Spermanın Spermanın Dondurulması Dondurulması

(1)

Spermanın Spermanın Dondurulması Dondurulması

( ( CRYOPRESERVATIO) CRYOPRESERVATIO)

Prof. Dr. Mesut ÇEVİK

(2)

BİYOTEKNOLOJİ NEDİR?

Canlılar aracılığı ile ürün ve Canlılar aracılığı ile ürün ve

hizmet üretmektir

(3)

Reprodüktif Biyoteknolojinin Reprodüktif Biyoteknolojinin

Amacı Amacı

Canlılarda

Canlılarda in vivo in vivo ve ve in vitro in vitro koşullarda gen koşullarda gen kaynaklarının uzun süreli korunması ve kaynaklarının uzun süreli korunması ve daha fazla sayıda yavru elde etmek

daha fazla sayıda yavru elde etmek

(4)

Beklenen Faydalar Beklenen Faydalar

► Yaşam içinde damızlıklardan daha fazla Yaşam içinde damızlıklardan daha fazla yavru elde edebilme

yavru elde edebilme

► Zorunlu kesime giden damızlıklardan kesim Zorunlu kesime giden damızlıklardan kesim sonrası damızlık olarak faydalanabilme

sonrası damızlık olarak faydalanabilme

► Gen transferi ile biyoreaktör üretimi, Gen transferi ile biyoreaktör üretimi, klonlama gibi BİYOTEKNOLOJİK

klonlama gibi BİYOTEKNOLOJİK yöntemleri uygulayabilme

yöntemleri uygulayabilme

(5)

Reprodüktif Biyoteknoloji Reprodüktif Biyoteknoloji

Konuları Konuları

► Erkek hayvanlarla ilgili konular Erkek hayvanlarla ilgili konular

 Erkek damızlıklardan sperma üretimi ve Erkek damızlıklardan sperma üretimi ve dondurulması

dondurulması

 Transgenik çalışmalar Transgenik çalışmalar

 Spermada cinsiyetin kontrolü Spermada cinsiyetin kontrolü

► Dişi hayvanlarla ilgili konular Dişi hayvanlarla ilgili konular

 Embriyolojik çalışmalar Embriyolojik çalışmalar

 Üremenin kontrolü çalışmaları Üremenin kontrolü çalışmaları

(6)

EMBRİYOLARLA İLGİLİ REPRODÜKTİF EMBRİYOLARLA İLGİLİ REPRODÜKTİF

BİYOTEKNOLOJİ KONULARI BİYOTEKNOLOJİ KONULARI

 EMBRİYOLARIN DONDURULMASI EMBRİYOLARIN DONDURULMASI

 KİMERİSMUS KİMERİSMUS

 İDENTİK İKİZLİK İDENTİK İKİZLİK

 EMBRİYOLARIN İN VİTRO ÜRETİMİ EMBRİYOLARIN İN VİTRO ÜRETİMİ

 CİNSİYET TAYİNİ CİNSİYET TAYİNİ

 GEN TRANSFERİ GEN TRANSFERİ

 KLONLAMA KLONLAMA

(7)

SPERMA ÜRETİMİ VE SPERMA ÜRETİMİ VE

SUNİ TOHUMLAMA SUNİ TOHUMLAMA

FAALİYETLERİ

(8)

SPERMA ÜRETİMİ VE SUNİ SPERMA ÜRETİMİ VE SUNİ TOHUMLAMA FAALİYETLERİ TOHUMLAMA FAALİYETLERİ

► Tanımı: Tanımı: Spermanın kazanılması, potansiyel Spermanın kazanılması, potansiyel fertilitesinin belirlenmesi, özel medyumlarda fertilitesinin belirlenmesi, özel medyumlarda

sulandırılması, soğutulması, dondurulması, sulandırılması, soğutulması, dondurulması,

derin ısılarda depolanması ve eritilmesi derin ısılarda depolanması ve eritilmesi

tekniklerini içeren bilim alanıdır.

(9)

SPERMA ÜRETİMİ VE SUNİ SPERMA ÜRETİMİ VE SUNİ TOHUMLAMA FAALİYETLERİ TOHUMLAMA FAALİYETLERİ

► Spermanın Kazanılması Spermanın Kazanılması : Isı kayganlık, basınç : Isı kayganlık, basınç vb. doğal ortama yakın koşulları sağlayan

vb. doğal ortama yakın koşulları sağlayan sun’i sun’i vagen

vagen ’in yanısıra, ampulla ductus defferensin ’in yanısıra, ampulla ductus defferensin

masajı, elektrik uyarımları vb. tekniklerle spermanın masajı, elektrik uyarımları vb. tekniklerle spermanın

erkek hayvanlardan alınmasıdır.

► Spermanın Potansiyel Fertilitesinin Spermanın Potansiyel Fertilitesinin Belirlenmesi

Belirlenmesi : Özel bir dizi testlerin yardımı ve : Özel bir dizi testlerin yardımı ve spermanın özelliklerinin saptanmasıyla tohumlama spermanın özelliklerinin saptanmasıyla tohumlama

öncesi fertilizasyon yeteneğinin belirlenmesidir.

► Spermatolojik Özelliklerin Belirlenmesi: Spermatolojik Özelliklerin Belirlenmesi:

Spermatozoon hareketi, canlılığı ve morfolojisinin Spermatozoon hareketi, canlılığı ve morfolojisinin

incelenerek, fertilizasyon yeteneği olan incelenerek, fertilizasyon yeteneği olan

spermatozoonların oran ve sayılarının spermatozoonların oran ve sayılarının

saptanmasıdır.

(10)

Aygırdan Suni Vagen ile Spermanın Alınması

(11)

Boğadan Suni Vagen ile Spermanın Alınması

(12)

Damızlık Boğadan Sperma Damızlık Boğadan Sperma

Alınması

(13)

Motilite

(14)

(15)

SPERMA ÜRETİMİ VE SUNİ SPERMA ÜRETİMİ VE SUNİ TOHUMLAMA FAALİYETLERİ TOHUMLAMA FAALİYETLERİ

► Hamster Testi: Hamster Testi: İn vitro koşullarda, kapasite İn vitro koşullarda, kapasite olmuş spermatozoanın, zonasız hamster

olmuş spermatozoanın, zonasız hamster oositine penetrasyon yeteneğinin

oositine penetrasyon yeteneğinin belirlenmesidir.

belirlenmesidir.

► Hipo-Osmotik Test: Hipo-Osmotik Test: 37 37   C’lik Hipoosmatik C’lik Hipoosmatik medyumda 30-60 dakika inkübasyon sonrası, medyumda 30-60 dakika inkübasyon sonrası,

canlı spermatozoonların şişmesine dayanan canlı spermatozoonların şişmesine dayanan

testtir.

► Dayanıklılık Testleri: Dayanıklılık Testleri: Spermanın 40-42 Spermanın 40-42   C C gibi yüksek veya 5

gibi yüksek veya 5   C düşük ısılarda canlı C düşük ısılarda canlı kalabilme süresine dayalı testtir.

kalabilme süresine dayalı testtir.

(16)

SPERMANIN DONDURULMASI SPERMANIN DONDURULMASI

► 1949’da Polge, Smith ve Parkes 1949’da Polge, Smith ve Parkes spermanın spermanın

dondurularak uzun süreli olarak saklanıp, suni dondurularak uzun süreli olarak saklanıp, suni

tohumlama uygulamasında kullanılabileceğini tohumlama uygulamasında kullanılabileceğini

bilimsel denemelerle ortaya koymuşlardır.

► Bu tekniğin dayandığı temel ilke; Bu tekniğin dayandığı temel ilke;

► Uygun tekniklerle sperma ısısının -79 Uygun tekniklerle sperma ısısının -79 ⁰ ⁰ C ile C ile

-120 -120 ⁰ ⁰ C’ye kadar düşürülerek, sıvı azot (liquid C’ye kadar düşürülerek, sıvı azot (liquid N N ₂ ₂ ) içerisinde (-196 ) içerisinde (-196 ⁰ ⁰ C) muhafaza edilmesi C) muhafaza edilmesi

esasına dayanmaktadır.

(17)

SPERMANIN DONDURULMASI SPERMANIN DONDURULMASI

► Sperma değişik hayvan türlerine ve ırklarına Sperma değişik hayvan türlerine ve ırklarına göre değişen teknik ve yöntemlerle

göre değişen teknik ve yöntemlerle

dondurulmakta olup, hepsinde de ortak temel dondurulmakta olup, hepsinde de ortak temel

prensipler vardır.

► Bu prensiplerin en başında spermanın uygun Bu prensiplerin en başında spermanın uygun sulandırıcılarla sulandırılması gelmektedir.

sulandırıcılarla sulandırılması gelmektedir.

(18)

SPERMANIN DONDURULMASI SPERMANIN DONDURULMASI

► Sperma Sulandırıcıları (medyum): Sperma Sulandırıcıları (medyum):

Spermatozoa ani ısı değişimlerine karşı hassastır ve Spermatozoa ani ısı değişimlerine karşı hassastır ve

böyle ortamlarda hareketi, canlılığı ve morfolojisi böyle ortamlarda hareketi, canlılığı ve morfolojisi

zarar görür. Bu nedenle spermaya; soğutma, zarar görür. Bu nedenle spermaya; soğutma,

dondurma ve eritme aşamalarındaki ani ısı dondurma ve eritme aşamalarındaki ani ısı

değişimlerinden koruyan sulandırıcılar ilave edilir.

Sulandırıcılar içinde bulunan ve spermayı ısı Sulandırıcılar içinde bulunan ve spermayı ısı

değişiklerinden koruyan maddelere

değişiklerinden koruyan maddelere kriyoprotektif kriyoprotektif maddeler

maddeler adı verilir. En önemli kriyoprotektif adı verilir. En önemli kriyoprotektif maddeler gliserol ve glikoprotein yapıdaki

maddeler gliserol ve glikoprotein yapıdaki makromoleküllerdir.

makromoleküllerdir.

(19)

SPERMANIN DONDURULMASI SPERMANIN DONDURULMASI

► Spermayı sulandırmada kullanılacak Spermayı sulandırmada kullanılacak

sulandırıcıların bazı temel özellikleri taşıması sulandırıcıların bazı temel özellikleri taşıması

gerekmektedir:

► A- A- Ozmotik basınç Ozmotik basınç izotonik olmalı izotonik olmalı ve hayvan ve hayvan türlerindeki

türlerindeki kanın ozmotik basıncına uyumlu kanın ozmotik basıncına uyumlu olmalıdır.

olmalıdır.

► B- B- Spermatozoanın yaşaması için (canlılığını ve Spermatozoanın yaşaması için (canlılığını ve aktivitelerini uzun süre sağlamalı) gerekli olan aktivitelerini uzun süre sağlamalı) gerekli olan

sentetik kimyasal maddeler arasında bir

sentetik kimyasal maddeler arasında bir denge denge olmalıdır

olmalıdır . .

(20)

SPERMANIN DONDURULMASI SPERMANIN DONDURULMASI

► C- C- Gerek aerob gerekse anaerob koşullarda Gerek aerob gerekse anaerob koşullarda spermatozoanın beslenmesini sağlayacak

spermatozoanın beslenmesini sağlayacak besin besin maddelerini içermelidir…

maddelerini içermelidir…

► D- Soğuk şokuna karşı D- Soğuk şokuna karşı spermatozoayı spermatozoayı korumalıdır.

korumalıdır.

► E- E- Spermatozoanın metabolizma artıklarından Spermatozoanın metabolizma artıklarından meydana gelen

meydana gelen toksik tesirleri ortadan toksik tesirleri ortadan kaldıracak kimyasal maddeleri

kaldıracak kimyasal maddeleri içermelidir. içermelidir.

(21)

SPERMANIN DONDURULMASI SPERMANIN DONDURULMASI

► F- F- Spermatozoaya ve dişi genital organlarına Spermatozoaya ve dişi genital organlarına zarar verecek, fertilizasyonun şekillenmesine , zarar verecek, fertilizasyonun şekillenmesine ,

döllenmiş yumurtanın implantasyonuna ve döllenmiş yumurtanın implantasyonuna ve

gelişmesine engel olabilecek

gelişmesine engel olabilecek enfeksiyon enfeksiyon etkenlerini taşımamalıdır.

etkenlerini taşımamalıdır.

► G- G- Sulandırıcılarda bulunan kimyasal ve Sulandırıcılarda bulunan kimyasal ve

biyolojik maddeler her zaman bulunabilen

biyolojik maddeler her zaman bulunabilen ucuz ucuz maddeler olmalıdır.

maddeler olmalıdır.

► Bunların yanısıra, sperma ile sulandırıcının Bunların yanısıra, sperma ile sulandırıcının aynı aynı ısı derecesinde olması gerekmektedir.

ısı derecesinde olması gerekmektedir.

(22)

SPERMANIN DONDURULMASI SPERMANIN DONDURULMASI

► Bilindiği gibi sperma ani ısı Bilindiği gibi sperma ani ısı değişimlerinden çok çabuk değişimlerinden çok çabuk

etkilenmektedir.

► Sulandırıcı spermaya Sulandırıcı spermaya kademeli olarak kademeli olarak katılmalıdır.

katılmalıdır.

► Sperma hiçbir zaman Sperma hiçbir zaman

sulandırıcıya katılmaz

sulandırıcıya katılmaz . .

(23)

SPERMANIN DONDURULMASI SPERMANIN DONDURULMASI

► Spermaya katılan sulandırıcının Miktarı; Spermaya katılan sulandırıcının Miktarı;

 Ejakülat miktarı, Ejakülat miktarı,

 Spermanın motilitesi ve yoğunluğu, Spermanın motilitesi ve yoğunluğu,

 Hayvan türlerine göre bir tohumlama Hayvan türlerine göre bir tohumlama dozunda bulunacak olan Motil

dozunda bulunacak olan Motil

spermatozoa sayısına göre belirlenir.

(24)

SPERMANIN DONDURULMASI SPERMANIN DONDURULMASI

► Spermayı dondurmak için bütün türlerde Spermayı dondurmak için bütün türlerde değişmeyen temel prensipleri ise şöyle değişmeyen temel prensipleri ise şöyle

sıralamak mümkündür;

► 1- Spermanın alınması, 1- Spermanın alınması,

► 2- Alınan spermanın tüm spermatolojik 2- Alınan spermanın tüm spermatolojik özelliklerinin (

özelliklerinin ( miktar, pH, motilite, yoğunluk miktar, pH, motilite, yoğunluk ve morfolojik özellikler

ve morfolojik özellikler ) belirlenmesi, ) belirlenmesi,

► 3- Türlere göre belli oranlarda 3- Türlere göre belli oranlarda Gliserin veya Gliserin veya benzeri kriyoprotektan içeren

benzeri kriyoprotektan içeren sulandırıcılarla sulandırıcılarla sulandırılması

sulandırılması

(25)

SPERMANIN DONDURULMASI SPERMANIN DONDURULMASI

► 4- Spermaların 4- Spermaların dozlanması, dozlanması,

► 5- Ne içinde ( 5- Ne içinde ( normal, mini, maksi veya normal, mini, maksi veya makrotüp)

makrotüp) dondurulacaksa onlara çekilmesi, dondurulacaksa onlara çekilmesi,

► 6- Belirli süre için +4 6- Belirli süre için +4 ⁰ ⁰ C’de alışıma C’de alışıma ( ( Equilibration Equilibration ) tabii tutulması ) tabii tutulması

► 7- Sıvı azot buharında 7- Sıvı azot buharında dondurulması dondurulması (-79 (-79 ⁰ ⁰ C C ile -120

ile -120 ⁰ ⁰ C arasında), C arasında),

► 8- Dondurulmuş spermanın -196 8- Dondurulmuş spermanın -196 ⁰ ⁰ C’de sıvı C’de sıvı azot tankı içerisinde

azot tankı içerisinde muhafaza edilmesi muhafaza edilmesi … …

(26)

Alınan Ejakülatın Görünüşü

(27)

Spermada Canlılık Muayenesi

(28)

Spermada Yoğunluk Tayini İçin Spermada Yoğunluk Tayini İçin

Kullanılan Fotometrik Cihaz

(29)

Sulandırılan Spermaların Görünüşü

(30)

Otomatik Payet Etiketleme Makinesi

(31)

Sulandırılmış Spermayı Otomatik

Olarak Payetlere Dolduran Makine

(32)

Otomatik Dondurma Makin

Otomatik Dondurma Makin e e s s i i

(33)

(34)

S S perma Payeti perma Payeti

29HO12345 102100 ABS CSS Country-View CROWN *TL USA123456789

Pamuklu Tıkaç

Kapatılacak Kısım

ABS Global Semen

CSS Logo’lu ise.

Bu sperma “Certified Semen Services”in standartlarını

karşıladığını belirtir.

Boğanın kayıtlı TAM adı yazılır.

Yaygın olarak bilinen isim ise KOYU olarak yazılır.

Resesif Test Kodu’dur. Bu boğada bu işaret varsa BLAD Testinin NEGATİF

olduğunu gösterir.

Country of registration and registration number

ABS Damızlık Kodudur.

HO=Holstein

Collection Date:

Julian Calendar 1=Leading Character 02100= Year 2002, 100^th day

(35)

(36)

(37)

Payetlerin PVA (Polivinil alkol) ile Kapatılması

(38)

SIVI AZOT BUHARINDA SPERMANIN SIVI AZOT BUHARINDA SPERMANIN

DONDURULMASI

(39)

Dondurulmuş Spermaların Depo Dondurulmuş Spermaların Depo

Tanklara Aktarımı

(40)

TANKALRDA DEPOLANMIŞ SPERMALAR

(41)

Spermanın dondurulması Spermanın dondurulması

► Sulandırıcıların hazırlanması ve spermanın sulandırılması Sulandırıcıların hazırlanması ve spermanın sulandırılması

 Kryoprotektanların kullanımı Kryoprotektanların kullanımı

► Yumurta sarısı Yumurta sarısı

► Gliserol katımı Gliserol katımı

► Payetlere doldurulma Payetlere doldurulma

► Spermanın dondurulması Spermanın dondurulması

 Ampul yöntemi (-79 Ampul yöntemi (-79

^o^o

C kuru buz etil alkol C kuru buz etil alkol banyosunda)

banyosunda)

 Pellet yöntemi (-79 Pellet yöntemi (-79

^o^o

C kuru buz üzerinde) C kuru buz üzerinde)

 Payet yöntemi (-110 Payet yöntemi (-110

^o^o

C sıvı azot buharında) C sıvı azot buharında)

► Dondurulmuş spermaların saklanması (-196 Dondurulmuş spermaların saklanması (-196

^o^o

C sıvı azot C sıvı azot içinde)

içinde)

(42)

Dondurma İşleminin Prensipleri Dondurma İşleminin Prensipleri

Kryoprotektan dışarı

1. Kryoprotektan ilavesi H

₂

O dışarı

2. Dondurma

3. Çözündürme

H

₂

O içeri 4. Kriyoprotektanın

uzaklaşması

Kryoprotektan

içeri

(43)

SPERMANIN DONDURULMASI SPERMANIN DONDURULMASI

► Sperma günümüzde Sperma günümüzde kuru buz (katı CO kuru buz (katı CO ₂ ₂ ) ) üzerinde pellet olarak veya sıvı azot

üzerinde pellet olarak veya sıvı azot buharında payetler

buharında payetler vb. içerisinde vb. içerisinde dondurulmaktadır.

dondurulmaktadır.

► Bu dondurma teknik ve yöntemlerinde temel Bu dondurma teknik ve yöntemlerinde temel prensipler aynı olmakla beraber hayvan türleri prensipler aynı olmakla beraber hayvan türleri

arasında kimi farklılıklar vardır.

► Hangi yöntemle olursa olsun dondurulan Hangi yöntemle olursa olsun dondurulan spermalar Container’lar içinde -196

spermalar Container’lar içinde -196 ⁰ ⁰ C’de C’de

muhafaza edilerek, tohumlama veya başka muhafaza edilerek, tohumlama veya başka

amaçlarla kullanılmak üzere uygulayıcılara amaçlarla kullanılmak üzere uygulayıcılara

gönderilir.

(44)

SPERMANIN DONDURULMASI SPERMANIN DONDURULMASI

► Soğutma Teknikleri: Soğutma Teknikleri: Her ne kadar Her ne kadar

kriyoprotektif madde içerse de sulandırılmış kriyoprotektif madde içerse de sulandırılmış sperma ani ısı değişimlerine karşı hassastır.

sperma ani ısı değişimlerine karşı hassastır.

► Bu nedenle sulandırılmış sperma 5 Bu nedenle sulandırılmış sperma 5   C’ye, kademeli C’ye, kademeli bir şekilde 45-120 dakikada yavaşça soğutulur.

bir şekilde 45-120 dakikada yavaşça soğutulur.

► Spermatozoon hareketi 5 Spermatozoon hareketi 5   C de oldukça azdır ve C de oldukça azdır ve enerjisini uzun süre koruyabilir.

enerjisini uzun süre koruyabilir.

► Oda ısısında bir kaç saat sürede fertilizasyon Oda ısısında bir kaç saat sürede fertilizasyon

yeteneğini koruyabilen sperma, sulandırılırsa ve yeteneğini koruyabilen sperma, sulandırılırsa ve 5 5   C‘de saklanırsa bu yeteneğini bir kaç gün C‘de saklanırsa bu yeteneğini bir kaç gün

sürdürebilir.

(45)

SPERMANIN DONDURULMASI SPERMANIN DONDURULMASI

► 5 5   C gibi düşük ısılarda spermatozoon C gibi düşük ısılarda spermatozoon metabolizmasının yavaşlatılarak yaşam metabolizmasının yavaşlatılarak yaşam

süresinin ve buna bağlı olarak fertilizasyon süresinin ve buna bağlı olarak fertilizasyon

yeteneğinin uzatılmasına

yeteneğinin uzatılmasına anabiose anabiose adı adı

verilir. Aynı şekilde spermanın dondurularak verilir. Aynı şekilde spermanın dondurularak

metabolizmasının durma noktasına metabolizmasının durma noktasına

yaklaştırılmasına ve böylece canlılığını yaklaştırılmasına ve böylece canlılığını

yıllarca koruyabilmesine de

yıllarca koruyabilmesine de anabiose anabiose adı adı verilir.

verilir.

(46)

SPERMANIN DONDURULMASI SPERMANIN DONDURULMASI

► Donma Teknikleri: Donma Teknikleri: Spermanın Spermanın

dondurulmasında kullanılan tekniklerde dondurulmasında kullanılan tekniklerde

kristalizasyonun

kristalizasyonun ayrı bir önemi vardır. ayrı bir önemi vardır.

Özellikle

Özellikle ilk oluşan kristaller donmanın ilk oluşan kristaller donmanın başarısını belirler

başarısını belirler . .

► Kristallerin mümkün olduğunca Kristallerin mümkün olduğunca küçük küçük hacimde ve fazla sayıda olmaları

hacimde ve fazla sayıda olmaları amaçlanır. amaçlanır.

Burada kriyoprotektif maddeler ve donma hızı Burada kriyoprotektif maddeler ve donma hızı

etkilidir.

► Spermanın dondurulmasında kullanılan üç Spermanın dondurulmasında kullanılan üç farklı yöntem bulunmaktadır.

farklı yöntem bulunmaktadır.

(47)

SPERMANIN DONDURULMASI SPERMANIN DONDURULMASI

► Ampul Yöntemi: Ampul Yöntemi: Bu yöntemde Bu yöntemde 1 ml ampullere 1 ml ampullere doldurulan sperma

doldurulan sperma alkol banyosunda 5 alkol banyosunda 5   C’den –20 C’den –20   C‘ye dakikada 1-2

C‘ye dakikada 1-2   C hızla dondurulur ve bu ısıdan C hızla dondurulur ve bu ısıdan sonra hızla –79

sonra hızla –79   C‘ye soğutularak C‘ye soğutularak bu ısıda depolanır bu ısıda depolanır

► Pellet yöntemi: Pellet yöntemi: Bu yöntemde ise sperma Bu yöntemde ise sperma 5 5   C C

ısıya soğutulduktan ve içine gereken kriyoprotektan ısıya soğutulduktan ve içine gereken kriyoprotektan

maddenin ilave edilmesinden sonra 0.2 ml maddenin ilave edilmesinden sonra 0.2 ml

hacimlerde hacimlerde

-79 -79   C’deki kuru buz üzerinde (katı CO2) açılan C’deki kuru buz üzerinde (katı CO2) açılan oyuklarda hızla dondurulur

oyuklarda hızla dondurulur ve donma aşaması ve donma aşaması tamamlandıktan sonra sıvı azot içerisinde (-196

tamamlandıktan sonra sıvı azot içerisinde (-196   C) C) depolanır.

depolanır.

(48)

SPERMANIN DONDURULMASI SPERMANIN DONDURULMASI

► Payet yöntemi: Payet yöntemi: Günümüzde kullanılan en Günümüzde kullanılan en yaygın ve en başarı metot

yaygın ve en başarı metot payet payet yöntemi

yöntemi dir. dir. 0,5 veya 0,25 ml’lik özel plastik 0,5 veya 0,25 ml’lik özel plastik çubuklara doldurulan sperma 5

çubuklara doldurulan sperma 5   C’den – C’den – 110 110   C’ye 7 dakikada soğutulur C’ye 7 dakikada soğutulur . Sıvı azot . Sıvı azot

buharında gerçekleştirilen bu işlem buharında gerçekleştirilen bu işlem

sonrasında dondurulan sperma sıvı azot sonrasında dondurulan sperma sıvı azot

içinde –196

içinde –196   C‘de depolanır. C‘de depolanır.

(49)

SPERMANIN DONDURULMASI SPERMANIN DONDURULMASI

► Spermanın sulandırılarak dondurulması ve Spermanın sulandırılarak dondurulması ve dozlanmasının en önemli faydası;

dozlanmasının en önemli faydası;

bir boğa tek aşımda sadece bir ineği bir boğa tek aşımda sadece bir ineği

tohumlarken, tohumlarken,

► Tek aşımdan elde edilen sperma uygun Tek aşımdan elde edilen sperma uygun sulandırıcılarla sulandırılıp dozlandığında, sulandırıcılarla sulandırılıp dozlandığında,

spermanın miktar ve yoğunluğuna bağlı spermanın miktar ve yoğunluğuna bağlı

olmakla birlikte

olmakla birlikte 300-1000 baş ineğin 300-1000 baş ineğin tohumlamasına olanak sağlamaktadır.

tohumlamasına olanak sağlamaktadır.

(50)

(51)

(52)

(53)

(54)

(55)

(56)

(57)

(58)

SPERMANIN DONDURULMASI SPERMANIN DONDURULMASI

► İDEAL BİR SULANDIRICI; İDEAL BİR SULANDIRICI;

► Dondurulmuş sperma için Dondurulmuş sperma için besin ve enerji besin ve enerji sağlamalıdır.

sağlamalıdır.

► Laktik asit oluşumu sebebiyle oluşacak olan Laktik asit oluşumu sebebiyle oluşacak olan pH pH değişimlerini kompanse

değişimlerini kompanse edebilmelidir edebilmelidir . .

► Isı şoku ve hızlı donma işlemine Isı şoku ve hızlı donma işlemine karşı karşı koruma sağlayabilmelidir.

koruma sağlayabilmelidir.

► Sulandırıcıdaki elektrolitlerin Sulandırıcıdaki elektrolitlerin ozmotik ozmotik basınçları ve balansları optimum

basınçları ve balansları optimum seviyede seviyede olmalıdır.

olmalıdır.

(59)

SPERMANIN DONDURULMASI SPERMANIN DONDURULMASI

► İstenmeyen İstenmeyen mikroorganizmaların mikroorganizmaların gelişimini inhibe edebilmelidir

gelişimini inhibe edebilmelidir . .

► Spermanın Spermanın volümünü ideal olarak volümünü ideal olarak artışını sorunsuz bir şekilde

artışını sorunsuz bir şekilde sağlamalıdır. sağlamalıdır.

► YUMURTA SARISI, YUMURTA SARISI,

► SÜT VEYA SÜT TOZU, SÜT VEYA SÜT TOZU,

► YUMURTA SARISI+TRİS MEDYUMU Amerika YUMURTA SARISI+TRİS MEDYUMU Amerika dahil bir çok ülkede yaygın olarak

dahil bir çok ülkede yaygın olarak kullanılmaktadır.

kullanılmaktadır.

(60)

SPERMANIN DONDURULMASI SPERMANIN DONDURULMASI

► Bunun yanısıra, Bunun yanısıra, Laiciphos 488, Biociphos Laiciphos 488, Biociphos vs. vs.

ticari sulandırıcılar da üretim yapılan ticari sulandırıcılar da üretim yapılan

istasyonlarda yaygın olarak kullanılmaktadır.

► Sulandırıcı medyuma mutlaka Sulandırıcı medyuma mutlaka Antibiyotik Antibiyotik ilavesi

ilavesi yapılmak durumundadır. Aksi yapılmak durumundadır. Aksi

takdirde mikroorganizma üremesinin önüne takdirde mikroorganizma üremesinin önüne

geçilemez. Sulandırıcıya antibiyotik katılması geçilemez. Sulandırıcıya antibiyotik katılması

işlemi de belirli kurallara bağlıdır.

► Bu kurallar Certified Semen Services (CSS) Bu kurallar Certified Semen Services (CSS) tarafından belirlenmektedir.

tarafından belirlenmektedir.

(61)

SPERMANIN DONDURULMASI SPERMANIN DONDURULMASI

► Sulandırıcılara enerji sağlama amaçlı katılan Sulandırıcılara enerji sağlama amaçlı katılan şekerler Glukos, Fruktoz, laktoz vb.

şekerler Glukos, Fruktoz, laktoz vb.

► Laktoz genellikle Aygır spermasını Laktoz genellikle Aygır spermasını

sulandırılması amaçlı kullanılmaktadır.

► Sulandırıcıya katılan buffer sistemi amaçlı Sulandırıcıya katılan buffer sistemi amaçlı olarak

olarak Sodyum sitrat veya Tris Sodyum sitrat veya Tris (Hydroxymethyl) aminoethane, (Hydroxymethyl) aminoethane,

► Yumurta sarısı veya süt ya da süt tozu; ki Yumurta sarısı veya süt ya da süt tozu; ki bu maddelerin içerdiği makromoleküller bu maddelerin içerdiği makromoleküller

soğuk şokuna karşı koruma sağlarlar.

(62)

SPERMANIN DONDURULMASI SPERMANIN DONDURULMASI

► Sulandırıcılara katıla kriyoprotektanlar Sulandırıcılara katıla kriyoprotektanlar

( ( Gliserin, Etanol, DMSO, Dİmethylacetamide Gliserin, Etanol, DMSO, Dİmethylacetamide vs.)

vs.)

► ki bu kriyoprotektanlar dondurma- ki bu kriyoprotektanlar dondurma-

çözündürme işlemi sırasında çözünmenin çözündürme işlemi sırasında çözünmenin

etkileri ve intercellular bölgede oluşan

etkileri ve intercellular bölgede oluşan buz buz kristallerinin seviyesini düşürür.

kristallerinin seviyesini düşürür.

► Antibiyotikler; ( Antibiyotikler; ( Gentamycine, Tylosin, Linco- Gentamycine, Tylosin, Linco- spectin (GTLS)

spectin (GTLS)

► Ki bunlar spermada istenmeyen Ki bunlar spermada istenmeyen

mikroorganizmaların üremesini engellerler.

(63)

SPERMANIN DONDURULMASI SPERMANIN DONDURULMASI

► Sperma diğer bütün vücut sıvıları gibi (kan Sperma diğer bütün vücut sıvıları gibi (kan plazması, süt, diğer sekresyonlar)

plazması, süt, diğer sekresyonlar) İZOTONİK’tir.(

İZOTONİK’tir.( yaklaşık olarak yaklaşık olarak 300 300 miliosmol

miliosmol ) )

► Dolayısıyle semen sulandırıcısı da Dolayısıyle semen sulandırıcısı da izotonik izotonik veya izoozmotik olmalıdır.

veya izoozmotik olmalıdır.

► pH derecesi nötre yakın veya hafif asidik pH derecesi nötre yakın veya hafif asidik olmalıdır.

olmalıdır. ( ( 6.5-6.9 6.5-6.9 ). ).

► Sulandırıcı eğer laboratuvarda hazırlanıyorsa Sulandırıcı eğer laboratuvarda hazırlanıyorsa mutlaka kullanımdan önce

mutlaka kullanımdan önce pH ve ozmotik pH ve ozmotik basınç yönünden kontrol

basınç yönünden kontrol edilmelidir. edilmelidir.

(64)

SPERMANIN DONDURULMASI SPERMANIN DONDURULMASI

► Sperma sulandırıcısı hazırlamak zor değildir. Sperma sulandırıcısı hazırlamak zor değildir.

Ancak, dikkat ister.

► Kullanılan malzemeler ve laboratuvar Kullanılan malzemeler ve laboratuvar

ortamını son derece temiz olması gerekir.

Ayrıca işlemi yapacak olan kişinin de temiz Ayrıca işlemi yapacak olan kişinin de temiz

ve dikkatli olması gereklidir.

► Bunun için gerekli malzeme ve ekipmanlar; Bunun için gerekli malzeme ve ekipmanlar;

► Su purification (arıtma) sistemi, Su purification (arıtma) sistemi,

► pH Metre pH Metre

► Ozmometre, Ozmometre,

► Manyetik karıştırıcı, Manyetik karıştırıcı,

(65)

SPERMANIN DONDURULMASI SPERMANIN DONDURULMASI

► Sterilizasyon aleti veya otoklav, (yaklaşık Sterilizasyon aleti veya otoklav, (yaklaşık 185 185 ⁰ ⁰ C’de yapılır) (Otoklav işlemi ise 120- C’de yapılır) (Otoklav işlemi ise 120- 125 125 ⁰ ⁰ C’de 20-30 dakika yeterlidir) C’de 20-30 dakika yeterlidir)

► Filtrasyon sistemi, Filtrasyon sistemi,

► Vakum pompası, Vakum pompası,

► Isı monitoring sistemi, (termometre vb.) Isı monitoring sistemi, (termometre vb.)

► Cam malzemeler (beher, erlen, mezür vb.), Cam malzemeler (beher, erlen, mezür vb.),

► Anibiyotikler, şekerler, süt veya süt tozu, Anibiyotikler, şekerler, süt veya süt tozu, buffer kimyasallar.

buffer kimyasallar.

(66)

SPERMANIN DONDURULMASI SPERMANIN DONDURULMASI

► YAYGIN OLARAK KULLANILAN SULANDIRICILAR YAYGIN OLARAK KULLANILAN SULANDIRICILAR

► Egg yolk-citrate extender Egg yolk-citrate extender

► Whole Milk Extender Whole Milk Extender

► Egg yolk-Tris extender Egg yolk-Tris extender

► Minnesota GO Extender Minnesota GO Extender

► Egg yolk-Phosphate extender Egg yolk-Phosphate extender

► Cornell University Extender (CUE) Cornell University Extender (CUE)

► Raffinose extender Raffinose extender

► Milk-gilcerol extender Milk-gilcerol extender

► Commercial extenders: Commercial extenders: (Plus X extender, Biladyl (Plus X extender, Biladyl

extender, Europhos Diluter gibi. Ki bu ticari sulandırıcılar extender, Europhos Diluter gibi. Ki bu ticari sulandırıcılar mutlaka Certified Semen Services tarafından onaylanmak mutlaka Certified Semen Services tarafından onaylanmak

durumundadırlar.

(67)

SPERMANIN DONDURULMASI SPERMANIN DONDURULMASI

► Eritme Teknikleri: Eritme Teknikleri: Dondurulmuş sperma Dondurulmuş sperma bir çok yöntemle eritilse de temel prensip bir çok yöntemle eritilse de temel prensip

spermanın mümkün olduğu kadar kısa spermanın mümkün olduğu kadar kısa

sürede eritilmesidir. Günümüzde kullanılan sürede eritilmesidir. Günümüzde kullanılan

en yaygın ve en güvenilir yöntem spermanın en yaygın ve en güvenilir yöntem spermanın 37 37   C’lik su banyosunda 12-30 saniyede C’lik su banyosunda 12-30 saniyede

eritme

eritme tekniğidir. tekniğidir.

(68)

Mating and semen characteristics Mating and semen characteristics

Mating

Mating ^Semen ^Semen

dep dep osition osition Freezability Freezability

Bull Bull Quick Quick Vagina Vagina +++ +++

Ram/buck

Ram/buck Quick Quick Vagina Vagina +++ +++

Boar Boar Takes time Takes time Cervix/uteru Cervix/uteru

s s (+) (+)

Fox Fox Takes long Takes long

time time Cervix/uteru Cervix/uteru

s s ++ / (+) ++ / (+) Atlantic

Atlantic salmon

salmon Quick Quick On the eggs On the eggs + + Rainbow trout

Rainbow trout Quick Quick On the eggs On the eggs + +

(69)

Gamete, Embryo and Gonadal Gamete, Embryo and Gonadal

Tissue Cryopreservation Tissue Cryopreservation

and and

Osmotic Tolerans Limits

(70)

Sperm growth Spermatogonia

In vitro sperm growth Epididymal sperm

AI or IVF

AI, IVF or ICSI

Testicular tissue Ejaculate

Transplantation

B ir th

T E S T E S

ICSI, ROSI Sperm, spermatid

Reproductive Options for Males

(71)

O V A R Y

Follicle

isolation IVMFC

Orthotopic transplant

Natural mating Autograft

Xenograft Oocyte

retrieval IVMFC In vivo follicle

growth Oocyte

retrieval IVMFC

B ir th

IVMFC: In-vitro maturation, fertilization and culture

Reproductive Options for Females

(72)

Success of ART Depends on Success of ART Depends on

Development of Optimal Methods For:

► In-vitro oocyte, sperm development In-vitro oocyte, sperm development

► In-vitro fertilization and sperm injection In-vitro fertilization and sperm injection

► In-vitro embryo culture In-vitro embryo culture

► Gamete and embryo cryopreservation Gamete and embryo cryopreservation

► Gonadal tissue cryopreservation Gonadal tissue cryopreservation

► Ovarian / testicular tissue transplantation Ovarian / testicular tissue transplantation

(73)

Significance of Germplasm Significance of Germplasm

Cryopreservation Cryopreservation

► Animal production programs Animal production programs

► Human reproductive medicine Human reproductive medicine

► Re-derivation laboratory animals Re-derivation laboratory animals

► Biomedical research Biomedical research

► Conservation biology Conservation biology

(74)

Need for National Genome Need for National Genome

Banking Banking

► Genetic drift Genetic drift

► Genetic instability Genetic instability

► Genetic contamination Genetic contamination

► Loss due to disease, environmental Loss due to disease, environmental pollutions, or catastrophic events

pollutions, or catastrophic events

(75)

Factors Affecting Cryosurvival Factors Affecting Cryosurvival

of Mammalian Germplasm of Mammalian Germplasm

► Species of Origin Species of Origin

► Developmental stage Developmental stage

► Method of production Method of production

► Choice of cryoprotectant Choice of cryoprotectant

► Equilibration time and temperature Equilibration time and temperature

► Hypothermic tolerance Hypothermic tolerance

► Osmotic tolerance Osmotic tolerance

(76)

Factors Affecting Sperm Cryosurvival Factors Affecting Sperm Cryosurvival

► Hypothermia Hypothermia

► Osmotic shock Osmotic shock

► Physical stress (centrifugation, pipetting) Physical stress (centrifugation, pipetting)

► Species Species

Breeds / Strains Breeds / Strains

 Individual Individual

 Source ( Source ( i.e. i.e. testicular, epididymal, ejaculate) testicular, epididymal, ejaculate)

 Development stage (spermatagonia, spermatid, sperm) Development stage (spermatagonia, spermatid, sperm)

(77)

Factors Affecting Oocyte Cryosurvival Factors Affecting Oocyte Cryosurvival

► Hypothermia Hypothermia

► Freezing Freezing

► Osmotic shock Osmotic shock

► Developmental stage Developmental stage

• Germinal Vesicle Germinal Vesicle

• Metaphase II Metaphase II

(78)

Factors Affecting Gon

Factors Affecting Gon a a dal Tissue Cryosurvival dal Tissue Cryosurvival

► Heat transfer Heat transfer

► Mass transfer (water, cryoprotectant) Mass transfer (water, cryoprotectant)

► Presence of extra cellular space Presence of extra cellular space

► Compartmentalization Compartmentalization

► Multi-cellular structure Multi-cellular structure

(79)

Principles of Cryopreservation Principles of Cryopreservation

1. Addition of CPA CPA in H

₂

O out

2. Cooling

3. Thawing

H

₂

O in CPA out

4. Removal of CPA

(80)

Requirements of Cryopreservation:

► Optimum CPA addition; Optimum CPA addition; avoid avoid osmotic shock / osmotic shock / toxicity

toxicity

► Optimum cooling rate Optimum cooling rate ; ; avoid thermal shock avoid thermal shock between room temperature and ice formation between room temperature and ice formation

► Low temp. Low temp. storage (LN storage (LN ₂ ₂ ) at -196 ) at -196 ^o ^o C C

► Optimum warming rate and dilution method; Optimum warming rate and dilution method;

avoid osmotic shock, intracellular ice

avoid osmotic shock, intracellular ice , ,

(81)

Cryoprotective Agents Cryoprotective Agents

Permeating CPA: glycerol, ethylene glycol, DMSO

Non-permeating CPA: Sucrose, Raffinose Macromolecules: Egg yolk, Skim milk

Natural compounds: Antifreeze proteins

(82)

Equilibrium freezing Non-equilibrium freezing

Ultra-rapid cooling 5,000>

^o

C/min

Rapid cooling 5-100

^o

C/min

v

Slow cooling 0.2-0.5

^o

C/min

Cryopreservation Methods Cryopreservation Methods

Cell

(83)

Action of Cryoprotective Agents Action of Cryoprotective Agents

► Attach to hydrogen bonds in protein, substitute Attach to hydrogen bonds in protein, substitute for bound water, prevent protein denaturation for bound water, prevent protein denaturation

► Act as an osmotic buffer Act as an osmotic buffer

► Inhibit ice formation Inhibit ice formation

► Membrane stabilization Membrane stabilization

► CPA toxicity may be reduced at low temperatures CPA toxicity may be reduced at low temperatures

(84)

Cryoinjury Cryoinjury

Sperm:

► Outer acrosomal membrane ( Outer acrosomal membrane ( fragmentation fragmentation ) )

► Mitochondria ( Mitochondria ( swelling) swelling)

► Plasma membrane damage Plasma membrane damage

► Loss of motility Loss of motility Oocyte:

Oocyte:

► Meiotic spindle-microtubule depolymerization Meiotic spindle-microtubule depolymerization

► Disruption of Cortical granules Disruption of Cortical granules → → Zona hardening Zona hardening

► Plasma membrane damage Plasma membrane damage Embryos

Embryos

► Damage to plasma membrane Damage to plasma membrane

► Depolymerization Depolymerization of actin filaments of actin filaments

► Damage to cell- to-cell junctions Damage to cell- to-cell junctions

(85)

Developmental Stages of Oocytes Developmental Stages of Oocytes

First polar body Metaphase II plate

Germinal vesicle

IMMATURE (GV) MATURE (MII)

Cumulus cells

Zona pellucida

(86)

Subcellular Structure of Oocytes

Germinal vesicle

Metaphase II

Park et al., 1999

(87)

Bovine

Human

Mouse

Normal Abnormal

Normal and Abnormal Spindles After Exposure to

Hypothermia, CPAs or Anisosmotic Conditions

(88)

Embryo Development Embryo Development

Cleavage stage embryos Blastocyst Zygote

ICM TF

(89)

Actin filament integrity of in-vitro produced bovine blastocyst after exposure to various anisosmotic conditions

285 mOsm 600 mOsm

(90)

GV GV MII MII

Osmotic tolerance limits of GV and MII bovine oocytes

(91)

10% Glycerol 10% Gly + 25% EG 25% Gly + 25% EG

5 min 30-45 sec

5 min

1 M sucrose 1 M sucrose Vitrified by

plunging into LN

₂

Vitrification of In vitro Produced Bovine Embryo

(92)

1M sucrose 0.5 M sucrose 0.25 M sucrose

5 min 5 min 5 min

Thawing: at 37

^o

C followed by 3 step CPA removal:

24 h post-thaw 48 h post-thaw

(93)

Embryo Biopsy and Sexing Embryo Biopsy and Sexing

In-vitro culture

Amplification of zfx, zfy by PCR

Day 5 morulae

Vitrified

(94)

Group

Group No. No.

Recipient Recipient

Pregnancy Pregnancy rate (%)

rate (%) Singles (%) Singles (%) Twins (%) Twins (%) No. calves/ No. calves/

recipient recipient

AI AI 31 31 20 (65) 20 (65)

^a^a

20 (100) 20 (100)

^a^a

N/A N/A 20/31 (65) 20/31 (65)

^a^a

AI + SET

AI + SET 36 36 27 (75) 27 (75)

^a^a

16 (60) 16 (60)

^b^b

11 (41) 11 (41)

^a^a

29/36 (81) 29/36 (81)

^a^a

DET DET 36 36 26 (72) 26 (72)

^a^a

16 (62) 16 (62)

^b^b

10 (38) 10 (38)

^a^a

26/36 (72) 26/36 (72)

^a^a

SET SET 40 40 16 (40) 16 (40)

^b^b

16 (100) 16 (100)

^a^a

NA NA 8/40 (20) 8/40 (20)

^b^b

Pregnancy and calving rates of sexed and vitrified in vitro produced bovine embryos

SET: Single ET

DET: Double ET

Spermanın Spermanın Dondurulması Dondurulması