GENOM PROJELERİ

(1)

GENOM PROJELERİ

Prof. Dr. Hilâl Özdağ

Biyoteknoloji ve Genetik II

(2)

Genom Projeleri

• Dizileme

• Klon kütüphaneleri

• Stratejiler

– Genom Dizilemesi

• Tekrar eden DNA dizileri

• Biraraya getirme (Assembly)

– PHRAP, PHRED,CONSED

• Bitiş

• Boşlukların kapatılması

(3)

Genetik harita

Genetik haritaların bazı eksiklikleri vardır.

Bunlardan en önemlisi çözünülürlük veya ayrıntıdır. İnsan genomu 3.2 milyar baz çifti içermektedir, yaklaşık 4000 cM uzunluğundadır, yani 850000bç/cM.

Herbir sentimorganda bir belirteç bulunsa dahi (hayal bile olamaz) fiziksel haritaya göre çözünülürlüğü çok düşüktür.

(4)

Fiziksel harita

(5)

Genetik / Fiziksel

(6)

Fiziksel Harita

(7)

(Ureta-Vidal et al., Nature Review Genetics 2003)

(8)

DİZİLEME DİZİLEME

• İlgilenilen DNA’nın altklonlanması

– Değişik “insert” boyutları

• Herbir klon

– Büyür, DNAsaflaştırılır

– Dizileme reaksiyonu yapılır

– Dizileme fragmentleri kapiller elektroforezle ayrıştırılıp lazer eksitasyonu ile tanımlanır.

– Reaksiyon başına 500-1000 bç okuma yapılabilir (bugünkü teknoloji ile)

(9)

DNA Dizi Analizi

(10)

(11)

(12)

(13)

Vektörler

• Plazmid (2kb)

• Kozmid (40kb)

• BAC (>= 100kb)

• YAC (1Mb)

(14)

Vektörler

Çoklu klonlama bölgesi

insert

(15)

Kavramlar

• Fiziksel harita

– Örtüşmeyen klonlar ((non)-overlapping clones)

• Genetik harita

– Moleküler belirteçler (marker)

(16)

Shotgun yaklaşımı

• Sanger et al., 1977

• bacteriophage  genomuna uygulandı (1980)

• 1980’lerde:- plazmid, kloroplast, virusler, kozmidler

• 1990’larda:- mitokondri/BAC/bakteri

• Küçük prokaryotik genomlarda başarılı

(17)

Shotgun yaklaşımı

• Rasgele fragmentlerin dizilenmelerinin ardından yap boz misali biraraya getirilmeleri

• Bir genomdan örtüşen/kesişen birçok fragmentler toplamak gerekir.

• Bir genom 10x kez 500 bç’lik parçalar

halinde okunduğunda 10

⁶

bç’de 1 boşluk olur.

(18)

Shotgun yaklaşımı

• L boyundaki bir DNA fragmenti: Bu fragmentin bir diğer kopyasını daha bulabilmemiz için genomun 4^L bç olması gerekir.

• Rasgele diziler

– İki okumanın 30 bç kesişmesi – Beklenen 4³⁰ >>>> 1.2X10¹⁸ bç.

– 3 milyarlık bir genomda bu kesişmeyi bulmak pek de kolay değil.

(19)

Shotgun yaklaşımı

• DNA

tekrar yapıları içerir

 LINE

 segmental duplikasyon (Samonte and Eichler 2002)

(20)

(21)

Hiyerarşik Yaklaşım Klon-Klon

• Genom 1.5Mb fragment’lere ayrılır

• Fragmentler BAC ve YAC’lara klonlanır

• Insertler > 100kb ve tekrar bölgelerinden daha büyüktür.

• Bu şekilde klonlar örtüşen/kesişen fragmentlerin tanımlanması ile bir kontig haline getirilip dizilenir.

(22)

Hiyerarşik Yaklaşım Klon-Klon

• Klon kontiglerin biraraya getirilmesi

– Klon parmakizi yaklaşımı

• Klonlanmış DNA fragmentinin yapısına dair bilgi.

• Parmakizindeki örtüşmeler tanımlanabilir.

• Restriksiyon paternleri; Tekrar eden DNA parmakizleri; Tekrar eden DNA PCR; STS haritalama

(23)

(24)

(25)

Restriksiyon Haritası

(26)

Flow sorting: özgül kromozomlar

(27)

(28)

Klon-Klon Harita Temelli

Yaklaşım

(29)

(30)

(31)

Watson Watson veve Crick, May Crick, Mayısıs 1953 1953

(32)

(33)

(34)

• http://www.dnai.org/text/mediashowcase/i ndex2.html?id=562