T.C.
PAMUKKALE ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
BIYOLOJI ANABILIM DALI
EGE BÖLGESI’NDEKI BAZI ALYSSUM L. TAKSONLARININ BIYOLOJIK AKTIVITELERININ İNCELENMESI VE AKTIF
BILEŞENLERININ KARAKTERIZASYONU
DOKTORA TEZI
CENNET ÖZAY
DENİZLİ, KASIM - 2015
T.C.
PAMUKKALE ÜNIVERSITESI FEN BILIMLERI ENSTITÜSÜ
BIYOLOJI ANABILIM DALI
BILIM DALINIZ YOKSA BU SEKMEYI SILINIZ
EGE BÖLGESI’NDEKI BAZI ALYSSUM L. TAKSONLARININ BIYOLOJIK AKTIVITELERININ İNCELENMESI VE AKTIF
BILEŞENLERININ KARAKTERIZASYONU
DOKTORA TEZI
CENNET ÖZAY
DENİZLİ, KASIM - 2015
Bu tez çalışması PAÜ-Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimi tarafından 2013FBE029 nolu proje ile desteklenmiştir.
i
ÖZET
EGE BÖLGESI’NDEKI BAZI ALYSSUM L. TAKSONLARININ BIYOLOJIK AKTIVITELERININ İNCELENMESI VE AKTIF BILEŞENLERININ
KARAKTERIZASYONU DOKTORA TEZI
CENNET ÖZAY
PAMUKKALE ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BIYOLOJI ANABILIM DALI
(TEZ DANIŞMANI: PROF. DR. RAMAZAN MAMMADOV) DENİZLİ, KASIM - 2015
Bu çalışmada, kuduzotu olarak bilinen bazı Alyssum L. taksonlarına (A. foliosum var.
megalocarpum, A. fulvescens var. fulvescens, A. simplex, A. murale var. murale, A.
strigosum subsp. strigosum, A. corsicum, A. virgatum, A. cypricum, A. sibiricum, A.
discolor) ait metanol ekstraktlarının antioksidan, antibakteriyel ve sitotoksik aktiviteleri ile fenolik kompozisyonu ilk defa araştırılmıştır. Ekstraktların antioksidan aktivitesi DPPH, metal şelatlama, fosfomolibdenyum, β-karoten/linoleik asit ve demir indirgeme metotlarıyla belirlenmiştir. Ayrıca toplam fenolik ve flavonoid madde miktarları da Folin-Ciocalteu reaktifi ve alüminyum klorür kullanılarak tespit edilmiştir. Brine shrimp (Artemia salina L.) letalite testi ile ekstraktların olası sitotoksik aktivitesi incelenmiştir. Alyssum ekstraktlarının kanser hücreleri üzerindeki sitotoksik etkisinin tayini için üç farklı kanser hücre hattı (MCF-7, H1299 ve HeLa) kullanılmıştır. Antibakteriyal aktivite deneylerinde MİK konsantrasyonları belirlenmiştir. HPLC ile tespit edilen fenolik bileşen miktarlarında hiperakümülatör türlerde sinnamik asit türevleri, non-hiperakümülatör taksonlarda ise benzoik asit türevleri daha yüksek çıkmıştır. Bulunan toplam fenolik ve flavonoid miktarları ekstraktların antioksidan kapasiteleri ile uyumlu bulunmuştur. Genel olarak, non- hiperakümülatör taksonlarda A. simplex ve A. discolor gerçekleştirilen tüm deneylerde biyolojik olarak en aktif takson iken, A. virgatum ise hiperakümülatör taksonlar içinde biyolojik olarak en aktif takson olmuştur. Ülkemizde yayılış gösteren Alyssum L.
cinsinin oldukça fazla türle temsil edilmesi ve bunların büyük çoğunluğunun endemik olması nedeniyle bu cinsin türlerinin biyolojik aktivitelerinin hiperakümülatör ve non- hiperakümülatör taksonlar düzeyinde daha ayrıntılı araştırılmalarına ihtiyaç vardır.
ANAHTAR KELİMELER: Alyssum L., antioksidan kapasite, antibakteriyal aktivite, sitotoksisite, HPLC
ii ANAHTAR KELİMELER:
ABSTRACT
INVESTIGATION OF BIOLOGICAL ACTIVITIES OF SOME ALYSSUM L.
TAXA DISTRIBUTED IN THE AEGEAN REGION AND CHARACTERIZATION OF THEIR ACTIVE COMPONENTS
PH.D THESIS CENNET ÖZAY
PAMUKKALE UNIVERSITY INSTITUTE OF SCIENCE BIOLOGY
(SUPERVISOR:PROF. DR. RAMAZAN MAMMADOV) DENİZLİ, NOVEMBER 2015
In this research the phenolic composition, antioxidant, antibacterial and cytotoxic activities of the methanolic extracts obtained from some Alyssum taxa (A. foliosum var. megalocarpum, A. fulvescens var. fulvescens, A. simplex, A. murale var. murale, A. strigosum subsp. strigosum, A. corsicum, A. virgatum, A. cypricum, A. sibiricum, A.
discolor) known as kuduzotu in western Turkey, were firstly investigated. The antioxidant activity of the extract was determined by DPPH, metal chelating, phosphomolybdenum, β-carotene/linoleic acid and ferric reducing power assays. Total phenolic and flavonoid contents of each extract were also investigated by using both Folin-Ciocalteu reagent and aluminium chloride. The brine shrimp (Artemia salina L.) lethality test was used to screen for the possible cytotoxic activity of the extracts.
Three human cancer cell lines (MCF-7, H1299 and HeLa) were used for the determination of cytotoxic effects on cancer cells of extracts. MIC concentrations were determined with broth microdilution assay for the antibacterial activity. The phenolic components were determined by HPLC. The amounts of cinnamic acid derivatives were higher in hyperaccumulators taxa, while the benzoic acid derivatives were higher in non-hyperaccumulator taxa. Total phenolic and flavonoid contents in the extracts were correlated with antioxidant potentials. Generally, A. simplex ve A.
discolor were the most biologically active taxa in all assays as non- hyperaccumulators, while A. virgatum was the most biologically active taxon in the hyperaccumulator taxa. More detailed investigations are needed to test the biological activities of Alyssum taxa as hyperaccumulators and non-hyperaccumulator species.
Because the genus Alyssum L. is one of the biggest genera in Turkey and many of them are endemic.
KEYWORDS: Alyssum L., antioxidant capacity, antibacterial activity, cytotoxicity, HPLC
iii KEYWORDS:
İÇİNDEKİLER
Sayfa
ÖZET ... i
ABSTRACT ... ii
İÇİNDEKİLER ... iii
ŞEKİL LİSTESİ ... v
TABLO LİSTESİ ... vi
KISALTMALAR ve SEMBOLLER LİSTESİ ... vii
ÖNSÖZ... viii
1. GİRİŞ ... 1
1.1 Çalışmanın Amacı ve Önemi ... 4
1.2 Brassicaceae Familyası ve Alyssum L. Cinsi ... 5
1.3 Bitkisel Sekonder Metabolitler... 7
1.4 Serbest Radikaller ... 9
1.5 Antioksidanlar ... 9
1.5.1 Fenolik Bileşikler ... 11
1.5.1.1 Fenolik Asitler ... 12
1.5.1.2 Flavonoidler ... 13
1.6 Antioksidan Aktivite Tayin Yöntemleri ... 15
1.6.1 β-karoten/Linoleik Asit Emülsiyon Sistemi ... 16
1.6.2 Toplam Antioksidan Kapasite Testi (Fosfomolibdat Yöntemi) .. 16
1.6.3 DPPH Yöntemi ... 16
1.6.4 Demir İyonu İndirgeme Gücü ... 17
1.6.5 Metal Şelatlama Gücü ... 18
1.6.6 Toplam Fenolik Madde Tayini (Folin-Ciocalteu Yöntemi) ... 18
1.6.7 Toplam Flavonoid Madde Tayini ... 19
1.7 Antimikrobiyal Ajanlar ve Etki Mekanizmaları... 19
1.8 Brine Shrimp (Artemia salina L.) Letalite Testi ... 21
1.9 Kanser Hücreleri ve Sitotoksisite ... 22
1.10 Bitkilerden Aktif Bileşenlerin İzolasyonu... 23
2. MATERYAL VE YÖNTEM ... 25
2.1 Materyal ... 25
2.1.1 Çalışmada Kullanılan Alyssum L. Taksonları ... 25
2.2 Yöntemler ... 29
2.2.1 Bitki Ekstraktlarının Hazırlanması ... 29
2.2.2 Antioksidan Aktivitenin Belirlenmesinde Kullanılan Yöntemler 29 2.2.2.1 β-karoten/Linoleik Asit Yöntemi ... 29
2.2.2.2 Fosfomolibdenyum Yöntemi ... 30
2.2.2.3 DPPH Serbest Radikal Giderim Kapasitesi ... 30
2.2.2.4 Demir İyonu İndirgeme Gücü Kapasitesi ... 31
2.2.2.5 Şelatlama Kapasitesi ... 31
2.2.2.6 Toplam Fenolik Madde Miktarı ... 31
2.2.2.7 Toplam Flavonoid Madde Miktarı ... 32
2.2.3 Antibakteriyal Aktivitenin Belirlenmesi ... 33
iv
2.2.4 Brine Shrimp (Artemia salina L.) Letalite Testi ... 34
2.2.5 Kanser Hücreleri Üzerindeki Sitotoksik Etkinin Belirlenmesi .... 34
2.2.6 Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) ile Fenolik Bileşiklerin Analizi ... 35
2.2.7 Verilerin Değerlendirilmesi ... 36
3. BULGULAR ... 37
3.1 Antioksidan Aktivite Yöntemlerine Ait Sonuçlar ... 37
3.1.1 β-karoten/Linoleik Asit Testi ... 37
3.1.2 Fosfomolibdenyum Testi ... 38
3.1.3 DPPH Giderim Kapasitesi ... 39
3.1.4 Demir İyonu İndirgeme Gücü Kapasitesi ... 40
3.1.5 Şelatlama Kapasitesi ... 41
3.1.6 Toplam Fenolik ve Flavonoid Madde Miktarları ... 42
3.2 Antibakteriyal Aktivite Sonuçları ... 43
3.3 Brine Shrimp Letalite Testi Sonuçları ... 44
3.4 Kanser Hücreleri Üzerindeki Sitotoksik Aktivite Sonuçları ... 44
3.5 HPLC Analizlerine Ait Sonuçlar... 46
4. TARTIŞMA VE SONUÇ ... 52
5. KAYNAKLAR ... 74
6. ÖZGEÇMİŞ ... 91
v
ŞEKİL LİSTESİ
Sayfa
Şekil 1.1: Sekonder metabolit biyosentezinin başlıca yolakları………...…8
Şekil 1.2: Fenolik asitlerin genel yapısı: a) Benzoik asit türevleri b) Sinnamik asit türevleri……….….…...…13
Şekil 1.3: Flavonoidlerin genel yapısı ve alt grupları.………....…....14
Şekil 1.4: DPPH’ın antioksidan madde ile reaksiyonu………...……...….17
Şekil 1.5: Artemia salina L. ve hayat döngüsü………...……...21
Şekil 2.1: a) A. foliosum var. megalocarpum b) A. fulvescens.……… 27
Şekil 2.2: c) A. simplex d) A. strigosum subsp. strigosum………..………..…...…27
Şekil 2.3: e) A. discolor f) A. sibiricum……….……….………..28
Şekil 2.4: g) A. cypricum h) A. corsicum ……..……… …………...28
Şekil 2.5: ı) A. virgatum i) A. murale var. murale...……….………..………... 28
Şekil 2.6: Gallik asit kalibrasyon grafiği……….…..32
Şekil 2.7: Kuersetin kalibrasyon grafiği ……… …...…...33
Şekil 2.8: CytoTox-GloTM kitinin çalışma mekanizması………...……35
Şekil 3.1: Alyssum taksonlarının % inhibisyon grafiği……….……….38
Şekil 3.2: Alyssum taksonlarının askorbik aside eşdeğer (mgAE/g) antioksidan kapasiteleri………..……….…..39
Şekil 3.3: Alyssum taksonları ve standart antioksidanların IC50 değerleri …... 40
Şekil 3.4: Alyssum taksonları ve standart antioksidanların EC50 değerleri …. …41 Şekil 3.5: Alyssum taksonlarının EDTA’ya eşdeğer (mgEDTA/g) antioksidan kapasiteleri……….... 42
Şekil 3.6: Alyssum taksonlarının toplam fenolik ve flavonoid madde miktarları……….…...43
Şekil 3.7: Alyssum taksonlarının MCF-7 hücrelerinin sağkalımı üzerine etkisi………...45
Şekil 3.8: Alyssum taksonlarının H1299 hücrelerinin sağkalımı üzerine etkisi……...45
Şekil 3.9: Alyssum taksonlarının HeLa hücrelerinin sağkalımı üzerine etkisi……… …… .46
Şekil 3.10: Standartların HPLC kromatogramı……….……... 47
Şekil 3.11: Alyssum taksonlarının HPLC kromatogramları……….. …..47
Şekil 3.12: Alyssum taksonlarının HPLC kromatogramları (devamı)……… ...48
Şekil 3.13: Alyssum taksonlarının HPLC kromatogramları (devamı)..….…..…..49
TABLO LİSTESİ
vi
TABLO LİSTESİ
Sayfa
Tablo 1.1: Sekonder metabolitlerin sınıflandırılması…………..………...……..…8
Tablo 3.1: Alyssum taksonlarının β-karoten/Linoleik asit emülsiyon sisteminde % inhibisyonları………37
Tablo 3.2: Alyssum taksonlarının askorbik aside eşdeğer (mgAE/g) antioksidan kapasiteleri………...….….38
Tablo 3.3: Alyssum taksonları ve standart antioksidanların IC50 değerleri……….….……….. 39
Tablo 3.4: Alyssum taksonları ve standart antioksidanların EC50 değerleri………...…....40
Tablo 3.5 Alyssum taksonlarının EDTA’ya eşdeğer (mgEDTA/g) antioksidan kapasiteleri………..….41
Tablo 3.6: Alyssum taksonlarının toplam fenolik ve flavonoid madde miktarları………....…………....42
Tablo 3.7: Alyssum taksonlarının MİK değerleri (mg/mL)……….…………...43
Tablo 3.8: Alyssum taksonlarının BSLT sonuçları……….44
Tablo 3.9: Kanser hücre hatlarında Alyssum taksonlarının IC50 değerleri……...46
Tablo 3.10: Alyssum taksonlarındaki fenolik bileşikler (mg/g ekstrakt)………...50
Tablo 3.11: Alyssum taksonlarındaki fenolik bileşikler (mg/g ekstrakt) (devamı)………...50
Tablo 3.12: Alyssum taksonlarındaki fenolik bileşikler (mg/g ekstrakt) (devamı) ………...51
vii
KISALTMALAR ve SEMBOLLER LİSTESİ
EDTA : Etilen Diamin Tetra Asetik Asit DNA : Deoksiribonükleik Asit
RNA : Ribonükleik Asit
DPPH : 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil SOD : Süperoksit Dismutaz
QE : Kuersetin Eşdeğeri
GAE : Gallik Asit Eşdeğeri OH• : Hidroksil radikali OOH• : Peroksit radikali
AE : Askorbik Asit Eşdeğeri FCR : Folin-Ciocalteu reaktifi MHB : Mueller Hinton Broth MHA : Mueller Hinton Agar Na2CO3 : Sodyum karbonat FeCI2 : Demir (II) klorür
BSLT : Brine Shrimp Letalite Testi
HPLC : Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi BHT : Bütillenmiş hidroksi toluen
BHA : Bütillenmiş hidroksi anisol
CUPRAC : Bakır (II) İndirgeyici Antioksidan Kapasite TBA : Tiyobarbitürik asit metodu
TCA : Trikloroasetik asit
BHT : Bütillenmiş hidroksi toluen BHA : Bütillenmiş hidroksi anisol dH2O : Distile Su
cfu : Colony forming unit
Mo : Molibden
IC50 : %50 İnhibisyon Konsantrasyonu
EC50 : Absorbansın 0.5 olduğu Etkin Konsantrasyon LC50 : Letal Konsantrasyon
mM : Milimolar
mL : Mililitre
mg : Miligram
% : Yüzde
nm : Nanometre
β : Beta
VU : Vulnerable (Zarar görebilir)
NT : Near Threatened (Tehlike altına girebilir) C. Özay : Cennet Özay
D. Akd. el. : Doğu Akdeniz Elementi
m : metre
dk. : Dakika
g : Gram
oC : Santigrat derece
µL : Mikrolitre µL : Mikrolitre
M : Molarite
Ni : Nikel
viii
ÖNSÖZ
Çalışmalarım boyunca yardımını ve ilgisini esirgemeyen, engin bilgi ve tecrübesiyle her zaman bana destek olan saygıdeğer danışman hocam, Prof. Dr.
Ramazan MAMMADOV’a,
Tez İzleme Komitesi toplantılarında bilgi ve desteklerini benden esirgemeyen sayın hocalarım Prof. Dr. Olcay DÜŞEN ve Prof. Dr. Hakan AKÇA’ya,
Antibakteriyal aktivite deneylerinde yardımlarından dolayı Doç. Dr. Vildan CANER’e,
Hayatım boyunca sonsuz sabır ve sevgileriyle, maddi ve manevi destekleriyle her zaman yanımda olan, çok sevdiğim canım babam Nurettin ÖZAY ve canım annem Sultan ÖZAY’a sonsuz şükranlarımı sunarım.
Ayrıca tezin yapılmasında 2013FBE029 nolu proje ile maddi destek sağlayan Pamukkale Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimi’ne de çok teşekkür ederim.
1 ÖNSÖZ
1. GİRİŞ
Ülkemiz, farklı iklim ve ekolojik koşullara sahip olması, floranın çok sayıda bitki türü ve çeşitliliği içermesi bakımından oldukça zengindir ve dünyanın sayılı ülkeleri arasında yer almaktadır. Üç farklı fitocoğrafik bölgenin (İran-Turan, Avrupa- Sibirya ve Akdeniz) geçiş lokalitelerinde ve üç kıtanın birleşme noktasında yer alması, jeolojik yapısı, farklı iklimsel ve topografik özellikleri barındırması ile Anadolu, özel bir konuma sahiptir (Güner 1994).
Bir ülkenin sahip olduğu biyolojik çeşitliliğin ve özellikle floristik zenginliğin yaşamsal ölçüde önemli olduğu gerçeği bugün tüm dünya tarafından kabul edilen bir olgudur. Ülkemiz bu bakımdan kıskanılacak bir zenginliğe sahiptir.
Türkiye, 12000 civarında eğrelti ve tohumlu bitki taksonu ile dünyada, bulunduğu iklim kuşağında oldukça zengin bir floraya sahip ender ülkelerden biridir (Erik ve Tarıkahya 2004). Ülkemizin yaklaşık 15 katı büyüklüğündeki Avrupa kıtasının bütününde 13000’e yakın bitki taksonu olduğu düşünüldüğünde ülkemizin bu konuda ne kadar zengin olduğu daha açık bir şekilde ortaya çıkmaktadır. Türkiye florası, sahip olduğu tür zenginliğinin yanında içerdiği endemik bitki sayısı bakımından da çok zengindir. Avrupa ülkelerindeki endemik bitki sayısının toplamı 3500 kadar iken ülkemizde bu sayı 4000’e yakındır. Ülkemizin bu denli zengin bir çeşitliliğe sahip olmasının başlıca sebepleri arasında klimatik ve edafik farklılıkların yanında jeomorfolojik, topografik çeşitlilik, deniz, akarsu, göl gibi değişik su ortamı çeşitlilikleri, 0-5000 m.’ler arasında değişen yükselti farklılıkları, üç farklı fitocoğrafik bölgenin kesişme noktasında yer alması ve Güneybatı Asya ile Avrupa arasında bir köprü konumunda bulunması sayılabilir. Ayrıca son 1 milyon yıldan 12 bin yıl öncesine dek yeryüzünün yaşadığı dört buzul döneminden de ülkemizin çok fazla etkilenmemiş olması, Kuzey Avrupa’dan Akdenize doğru inen buzullardan çeşitli yollarla kaçan, göç eden bitkilerin ülkemizi bir tür sığınma alanı olarak bulmaları nedeniyle de Avrupa’da binlerce tür yok olurken ülkemizde tam aksi bir çeşitliliğin ortaya çıkmasına neden olmuştur (Ocak 2012).
Bitkiler içerdikleri maddelerle, beslenmenin yanısıra insan ve hayvan sağlığı açısından da büyük öneme sahiptir (Dimayuga ve Garcia 1991). Bitkisel ürünlerin [Belgeden bir
alıntı veya ilginç bir noktanın özetini yazın.
Metin kutusunu belge içinde herhangi bir yere konumlandırabilir siniz. Kısa alıntı metin kutusunun biçimlendirmesini değiştirmek için Metin Kutusu Araçları sekmesini kullanın.]
2
tüketiminin artırılmasının sağlık açısından faydalı olduğu çok eski çağlardan beri bilinmesine rağmen bu faydalı etkiden hangi özel bileşenlerin sorumlu olduğu pek bilinmemekteydi. Ancak günümüzde bitkilerin bileşiminde bulunan birçok ürün daha fazla ilgi çekmekte, bunların faydaları ve kullanım alanlarının araştırıldığı çalışmaların sayısı her geçen gün artmaktadır. Bitkiler lipidler, basit ve kompleks karbohidratlar, proteinler, mineraller ve insan beslenmesi için önemli sekonder metabolitlerin iyi bir kaynağıdır. Bunlara ek olarak bitkilerin kimyasal bileşiminde bulunan fitokimyasallar gibi bazı maddelerin sağlık açısından faydaları son zamanlarda oldukça ilgi çekmektedir (Heber 2004). Fakat 19. yüzyılın başlarına kadar bitkilerdeki bu aktif bileşenler izole edilememiştir. Doğal bitkisel bileşenlerin kimyasal yapıları ancak bu yüzyılın sonlarında belirlenebilmiştir. Son 50 yılda yeni kimyasal teknolojilerin geliştirilmesiyle biyolojik bileşenlerin belirlenmesi, izolasyonu ve sentezi mümkün hale gelmiştir. Bitkiler ve onların çeşitli kısımlarından elde edilen bileşenler boya, koku, tat verici, hastalıkların tedavisi gibi birçok amaçla kullanılmaktadır.
Yakın geçmişimizde ilaç sanayisinin hızlı bir şekilde gelişmesiyle göz ardı edilen bitkilerle tedavi, çoğunlukla sentetik ilaçların neden olduğu olumsuz yan etkiler nedeniyle günümüzde yeniden önem kazanmıştır. Bitkiler üzerinde yapılan çalışmalar çeşitli hastalıklara karşı kullanılan yeni ilaçların keşfine öncülük etmiştir (Orhan ve diğ. 2006). Bitkilerin içerdiği biyoaktif bileşikler olan sekonder metabolitlerin keşfi, bu alanda yapılan çalışmaları tetiklemiştir. Birçok çalışmada farklı sekonder metabolitlerin antioksidan, antimikrobiyal, antiviral, antikanser ve yaşlanmayı geciktirici gibi farklı biyolojik aktiviteler gösterdiği ortaya koyulmuştur.
Çok sayıdaki fizyolojik ve biyokimyasal süreçlerde insan vücudunda genellikle oksijen içeren serbest radikaller ve diğer reaktif oksijen türleri oluşmaktadır. Serbest radikallerin aşırı miktarda üretimi biyomoleküllerde (lipid, protein, DNA) oksidatif hasar meydana getirebilmektedir ve sonuçta ateroskleroz, kanser, diabet, yaşlanma gibi kronik hastalıklara ve diğer dejeneratif hastalıklara neden olmaktadır (Halliwell 1994). Bununla birlikte organizmada bu bileşikleri etkisiz hale getirebilecek çeşitli koruyucu mekanizmalar mevcuttur. Eğer bu mekanizmalar düzenli bir şekilde çalışmazsa besinsel kaynaklı antioksidanların alımı büyük önem kazanmaktadır. Bitkiler serbest radikal yakalayan ve bu şekilde serbest radikalleri etkisiz hale getiren fenolik bileşikler, azotlu bileşikler, vitaminler,
3
terpenler ve bazı iç metabolitler gibi güçlü antioksidan aktiviteye sahip çeşitli bileşikleri içermektedir (Velioğlu ve diğ. 1998). Bitkilerde fazla miktarda bulunan sekonder metabolitlerden olan fenolik bileşikler, antimikrobiyal ve antioksidatif etki göstermeleriyle öne çıkmaktadırlar.
Mikroorganizmaların sebep oldukları çeşitli hastalıkların tedavisi için insanlar genellikle antimikrobiyal etkili ilaçlar kullanmaktadır. Ancak bu ilaçlara karşı mikroorganizmaların direnç kazanması bu ilaçların kullanımını kısıtlamaktadır.
Geçen yüzyıl içerisinde mikroorganizmaların antibiyotiklere karşı gösterdiği direnç mekanizmalarından dolayı antimikrobiyal etkili bitkisel ürünlerin önemi artmıştır (Martin-Bettolo 1980). Bitki özütleri ve uçucu yağlar antimikrobiyal bileşiklerin doğal kaynağını oluşturmaktadır (Tepe ve diğ. 2004). Antimikrobiyal etkili sekonder metabolitler, yiyeceklerde oluşan mikroorganizmaların gelişimini önleyebilmektedirler. Dolayısıyla yiyeceklerin raf ömrü uzamaktadır.
Fitokimyasallar içerisinde önemli antimikrobiyal aktivite gösteren gruplar;
alkaloidler, flavonoidler, tanenler, kumarinler, terpenler ve fenilpropenlerdir (Burt 2004).
Kanser, günümüzde ciddi bir sağlık problemidir. Kanserin tanılanması, engelleme çabaları ve tedavideki modern ilerlemelere rağmen bu hastalık dünya çapında milyonlarca insanı etkileyerek, hastaların yaşam kalitesini düşürmekte ve ölümlere neden olmaktadır. Epidemiyolojik verilere göre kanserin görülme sıklığı çevreden (kirlilik, kimyasal maddeler, X ve UV ışınları gibi), yaşama biçiminden (sigara ve alkol alışkanlığı gibi) ve beslenme şeklinden (antioksidan faktörlerin, vitaminlerin, lifli veya yağlı yiyeceklerin varlığı veya yokluğu gibi) etkilenmektedir (Bahçeci 1999). Kanser ilaçlarının çoğu etkilerini kanser hücresinin proliferasyon ve bölünme fazlarını etkileyerek göstermektedirler. Bazı kemoterapi ajanları bazı spesifik kanser hücrelerine etkiliyken, diğer kanser hücrelerinde etkileri sınırlı olabilmektedir. Bu nedenle farklı sitotoksik maddelerin, farklı hücrelerdeki etkilerinin tam olarak aydınlatılması oldukça önemlidir. Sentetik ilaçların yol açtığı ciddi yan etkiler de düşünülürse kanser tedavisinde kullanılmak üzere, doğal kaynakların incelenerek yeni bileşiklerin belirlenmesi önemli ve gereklidir.
Yapılan birçok çalışmada bitki ekstraktlarının potansiyel sitotoksik aktivitesi Brine Shrimp (Artemia salina L.) Letalite testi ile belirlenmektedir (Oturgan 2007, Pourfraidon ve Sharma 2009, Sökmen 2001). Brine Shrimp testi bitkilerin biyolojik
4
aktivitelerinin belirlenmesi ve sonrasında geleneksel tıpta kullanılıp kullanılamayacaklarının belirlenmesi çalışmalarında başlangıçta kullanılması uygun olan, ön değerlendirme için çok güzel veriler sunan bir yöntemdir.
1.1 Çalışmanın Amacı ve Önemi
Brassicaceae familyası üzerinde günümüze kadar yapılan fitokimyasal araştırmalar, bu bitkilerin kükürt (S) ve azot (N) içeren bitkisel sekonder metabolitler olan glukosinolatlarca ve fenolik bileşiklerce zengin olduğunu göstermiştir.
Glukosinolatlar, özellikle kanser tedavisinde veya oluşmasının önlenmesinde etkili olabilecekleri düşünülen ve üzerlerinde halen çalışmaların devam ettiği önemli bileşiklerdir. Ülkemizde yayılış gösteren Alyssum L. cinsinin oldukça fazla türle temsil edilmesi ve bunların büyük çoğunluğunun endemik olması nedeniyle bu cinsin türlerinin biyolojik aktivitelerinin incelenmesi ve aktif bileşenlerinin belirlenmesi büyük önem taşımaktadır. Halk arasında çeşitli hastalıkların (idrar söktürücü olarak, ödem hastalığında, mesane taşlarının düşürülmesinde, spazm ve ağrıların giderilmesinde ve hemoroid tedavisinde) tedavisinde kullanılan çeşitli Alyssum türleri bulunmaktadır. Ayrıca Alyssum cinsinin bazı türlerinin nikel hiperakümülatörü olması sebebiyle ekolojik değeri olan bir bitki grubudur.
Literatürde Alyssum türlerinin antioksidan, antibakteriyel, antiproliferatif özellikleri üzerinde yapılmış çok az çalışma mevcuttur. Tez çalışması için belirlenen taksonlarla ilgili ise bu konuda bir çalışmaya rastlanmamıştır. Bu bağlamda çalışılması planlanan, ikisi endemik (A. virgatum, A. discolor) olmak üzere toplam on Alyssum L. taksonuna (A. foliosum var. megalocarpum, A. fulvescens var.
fulvescens, A. simplex, A. murale var. murale, A. strigosum subsp. strigosum, A.
corsicum, A. virgatum, A. cypricum, A. sibiricum, A. discolor) ait ekstraktların antioksidan kapasiteleri, antibakteriyel özellikleri, kanser hücreleri üzerinde antiproliferatif etkileri ve potansiyel sitotoksik etkilerinin araştırılması ve elde edilen ekstraktların aktif bileşenlerinin karakterizasyonu amaçlanmaktadır.
5
1.2 Brassicaceae Familyası ve Alyssum L. Cinsi
Brassicaceae familyası (=Cruciferae) daha çok kuzey yarımkürede, nadiren tropiklerde yayılmış 350 cins ve yaklaşık 4000 tür içermekte olup, ülkemizde ise 85 cins ve 515 tür ile doğal yayılış göstermektedir. Genellikle tek ya da çok yıllık otsu bitkiler, bir kaçı çalı ya da yarı çalı şeklinde olan bitkilerdir. Familyanın bazı üyeleri sebze ve yem bitkisi olarak, bazıları tohumlarından yağ elde etmek amacıyla, bir kısmı ise süs bitkisi olarak kullanılan, ekonomik bakımdan değerli bitkilerdir (Kürşat 1999). Brassicaceae familyası Crambe, Sinapis, Thlaspi, Alyssum ve Brassica başta olmak üzere pek çok cinsi barındırmaktadır (Cartea ve diğ. 2010). Familya üyeleri;
antioksidan, antibakteriyal ve antikanser özellikleri ile ilgili olarak glukozinolatlar, fenolik asitler, flavonoidler ve vitaminler gibi çeşitli biyolojik aktif bileşikler bakımından zengindir (Vaughn ve Berhow 2005). Glukozinolatlar, sülfür ve nitrojen içeren bitki sekonder metabolitleri arasındadır ve çeşitli kanser türlerinde tümör oluşumunu inhibe etme özellikleri vardır. Antioksidan ve antimikrobiyal özellikleri olan fenolik bileşikler de bu familyada oldukça yaygın olarak bulunurlar (Kim ve Milner 2005).
Birçok Brassicaceae türü, geleneksel tıpta yılan ısırmalarını tedavi etmeleriyle bilinmektedir. Ayrıca, safra kesesi sancılarının rahatlatılmasında ve yaraların iyileştirilmesinde antimikrobiyal ajan olarak kullanılmaktadır. Kimyasal karsinojenlerin detoksifikasyonunu arttırıcı etkilerinin yanında bazı türler hipoglisemik ve hipotansiyon etkilere sahiptir (Hall ve diğ. 2002, Nawal ve diğ.
2009).
Alyssum L. cinsi, dünyada 230’a varan tür sayısı ile bilinen en büyük cinsler arasındadır ve başlıca yayılış alanı Doğu Avrupa ve Türkiye’dir (AL-Shehbaze ve Beilstein 2006). Ülkemizde bu cins, Türkiye Florası’nın da büyük cinsleri arasında yer almakta ve 90 türle temsil edilmektedir. Bu türlerin 54’ü endemik olup, bunların da yaklaşık üçte biri, tehlike altında ve korunmaya muhtaç türlerdir (Babaoğlu ve diğ. 2004). Yapılan son revizyonlarla birlikte bu cinsin yaklaşık 110 taksona sahip olduğu tespit edilmiştir (Güner ve diğ. 2012). Alyssum cinsinin genel botanik özellikleri şu şekilde özetlenebilir: Tek, iki veya çok yıllık bitkilerdir. Çok yıllık ise daima verimsiz sürgün ve kış rozetleri vardır. Verimli sürgünler çok yapraklıdır.
Yapraklar basit, bütündür. Çiçek durumu rasem, korimboz, panikula veya
6
umbellattır. Petaller 4 tane; genellikle sarı, obovat-spatulat, bütün lobludur.
Stamenler 6 tane; uzun filamentler 4, unilateral veya bilateral kanatlıdır. Kısa filamentler 2 tane; kanatlı veya kanatsızdır. Silikula geniş septalı, açılan veya nadiren açılmayan tüysüz veya tüylüdür. Tohumlar kanatlı veya kanatsız, sıklıkla müsilajımsıdır (Davis 1984). Oldukça fazla varyasyon gösteren Alyssum türleri, özellikle Odontarrhena (Meyer) Hooker seksiyonunda, serpantin bölgelerde, ultramafik (volkanik) kaya ve topraklarda yetişmektedir (Davis 1965).
Alyssum ismi Yunan kökenlidir; a olumsuzluk, lyssa ise hidrofobi, kudurma, delilik anlamındadır. Alyssum, ismi gereğince deli otu (madwort) şeklinde şifalı bir bitki olarak tanına gelmiştir. Yaprak ve çiçeklerinden hazırlanan infüzyon, kuduz köpek ısırdığında panzehir olarak kullanılmaktadır. Bazı kaynaklar bu bitkinin çay olarak; sakinleştirici, sinirleri yatıştırıcı özelliğinden dolayı kullanılmasını önermektedir (Dudley 1966). Shimer (1943), Alyssum’un Yunanlılar tarafından hıçkırığın tedavisinde kullanıldığını belirtmektedir. Alyssum cinsinin farklı türleri Anadolu’da faklı isimlerle (kuduz otu, deli otu, saman çiçeği, kevke, bal çiçeği, altın sepeti, sarıbenek vs) anılmaktadır. Alyssum’un çeşitli türleri halk hekimliğinde;
balgam söktürücü, yatıştırıcı olarak, karın ağrısı, diş ağrılarında, böbrek taşlarına karşı, idrar söktürücü, yaraların tedavisinde ve öksürüğü kesmesi amaçlı kullanılmaktadır (Saber Amoli ve diğ. 2000, Souri ve diğ. 2008, Savo ve diğ. 2011, Raimondo ve Lentini 1990, Mart 2006, Güngör 2013).
Genel olarak Alyssum türleri gerek kuraklığa dayanıklı olmaları, gerekse toprak istekleri bakımından çok seçici olmadıklarından özellikle çok yıllık olanları erozyon çalışmalarında öncü bitki olarak kullanılma potansiyeline sahiptir. Bazı Alyssum türlerinin kültürü yapılmış olup, park ve bahçelerde süs bitkisi olarak kullanılmaktadır (Orcan 1993). Bunlar genellikle bodur ve erken çiçek açan, bordür veya kaya bahçeleri için elverişli olan bitkilerdir. Alyssum L. cinsinin bazı türleri nikel metalini kuru yaprak biyokütlesinin %3’üne varan derişimlerde biriktirme özelliğine sahip hiperakümülatör türlerdir. Bu özellik, bazı Alyssum türlerinin fitoremediasyonda kullanımına olanak sağlamaktadır (Aydın 2011, Singer ve diğ.
2007, Robinson ve diğ. 1997).
7 1.3 Bitkisel Sekonder Metabolitler
Bitkiler ve onlar gibi bağlı yaşayan diğer organizmaların tipik özellikleri, düşman saldırısına maruz kaldıklarında kaçamamalarından ya da patojenlere karşı bir immün sistemleri bulunmamasından dolayı, büyük çeşitlilikte düşük moleküler ağırlıklı bileşikler (sekonder metabolitler ya da naturel ürünler) sentezleyebilme kapasiteleridir. Sekonder metabolitler, bitkiler tarafından üretilen ve günümüzde birçok sektörde ham madde olarak kullanılan, bitkinin temel yaşamsal işlevleri ile doğrudan ilişkisi olmayan bileşenlerdir. Sekonder metabolitler keşfedildiklerinde herhangi bir işlevinin olmadığı ve bitkiler tarafından üretilen atık maddeler olduğu düşünülmüştür. Ancak daha sonraları bu maddelerin bitkilerde; savunma, korunma, ortama uyum, hayatta kalma ve neslin devamı için oldukça karmaşık mekanizmaların ürünleri olduğu anlaşılmıştır. Sekonder metabolizmanın biyokimyası ve fizyolojik özellikleri fonksiyonları ile yakından ilgilidir (Mammadov 2014).
Sekonder metabolitlerin tipik özellikleri, yüksek konsantrasyonlarda kompleks karışımlar şeklinde, bazen de bunları üretmeyen organlarda depolanmalarıdır. Bazı sekonder metabolitler, aktif olmayan “öncül ilaçlar” şeklinde depolanır ve bunlar bir tehlike anında (yanma, enfeksiyon) enzimatik olarak aktive edilirler. Birçok sekonder metabolit, proteinlerle, DNA/RNA ve/veya biyomembranlarla etkileşime girer. Bu etkileşimlerin bazıları moleküler hedefleri açısından oldukça spesifikken, bazıları değişken özelliklere sahiptirler (Taiz ve Zeiger 2010). Primer metabolitlerin sayısı, insanlarda 2000 iken bitkilerde ise 5000- 25.000 arasındadır. Bilinen bitki sekonder metabolitleri ise yaklaşık 100.000 civarındadır (Hegeman 2010).
Bitkisel kökenli sekonder metabolitler; terpenler, fenolik bileşikler ve azotlu bileşikler olmak üzere üç ana gruba ayrılabilirler (Tablo 1.1) Bu gruplar kimyasal olarak birbirlerinden farklı olup, glikoliz, fotosentez ve krebs döngüsü süreci boyunca gerçekleşen metabolik yan basamaklardan üretilmektedir (Şekil 1.1). Primer metabolizmanın ana yolları olan bu süreçlerin ara ürünleri olan asetil CoA, şikimik asit, mevalonik asit ve deoksiksiloz-5-fosfat üzerinden sekonder metabolitler sentezlenmektedir (Dewick 2002).
8
Tablo 1.1: Sekonder metabolitlerin sınıflandırılması (Mammadov 2014’den uyarlanmıştır)
Terpenler Fenolik bileşikler Azot içeren bileşikler
Çeşitleri Örnek Çeşitleri Örnek Çeşitleri Örnek
Hemiterpenler Prenol Hidroksibenzoik asitler
Gallik asit
Heterosiklik
alkaloidler Nikotin Monoterpenler Limonen Hidroksisinamik
asitler
Ferulik asit
Non- heterosiklik alkaloidler
Efedrin
Seskiterpenler Absisik asit Fenilpropanoidler Kumarin Psödo
alkaloidler Solanidin Diterpenler Taksol Naftokinonlar Juglon Siyanojenik
glikozitler
Hidrojen siyanid Triterpenler Digitogenin Antrasenler Antranol Glukozinolatlar Sinigrin Tetraterpenler Karoten Flavonlar Apigenin Non-protein
a.asitler Mimozin Meroterpenler Klorofil Flavonoller Kuersetin
Politerpenler Kauçuk İzoflavonlar Genistein Antosiyaninler Petunidin
Şekil 1.1: Sekonder metabolit biyosentezinin başlıca yolakları (Taiz ve Zeiger 2010’dan uyarlanmıştır, syf: 371)
9
1.4 Serbest Radikaller
Serbest radikaller son yörüngelerinde ortaklanmamış elektron çifti içeren atom ya da moleküllerdir. Kararlı bir yapıda olmayan, oldukça reaktif olan serbest radikaller, diğer bazı maddelerle kolayca reaksiyona girerek, toksik etkisi yüksek yeni bileşikler meydana getirebilirler. Serbest radikaller genel olarak (R•) simgesi ile gösterilir ve en sık rastlanan türleri, süperoksit anyonu (O•), hidroksil radikali (OH•), peroksit radikali (OOH•), azot oksit radikali (NO•)’dir. Canlı organizmalarda serbest radikallerin büyük çoğunluğunu serbest oksijen radikalleri oluşturur. Serbest oksijen radikalleri özellikle oksijenli solunum sırasında elektronların son elektron alıcısı olan oksijene taşınması sırasında meydana gelir. Oksijen tam olarak indirgendiğinde meydana gelen son ürün sudur. Ancak oksijen tam olarak indirgenemez ise serbest oksijen radikalleri meydana gelir. Oksijen molekülünün bir elektron alarak indirgenmesi ile süperoksit, iki elektron alarak indirgenmesi ile hidrojen peroksit, üç elektron alarak indirgenmesi ile hidroksil radikali oluşur (Winston 1991).
Serbest radikallerin oluşumu oksidasyon süreci gibi endojen kaynaklı olabileceği gibi başlıca sigara, alkol, çevresel kirlenme, ozon ve ilaçlar gibi ekzojen kaynaklı da olabilir. Serbest radikallerin aşırı üretimi sonucu oksidatif stres denilen durum ortaya çıkmaktadır. Oksidatif stres DNA, lipoproteinler, lipidler ve proteinler gibi hücre membranı ve diğer yapılarda görev alan yapısal moleküller üzerinde değişikliklere ve ciddi zararlara neden olabilmektedir (Willcox ve diğ. 2004, Pacher ve diğ. 2007). Oksidatif stresin yaşlanmanın yanı sıra kanser, kardiyovasküler hastalıklar, nörolojik hastalıklar, pulmoner hastalıklar, romatoid artrit, renal rahatsızlıklar, göz rahatsızlıkları gibi pek çok hastalıkla ilişkisi bulunmaktadır.
1.5 Antioksidanlar
Çeşitli kaynaklardan gelen serbest radikallere maruz kalmak organizmanın bir dizi savunma mekanizması geliştirmesine neden olmuştur. Serbest radikaller ve onların neden olduğu oksidatif strese karşı geliştirilen antioksidan savunma
10
mekanizmaları oldukça önemlidir. Antioksidanlar serbest radikalleri nötralize ederek oksitlenebilir substratların oksidasyonunu engelleyen veya geciktiren moleküllerdir (Antolovich ve diğ. 2002). Antioksidanların önemli bir kısmı mikroorganizmalar, mantarlar, bitkiler ve organizmanın kendisi gibi canlı sistemler tarafından doğal olarak sentezlenmektedir. Bunlar doğal antioksidanlar olarak adlandırılmaktadır ve tercih edilen antioksidan kaynakları olarak kabul edilmektedirler (Pokorný 2007).
Doğal antioksidanlar enzimatik ve enzimatik olmayan antioksidanlar olarak iki gruba ayrılabilir. Önemli enzimatik antioksidanlar süperoksit dismutaz (SOD), glutatyon peroksidaz (GPx) ve katalazdır (CAT). Enzimatik antioksidanlar organizmanın kendini korumak amacıyla ürettiği ve biyokimyasal süreçlerde üretilen serbest radikallerin zararlı etkilerinden korunma mekanizmasıdır. Normal şartlar altında, bu antioksidanların aktiviteleri ve hücre içi seviyeleri arasında bir denge vardır. Bu denge organizmanın hayatta kalabilmesi için esastır (Valko ve diğ. 2007). Enzimatik olmayan antioksidanlar ise askorbik asit (C vitamini), α tokoferol (E vitamini), glutatyon (GSH), karotenoidler ve flavonoidlerdir (Larson 1988). Diyetle alınan antioksidanlar, oksidatif stresin etkilerinin ortadan kaldırılmasında endojen kaynaklı antioksidanlara yardımcı olmaktadırlar. Antioksidanların diğer üretim yolu ise bunların endüstriyel olarak sentezlenmesidir. Bu şekilde üretilen antioksidanlar sentetik antioksidanlardır. Doğal antioksidanların tersine sentetik antioksidanların insan sağlığı açısından güvenilirliği tartışmalıdır (Jadhav ve diğ. 1996). Sentetik antioksidanlar özellikle hazır gıdalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Bunun temel nedeni deodorizasyon veya kızartma gibi sıcaklık uygulamaları ve uzun depolama şartları altında gıdalarda lipid oksidasyonu sonucunda serbest radikal oluşumunun önlenmesi ve beslenmeyle alınan gıdalar aracılığıyla organizmada oluşabilecek serbest radikal düzeyini düşürerek ortaya çıkabilecek hastalıklara karşı korumaktır (Pokorný 2007). Sentetik antioksidanlardan en önemlileri BHA (bütillenmiş hidroksianisol), BHT (bütillenmiş hidroksitoluen), TBHQ (tersiyerbutil hidrokinon) ve PG (propilgallat)’dır. Ancak günümüzde sentetik antioksidanların bazı toksik etkilere sahip olduğunun belirlenmesi sonucu doğal antioksidanlara olan ilgi giderek artmaktadır (Jadhav ve diğ. 1996).
Bitkiler doğal antioksidan bileşiklerin esas kaynağını oluşturmaktadır.
Yapılan çalışmalar bitki ekstraklarının antioksidan kapasitelerinin sentetik antioksidanlardan daha güçlü olduğunu ortaya koymuştur (Bandoniene ve diğ. 2002).
11
Antioksidanların alımında fenolik ve flavonoid içeriği yüksek olan bitkisel ürünlerin tüketilmesi tavsiye edilmektedir. Pek çok bitkisel ürün kuru madde ağırlığının %0.5- 5 düzeyinde fenolik bileşik içerdiğinden bunların iyi birer antioksidan kaynağı olduğu söylenebilir (Chung ve diğ. 1998). Fenolik maddeler yapılarında hidroksil grubu içeren en az bir aromatik halka ile buna bağlı bir veya daha fazla hidroksil grubuyla karakterizedir. Fenoller; basit fenoller, benzoik asit, fenilopropanoidler ve flavonoidler gibi farklı gruplara ayrılabilmektedir (Solecka 1997, Chaudiere ve Ferrari-Iliou 1999). Fenolik bileşikler yüksek metal şelatlama eğilimine sahiptir.
Yapılarında bulunan hidroksil ve karboksil grupları özellikle demir ve bakır iyonları bağlama kabiliyetine sahiptir (Jung ve diğ. 2003). Bu şekilde demir iyonlarını inaktive ederek reaktif oksijen türlerinin en önemli kaynağı olduğu düşünülen Fenton reaksiyonu aracılığıyla süperoksit oluşumunu durdurabilmektedirler (Rice-Evans ve diğ. 1996).
Antioksidanların etki mekanizmaları şunlardır:
1. Reaktif oksijen türlerinin enzimatik reaksiyonlar aracılığıyla veya doğrudan temizlenmesi,
2. Reaktif oksijen türlerinin oluşumunun baskılama yoluyla engellenmesi,
3. Metal iyonlarının bağlanması ve böylece radikal oluşum reaksiyonlarının engellenmesi,
4. Serbest radikallerin bağlandığı organik moleküllerin hasar sonrası tamiri ve temizlemesi.
Bitkiler doğal antioksidanlar açısından oldukça zengin kaynaklardır. Özellikle fenolik bileşikler, bu yeteneklerinden dolayı ön plana çıkmaktadır (Shahidi ve Naczk 1995).
1.5.1 Fenolik Bileşikler
Bütün bitki metabolizmalarında, sekonder metabolit olarak bulunan ve bitkilerin kendilerini bazı zararlılara karşı korumada rolleri olduğu sanılan çok sayıda farklı nitelik ve miktarlarda çeşitli fenolik bileşikler bulunmaktadır (Saldamlı 2007).
Fenolik bileşenler yapısında, aromatik halkanın karbon atomları ile birleşmiş olan
12
bir veya birkaç adet hidroksil grubu bulunduran, doğal bileşenlerdir. Aromatik halkaya bağlı olan hidroksil grubu sayısı bir ise bu madde fenol, iki ve daha çok sayıda ise polifenol olarak adlandırılmıştır. Ubikinon, adrenalin, tiroksin, serotonin vb. gibi fenolik bileşenler canlı dokularda çok önemli fonksiyonlar yerine getirmektedirler. Genelde insan ve hayvan dokularında benzol halkası sentezlenemez ve yalnız hazır gıdalarla alınır. Fenolik bileşikler, fenolik asitler ve flavonoidler olmak üzere iki gruba ayrılırlar (Mammadov 2014).
Günümüzde binlerce fenolik bileşiğin yapısı tanımlanmıştır (Kafkas ve diğ.
2006). Bunlara devamlı olarak bulunan ve yeni tanımlanan fenolikler eklenmektedir (Cemeroğlu 2004). Fenolik bileşikler bitkilerin meyve, sebze, tohum, çiçek, yaprak, dal ve gövdelerinde bulunabilirler (Coşkun 2006, Aydın ve Stün 2007). Flavonoidler, bitkisel çayların, meyve ve sebzelerin doğal yapılarında bulunan polifenolik antioksidanlardır. Fenolik bileşiklerin bir kısmı meyve ve sebzelerin lezzetinin oluşmasında, özellikle ağızda acılık ve burukluk gibi iki önemli tat unsurunun oluşmasında etkilidirler. Bir kısmı ise meyve ve sebzelerin sarı, sarı-esmer, kırmızı- mavi tonlardaki renklerinin oluşmasını sağlamaktadırlar. (Zor 2007, Güngör 2007).
Meyveler, özellikle içerdikleri fenolik bileşiklerin antioksidatif ve antimikrobiyal etkilerine bağlı olarak sağlık üzerine olumlu etkilerinden dolayı fonksiyonel gıda olarak değerlendirilmektedir (Pehluvan ve Güleryüz 2004). Fenolik bileşiklere, beslenme fizyolojisi açısından olumlu etkileri nedeniyle "biyoflavonoid" adı da verilmektedir. Bazı kaynaklarda P faktörü (permeabilite faktörü) veya P vitamini olarak da adlandırılmaktadırlar (Saldamlı 2007, Cemeroğlu 2004).
1.5.1.1 Fenolik Asitler
Hidroksi benzoik ve hidroksisinnamik asitler olarak iki gruba ayrılırlar.
Hidroksibenzoik asitler C6-C1 fenilmetan yapısında olup, bitkisel gıdalarda genelde iz miktarda bulunurlar. Bunlar salisilik asit, m-hidroksibenzoik asit, gallik asit, vanilik asitler gibi asitlerdir. Hidroksisinnamik asitler ise C6-C3 fenilpropan yapısındadırlar. Fenilpropan halkasına bağlanan OH grubunun konumu ve yapısına göre farklı özellik gösterirler. Çok yaygın bulunanları; kafeik asit, ferulik asit, p- kumarik asit ve o-kumarik asitlerdir. Bitkilerde büyük bir kısmı organik asitler ve şekerlerle esterleşmiş halde bulunan fenolik asitlerin (Saldamlı 2007, Balasundram
13
ve diğ. 2006) kimyasal yapıları Şekil 1.2’de görülmektedir.
Şekil 1.2: Fenolik asitlerin genel yapısı: a) Benzoik asit türevleri b) Sinnamik asit türevleri (Shahidi ve Naczk 1995).
1.5.1.2 Flavonoidler
Flavonoidlerin karbon iskeleti, iki fenil halkasının propan zinciri ile birleşmesinden oluşan ve 15 karbon atomu içeren, difenilpropan (C6-C3-C6) yapısındadır. Flavonoidlerin yapısındaki OH grupları, reaktif özelliklerinden dolayı kolaylıkla glikozitlenir (Bilaloğlu ve Harmandar 1999). Flavan türevleri olan flavonoidlerin genel yapısı ve alt grupları Şekil 1.3’de görülmektedir.
Flavonidler bitkiler aleminde geniş bir dağılıma sahip olup oldukça önemli fenolik bileşiklerdir. Kimyasal olarak flavonoidlerin güçlü antioksidan özellikleri üç özellikten kaynaklanır; aromatik halka yapılarındaki hidroksil grupları sayesinde hidrojen vererek redoks reaksiyonlarına girebilirler. Bu sayede serbest radikalleri yok edebilirler. Aromatik heterosiklik ve çoklu doymamış bağlardan oluşan yapılarıyla dayanıklı bir kimyasal yapı oluştururlar. Metal şelatlama kapasitesine sahip yapısal grupları vasıtasıyla hidroksil ve süperoksit radikalleri gibi reaktif oksijen türlerinin oluşumunu engelleyebilirler (Cam ve Hışıl 2003). Yapılan çalışmalarda fenolik
14
bileşiklerin lipid peroksidasyonunu önemli ölçüde kısıtladığı belirtilmektedir. Düşük yoğunluklu lipoprotein (LDL), plazmadan arterlere girerek oksidatif strese bağlı lokal olarak okside olmaktadır. Çeşitli antioksidanlar özellikle LDL oksidasyonunu engelleyerek kalp krizine yakalanma ve ölüm riskinin azaltılmasında görev almaktadır. Yapılan çalışmalarda sebze ve meyvelerin tüketimi ile koroner kalp rahatsızlıklarının ters orantılı olduğu belirtilmiştir ve bu durumunun bitkilerde bulunan antioksidan vitaminler ile diğer antioksidan maddelerden kaynaklandığı belirtilmektedir (Artajo ve diğ. 2006).
Şekil 1.3: Flavonoidlerin genel yapısı ve alt grupları (web 1)
15
1.6 Antioksidan Aktivite Tayin Yöntemleri
Bitkilerin antioksidan kapasitelerinin belirlenmesine yönelik çalışmalarda çeşitli yöntemler kullanılmaktadır. Antioksidan kapasite için çok sayıda metot olmasına rağmen kullanışlı ve antioksidan kapasiteyi tümüyle yansıtan standart bir metot henüz geliştirilememiştir. Bitkilerde antioksidan kapasite, test sisteminin şartları ve ekstraktların komposizyonu gibi birçok faktöre bağlı olarak değişiklik göstermektedir. Araştırıcılar bu yüzden bitkilerin antioksidan kapasitelerinin belirlenmesi çalışmalarında tek bir metotun antioksidan kapasiteyi tümüyle yansıtmadığını ve birkaç farklı antioksidan kapasite tayin metodu kullanarak bu durumun doğrulanması gerektiğini belirtmektedirler (Wong ve diğ. 2006).
Günümüzde kullanılan antioksidan kapasite tayin testleri genellikle serbest radikalleri içermektedir. Kullanılan serbest radikalin özelliğine bağlı olarak farklı sonuçlar elde edilebilmektedir (Prakash 2001). Antioksidan kapasite tayin testleri genel olarak elektron transferine dayalı testler ile hidrojen atomu transferine dayalı testler olarak gruplandırılır. Elektron transferine dayalı testler antioksidan ile oksidanın reaksiyonunda oksidanın indirgenmesi sonucu oluşan renk değişimi esasına dayanır. Elektron transferine dayalı testlere Folin-Ciocalteu ve DPPH yöntemleri örnek olarak verilebilir ve bu testlerin esası aşağıdaki reaksiyonda özetlenebilir:
Hidrojen transferine dayalı testlerde ölçüm, antioksidanların hidrojen atomu vererek serbest radikalleri yakalama aktivitesine dayanmaktadır. Bu testlerin mekanizması ise peroksit radikallerinin antioksidan ve substrat arasında kompetitif bir reaksiyon göstermesi şeklindedir ve şu şekilde özetlenebilir:
β-karoten/linoleik asit emülsiyon yöntemi, hidrojen transferine dayalı testlere örnektir (Apak ve diğ. 2007).
16
1.6.1 β-karoten/Linoleik Asit Emülsiyon Sistemi
β-karoten/linoleik asit sistemi yüksek sıcaklıkta linoleik asitin oksidasyonu sırasında meydana gelen peroksit radikallerinin β-karoten molekülünde renk açılımına neden olması durumuna dayanır (Taga ve diğ. 1984). Ölçümler sonucunda linoleik asidin oksidayonunu inhibe etme oranının yüksek olması bu numunenin güçlü bir antioksidan kapasiteye sahip olduğunu gösterir. β-karoten/linoleik asit sistemi esas olarak hidrojen transferine dayanan antioksidan kapasite testlerinden biri olup çözücü ve pH’dan etkilenmeden oldukça kısa sürede gerçekleşmektedir (Apak ve diğ. 2007).
1.6.2 Toplam Antioksidan Kapasite Testi (Fosfomolibdat Yöntemi)
Bu metot aynı zamanda fosfomolibdat yöntemi olarak da isimlendirilir.
Metodun esası fenolik bileşiklerin asidik ortamda Molibden (VI)’yı Molibden (V)’e indirgemesi ve bunu takiben oluşan yeşil renkli fosfat/Mo(V) kompleksinin oluşmasına dayanmaktadır. Oluşan bu kompleks 695 nm’de maksimum absorbans göstermektedir. Bu testin sonuçları antioksidan etkinliği bilinen maddelere eşdeğer olarak (mg/g) verilmektedir. Bu amaçla özellikle askorbik asit ve α-tokoferol kullanılmaktadır. Bu metot özellikle basitliği ve kullanılan reaktiflerin ucuzluğundan dolayı total antioksidan kapasitenin tayininde alternatif bir metot olarak kullanılmaktadır (Prieto ve diğ. 1999).
1.6.3 DPPH Yöntemi
DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil) azot köprüsünde eşleşmemiş bir elektron taşıyan stabil bir serbest radikaldir (Eklund ve diğ. 2005). Bu test sisteminde, mor renkli olan DPPH antioksidan veya indirgeyici bir bileşik tarafından indirgenerek sarı renkli difenilpikrilhidrazine dönüşür (Şekil 1.4). Antioksidanların bu indirgeme kapasiteleri 515-528 nm aralığında absorbansdaki azalmayla gözlenir (Brand- Williams ve diğ. 1995). Metot özellikle basitliği, hızlı olması ve spektrofotometre dışında spesifik bir araç gerektirmemesi nedeniyle antioksidan kapasite tayin çalışmalarında en sık kullanılan yöntemlerdendir (Fukumoto ve Mazza 2000).
17
Bununla birlikte metodun bazı eksik yönleri rapor edilmiştir. Bunlardan biri DPPH’in organik çözücülerle özellikle de alkolik solüsyonlarda çözülmesi buna karşılık sulu sistemlerde çözülmemesidir (Huang ve diğ. 2005). Bu durum özellikle hidrofilik antioksidanların yorumlanmasına sınırlamalar getirmektedir. Ayrıca kullanılan radikalin biyolojik bir radikal olmaması oksijen ve azot radikallerinin süpürme yeteneğini bire bir yansıtmamaktadır. Metodun sonuçları genellikle IC50
olarak nitelendirilen serbest radikalin yarısını süpüren konsantrasyon belirlenerek yorumlanmaktadır. IC50 değerinin düşüklüğü radikal süpürme etkinliğinin yüksekliğini gösterir (Brand-Williams ve diğ. 1995).
2,2-difenil-1-pikrilhidrazil 2,2-difenil-1-pikrilhidrazin (DPPH•) (DPPH-H)
Şekil 1.4: DPPH’ın antioksidan madde ile reaksiyonu (web 2)
1.6.4 Demir İyonu İndirgeme Gücü
Antioksidan kapasite tayininde kullanılan diğer bir metot olan indirgeme gücünde yüksek absorbans yüksek indirgeme potansiyelini göstermektedir. Metot, asidik ortamda antioksidan fenolik bileşiklerin [K3Fe(CN)6] içindeki Fe (III)’ün Fe(II)’ye indirgenmesine dayanmaktadır. İndirgeme reaksiyonu sonucu oluşan Prusya mavisi renkli kompleks 700 nm’de maksimum absorbans göstermektedir. Antioksidan maddelerin etkinliğine bağlı olarak Prusya mavisi renk yeşil ile mavi arasında değişmektedir. Absorbansın artması indirgeme gücünün yüksekliğini gösterir (Mathew ve Abraham 2006).
18 1.6.5 Metal Şelatlama Gücü
Demir ve bakır gibi geçiş metal iyonları, canlı sistemde serbest radikal oluşturan güçlü birer oksidatif katalist olarak görev yapmaktadırlar. Biyolojik sistemlerde oksijen taşınması, ATP üretimi, DNA ve klorofil sentezinde önemli role sahip olan demirin serbest formları canlı hücrelerde toksik etki yapabilmektedir (Miller 1996). Bu toksisite sonucunda oluşan aktif oksijen türleri lipid oksidasyonunu teşvik edebilmekte veya DNA moleküllerine saldırabilmektedir. Şelat oluşumu antioksidan savunma sistemine önemli katkıda bulunmakla birlikte, vücutta travma, toksinler, hastalık gibi çeşitli nedenlerle oksidatif reaksiyonları katalizleyebilen serbest metal iyon formlarına dönüşümler de gerçekleşebilmektedir (Lindsay 1996). Katarakt, aterosklerosiz, diyabet gibi patolojik koşullar altında metal iyonlarının serbest ve zararlı formlarda bulunduğuna dair güçlü kanıtlar bulunmaktadır (Lavelli ve diğ. 2000). Metal iyonu şelatlama aktivitesi; bitki ekstraktlarının çözeltideki Fe2+ iyonlarını bağlayabilmek için güçlü bir demir şelatlayıcı olan ferrozin reaktifi ile yarışmasına dayanır. Şelatlama gücü yüksek ise kırmızı renkli Fe2+/ferrozin kompleksinin oluşumu engellenir. Fe2+/ferrozin kompleksinin inhibisyon yüzdesi hesaplanarak, bitki ekstraktlarının Fe2+ iyonlarını şelatlama kapasitesi tespit edilir (Dinis ve diğ. 1994).
1.6.6 Toplam Fenolik Madde Tayini (Folin-Ciocalteu Yöntemi)
Bitkilerde bol miktarda bulunan fenolik bileşikler, antioksidan kapasitenin oluşumunda en önemli katkıyı yapan bileşiklerdendir (Apak ve diğ. 2007). Folin- Ciocalteu yöntemi bitkisel ekstraktların toplam fenolik madde içeriğini ortaya koymada en yaygın kullanılan yöntemlerden birisidir. Metodun esasını suda ve organik çözücülerde çözünmüş olan fenolik bileşiklerin folin reaktifi ile alkali ortamda renkli kompleksler meydana getirmesi oluşturur (Singleton ve Rossi 1965). Metot kolay uygulanabilir ve tekrarlanabilir olması ve diğer metotlarla korelasyon göstermesi gibi avantajlarından dolayı yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak folin reaktifi, sadece fenolik maddeler tarafından değil aynı zamanda fenolik olmayan bazı bileşikler tarafından da indirgenebilmektedir. Bu nedenle bu metot spesifik bir metot olarak kabul edilmemektedir. Bu duruma uygun olarak metotun total fenolik içeriği tümüyle
19
yansıtmadığı belirtilmektedir. Sonuçlar genellikle standart fenolik maddeler olan gallik asit veya kateşine eş değer olarak verilmektedir.
1.6.7 Toplam Flavonoid Madde Tayini
Flavonoidlerin antioksidatif özellikleri serbest radikal üretmekten sorumlu enzimlerin inhibisyonu, demir ve bakır iyonlarının şelatlanması, serbest radikallerin süpürülmesi gibi pek çok farklı mekanizmadan dolayıdır (Benavente-Garcia 1997).
Flavonoidler, ksantin oksidaz ve protein kinaz gibi süperoksit anyonu üretiminden sorumlu enzimleri inhibe etmektedir. Ayrıca bütün reaktif oksijen türlerinin oluşumunda ilgili siklooksigenaz, hipoksigenaz, mikrozomal oksigenaz, glutatyon S- transferaz, mitokondrial süksinoksidaz ve NADH oksidazı da inhibe ettiği gösterilmiştir. Flavonoidler yapılarına bağlı olarak, bilinen bütün reaktif oksijen türlerini süpürme yeteneğindedirler. Birçok flavonoid, oksijen metabolizmasında önemli rol oynayan eser elementlerle şelat oluşturarak onları bloke etmektedir (Rice- Evans ve Miller 1996). Toplam flavonoid içeriğin miktarı Alüminyum klorür (AlCl3) kolorimetrik metodu kullanılarak belirlenebilmektedir. Metodun prensibi, AlCl3’ün flavonlar ve flavonollerin C-4 keto grubu ve C-3 veya C-5 hidroksil grupları ile asitte kararlı kompleksler oluşturması esasına dayanmaktadır. Buna ek olarak, AlCl3, flavonoidlerin A- veya B- halkalarının orto-dihidroksil grupları ile de kompleks oluşturmaktadır. Sonuçlar genellikle standart flavonoid madde olan kuersetine eş değer olarak verilmektedir (Chang ve diğ. 2002).
1.7 Antimikrobiyal Ajanlar ve Etki Mekanizmaları
1920’lerde penisilinin keşfinden bugüne dek pek çok antimikrobiyal ilaç geliştirilmiştir. Antibakteriyel ilaçların temelde 4 farklı etki mekanizması vardır.
Bunlar; hücre duvarı sentezinin inhibisyonu, hücre membran fonksiyonunun inhibisyonu, protein sentezinin inhibisyonu, nükleik asit sentezinin inhibisyonudur.
Hücre duvarı inhibitörleri, bakteri hücre duvarında transpeptidasyonu engelleyerek peptidoglikan sentezini inhibe ederler. Pek çok ilaç bakterilerdeki protein sentezini insan hücrelerindeki protein sentezine zarar vermeden inhibe edebilmektedir. Bu seçicilik; bakterilerdeki ve insanlardaki ribozomal proteinlerin, RNA’nın ve ilgili
20
enzimlerin farklı olmasına bağlıdır. Bakteriler 50S ve 30S alt üniteleri olan 70S ribozomlara sahiptirler. İnsanlarda ise 60S ve 40S alt üniteleri olan 80S ribozomlar bulunur. Antimikrobiyal ajanlar bakteri hücrelerinde 50S veya 30S ribozomal alt ünitelere bağlanarak protein sentezini inhibe ederler ve sonuçta peptid zincirinin uzaması önlenmiş olur. p-aminobenzoik asit (PABA), bakteriyel folik asit sentezinde gerekli olan bir moleküldür. Antimikrobiyal ajanlar folik asit metabolizmasını bozarak pürin ve primidin sentezini engellerler. Sonuçta bakteriyel DNA sentezi bloke olur. Memeli hücrelerinde folik asit sentezi olmadığı için bu ajanlar insan hücrelerinde DNA sentezine etki etmezler. Ayrıca bazı ajanlar DNA’nın süper sarmal oluşturması için gerekli olan DNA giraz enzimini inhibe etmektedirler.
Bazıları ise DNA’ya bağımlı RNA polimeraz enzimi ile kompleks oluşturarak bakterilerde RNA sentezini önlemektedirler. Hücre membran fonksyonunu değiştiren antimikrobiyal ajanlar ise deterjanlara benzer şekilde bakteri hücre membranındaki fosfolipidlerle ilişkiye girerek permeabiliteyi artırırlar ve hücresel bütünlüğü bozarlar. Sonuçta hücre ölümü gerçekleşir (Ustaçelebi 1999).
Antimikrobiyal ilaçlara özellikle de antibiyotiklere karşı enfeksiyöz hastalıklara neden olan mikroorganizmaların direnç kazanması klinik bir problem haline geldikten sonra, insanlar yeniden doğal antimikrobiyallere yönelmişler ve bu konudaki çalışmalar hız kazanmıştır (Oskay ve diğ. 2007). Bilim insanları direnç geliştiren bakterilere karşı koyabilmek için alternatif antibiyotik ajan üretme çalışmalarını hızlı bir şekilde sürdürmektedirler. İn vitro koşullarda yapılmış pek çok çalışmada bitkilerden elde edilen özütlerin ve bu özütlerden saflaştırılan bileşiklerin antimikrobiyal aktivite gösterdiği çok sayıda araştırmacı tarafından rapor edilmiştir (Sibanda ve Okoh 2007).
21
1.8 Brine Shrimp (Artemia salina L.) Letalite Testi
Artemia salina L. Crustacea alt şubesi, Branchiopoda sınıfı, Anostraca takımına bağlı primitif kabuklular arasında yer alan, tuzlu su karidesi (brine shrimp) olarak da adlandırılan, doğada tropik ve ılıman bölgelerde, doğal ve yapay tuz göllerinde yaşayan bir kabuklu türüdür (Şekil 1.5). En fazla üretildiği göllerden birisi ABD'deki “Büyük Tuz Gölü” (Great Salt Lake) ve San Franscisco Körfezi’dir (Treece 2000). Böylesine geniş bir yaşam aralığına sahip olan bu zooplankton, su canlılarının üretilmesinde larva besleme aşamasında oldukça önemli bir yer tutmaktadır (Kocataş 2002). A. salina, özellikle balıkların kültür çalışmalarında 1920’den bu yana canlı yem olarak kullanılmaktadır.
Şekil 1.5: A) Artemia salina L. B) Artemia salina L.’nın hayat döngüsü (web 3)
Genel olarak toksisitesi araştırılacak bir kimyasal maddenin etkileri, hayvanlarda ve birden fazla türde in vivo olarak incelenir. Akut toksisitede mortalite testi, kronik toksisitede ise, dokulardaki patolojik incelemeler yapılır. Toksikolojide akut toksisite deneyleri; ilaç, kozmetik, bitkisel ekstreler, hijyenik maddeler ve çeşitli amaçlarla kullanılan diğer kimyasal maddelerin toksik etkilerini belirlemek için yapılmaktadır. Bir maddenin ne kadar toksik olduğunu yani toksisite derecesini ifade etmek için, akut toksisite letalite birimi olan LD50 (Letal Doz) ifadesi kullanılır. LD50
değerini etkileyen birçok bireysel (deney hayvanı ile ilgili) ve dış faktörler vardır.
Ayrıca kesin sonuç almak için de çok sayıda deney hayvanına ihtiyaç vardır. Buna rağmen, doz-cevap ilişkisi ve semptomolojinin araştırılması bugün de toksikoloji ve
22
farmakolojinin temelini oluşturmaktadır. LD50; solunum yolu dışında diğer tüm yollarla vücuda girerek etki gösteren katı veya sıvı haldeki kimyasal maddelerin belirli koşullarda bir kez verildiğinde bir gruptaki deney hayvanlarının %50’sini öldüren dozunu ifade eder ve bu değer mg/kg olarak belirtilir. LC50 (Letal Konsantrasyon) ise havadaki ya da sudaki bir kimyasalın vücuda girerek deney hayvanlarının %50’sini öldüren konsantrasyondur ve birim olarak ppm veya mg/mm3 olarak ifade edilir (Dökmeci 2001, Lu ve Kacew 2002). Brine Shrimp Letalite Testi (BSLT), hem LC50 hem de LD50 dozunun belirlenmesi için kullanılabilen toksisite testlerindendir. Bu larvalar, günümüzde biyolojik aktiviteleri araştırılan örneklerin ve bitkisel içeriklerin sitotoksisitesinin belirlenmesinde etkili bir yöntem olarak kullanılmaktadır. Ayrıca fungal toksinlerin, ağır metallerin, cyanobacteria toksinlerinin ve pestisitlerin sitotoksik etkilerinin araştırılmasında kullanılmaktadır (Sharififar ve diğ. 2009).
1.9 Kanser Hücreleri ve Sitotoksisite
Canlı organizmalardaki tüm hücreler belirli bir yaşam süresine sahiptir ve bu süreçte hücre çoğalması ve ölümünü kontrol eden mekanizmalar mevcuttur. Ancak canlıda gerçekleşebilecek bir moleküler kargaşa sonucu hücreler kontrolsüz ve aşırı çoğalmaya başlayabilir ve bunu takiben tümör oluşumu ile birlikte kanserleşme süreci de başlamış olur. Kısacası kanser, hücrelerin aşırı ve zamansız çoğalmalarına, immün sistemden kaçmalarına ve sonuç olarak daha uzak dokulara metastazlar oluşturmalarına yol açan metabolik değişiklikler geçirdikleri çok adımlı bir süreçtir (Merlo ve diğ. 2006). Kanser gelişiminin ilk basamağı, tek bir hücrede meydana gelen genetik veya epigenetik değişiklik sonucu bu hücrenin anormal bölünme yeteneği kazanmasıdır. Anormal hücre bölünmelerine paralel olarak, hücrelerde ek mutasyonların oluşması, bu tümör hücrelerine daha hızlı çoğalma, daha uzun süre canlı kalma yeteneği gibi avantajlar kazandırır. Sonuçta, bu avantajlı hücreler, tümör populasyonunda dominant hale gelirler. Tümörü oluşturan hücre populasyonlarının artan büyüme hızı, sağkalım, invazyon, metastaz gibi özellikler bakımından daha baskın hale gelme sürecine “klonal seleksiyon” adı verilir. Klonal seleksiyon, kanser
23
oluşum süreci boyunca sürekli devam eden ve tümörlerin malign forma dönüşmesini sağlayan önemli bir mekanizmadır (Cooper ve Hausmann 2006, Lüleyap 2008).
Anti-kanser yönü bilinen flavonoid, alkaloid ve fenilpropanoid gibi metabolitler bitkilerden izole edilirler (Kintzios 2006, Park ve diğ. 2008). Vinca alkaloidi veya paclitaxel gibi fitokimyasallar onkolojide hem kuvvetli ilaçlar olarak, hem de sentetik maddelerin üretilmesinde temel olarak yer alırlar (Pandi ve diğ.
2011, Huang ve diğ. 2012). Bu durumda tek bir bitkiden izole edilmiş özütler ya tek başlarına ya da belirli bir oranda diğer bitki özütleri ile bileşik oluşturarak kullanılırlar (Dahiru ve diğ. 2006). Hem in-vitro hem de in-vivo yapılan araştırmalarda fitokimyasalların çoğunun kanser hücreleri üzerinde sitotoksik etkiye sahip oldukları ve apoptotik potansiyellerinin yanı sıra belirli hücre sinyal yolaklarına etki ederek hücre döngüsünün durdurulmasına neden oldukları da gösterilmiştir (Chathoth ve diğ. 2008).
1.10 Bitkilerden Aktif Bileşenlerin İzolasyonu
Bitkiler, yapı ve fonksiyonları farklı olan çok sayıda kimyasal madde üretmektedirler. Bunlardan sekonder maddelerin şu ana kadar çok az bir kısmının izole edildiği bilinmekte olup, izole edilenlerden birçoğunun yapıları ile biyolojik aktiviteleri saptandığı gibi çok çeşitli endüstriyel alanlarda kullanılmaktadırlar.
Özellikle tıpta ağrı kesici, yatıştırıcı, kas gevşetici ilaçlar (morfin, atropin, papaverin gibi), enfeksiyoz hastalıklara karşı antimikrobiyaller, insektisitler (nikotin, rotenon gibi), gıda koruma maddeleri olarak kullanılanları mevcuttur.
Bitki bileşenlerinin ayrıştırılması ve saflaştırılması için tek başına ya da birlikte kullanılan genellikle dört farklı kromatografi tekniği bulunmaktadır. Bu teknikler, çoğunlukla çözünme özellikleri ve ayrışan bileşenlerin uçuculuğuna bağlı olarak değişmektedir. Bu teknikler şunlardır:
Kağıt kromatografisi (PC): Karbohidrat, amino asit, nükleik asit, organik asit ve fenolik bileşikler gibi suda çözünebilen bitki bileşenlerinin belirlenmesinde kullanılır.
