Sekans Teknolojilerinin Gelişmi

Sekans Teknolojilerinin Gelişmi

Sekanslama süreci

•Örnek hazırlama-hedef genomun küçük parçalara ayrılması

•Fiziksel sekanslama- her parçadaki bazların sırayla tayini

•Geri birleştirme- üst üste gelen sekansların hizalanması

1. Nesil sekanslama (1st generation)

•Sanger(in 1975), Maxam and Gilbert (in 1977)

odideoxy nucleotides,floresan ile işaretlenmiş

oKapiler elektroforez

1st generation sekanslama

•Sanger-zincir sonlandırma metodu (chain termination method)

•SANGER SEQ

http://www.youtube.com/watch?v=6ldtdWj Dwes&feature=related

http://www.youtube.com/watch?

v=bEFLBf5WEtc&NR=1&feature=endscr een

Sekans kromatogramlarının analizi

•Sekans sonuçlarının iyi değerlendirilmesi için kromatogramların indirilmesi ve

detaylı analiz edilmesi gerekir.

•Sadece cihazdan alınan text dosyası ile işlem yapılıyorsa, güvenilir sonuçlar elde edilemeyebilir.

•Kısa sürede kromatogram okuma.

1. Sekansın ne kadar temiz olduğu ile ilgili fikir edinin

▫Genel olarak nükleotid pikleri ne kadar temiz?

▫Eşit aralıklarla ayrılmış ve her biri farklı renklerde pik görüntüsü olmalı. «Gürültü»

(baseline) pikleri olabilir ancak iyi bir

şablon DNA ve iyi primerler ile minimum seviyeye indirilebilir.

II. Yanlış adlandırılmış pikleri kontrol edin

•Baz eşleşmelerinde ciddi hatalar var mı?

•Heterozigot pikler (2li tepecikler) var mı?

1- Eşit aralıklı olmayan pikler

2-Dubleks pikler

Base and ambiguity codes used in DNA FASTA-files

III. Jelin sonlarına doğru rezolusyon kaybı

Çok iyi giden kromatogramlar bile sonlara doğru bozulmaya başlayabilir

IV. Problemeler artmaya başladığında sekans sonlandırılmalı

•Yayınlanabilir sonuçlar için

•SNP arayışında

•Sekans kalitesini göz önünde bulundurarak sekans uzunluğu

istenilenden daha kısa olarak alınabilir (1100 yerine 900 nükleotid gibi)

Diğer ortak problemler

• Spikes in the chromatogram (air bubbles on a dim chromatogram)

• A few peaks with multiple colors (PCR on polymorphic genomic region)

• The first few nucleotides are poor (typical -

don't expect good sequence close to the primer)

• One base is [wrong/missing/inserted]. Did the sequencer screw up? (probably not, but

sequence the other strand)

• There's an 'N' in the midst of otherwise good sequence

Problems with the Primers & PCR Cond.

•PCR is exponential, sequencing is not.

•PCR reactions can be tailored to the primer;

sequencing reactions cannot.

•PCR reactions actually can use a mismatched priming site; sequencing rarely can.

•Sequencing PCR products with the PCR primers:

1. Nesil sekanslamanın limitasyonları

•Çok fazla klonlama adımı gerektiriyor

•Düşük işlem kapasiteli

•İlk insan genomunun sekanslanması;

o 3 milyar $ o ~10 yıl

o >20.000 BAC clones

Next generation sequencing (Yeni nesil sekanslama)

•2. nesil (yıka-görüntüle metodolojisi) 2005

•Birbiri ile aynı olan sekansların hibritleşmesi ve uygun yıkama ve görüntüleme protokolleri (template immobilization)

Schadt et al., 2010;

Kalıp DNA immobilizasyon stratejileri

Metzker et al., 2010;

Kalıp DNA immobilizasyon stratejileri

Metzker et al., 2010;

Kalıp DNA immobilizasyon stratejileri

Metzker et al., 2010;

2. Nesil sekans platformları

oRoche Pyrosequencing(2004) oIllumina/Solexa(2006)

oApplied Biosystems Solid sequencer(2007)

oHelicos(2009)

Roche 454 pirosekanslama (pyrosequencing)

•İlk ticari yeni nesil sekans platformu (2004)

•Prosedür adımları;

oDNA kütüphanesi hazırlanması

oemülsiyon PCR (isolation of single DNA molecules in water-oil droplets)

osekanslama

Roche 454 pyrosequencing

Mardis et al., 2008;

Roche 454 pyrosequencing

Mardis et al., 2008;

Roche 454 pyrosequencing

Mardis et al., 2008;

Roche 454 pyrosequencing

Each dNTP incorporation leads to Ppi release and ultimately light production via luciferase

emPCR produces ~1m copies of DNA template at the surface

of each bead

Metzker et al., 2010;

MOVIE

•Pyrosequencing

•ROCHE 454

http://www.youtube.com/watch?

v=bFNjxKHP8Jc

Illumina/Solexa

Mardis et al., 2008;

Illumina/Solexa

Mardis et al., 2008;

Solid-phase amplification

Illumina/Solexa

Mardis et al., 2008;

Illumina/Solexa

Metzker et al., 2010;

CCD(charge-coupled device) camera takes

images after each nucleotide

incorporation

MOVIE

•Illumina/Solexa

http://www.youtube.com/watch?v=77r5p8I BwJk

http://www.youtube.com/watch?v=HtuUFU nYB9Y&feature=related

https://www.youtube.com/watch?

v=fCd6B5HRaZ8

Yeni nesil sekans platformlarının karşılaştırması

Metzker et al., 2010;

2. Nesil sekanslamanın limitasyonları

•Pek çok yıkama ve görüntüleme basamağı

•Ortalama okuma uzunluğu 35-400 baz arasında

•Karmaşık örnek hazırlama

•PZR çoğaltmalına geriksinim duyulması sekanslama hatalarını ortaya çıkartıyor

•Uzun süre

Güncel teknolojiler

2. nesilden 3. nesile geçiş;

•Helicos BioSciences

oIon torrent-semiconductor technology

Munroe et al., 2010;

Helicos BioSciences

Metzker et al., 2010;

Single molecule templates involved, no

PCR

Immobilized primer, Poly(A) adaptor

CCD(charge-coupled device) camera takes

images after each nucleotide

incorporation

MOVIE

•HELICOS

http://www.youtube.com/watch?

v=TboL7wODBj4

Ion torrent-semiconductor technology

• Bazlar bağlandıkça açığa salınan H⁺ iyonunun algılanması metodu

• Sonuca ulaşma süresi kısa

• ucuz

• Hala yıka-görüntüle teknolojisi

Munroe et al., 2010;

MOVE

•ION TORENT

•http://www.youtube.com/watch?

v=yVf2295JqUg

1., 2. ve 3. nesil sekanslamaların karşılaştırılması

NGS Genomics and Applications

Ancient genomes sequenced (mammoth, neanderthal)

Protein-DNA interactions via CHIP-seq

Noncoding RNA discovery

Mutation discovery from a programmable microarray and sequencing them using

NGS

Characterization of biodiversity with the help of sequenced genomes

Variability search in human genome (CNV, SNP, epigenetics)

References

 Schadt E. E., Turner S., Kasarskis A. 2010 A Window into Third Generation Sequencing Hum Mol Genet.

 Krivanek, O.L., Chisholm, M.F., Nicolosi, V., Pennycook, T.J., Corbin, G.J., Dellby, N., Murfitt, M.F., Own, C.S., Szilagyi, Z.S., Oxley, M.P. et al. Atom-by- atom structural and chemical analysis by annular dark-field electron

microscopy. Nature, 464, 571-574.

 http://www.pacificbiosciences.com/index.php?q=evolution-of-sequencing

 Mardis E.R. 2008 Next-Generation DNA Sequencing Methods Annu. Rev.

Genomics Hum. Genet. 9:387–402

 Metzker M.L. 2010 Sequencing technologies- the next generation Nature Reviews 11:31-46

 Munroe D.J., Harris T.J.R. 2010 Third-generation sequencing fireworks at Marco Island. Nature Biotechnology 28:426-428

 Genome sequencing: the third generation 2009 Nature News 457:768-769

 Eid J., Fehr A., Gray J. et al. 2009 Real-Time DNA sequencing from single polymerase molecules. Science 323:133-138

 Bowers J., Mitchell J., Beer E. Et al. 2009 Virtual Terminator nucleotides for next generation DNA Sequencing Nature Methods 6(8): 593–595

 Branton D., Deamer D.W., Marziali A. 2008 The potential and challenges of nanopore sequencing Nat Biotechnol. 26(10): 1146–1153