süspanse THP-1 monosit hücreleri çeşitli konsantrasyonlarda PMA ile inkübe edilmiş ve 24, 48 ve 72. saatlerde alınan süpernatantlar da ELISA ile saptanan midkin, TNF-α, IL-10 ve IFN-γ düzeyleri (pg/ml) sırasıyla Şekil 2-5’te gösterilmiştir. Hem uyarılmayan monosit hücrelerinde hem de çeşitli konsantrasyonlarda belirlediğimiz inkübasyon süre-leri sonunda PMA ile muamele edilen hücrelerde basal TNF-α ve IL-10 salınımının artmış olduğu gözlenmiştir (p< 0.001). TNF-α sitokin düzeyi 10 ve 20 ng/ml PMA ile uyarılan
Şekil 1A. PMA ile uyarılmamış THP-1 hücreleri, B. THP-1 hücrelerinin (x200) 20 ng/ml PMA konsantrasyonunda 48 saat inkübasyonu ve kontrol hücrelerinin faz kontrast mikroskop görüntüsü.
hücrelerde uyarılmayan hücrelere göre 48. ve 72. saatlerde anlamlı olarak yüksek bulun-muştur (p< 0.001) (Şekil 2). IL-10 sitokin düzeyi 10 ve 20 ng/ml PMA uyarılan hücre-lerde uyarılmayan hücrelere göre 48. saathücre-lerde anlamlı olarak yüksek bulunmuştur (p< 0.001) (Şekil 3). TNF-α ve IL-10 salınımının en yüksek seviyesi 20 ng/ml’de 48. saatte gözlenmiş, bu dozdan sonra yanıtlarda istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık görülme-miştir. IFN-γ düzeyleri ise PMA uyarımı ile doza bağımlı olarak azalmıştır (Şekil 4). PMA uyarımı basal midkin sekresyonunu arttırmıştır. Midkin sekresyonu 10 ve 20 ng/ml PMA ile uyarılan hücrelerde uyarılmayan hücrelere göre 48 ve 72. saatlerde anlamlı düzeyde yüksek bulunmuştur (p< 0.001) (Şekil 5). Midkin yanıtı tüm uyarım dozlarında ilk 24 sa-atte uyarılmayan hücrelere göre daha yüksek (p< 0.001) (Şekil 5) bulunmuştur. Uyarımın 48. ve 72. saatlerinde 10 ng/ml PMA ile uyarılan hücrelerde yanıt yüksek bulunurken, 20 ng/ml PMA yanıtı aynı saatlerde anlamlı fark bulunmamıştır. Bu etki PMA 40 ve 60 ng/ ml olduğunda aynı saatlerde kontrole göre azalmış olduğu saptanmıştır (p< 0.01) (Şekil 5). Monosit-makrofajların farklı konsantrasyonlarda PMA ile uyarılması sonucu oluşan
Şekil 2. THP-1 monosit hücrelerinin 10 ng/ml, 20 ng/ml, 40 ng/ml, 60 ng/ml PMA ile konsantrasyonlarda ve 24, 48 ve 72. saatlerindeki TNF-α düzeyleri (pg/ml).
midkin düzeylerinin, hücre canlılığı ile doğrudan ilişkili olduğu gösterilmiştir (p< 0.01, R= 0.563). PMA uyarımı sonrası TNF-α ve IL-10 yanıtı birlikte artarken (p< 0.000; R= 0.758), IFN-γ cevabının azalmış olduğu (p= 0.011; R= -383) bulunmuştur.
TARTIŞMA
THP-1 hücreleri, akut monositik lösemi olan bir hastadan elde edilmiş bir lösemik hücre dizisidir. 1980 yılındaki tanımından beri, THP-1 hücreleri hem makrofaj biyolojisini anlamak hem de monosit-makrofaj farklılaşmasının araştırılmasında kullanılan bir model olarak bu hücrelerin uygun olduğunu gösteren çok sayıda çalışma bulunmaktadır4,5,10.
THP-1 hücreleri; kolaylıkla bölünebildiği, hücre kültüründe uzun süre muhafaza edilebil-diği için kan monosit modellerinin yerine geçebilecek uygunluğa sahiptir4,7,8,15. Aktive
Şekil 5. THP-1 monosit hücrelerinin 10 ng/ml, 20 ng/ml, 40 ng/ml, 60 ng/ml PMA ile konsantrasyonlarda ve 24, 48 ve 72. saatlerindeki midkin düzeyleri (pg/ml).
makrofaj hücrelerinin; sitokin salınımlarının yanı sıra fagositik aktivite, bakterisidal aktivite ve antijen sunma özellikleri de bulunmaktadır. THP-1 hücrelerinin makrofaj hücrelerine farklılaşabilmesi için genellikle lipopolisakkarit (LPS), PMA, vitamin D3 gibi çeşitli uyaran-lara gereksinimleri bulunmaktadır10,17. PMA, monositik hücre hattı THP-1’in makrofaja
farklılaşmasını başlatmak için en yaygın olarak kullanılan uyaran maddelerdir. PMA sti-mülasyonunu takiben hücrelerin fenotipik özellikleri ve fonksiyonelliği çalışmalara göre farklılıklar göstermektedir; bu farklılıklara arasında inkübasyon süresi veya konsantrasyon zamanı yer almaktadır.
THP-1 monositleri in vitro makrofaj modeli olarak, yoğun olarak kullanılmış olsa da bu hücrelerin makrofajlara farklılaşmasının optimizasyonu için çok az sayıda çalışma bu-lunmaktadır. Farklılaşma süreci, hücre morfolojisi ile yüzeye tutunmanın basit kontrolü yapılarak, yüzey belirteçlerinin ekspresyonu incelenerek doğrulanmaktadır. Farklı hüc-re miktarları, inkübasyon sühüc-releri ve PMA ile THP-1 hüchüc-relerinin muamelesinin yapıldığı birçok çalışma bulunmaktadır 6-9,11,13,17-20. Daha önceki bir çalışmamızda THP-1
hüc-relerinin PMA ile farklı konsantrasyonlarda ve farklı inkübasyon süreleri sonunda en be-lirgin fenotipik değişiklikleri ve en iyi hücre canlılığını (%92.2) sağlayan optimum PMA konsantrasyonu ve inkübasyon süresi (20 ng/ml PMA ve 48 saat) saptanmıştı. Optimize edilen bu sonuçlarla yaptığımız bir çalışmada makrofaj ve epitel hücrelerinin temasının olduğu ko-kültürlerde bakterisidal etkinin ve nitrik oksit yanıtının artmış olduğu, makrofaj yanıtında epitel hücresi ile temasın güçlendirici bir etki yaptığı, ayrıca bakterisidal etkide monosit/makrofaj hücre dizisinin epitel hücre dizisinden daha büyük rol oynadığı sonu-cuna varılmıştır21. Park ve arkadaşlarının çalışmasında PMA’nın yüksek konsantrasyonlar
(100 ng/ml) kullanılarak farklılaştığı THP-1 hücrelerinde düşük konsantrasyon (5 ng/ml) kullanılarak farklılaşan hücrelere göre enflamasyonla ilişkili gen ekspresyon seviyesi ve proenflamatuvar sitokin salgılamasının arttığı gösterilmiştir13.
Başka bir çalışmada ise PMA ile uyarılan makrofaj fonksiyonlarının LPS ile uyarım sonu-cu gerçekleşen yanıtta TNF salınımının belirlenmesinde önemli ölçüde değişken olduğu ve monositlerin farklılaşmasını uyarmak için kullanılan PMA konsantrasyonuna ve PMA’ya maruz kaldıktan sonra dinlenme süresine bağlı olduğu saptanmıştır. Aynı çalışmada mo-nositik THP-1 hücrelerinin 25 nM/ml ve 48 saat üzerinde PMA ile muamele edilmesinin (PMA yokluğunda 24 saat inkübasyondan sonra) THP-1 farklılaşması için optimal bir protokol olduğu tespit edilmiştir19.
PMA uyarımı monositlerde monositik hücre dizilerinin bazal enflamatuvar yanıt dü-zeyini arttırdığı düşünülmektedir. Bu durum lipopolisakkarit gibi pek çok enflamatuvar uyarıcıya karşı daha yüksek proenflamatuvar yanıt görülmesine neden olabilmektedir. PMA uyarımı sonrası optimum TNF-α ve IL-10 yanıtı için 20 ng/ml ve 48. saatte PMA uygulamasının uygun olacağını düşündürmektedir. İnsan monositleri, bazal midkin sal-gılama kapasitesine sahiptir. Daha önceki bir çalışmada insan histiyositik lenfoma hüc-re hattı U937’nin midkin sekhüc-resyon kapasitesinin olduğu bildirilmiştir22. Bu çalışma ile,
insan akut monositik lösemi hücre hattı THP-1 monositlerde ve PMA ile farklılaşması sonunda oluşan makrofajlarının midkin salgılama kapasitesine sahip olduğunu gösterdik. PMA monositlerde midkin sekresyonunu farklılaşma sürecinde arttırmaktadır. Fakat doza bağlı midkin salınımı azalmaktadır. Bu supresyon, 20 ng/ml konsantrasyondan sonra daha belirgin olarak gözlenmektedir. Monosit-maktofajların farklı dozlarının midkin dü-zeylerinin, hücrelerin canlılığı ile bağlantılı olduğu gösterilmiştir.
Bulgularımız, modifiye edilmiş PMA ile farklılaşma protokolünün (20 ng/ml ve 48 saat inkübasyon) hücre ölümünü (canlılık %92.2) uyarmadan THP-1 hücrelerinin makrofaj farklılaşmasını arttırabileceğini, ayrıca sitokin salınımı ve midkin yanıtlarının makrofaj farklılaşmasında önemli ayırt edici faktörler olduğunu göstermektedir. Bu sonuçlar, in vitro makrofaj modellerinde gerçek in vivo fizyolojik şartları tam olarak yansıtmasını sağ-lamak için THP-1 monositlerin makrofaja farklılaşmasının optimize edilmesi gerekliliğini göstermektedir.
KAYNAKLAR
1. Gordon S. Mononuclear phagocytes in immune defence, pp: 181-202. In: Male D, Brostoff J, Roth DB, et al. (eds). Immunology. 2006, 7th ed. USA.
2. Si-Tahar M, Touqui L, Chignard M. Innate immunity and inflammation-two facets of the same anti-infectious reaction. Clin Exp Immunol 2009; 156(2): 194-8.
3. Chanput W, Reitsma ML, Kleinjans JJ, Mes JJ, Savelkoul HF, Wichers HJ. Beta-glucans are involved in immune-modulation of THP-1 macrophages. Mol Nutr Food Res 2012; 56(5): 822-33.
4. Qin Z. The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature. Atherosclerosis 2012; 221(1): 2-11.
5. Tsuchiya S, Yamabe M, Yamagochi Y, et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1 cells). Int J Cancer 1980; 26(2): 171-6.
6. Zhao W, Sun Z, Wang, S, Li Z, Zheng L. Wnt1 participates in inflammation induced by lipopolysaccharide through upregulating scavenger receptor A and NFkB. Inflammation 2015; 38(4): 1700-6.
7. Chanput W, Mes JJ, Wichers HJ. THP-1 cell line: an in vitro cell model for immune modulation approach. Int Immunopharmacol 2014; 23(1): 37-45.
8. Shiratori H, Feinweber C, Luckhardt S, et al. THP-1 and human peripheral blood mononuclear cell-derived macrophages differ in their capacity to polarize in vitro. Mol Immunol 2017; 88: 58-68.
9. Solberg R, Smith R, Almlof M, Tewolde E, Nilsen E, Johansen HT. Legumain expression, activity and secretion are increased during monocyte-to-macrophage differentiation and inhibited by atorvastatin. Biol Chem 2015; 396(1): 71-80.
11. Maeb MB, Wittig B, Cignarella A, Lorkowski S. Reduced PMA enhances the responsiveness of transfected THP-1 macrophages to polarizing stimuli. J Immunol Methods 20THP-14; 402(THP-1-2): 76-8THP-1.
12. Tulk SE, Liao KC, Muruve DA, Li Y, Beck PL, MacDonald JA. Vitamin D(3) metabolites enhance the NLRP3-dependent secretion of IL-1beta from human THP-1 monocytic cells. J Cell Biochem 2015; 116(5): 711-20. 13. Park EK, Jung HS, Yang HI, Yoo MC, Kim C, Kim KS. Optimized THP-1 differentiation is required for the
detection of responses to weak stimuli. Inflamm Res 2007; 56(1): 45-50.
14. Chanput W, Mes J, Vreeburg RA, Savelkoul HF, Wichers HJ. Transcription profiles of LPS-stimulated THP-1 monocytes and macrophages: a tool to study inflammation modulating effects of food-derived compounds. Food Funct 2010; 1(3): 254-61.
15. Tedesco S, De Majo F, Kim J, et al. Convenience versus biological significance: are PMA-differentiated THP-1 cells a reliable substitute for blood-derived macrophages when studying in vitro polarization? Front Pharmacol 2018; 9: 71.
16. Yazıhan N. Midkine in inflammatory and toxic conditions. Current Drug Delivery 2013; 10(1): 54-7. 17. Schwende H, Fitzke E, Ambs P, Dieter P. Differences in the state of differentiation of THP-1 cells induced by
phorbol ester and 1,25-dihydroxyvitamin D3. J Leukoc Biol 1996; 59 (4): 555-61.
18. Kohro T, Tanaka T, Murakami T, et al. A comporison of differences in the gene expression profiles of phorbol 12-myristate 13-acetate differentiated THP-1 cells and human monocyte-derived macrophage. J Athroscler Thromb 2004; 11(2): 88-97.
19. Lund ME, To J, O’Brien BA, Donnelly S. The choice of phorbol 12-myristate 13-acetate differentiation protocol influences the response of THP-1 macrophages to a pro-inflammatory stimulus. J Immunol Methods 2016; 430: 64-70.
20. Aldo PB, Craveiro V, Guller S. Effect of culture conditions on the phenotype of THP-1 monocyte cell line. Am J Reprod Immunol 2013; 70(1): 80-6.
21. Biriken D, Albayrak N, Yıldız S, Özenci H. Caco-2 epitel hücresi ve THP-1 makrofaj hücrelerinin Streptococcus
pyogenes ve Escherichia coli’ye karşı bakterisidal etki ve nitrik oksit yanıtlarının araştırılması. Mikrobiyol Bul
2009; 43(3): 373-81.
