immunoreaktif nöron sayısındaki olası değişikliklerin araştırılması planlanmıştır.

ÖNSÖZ

Bu projede sıçanlarda kontüzyon modeli kullanılarak oluşturulan omurilik travmasında, hiperbarik oksijen tedavisinin ağrı üzerine etkisinin omurilik hasarına komşu omurilik segmentlerinde ağrıya yanıt olarak ortaya çıkan Fos immunoreaktif nöron sayısındaki olası değişikliklerin araştırılması planlanmıştır.

Böylece, omurilik hasarı sonrası uygulanan hiperbarik oksijen tedavisinin moleküler mekanizmalardaki rolünün araştırılması ve yeni ağrı tedavi stratejilerinin geliştirmesine katkıda bulunulması amaçlanmıştır.

Bu proje 2011-TIP-30 nolu araştırma fonu tarafından desteklenmiştir.

Ege Üniversitesi Rektörlüğü Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonuna ve Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Bilimsel Araştırma Projeleri Alt Komisyonuna projemize verdikleri destek nedeniyle teşekkür ederiz.

YAYINLAR

Bu çalışma, 10-14 Eylül tarihleri arasında Hacettepe Üniversitesi’nde yapılan 39. Fizyoloji Kongresi’nde ‘Omurilik Hasarıyla Oluşan Nöropatik Ağrıda Hiperbarik Oksijen Tedavisinin Omurilik Nöronlarında Fos Ekspresyonuna Etkisi’ başlığıyla, tartışmalı poster bildirisi olarak sunulmuştur. Ayrıca yayın olarak hazırlanmaktadır.

DEMİRBAŞLAR

Bu proje için demirbaş alınmamıştır.

İÇİNDEKİLER

1
 GİRİŞ
...
1


2
 LİTERATÜR
ÖZETİ
...
3


3
 MATERYAL
ve
YÖNTEM
...
5


3.1
 Deney Hayvanları
...
5


3.2
 Çalışma Grupları
...
5


3.3
 Anestezi
...
5


3.4
 Omurilik Hasarı (OİH) ve Cerrahi Yöntem
...
5


3.5
 Motor Performansı Değerlendirme
...
6


3.6
 Hiperbarik Oksijen (HBO) Tedavisi
...
6


3.7
 Perfüzyon
...
6


3.8
 Fos İmmunohistokimyası
...
6


3.9
 Kesitlerin Mikroskop Altında İncelenmesi
...
7


3.10
İstatiksel Analiz
...
7


4
 BULGULAR
...
8


5
 TARTIŞMA,
SONUÇ
ve
ÖNERİLER
...
11


6
 KAYNAKLAR
...
15


ŞEKİL DİZİNİ

Şekil 1: Omurilik hasarı (OİH), preoperatif, postoperatif ve pre-postoperatif gruplarda omurilik lamina’ları (lamina 1-2, 3-4, 5-6, 7-8, 9, 10), intermediolateral nukleus (IML), lumbar dorsal commissural nukleus, dorsal nukleus (D), intermediomedial nukleus (IMM)’da Fos immunoreaktif hücre sayısı. ... 9
 Şekil 2: Preoperatif HBO uygulanan sıçanda omurilik arka boyuzunda Fos ekspresyonu ... 9
 Şekil 3: Postoperatif HBO uygulanan sıçanda omurilik arka boyuzunda Fos ekspresyonu ... 10
 Şekil 4: Pre ve postoperatif HBO uygulanan sıçanda omurilik arka boyuzunda Fos ekspresyonu ... 10


ÇİZELGE DİZİNİ

Tablo 1: Omurilik hasarı (OİH) sonrası omurilik lamina’ları, dorsal nukleus (D), intermediomedial nukleus (IMM), intermediolateral nukleus (IML) ve lumbar dorsal commissural nukleus (LDCom)’da Fos immunoreaktif nöron sayısı (Ortalama ±SEM) 8


KISALTMA ve SEMBOLLERDİZİNİ BBB =Basso, Beattie and Bresnahan Ca⁺² = Kalsiyum

D = Dorsal nukleus GPx = Glutatyon peroksidaz H2O2 = Hidrojen per oksit HBO = Hiperbarik oksijen

IML = İntermediolateral nukleus IMM = İntermedimedial nukleus

iNOS = İndüklenebilir nitrik oksit sentaz LDCom = Lumbar dorsal comissural nukleus NO = Nitrik oksit

NOS = Nitrik oksit sentaz OİH = Omurilik hasarı

PBS = Phosphate buffer saline postop. = Postoperatif

preop. = Preoperatif SCI = Spinal cord injury SOD = Superoksit dismutaz

ÖZ

Omurilik Hasarıyla Oluşan Nöropatik Ağrıda Hiperbarik Oksijen Tedavisinin Omurilik Nöronlarında Fos Ekspresyonuna Etkisi

Travmatik omurilik hasarından sonra ortaya çıkan nöropatik ağrı önemli bir klinik sorundur. Bu çalışmanın amacı kontüzyon modelini kullanarak oluşturulan omurilik hasarında (OİH) hiperbarik oksijen (HBO) tedavisinin omurilikte Fos proteini içeren nöron sayısında oluşturabileceği değişiklikleri araştırmaktır. Sprague-Dawley erkek sıçanda (n=16) T9-T11 hizasında Rivlin ve Tator yöntemiyle bir dakika süreyle klip uygulanarak OİH oluşturuldu. HBO tedavisi 2,80 ATA basınçta günde 1 seans, her seans 60 dakika olacak şekilde uygulandı. Gruplar: 1)Kontrol Grubu: OİH uygulanmış HBO uygulanmamış, 2)OİH öncesi (Preop.) HBO: OİH öncesi 5.günden başlanarak, 3)OİH sonrası (Postop.) HBO: OİH uygulandıktan sonra 1. saatte başlanarak 5 gün boyunca , 4)Preop.+ Postop. HBO: Sıçanlara OİH öncesi 5. günden başlanarak 5 gün boyunca, OİH sonrası 5 gün boyunca HBO. HBO uygulamasının hasar bölgesinin 1 cm proksimal ve distalini içeren kesitlerde preop, postop ve preop+postop HBO uygulamasının Fos ekspresyonunu önemli derecede arttırdığı görüldü. Bu artış HBO uygulamasının süresiyle doğru orantılıydı. Fos ekspresyonu tüm gruplarda en fazla lamina 1-2, ardından lamina 3-4’de, daha az olarak da lamina 7-8’de gözlendi. Daha önce yaptığımız oksidatif stresle ilgili araştırmada (Dayan ve ark., 2012), HBO uygulamasıyla omurilik dokusunda superoksit dismutaz, glutatyon peroksidaz, katalaz, ve ağrıyla ilişkili nitrik oksit ve nitrik oksit sentaz seviyelerinde azalma, ve BBB skorlarında önemli ölçüde iyileşme saptamıştık. Projemizde buna paralel olarak Fos ekspresyonun azalmasını beklerken, aksine arttığını saptadık. Bu durum HBO tedavisinin omurilik nöronlarında ağrı dışında yine hasara yanıt olarak, muhtemelen ağrıdan bağımsız nöral mekanizmalar nedeniyle Fos artışına neden olduğunu düşündürmektedir.

ANAHTAR KELİMELER:

Omurilik hasarı, Fos, Ağrı, Hiperbarik oksijen

ABSTRACT

Effect of Hyperbaric Oxygen Therapy on Fos Expression of Neuropathic Pain Caused by Spinal Cord Injury

Neuropathic pain caused by traumatic spinal cord injury (SCI) is an important clinical problem. The aim of this study was to investigate the changes in the number of neurons containing Fos protein after hyperbaric oxygen (HBO) treatment in SCI. Rivlin and Tator clip method was used to induce SCI on T9-T11 in Sprague-Dawley male rats (n=16). Rats received HBO at 2.80 ATA 60 min daily. Groups were: 1) Control (SCI, no HBO), 2) Preoperative HBO (HBO 5 days before SCI), 3) Postoperative HBO (HBO just after SCI for five days), 4) Preoperative and postoperative HBO (HBO 5 days before SCI and after SCI for 5 days). HBO applied preoperatively, postoperatively and preoperative+postoperatively in spinal cord sections 1cm proximal and 1cm distal to SCI induced Fos expression significantly. The increase was in proportion with the duration of HBO treatment. Fos expression was mostly found in laminae 1-2, followed by laminae 3-4, and laminae 7-8 groups. In a previous study on oxidative stress following SCI (Dayan et al., 2012), HBO treatment decreased enzyme levels of superoxide dismutase, glutathione peroxidase, catalase, and pain related nitric oxide synthase (and nitric oxide) levels in the spinal cord tissue, and a significant improvement in BBB scores. In this project, we had expected a decrease in Fos expression parallel to these improvements; however, we have observed an increase.

This leads us to the conclusion that HBO treatment induced Fos expression following injury is related to other mechanisms, not due to mechanisms related to pain.

KEY WORDS:

Spinal cord injury, Fos, Pain, Hyperbaric oxygen

1 GİRİŞ


Omurilik hasarı (OİH) toplum için sosyal, psikolojik yükleri ve ağır bakım masrafları nedeniyle önemli bir sorundur. Tipik olarak travmatik OİH akson hasarı ve hücre ölümüne yol açar (Schwab ve Bartholdi, 1996). Omuriliğe travmadan sonra primer ve sekonder hasarlar ortaya çıkar. Primer hasar mekanik faktörlere bağlı omurilik yapısının bozulmasıdır. Daha sonra oluşan sekonder hasar iskemi, ödem, inflamasyon, ekzitotoksisite ve oksidatif hücre hasarı gibi bir dizi kompleks patofizyolojik süreçten oluşur (Norenberg ve ark., 2004, Hodgetts ve ark., 2009).

Hasarın büyük kısmı glutamat ekzitotoksisitesi, kalsiyum (Ca⁺²)’un aşırı artışı ve oksidatif strese bağlıdır (Juurlink ve Paterson 1998). OİH’ndan sonra inflamatuvar hücreler, hücresel fonksiyonlar için önemli moleküllere saldıran ve bunların kimyasal yapısını değiştiren aşırı reaktif oksidatif ajanlar salgılarlar (Young 1995, Liu ve ark., 1998, Vaziri ve ark., 2004).

Omurilik yaralanmaları patofizyolojik olarak 4 tipe ayrılır: maserasyon, laserasyon, kontüzyon hasarı ve solid omurilik hasarı. İlk ikisinde omurilikte yüzeyel hasar mevcut olup son ikisine göre prognoz daha iyidir. Deneysel yaralanmalarda hayvan modeli olarak daha çok kontüzyon hasarı tercih edilmektedir (Bunge, Puckett et al. 1993;

Basso, Puckett et al. 1996).

Travmatik OİH’ndan sonra ortaya çıkan en önemli sorunlardan biri de nöropatik ağrıdır. Travmatik OİH’ndan sonra iki tip ağrı ortaya çıkar: nosiseptif ağrı (kas iskelet sistemi ve iç organlara ait) ve nöropatik ağrı. Kronik nöropatik ağrı hasar seviyesinin üstündeki duyu kusurunun olmadığı segmentlerde, hasar bölgesi seviyesinde ve hasar bölgesinin altındaki duyu kaybının oluştuğu vücut bölgelerinde ortaya çıkar (Siddal ve Loeser, 2001). Ağrı kronik spontan ağrı, spontan aralıklı ağrı ve allodiniya, hiperaljezi ve hiperpati gibi uyarıyla ortaya çıkan ağrı şekillerinde olabilir. OİH’ndan sonra ortaya çıkan kronik ağrı genellikle standart analjeziklere dirençlidir, morfin ve opioid analjeziklere de iyi yanıt vermez, bu nedenle hala önemli bir klinik problem teşkil etmektedir. Yeni ve etkili ağrı tedavisi stratejileri geliştirmek için kronik OİH ağrısının nöronal mekanizmalarının daha iyi anlaşılması gerekir. Günümüzde OİH’nın kronik fazında ağrıya neden olan nörofizyolojik mekanizmalar tam olarak bilinmemektedir. Bu

konuyu araştırmak için bazı hayvan modelleri (iskemik model, Xu ve ark., 1994;

ekzitotoksik model, Yezierski ve ark., 1998; kontüzyon modeli, Siddall ve ark., 1995) geliştirilmiştir. Bu modeller hayvanlarda nöropatik ağrının bazı özelliklerini taklit eden ve klinik olarak gözlenebilen bazı davranış yanıtlarına neden olur.

OİH tedavileri hasarın erken dönemlerinde ödemin ve iskeminin ve doku hasarının ortaya çıkışını önleme üzerine yoğunlaşmıştır. Son araştırmalar hiperbarik oksijen (HBO) tedavisinin akut ve kronik OİH’da faydalı olabileceğini göstermiştir.

HBO vücuttaki dokularda parsiyel oksijen basıncını önemli bir şekilde arttırır. Bu artış normobarik durumlarda saf oksijen solunumu ile sağlanan parsiyel oksijen basıncı artışından bile çok fazladır. Dokularda artan oksijen basıncı daha fazla oksijenin çözünmesini sağlar. HBO tedavisinde basınç 1 ATA’dan 2-2.5 ATA’ya çıkarıldığında plazmada oksijen çözünürlüğü normal havada solunan miktarın yaklaşık 3 katına çıkar (Edwards ML, 2010). Yapılan çalışmalar, HBO tedavisinin omurilikte hipersatüre plazma düzeyini arttırarak antioksidanları arttırdığı, ayrıca ödemi azalttığı, anjiogenezi arttırarak dokulardaki oksijen miktarını arttırmak suretiyle oksidatif stresi azaltarak ortaya çıkacak olan sitotoksinlerin düzeyini azaltarak tedaviye katkıda bulunduğunu göstermiştir.

Fos memelilerde bulunan c-fos protoonkogeninin bir nükleer fosfoprotein ürünüdür ve nöronlarda periferik uyaranlarla artar. Bu nedenle Fos immunohistokimyası santral sinir sisteminde ağrılı uyaranlara yanıt veren nöronların gösterilmesinde ve ağrı yollarının izlenmesinde kullanılır (Hunt ve ark., 1987; Bullit E, 1990; Herdegen ve ark., 1994; Wisden ve ark., 1990). Bu çalışmada sıçanda HBO tedavisinin omuriliğin hasarlı bölgesi ve komşu segmentlerinde nosiseptif (Fos içeren) nöronlarda nöropatik ağrıdaki rolü araştırılmıştır.

2 LİTERATÜR
ÖZETİ


Omurilik hasarı (OİH) sonucu gelişen ağrı lezyonun türüne, nörolojik yapıların hasarına ve dokudaki ikincil fizyopatolojik değişikliklere bağlıdır. Duyusal ve motor kayıplar OİH’nın en belirgin sonucu olsa da ağrı, hastanın gerekli aktivite ve yaşam kalitesini yeniden kazanabilmesi ile doğrudan ilişkilidir (Yezierski 2005).

Travmatik OİH’ndan sonra iki tip ağrı ortaya çıkar: nosiseptif ağrı (kas iskelet sistemi ve iç organlara ait) ve nöropatik ağrı. Kronik nöropatik ağrı hasar seviyesinin üstündeki duyu kusurunun olmadığı segmentlerde, hasar bölgesi seviyesinde ve hasar bölgesinin altındaki duyu kaybının oluştuğu vücut bölgelerinde ortaya çıkar (Siddall and Loeser 2001). Ağrı kronik spontan ağrı, spontan aralıklı ağrı ve allodini, hiperaljezi ve hiperpati gibi uyarıyla ortaya çıkan ağrı şekillerinde olabilir. Omurilik yaralanması ile birlikte olan ağrı tipik olarak hasar düzeyinin altındaki anestezik bölgelerde genellikle bilateral olarak algılanır ve sıklıkla deafferansiyon, dizestetik ağrı veya santral dizestetik sendrom olarak adlandırılır. Bu tip ağrı genellikle yanma, karıncalanma, hissizlik, acıma ve zonklama tarzında tarif edilir ve bu tip ağrıyı ayırmak oldukça güçtür. OİH’nın alt düzeyinde görülen nöropatik ağrı çok yaygındır ve tedavisi de aynı oranda çok güçtür (Yezierski, Liu et al. 1996; Yezierski 2005). OİH’ndan sonra ortaya çıkan kronik ağrı genellikle standart analjeziklere dirençlidir, morfin ve opioid analjeziklere de iyi yanıt vermez, bu nedenle hala önemli bir klinik problem teşkil etmektedir.

Sıçan omurilik arka boynuzundaki nöronlarda ağrılı uyaran da dahil değişik periferik uyaranlarla Fos proteininin ekspresyonu saptanmıştır. Kontrol grubu hayvanların omurilik hücrelerinde nadiren Fos içeren hücre bulunmasına rağmen (Bullitt, 1990;

Ruggiero, Anwar,1997) omurilik transeksiyonu (Ruggiero, Anwar,1997) siyatik sinir bağlanması (Orendacova, Marsala, 2000; Presley, Menetrey, 1990), siyatik sinir transeksiyonu (Molander, Hongpaisan, 1992; Molander, Hongpaisan, 1998), omurilik kontüzyonu (Molander, Hongpaisan, 1998) sonrası, ve ağrılı mekanik uyaranlarla (Bullitt, 1991; Clemens, Saunders,1993), formalin testi ile (Lima, Avelino, 1993; Todd, Spike,1994) omurilikte Fos içeren hücreler sayıca artar. Uyaranın ardından hücrede Fos ekspresyonu genellikle (uyaran tipine göre değişmekle birlikte) dakikalar içinde hızlıca

yükselir ve 60 dak içinde en üst seviyesine çıkar, 24 saat sonra tekrar eski seviyesine döner (Bullitt, Lee, 1992; Herdegen, Rudiger, 1994). Bu nedenle Fos immunohistokimyası santral sinir sisteminde ağrılı uyaranlara yanıt veren nöronların gösterilmesinde ve ağrı yollarının izlenmesinde kullanılmaktadır (Bullitt, Aylward, 2001; Herdegen, Rudiger, 1994; Hunt, Pini, 1987). Ancak Fos ekspresyonunun ağrısız somatik uyaranlar, yüzme stresi, uyku bozuklukları ve kuvvetli koku uyaranı gibi gibi diğer periferik uyaranlarla da arttığı bilinmektedir (Bellchambers, Chieng, 1998; Grassi- Zucconi, Menegazzi, 1993; Hunt, Pini, 1987; Jin, Franzen, 1996).

3 MATERYAL
ve
YÖNTEM


3.1 Deney Hayvanları

Deneylerde Ege Üniversitesi Deney Hayvanları Üretim Merkezi’nden temin edilen ve serbest su ve yem erişimli koşullarda yetiştirilen 4-6 aylık 200-240 gr ağırlıkta erkek Spraque Dawley cinsi sıçanlar kullanılmıştır. Tüm uygulamalar için Ege Üniversitesi Hayvan Etik Kurulundan izin alınmıştır (2010/70). Sıçanlar, ameliyat öncesi ve sonrası kobay yemi ve su ile beslenmiş, biyolojik ritme uygun olarak 12 saat karanlık ve 12 saat aydınlıkta dörderli kafeslerde barındırılmıştır. Sıçanların bakım ve ameliyatları Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Fizyoloji Anabilim Dalında yapılmıştır.

3.2 Çalışma Grupları

1. Kontrol Grubu: OİH uygulanmış HBO uygulanmamış (n=4),

2. OİH öncesi (preop.) HBO: Sıçanlara OİH öncesi 5. günden başlanarak HBO uygulanmış (n=4),

3. OİH sonrası (postop.) HBO: OİH’ndan sonra 1. saatte başlanarak 5 gün HBO uygulanmış (n=4),

4. preop. + postop. HBO: Sıçanlara OİH öncesi 5. günden başlanarak 5 gün boyunca, OİH sonrası 5 gün HBO uygulanmıştır (n=4).

3.3 Anestezi

50 mg/kg Ketamin HCl (Alfamine(R)), 5 mg/kg Ksilazin HCl (Alfazyne(R)) ve acepromazine maleate (1 mg/kg) kombinasonu intraperitoneal yoldan verilerek anestezi sağlandı.

3.4 Omurilik Hasarı (OİH) ve Cerrahi Yöntem

Tüm hayvanların genel anestezi sonrası sırt bölgesi traş edilerek Polyvidon iyot (Batticon, Adeka, Samsun) ile lokal antisepsi uygulandı. İnterskapuler mesafe referans alınarak prone pozisyonunda T9-T10 seviyesinden cilt, ciltaltı dokular ve paravertebral kas fasyası geçilerek kaslar künt disseksiyonla laterale sıyrıldı. Torakal 9-11 laminaları

görülerek total laminektomi uygulandı (Kontrol gruplarına yalnızca bu işlem uygulanmış omurilik hasarlanmamıştır). Bu işlem uygulanırken hayvanların dura mater’lerinin zedelenmemesine dikkat edildi. Daha sonra hayvanlara ekstradural olarak Rivlin ve Tator klip yöntemi ile (Rivlin and Tator, 1978) (Aesculap FE 654) bir dakika süreyle klip uygulanarak spinal travma oluşturuldu. Hemostazı takiben katlar anatomisine uygun olarak kapatıldı. Ameliyat sonrası 5 gün süreyle tüm sıçanlara profilaktik amaçla intraperitoneal olarak 30mg/kg Sefazolin Na (Cefazol(R)) verildi.

3.5 Motor Performansı Değerlendirme

BBB (Basso-Beattie-Bresnahan) lokomotor skalasına göre değerlendirildi.

3.6 Hiperbarik Oksijen (HBO) Tedavisi

Hiperbarik oksijen (HBO) tedavisi 2,80 ATA basınçta günde 1 seans ve her seans 60 dakika olacak şekilde uygulandı.

Preop. HBO: Sıçanlara OİH öncesi 5. günden başlanarak,

Postop. HBO: OİH uygulandıktan sonra 1. saatte başlanarak 5 gün,

Preop. + Postop. HBO: Sıçanlara OİH öncesi 5. günden başlanarak 5 gün ve OİH sonrası 5 gün günün aynı saatinde 1 seans HBO uygulandı.

3.7 Perfüzyon

Sıçanlar anestezik madde ile uyutularak önce 100-150 ml (37°C) %0.9 NaCl, ardından soğuk 750 ml formaldehit solusyonu (%4) ile perfüze edildi ve omurilikleri çıkarıldı. Perfüzyondan sonra omuriliğin travma bölgesinin ortasından başlayıp 2 cm yukarıya ve aşağıya kadar olan bölümü ayrılarak gece %4’lük formaldehit solusyonunda postfiksasyona bırakıldı. Ardından parçalar %10-20-30’luk sukroz solusyonlarından geçirilerek kriyoproteksiyon yapıldı ve kriyostat ile 40 µm kalınlıkta kesit alınarak, PBS (phosphate buffer saline) solüsyonunda biriktirildi.

muamele edildi. Primer c-fos antikoru (rabbit c-fos 1:15000, Santa Cruz) 72 saat süreyle 4°C’da uygulandı. Kesitlere 2 saat oda ısısında sekonder antikor (biotinylated goat anti- rabbit IgG, 1:200, Calbiochem) uygulandı. Daha sonra Vector Elite ABC (avidin-biotin complex, Vector, 1:100) kit kullanılarak 1 saat oda ısısında muamele edilen kesitlere son olarak karanlıkta 2-3 dakika süre ile diaminobenzidine (DAB) reaksiyonu yapıldı.

Ardından kesitler lam üzerine yerleştirilerek ışık mikroskobu altında Fos reaksiyonu ile pozitif boyanmış hücrelerin mevcudiyeti araştırılarak fotoğraflandı.

3.9 Kesitlerin Mikroskop Altında İncelenmesi

Kesitler ışık mikroskobu altında altında incelendi. Her sıçan omuriliği için en fazla boyamanın olduğu 10 omurilik kesiti seçildi. Her sıçan için bu omurilik kesitleri incelenerek Fos ile işaretli (Fos (+) - Fos immunoreaktif) hücreler Atlases of the Spinal Cord (Sengul ve ark., 2013)’dan alınan omurilik haritaları üzerinde işaretlendi.

Sayımların objektifliğini sağlamak açısından bütün incelemeler aynı araştırmacı tarafından yapıldı. Araştırmacı incelediği kesitlerin hangi sıçan grubuna dahil olduğundan haberdar değildi. Fos pozitifliği hücre nukleusunda koyu kahverengi renkte olarak izlendi.

3.10 İstatiksel Analiz

Çalışmada elde edilen veriler, SPSS 17.0 istatistik programında dağılımlarına uygun testler kullanılarak analiz edilerek ve p<0.05 değerler istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

4 BULGULAR


HBO uygulamasının hasar bölgesinin 1 cm proksimal ve distalini içeren omurilik kesitlerinde, preop, postop ve preop+postop HBO uygulamasında Fos ekspresyonunu önemli derecede arttırdığı görüldü. Bu artış HBO uygulamasının süresiyle doğru orantılıydı, en fazla preop+postop HBO grubunda, daha sonra sırayla preop HBO ve postop HBO gruplarındaydı. Fos ekspresyonu tüm gruplarda en fazla lamina 1-2, ardından lamina 3 -4’de, daha az olarak da lamina 7-8’de gözlendi (Tablo 1, Şekil 1, 2, 3, 4).

Tablo 1: Omurilik hasarı (OİH) sonrası omurilik lamina’ları, dorsal nukleus (D), intermediomedial nukleus (IMM), intermediolateral nukleus (IML) ve lumbar dorsal commissural nukleus (LDCom)’da Fos immunoreaktif nöron sayısı (Ortalama ±SEM)

OİH PreOp HBO PostOp HBO Preop+postop

HBO

Lamina 1-2 36.4 ± 4 122.3 ± 16.1 102.1 ± 10.6 140.9 ± 20.6 Lamina 3-4 54.2 ± 1.1 145.9 ± 16.6 111 ± 11 152.4 ± 19.9 Lamina 5-6 55.7 ± 3.5 136.9 ± 32.2 76.9 ± 8.6 195.5 ± 47.1 Lamina 7-8 45.8 ± 3.8 160.7 ± 75.3 87.5 ± 9 149.6 ± 26.1 Lamina 9 12.6 ± 0.2 34.4 ± 20.9 131 ± 1.7 30.5 ± 6.6 Lamina 10 4.7±0.9 16.1 ± 8.4 10.6 ± 0.9 29.1 ± 9

D 4.7 ± 0.6 11.4 ± 1.5 8.7 ± 0.8 1.2 ± 0.9

IML 0.7 ± 0.4 10.7 ± 8.6 7.5 ± 0.5 1.6 ± 1

IMM 0.36 ± 0.2 2.8 ± 2 2.8 ± 0.6 1.3 ± 1.2

LDCom 0.13 ±0.08 6.7 ± 5.1 8.7 ± 0.8 1.2 ± 0.9

Şekil 1: Omurilik hasarı (OİH), preoperatif, postoperatif ve pre-postoperatif gruplarda omurilik lamina’ları (lamina 1-2, 3-4, 5-6, 7-8, 9, 10), intermediolateral nukleus (IML), lumbar dorsal commissural nukleus, dorsal nukleus (D), intermediomedial nukleus (IMM)’da Fos immunoreaktif hücre sayısı.

*: OİH yapılan hayvanlarda lamina 1-2, 3-4, 5-6, 7-8’de preoperatif, postoperatif ve pre-post operatif HBO alan gruplardaki ve lamina 5-6 ve 5-6-D’da postoperatif ile pre-postoperatif gruplar arasında anlamlılık vardır, p<0.01

#: OİH yapılan hayvanlarda lamina 5-6, 7-8, 7-8-9 ve 5-6-D’de preoperatif, postoperatif ve pre-post operatif HBO alan gruplardaki anlamlılık p<0.05

Şekil 2: Preoperatif HBO uygulanan sıçanda omurilik arka boyuzunda Fos ekspresyonu

Şekil 3: Postoperatif HBO uygulanan sıçanda omurilik arka boyuzunda Fos ekspresyonu

5 TARTIŞMA,
SONUÇ
ve
ÖNERİLER


Son zamanlarda yapılan bazı araştırmalar HBO tedavisinin akut ve kronik OİH’nda faydalı olabileceğini göstermiştir. Ancak bu araştırmaların çoğu dokudaki hasarın durumunu ve nörolojik fonksiyonları inceleyen araştırmalardır. OİH ve HBO ardından dokudaki enzim düzeylerini araştıran az sayıda çalışma bulunmaktadır. OİH ve hasarın ardından HBO tedavisinin omurilikte Fos ekspresyonuna etkisini araştıran ilk çalışma ise bu projemizdir.

Çalışmamızda OİH yapılan hayvanlarda lamina 1-2, 3-4, 5-6, 7-8'de preoperatif, postoperatif ve pre-postoperatif HBO alan gruplardaki ve lamina 5-6 ve 5-6-D'da postoperatif ile pre-postoperatif gruplar arasında anlamlı farklılık görüldü (p<0.01).

OİH yapılan hayvanlarda lamina 5-6, 7-8, 7-8-9 ve 5-6-D'de preoperatif, postoperatif ve pre-postoperatif HBO alan gruplarda yine anlamlı farklılık görüldü (p<0.05). Lamina 1- 2 (substantia gelatinosa) yüzeyel arka boynuz nöronları ağrı ile ilişkilidir. Lamina 3-4 (nukleus proprius) propriosepsiyon, vibrasyon ve ağrı ile ilişkilidir. Lamina 5-6 proprioseptif afferentler ve motor ve sensoriyal korteks’den ve alt merkezlerden başlayan yollar gelir. Lamina 7’de nöronlar vardır, mezensefalon ve serebellum’la bağlantılıdır. Lamina 8, internöronlar, kas kontraksiyonlarının düzenlenmesinde görevlidir, komşu laminalar ve kontralateral lamina 8 ile bağlantılıdır.

Araştırmamızda visseral ağrı ile ilgili lamina 10, iç organlarla ilgili intermediomedial nukleus (IMM), lumbar dorsal komissural nukleus (LDCom), serebellum ile ilişkili D ve sempatik nöronların bulunduğu intermediolateral nukleus (IML)’da Fos immunoreaktif hücre sayısında OİH ve preoperatif, postoperatif ve pre-postoperatif HBO grupları arasında ise istatistiksel olarak anlamlı farklılık bulunmadı. IML sempatik preganglionik nöronlar, IMM’da visseral afferent impulslara bağlı olarak ortaya çıkan bazı otonomik refleksleri düzenleyen ara nöronlar bulunur. Dorsal nukleus (Clarke) bilinçsiz propriosepsiyon, serebellum bağlantılıdır. LDCom iç organ fonksiyonlarıyla ilgili otonom bir nukleustur. Lamina 9 iskelet kaslarını (ekstrafuzal kas lifleri) innerve eden alfa motor nöronlar, intrafuzal kas liflerini innerve eden gamma motor nöronlar, internöronlar içerir. Lamina 10’da radiks posteriorla gelen afferentlerin bir kısmı sinaps yapar, visseral afferentler ve ağrı ile ilişkilidir.

OİH’ndan sonra HBO tedavisi ilk kez Maeda (1995) tarafından köpeklerde uygulanmış ve 2 ATA HBO tedavisinin omurilik dokusunda oksijen düzeyinde belirgin artışa yol açtığını saptamıştır. Hartzog (1969) 3 ATA HBO tedavisinin hasardan sonra ilk 24 saat içinde uygulandığında belirgin iyileşmeye yol açtığını göstermiştir. Yep ve ark. (1976) ilk 8 hafta içinde uygulanan HBO tedavisinin motor iyileşmeyi arttırdığını ve omurilik dejenerasyonunu azalttığını saptamıştır. Omurilik dokusunda kistik nekrozda ve beyaz cevherde hasarda azalma yine Yeo ve ark. (1977) tarafından saptanmıştır. HBO tedavisi OİH’den sonra apoptozisi azaltmıştır (Calvert ve ark. 2006, Peng ve ark. 2008, Wang ve ark. 2009). Higgins ve ark. (1981) yaptıkları elektrofizyolojik çalışmada omurilik elektropotansiyellerini araştırmış ve erken dönemde uygulanan HBO tedavisinin SCI’de progressif dejenerasyonun önlenmesine katkıda bulunduğunu saptamışlardır. Neubauer ve Walker (1998) HBO tedavisinin omentum transpozisyonundan ve OİH hasarından sonra hücre transplantasyonunda rejenerasyona katkıda bulunduğunu saptamışlardır. Al-Waili ve ark. (2005) HBO uygulamasının omurilikte vasküler hasarı olan hastalara faydalı olduğunu göstermişlerdir. HBO’in kanamayı azaltan etkisinin ortamdaki demirin azalmasına, bunun da serbest radikal oluşumunu azaltmasına yol açtığını iddia etmişlerdir. Gelderd ve ark. (1983) OİH’den sonra HBO tedavisinin skar dokusunda daha az kavitasyona yol açtığını, ve sıkı kollajen lifler içeren iyi damarlanmış skarlara yol açtığını saptamışlardır.

Higgins ve ark. (1981) OİH’dan sonra erken dönemde uygulandığında HBO tedavisinin uzun traktusların ağır hasarlı nöronlarını koruduğunu saptamışlardır. HBO tedavisi arterlerde ve beyin omurilik sıvısında oksijen basıncını (PO2) arttırır. (Holbach ve ark., 1977).

HBO tedavisinin OİH’nda kullanılması sadece rejenerasyonla sınırlı değildir. Hart ve ark. (1984) HBO tedavisinin hastaların egzersiz kapasitesinde artışa yol açtığını saptamışlardır. OİH’ndan sonra hastaların çoğunun paraplejik olduğu ve rehabilitasyona ihtiyaçları olduğu gözönüne alındığında HBO tedavisinden faydalanacakları düşünülür.

Wilson ve ark., 2007; Zelinski ve ark., 2009). Bu çalışmalar HBO tedavisinin ağrının azaltılmasındaki potansiyel rolünü göstermektedir. Gu ve ark. (2012) idiopatik trigeminal nevraljili hastalarda ve siyatik sinir transeksiyonundan sonra sıçanlarda HBO tedavisinin nöropatik ağrıyı azalttığını, insanda vizuel analog skorlama, hayvanda mekanik ve termal hiperaljeziyi ölçen davranışsal yöntemlerle belirlemişlerdir.

Bizim de daha önce yaptığımız bir çalışmada (Dayan ve ark., 2012) pre-operatif HBO tedavisinin nörolojik iyileşmeyi belirgin ölçüde arttırdığı (BBB skorları gözönüne alındığında; p<0.05) saptadık. Bu araştırmada omurilik dokusunda superoksit dismutaz (SOD), glutatyon peroksidaz (GPx), nitrik oksit sentaz (NOS) ve nitrik oksit (NO) seviyelerinde OİH hasarlı grup kontrol (laminektomili) grup ile karşılaştırıldığında belirgin bir artış saptandı (p<0.05). Bu çalışmada sadece OİH olan grup 7 gün süreyle postoperatif HBO tedavisi alan grupla karşılaştırıldığında SOD, NOS ve NO düzeylerinde (p<0.05) belirgin azalma olduğu görüldü. Bu durum HBO tedavisinin serbest oksijen radikallerini belirgin olarak azalttığını gösterir.

HBO tedavisinin optimum süresi konusunda yapılmış bazı çalışmalar bulunmaktadır.

Bu çalışmada tedavi protokolünde günde bir kere, pre-operatif olarak 5 gün ve post- operatif olarak 7 gün olarak belirlemiştik (Dayan ve ark., 2012). Bu tedavi aralığı Schäbitz ve ark. (2004)’ın daha önce yaptığı bir çalışmada 1 saatlik HBO tedavisinin inme geçiren sıçanlarda inme başlangıcından 2 saat sonra başlayıp nöroprotektif etkisinin 5 güne kadar sürmesi ve nörolojik bulgularda belirgin iyileşmeyle sonuçlanması bulgularına dayanılarak yapılmıştır. Yine Hu ve ark. (2008) travmatik beyin hasarından sonra 5 gün 1 saat süreyle HBO uygulamasının beyni koruduğunu göstermişlerdir. Bu projemizde HBO tedavisi daha önceki çalışmalardan elde edilen bulgulara dayanılarak preoperatif 5 gün, postoperatif 5 gün ve pre + postoperatif 5 gün olarak düzenlenmiştir.

Huang ve ark. (2003) iskemik hasardan 30 dakika sonra başlatılan HBO tedavisinin tavşanlarda nöroprotektif etkisi olduğunu gözlemişlerdir. HBO tedavisi 6 saat sonra başlatıldığında ise aksine bir iyileşme saptamamışlardır. Araştırmacılar hasardan 3 saat sonra yapılan tek bir HBO tedavisinin veya 6 saat süreyle uygulamanın morfolojik ve nörolojik iyileşmeyi sağladığı, aksine 24 saattten sonra yapılan uygulamaların fayda getirmediğini saptamışlardır. Buna uyumlu olarak çalışmamızda (Dayan ve ark., 2012) OİH’ndan önce ve sonra HBO alan sıçanlarda SOD, GPx, NOS ve NO seviyelerinde

belirgin azalma saptanmıştır (p<0.05). Enzim seviyelerindeki bu azalma ve GPx seviyesinde özellikle pre ve postop HBO alanlardaki belirgin azalma (daha az süreyle HBO alan hayvanlara kıyaslandığında) HBO etkinliğinin tedavi süresi ile arttığı ve daha uzun uygulamaların daha etkin olduğunu göstermiştir. Bu projemizde de bu araştırmalara paralel olarak HBO tedavi süresi arttıkça HBO’nun Fos ekspresyonu gösteren hücre sayısını arttırdığını, ve en fazla Fos ekspresyonunun pre+postoperatif HBO uygulanan fareler olduğu gözlenmiştir. Preoperatif olarak HBO alan grup pre+postoperatif olarak HBO alan grupla karşılaştırıldığında SOD seviyelerinde sadece preop alanlarda istatistiksel olarak anlamlı bir azalma olduğunu gözlemledik (p<0.05).

Bu durum OİH’ndan sonra yapılan HBO tedavisinin etkinliğinin daha yüksek olduğunu da göstermiştir. Bu projemizde daha önceki bu çalışmamıza paralel olarak HBO tedavisi süresi arttıkça hücrelerde Fos ekspresyonunun buna paralel olarak arttığı gözlenmiştir.

Kahraman ve ark. (2007) OİH’ndan sonra yapılan HBO tedavisinin SOD ve GPx seviyelerini azalttığını saptamışlardır. Bu bizim bulgularımızla uyumludur. Topuz ve ark. (2010) HBO tedavisine hipotermiyi eklemiş ve yine SOD, GPx ve katalaz seviyelerinde azalma saptamışlardır. Bizim araştırmamızda (Dayan ve ark., 2012) ise katalaz düzeylerinde bir farklılık bulunmamıştır. Bu durum muhtemelen katalazın H2O2’e düşük afivitesi nedeniyle H2O2’i primer olarak indirgeyen enzimin GPx olmasıdır. Yu ve ark. (2004) iNOS immunoreaktif nöron sayısında HBO tedavisinden 1- 2 gün sonra azalma saptamışlardır.

Yukarıda bahsedilen oksidatif stresle ilgili araştırmamızda (Dayan ve ark., 2012), HBO uygulamasıyla omurilik dokusunda SOD, GPx, katalaz, ve ağrıyla ilişkili NO ve NOS seviyelerinde azalma, ve nörolojik iyileşmeyi gösteren BBB skorlarında önemli ölçüde iyileşme saptamıştık. Bu projemizde buna paralel olarak omurilik nöronlarında Fos ekspresyonun azalmasını beklerken, aksine HBO tedavisinin uygulama süresiyle orantılı olarak Fos ekspresyonunu arttırdığını saptadık. Bu durum HBO tedavisinin omurilik nöronlarında ağrı dışında yine hasara yanıt olarak, muhtemelen ağrıdan bağımsız nöral mekanizmalar nedeniyle Fos artışına neden olduğunu düşündürmektedir.

6 KAYNAKLAR


• Al-Waili Noori S, Butler GJ, Beale J, Abdullah MS, Hamilton RW, Lee BY, Lucus P, Allen MW, Petrillo RL, Carrey Z, Finkelstein M. Hyperbaric oxygen in the treatment of patients with cerebral stroke, brain trauma, and neurologic disease. Adv Ther. 2005;22(6):659–78.

• Basso DM, Beattie MS, Bresnahan JC. Graded histological and locomotor outcomes after spinal cord contusion using the NYU weight-drop device versus transection. Exp Neurol. 1996;139(2):244-56.

• Bellchambers CE, Chieng B, Keay KA, Christie MJ. Swim-stress but not opioid withdrawal increases expression of c-fos immunoreactivity in rat periaqueductal gray neurons which project to the rostral ventromedial medulla. Neurosci.

1998;83,517-24.

• Bullitt E. Expression of c-fos-like protein as a marker for neuronal activity following noxious stimulation in the rat. J Comp Neurol. 1990; 22;296(4):517- 30.

• Bullitt E. Somatotopy of spinal nociceptive processing. J Comp Neurol.

1991;312,279-90.

• Bullitt E, Lee CL, Light AR, Willcockson H. The effect of stimulus duration on noxious-stimulus induced c-fos expression in the rodent spinal cord. Brain Res.

1992; 580,172-9.

• Bullitt E, Aylward S, Bernard EJ Jr, Gerig G. Computer-assisted visualization of arteriovenous malformations on the home personal computer. Neurosurg.

2001;48,576-82; discussion 582-3.

• Bunge RP, Puckett WR, Becerra JL, Marcillo A, Quencer RM. Observations on the pathology of human spinal cord injury. A review and classification of 22 new cases with details from a case of chronic cord compression with extensive focal demyelination. Adv Neurol. 1993;59:75-89.

• Calvert JW, Cahill J, Yamaguchi-Okada M, Zhang JH. Oxygen treatment after experimental hypoxia–ischemia in neonatal rats alters the expression of HIF- 1alpha and its downstream target genes. J. Appl. Physiol. 2006;101:853–65.

• Clemens JA, Saunders RD, Ho PP, Phebus LA, Panetta JA. The antioxidant LY231617 reduces global ischemic neuronal injury in rats. Stroke 1993;24,716- 723.

• Dayan K, Keser A, Konyalioglu S, Erturk M, Aydin F, Sengul G, Dagci T. The effect of hyperbaric oxygen on neuroregeneration following acute thoracic spinal cord injury. Life Sci. 2012 Feb 27;90(9-10):360-4.

• Di Sabato F, Fusco BM, Pelaia P, Giacovazzo M. Hyperbaric oxygen therapy in cluster headache. Pain 1993;52:243–5.

• Edwards ML., Hyperbaric oxygen therapy. Part 1: history and principles,. J Vet Emerg Crit Care (San Antonio). 2010 Jun;20(3):284-8)

• Gelderd JB, Fife WP, Bowers DE, Deschner SH, Welch DW. Spinal cord transection in rats: the therapeutic effects of dimethyl sulfoxide and hyperbaric oxygen. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1983;411:218–33

• Grassi-Zucconi G, Menegazzi M, De Prati AC, Bassetti A, Montagnese P, Mandile P, Cosi C, Bentivoglio M. c-fos mRNA is spontaneously induced in the rat brain during the activity period of the circadian cycle. Eur J Neurosci.

1993;5,1071-8.

• Gu N, Niu JY, Liu WT, Sun YY, Liu S, Lv Y, Dong HL, Song XJ, Xiong LZ.

Hyperbaric oxygen therapy attenuates neuropathic hyperalgesia in rats and idiopathic trigeminal neuralgia in patients. Eur J Pain. 2012 Sep;16(8):1094-105.

• Hart GB, Strauss MB, Riker J. Vital capacity of quadriplegia patients treated with hyperbaric oxygen therapy. J. Am. Paraplegia Soc. 1984;7:8–9.

• Hartzog JI, Fischer RG, Snow C. Spinal cord trauma: effects of hyperbaric oxygenation. Proc. Ann. Clin. Spinal. Cord. Inj. Conf. 1969;17:70–1.

• Herdegen T, Rüdiger S, Mayer B, Bravo R, Zimmermann M. Expression of nitric oxide synthase and colocalisation with Jun, Fos and Krox transcription factors in spinal cord neurons following noxious stimulation of the rat hindpaw.

Brain Res Mol Brain Res. 1994 Mar;22(1-4):245-58.

• Hodgetts SI, Plant GW, Harvey AR. Spinal cord injury: experimental animal models and relation to human therapy. In: Watson C, Paxinos G, Kayalioglu G, editors. The Spinal Cord: A Christopher and Dana Reeve Foundation Text and Atlas. San Diego: Academic Press Elsevier 2009; 209–11.

• Holbach KH, Wassmann H, Linke D. The use of hyperbaric oxygenation in the treatment of spinal cord lesions. Eur. Neurol. 1977;16:213–21.

• Hu SL, Hu R, Li F, Liu Z, Xia YZ, Cui GY, et al. Hyperbaric oxygen preconditioning protects against traumatic brain injury at high altitude. Acta Neurochir. Suppl. 2008;105:191–6.

• Huang L, Mehta MP, Nanda A, Zhang JH. The role of multiple hyperbaric oxygenation in expanding therapeutic windows after acute spinal cord injury in rats. J. Neurosurg. 2003;99:198–205.

• Hunt SP, Pini A, Evan G. Induction of c-fos-like protein in spinal cord neurons following sensory stimulation. Nature. 1987 Aug 13-19;328(6131):632-4.

• Jin B.K, Franzen L, Baker H. Regulation of c-Fos mRNA and fos protein expression in olfactory bulbs from unilaterally odor-deprived adult mice, Int J Dev Neurosci, 1996;14,971-82.

• Kahraman S, Düz B, Kayali H, Korkmaz A, Oter S, Aydin A, et al. Effects of methylprednisolone and hyperbaric oxygen on oxidative status after

experimental spinal cord injury: a comparative study in rats. Neurochem. Res.

2007;32:1547–51.

• Lesný P, De Croos J, Prádný M, Vacík J, Michálek J, Woerly S, Syková E.

Polymer hydrogels usable for nervous tissue repair. J Chem Neuroanat. 2002 May; 23(4):243-7.

• Lima D, Avelino A, Coimbra A. Differential activation of c-fos in spinal neurones by distinct classes of noxious stimuli. Neuroreport 1993;4,747-50.

• Liu J, Solway K, Messing RO, Sharp FR. Increased neurogenesis in the dentate gyrus after transient global ischemia in gerbils. J Neurosci. 1998;18(19):7768–

78.

• Lombello CB, Malmonge SM, Wada ML. Morphology of fibroblastic cells cultured on poly(HEMA-co-AA) substrates. Cytobios. 2000;101(397):115-22.

• Maeda N. Experimental studies on the effect of decompression procedures and hyperbaric oxygenation for the treatment of spinal cord injury. J. Natl. Med.

Assoc. 1965;16:429–47.

• Mahesh VB, Dhandapani KM, Brann DW. Role of astrocytes in reproduction and neuroprotection. Mol Cell Endocrinol. 2006 Feb 26;246(1-2):1-9.

• Miya D, Giszter S, Mori F, Adipudi V, Tessler A, Murray M, Fetal transplants alter the development of function after spinal cord transection in newborn rats. J Neurosci. 1997 Jun 15;17(12):4856-72.

• Molander C, Hongpaisan J, Grant G. Changing pattern of c-FOS expression in spinal cord neurons after electrical stimulation of the chronically injured sciatic nerve in the rat. Neurosci. 1992; 50,223-36.

• Molander C, Hongpaisan J, Shortland P. Somatotopic redistribution of c-fos expressing neurons in the superficial dorsal horn after peripheral nerve injury.

Neurosci. 1998;84,241-53.

• Norenberg MD, Smith J, Marcillo A. The pathology of human spinal cord injury: defining the problems. J. Neurotrauma 2004;21:429–40.

• Neubauer RA, Walker M. Hyperbaric oxygen therapy. New York: Avery Publications Group; 1998

• Peng Z, Ren P, Kang Z, Du J, Lian Q, Liu Y, et al. Up-regulated HIF-1alpha is involved in the hypoxic tolerance induced by hyperbaric oxygen preconditioning. Brain Res. 2008;1212:71–8.

• Ruggiero DA, Anwar M, Kim J, Sica AL, Gootman N, Gootman PM. Induction of c-fos gene expression by spinal cord transection in the rat. Brain Res. 1997;

763,21-9.

• Schäbitz WR, Schade H, Heiland S, Kollmar R, Bardutzky J, Henninger N, et al.

Neuroprotection by hyperbaric oxygenation after experimental focal cerebral ischemia monitored by MRI. Stroke 2004;35:1175–9.

• Schwab ME, Bartholdi D. Degeneration and regeneration of axons in the

• Siddall PJ, Loeser JD. Pain following spinal cord injury. Spinal Cord. 2001 Feb;39(2):63-73.

• Siddall PJ, Taylor D, Cousins MJ. Pain associated with spinal cord injury. Curr Opin Neurol. 1995 Dec;8(6):447-50. Review.

• Sumen G, Cimsit M, Eroglu L. Hyperbaric oxygen treatment reduces carrageenan-induced acute inflammation in rats. Eur J Pharmacol.

2001;431:265–8.

• Todd AJ, Spike RC, Brodbelt AR, Price RF, Shehab SA. Some inhibitory neurons in the spinal cord develop c-fos-immunoreactivity after noxious stimulation. Neurosci. 1994;63,805-16.

• Topuz K, Colak A, Cemil B, Kutlay M, Demircan MN, Simsek H, et al.

Combined hyperbaric oxygen and hypothermia treatment on oxidative stress parameters after spinal cord injury: an experimental study. Arch. Med. Res.

2010;41:506–12.

• Vaziri ND, Lee YS, Lin CY, Lin VW, Sindhu RK. NAD(P)H oxidase, superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase and nitric oxide synthase expression in subacute spinal cord injury. Brain Res 2004;995(1):76–83.

• Wang L, Li W, Kang Z, Liu Y, Deng X, Tao H, et al. Hyperbaric oxygen preconditioning attenuates early apoptosis after spinal cord ischemia in rats. J.

Neurotrauma 2009;26:55–66

• Wilson HD, Toepfer VE, Senapati AK, Wilson JR, Fuchs PN. Hyperbaric oxygen treatment is comparable to acetylsalicylic acid treatment in an animal model of arthritis. J Pain 2007; 8:924–30.

• Wisden W, Errington ML, Williams S, Dunnett SB, Waters C, Hitchcock D, Evan G, Bliss TV, Hunt SP. :Differential expression of immediate early genes in the hippocampus and spinal cord. Neuron. 1990 Apr;4(4):603-14.

• Xu ZC, Pulsinelli WA. : Responses of CA1 pyramidal neurons in rat hippocampus to transient forebrain ischemia: an in vivo intracellular recording study. Neurosci Lett. 1994 Apr 25;171(1-2):187-91.

• Yeo JD, Stabback S, McKenzie B. A study of the effects of hyperbaric oxygen on the experimental spinal cord injury. Med. J. Aust. 1977;2:145–7.

• Yeo JD, McKenzie B, Hindwood B, Kidman A. Treatment of paraplegic sheep with hyperbaric oxygen. Med. J. Aust. 1976;1:538–40.

• Yezierski RP. : Spinal cord injury: a model of central neuropathic pain.

Neurosignals. 2005;14(4):182-93.

• Yezierski RP, Liu S, Ruenes GL, Kajander KJ, Brewer KL.: Excitotoxic spinal cord injury: behavioral and morphological characteristics of a central pain model. Pain. 1998 Mar;75(1):141-55.

• Young W, Huang PP, Kume-Kick J. Cellular, ionic, and biomolecular mechanisms of the injury process. In: Benzel ED, Tator CH, editors.

Contemporary Management of Spinal Cord Injury. Park Ridge, IL: American Association of Neurological Surgeons; 1995.

• Yezierski RP, Liu S, Ruenes GL, Busto R, Dietrich WD. Neuronal damage following intraspinal injection of a nitric oxide synthase inhibitor in the rat. J Cereb Blood Flow Metab. 1996 Sep;16(5):996-1004.

• Yu Y, Matsuyama Y, YanaseM, Ito S, Adachi K, Satake K, et al. effects of hyperbaric oxygen on GDNF expression and apoptosis in spinal cord injury.

Neuroreport 2004;25:2369-73.

• Zelinski LM, Ohgami Y, Chung E, Shirachi DY, Quock RM. A prolonged nitric oxide-dependent, opioid-mediated antinociceptive effect of hyperbaric oxygen in mice. J Pain 2009; 10:167–72