Tescilli haşhas (Papaver somniferum L.) çeşitlerinde su stresinin antioksidant enzimler üzerine etkisi

(1)

TESCİLLİ HAŞHAŞ (Papaver somniferum L.) ÇEŞİTLERİNDE SU STRESİNİN

ANTİOKSİDANT ENZİMLER ÜZERİNE ETKİSİ Yahya KILINÇ

Yüksek Lisans Tezi Biyoloji Anabilim Dalı

Yrd. Doç. Dr. İskender PARMAKSIZ 2011

(2)

T.C.

GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

BİYOLOJİ ANABİLİM DALI

Yüksek Lisans Tezi

TESCİLLİ HAŞHAŞ (Papaver somniferum L.) ÇEŞİTLERİNDE SU STRESİNİN

ANTİOKSİDANT ENZİMLER ÜZERİNE ETKİSİ

Yahya KILINÇ

TOKAT 2011

(3)

(4)

Tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu tezin yazılmasında bilimsel ahlak kurallarına uyulduğunu, başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunulduğunu, tezin içerdiği yenilik ve sonuçların başka bir yerden alınmadığını, kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapılmadığını, tezin herhangi bir kısmının bu üniversite veya başka bir üniversitedeki başka bir tez çalışması olarak sunulmadığını beyan ederim.

(5)

i

Yüksek Lisans Tezi

TESCİLLİ HAŞHAŞ (Papaver somniferum L.) ÇEŞİTLERİNDE SU STRESİNİN ANTİOKSİDANT ENZİMLER ÜZERİNE ETKİSİ

Yahya KILINÇ Gaziosmanpaşa Üniversitesi

Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı

Danışman: Yrd. Doç. Dr. İskender PARMAKSIZ

Haşhaş (Papaver somniferum L.) Papaveraceae familyasında yer alan tıbbi öneme sahip alkaloitleri içermesinden dolayı ticari önemi olan bir bitkidir. Su stresi, bitkiyi tüm gelişim sürecinde etkileyen en önemli çevresel faktörlerden biridir. Bu çalışmada, üç farklı su stresi seviyesinin (hafif, orta ve şiddetli) P. somniferum L. üzerine olan etkisi araştırılmıştır. 5 ay süresince yetiştirilen 17 tescilli haşhaş çeşidinde su stresi uygulamasının, katalaz (CAT), peroksidaz (POD), askorbat peroksidaz (APX) gibi antioksidant enzimlerin aktiviteleri araştırılmıştır. Çalışılan 17 çeşide ait hafif su stresi (%80) uygulamaları, CAT, enzimi aktivitesini kontrole göre önemli ölçüde, APX ve POD enzim aktivitelerinde değişmelere neden olmuştur. Orta (%40) şiddette su stresine maruz bırakılan çeşitlerde CAT aktivitesinde artma POD enzim aktivitesinde azalmaya, APX aktivitesinde değişmeye sebep olmuştur. Yüksek şiddette (%20) su stresine maruz bırakılan çeşitlerde APX ve CAT enzim aktivitesinde artmaya neden olurken POD aktivitesinde azalmaya neden olduğu belirlenmiştir.

2011, 51 sayfa

(6)

ii M. Sc. Thesis

EFFECTS OF WATER STRESS ON ANTIOKSIDANT ENZYMES IN REGISTERED POPPY (Papaver somniferum L.) VARIETIES

Yahya KILINÇ Gaziosmanpasa University

Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Biology

Supervisor: Asst. Prof. Dr. İskender PARMAKSIZ

Oppium poppy (Papaver somniferum L.) belongs to Papaveraceae family and it is a commercial plant because of its medically important alcoloid contents. Water stress is one of the environmental factors that affect the plant in all of the development stages. In this study, the effects of three different water stres levels (light, medium, severe) on P. somniferum L. were investigated. The water stress was applied to 17 registered poppy varieties that were grown for 5 months. The effects of water stress were investigated on the activities of antioxidant enzymes such as catalaz (CAT), peroxidase (POD) and ascorbate peroxidase (APX). Light water stress (80%) application caused significant changes in CAT, and led to changes in APX and POD enzyme activities compared to control. Medium water stress (40%) application caused an increase in CAT activity, a decrease in POD activity and a change in APX activity. In varieties subjected to severe water stress (20%) application, there was an increase in APX andCAT activities, while there was a decrease in POD activity.

2011, 51 pages

(7)

iii

yönlendiren değerli danışman hocam Sayın Yrd. Doç. Dr. İskender PARMAKSIZ’a, her türlü laboratuar koşullarını sağlayan bölüm başkanımız Sayın Prof. Dr. Zekeriya ALTUNER’e, çalışmalarımda her türlü desteğini esirgemeyen kıymetli hocam Sayın Doç. Dr. Lokman ÖZTÜRK’e, laboratuar çalışmalarımda emeği geçen değerli arkadaşlarım Öğr. Gör. Yakup ULUSU’ya, Arş.Gör. Dursun KISA’ya, Tuğba GÜRKÖK’e, Eda ALTU’ya, Hasan DURUKAN’a, Gülşen BOZTEPE’ye ve Elif KAYMAK’a, son olarak her zaman destekleriyle ayakta durduğum çok kıymetli aileme sonsuz teşekkürlerimi sunuyorum.

Bu çalışma Gaziosmanpaşa Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri 2010-113 nolu “ Tescilli Haşhaş (Papaver somniferum L.) çeşitlerinde su stresinin antioksidant enzimler üzerine etkisi” projesi tarafından desteklenmiştir.

YAHYA KILINÇ TOKAT 2011

(8)

iv Sayfa ÖZET ... i ABSTRACT ... ii ÖNSÖZ ... iii İÇİNDEKİLER ... iv ŞEKİLLER DİZİNİ ... vi ÇİZELGE DİZİNİ ... vii 1. GİRİŞ ... 1 2. LİTERATÜR ÖZETLERİ ... 3 2.1. Stres Tanımı ... 3 2.2. Stres Faktörleri ... 3

2.3. Stresin Teşvik Ettiği Fazlar ... 4

2.3.1. Tepki Fazı ... 4

2.3.2. Onarım Fazı ... 4

2.3.3. Bitiş Fazı ... 4

2.3.4. Rejenerasyon Fazı ... 4

2.4. Bitkilerde Su Stresi ... 5

2.5.Bitkilerde Kuraklık Stresinin Etkileri ... 6

2.5.1. Kuraklık Stresinin Mekanik Etkileri ... 6

2.5.2. Kuraklık Stresinin Metabolik Etkileri ... 8

2.5.3.Kuraklık Stresinin Oksidatif Etkileri ... 8

2.6. Kuraklık Stresinin Fotosentez Üzerine Etkisi ... 10

2.6.1. Stomal Sınırlamalar ... 10

2.6.2. Stomal Olmayan Sınırlamalar ... 10

2.7. Bitkilerin Stres Koşullarına Verdikleri Cevaplar ... 11

2.7.1. Kaçınma ... 11 2.7.2. Tolerans ... 12 2.8. Antioksidant Sistem ... 12 2.8.1. Katalaz ... 13 2.8.2. Peroksidaz ... 13 2.8.3. Askorbat Peroksidaz ... 14

2.9. Papaveraceae Familyasının Genel Özelikleri ... 14

2.9.1. Papaver somniferum L. Bitkisinin Genel Özellikleri ... 14

2.9.2. Türkiye’de Tescil Edilen Bazı Haşhaş Çeşitleri ... 15

3. MATERYAL ve YÖNTEM ... 17

3.1. MATERYAL ... 17

(9)

v

.3. Çalışmada Kullanılan Çözeltiler ... 20

3.2.3.1. Homojenat Tamponu ... 20

3.2.3.2. Katalaz Aktivitesinin Ölçülmesi için Kullanılan Çözeltiler ... 20

3.2.3.3. Peroksidaz Aktivitesinin Ölçülmesi için Kullanılan Çözeltiler ... 20

3.2.3.4.Askorbat Peroksidaz Aktivitesinin Ölçülmesi için Kullanılan Çözeltiler ... 20

3.2.3.5.Protein Miktarının Belirlenmesinde Kullanılan Çözeltiler ... 20

3.2.4. Katalaz, Peroksidaz, Askorbat Peroksidaz Aktivitelerinin ve Protein Miktarlarının Belirlenmesi için Homojenat Hazırlanması ... 21

3.2.5. Katalaz Aktivitesinin Belirlenmesi ... 21

3.2.6. Peroksidaz Aktivitesinin Belirlenmesi ... 21

3.2.7. Askorbat Peroksidaz Aktivitesinin Belirlenmesi ... 22

3.2.8. Protein Miktarının Belirlenmesi ... 22

3.2.9 İstatistik Analiz. ... 23

4. BULGULAR ... 24

4.1. Su Stresi Uygulamalarının Toplam Protein Miktarı Üzerine Etkisi ... 24

4.2. Su Stresi Uygulamalarının Askorbat Peroksidaz Aktivitesi Üzerine Etkisi ... 28

4.3. Su Stresi Uygulamalarının Katalaz Aktivitesi Üzerine Etkisi ... 33

4.4. Su Stresi Uygulamalarının Peroksidaz Aktivitesi Üzerine Etkisi ... 37

5. TARTIŞMA ve SONUÇ ... 42

KAYNAKLAR ... 46

(10)

vi

Sayfa 3.1. Beş aylık büyüme peryodu sonunda kasa içerisindeki haşhaş bitkilerin

genel görünümü ... 17

3.2. Protein tayininde kullanılan BSA standart grafiği ... 23

4.1.Su stresi uygulamalarının toplam protein miktarı (mg/ml) üzerine etkisi ... 25

4.2. Su stresi uygulamalarının APX aktivitesi üzerine görülen etkisi ... 29

4.3. Su stresi uygulamalarının CAT aktivitesi üzerine etkisi ... 34

(11)

vii

Sayfa

3.1. Haşhaş çeşitlerinin isimleri ... 18

4.1.Su stresi uygulamalarının toplam protein miktarı (mg/ml) üzerine etkisi ... 25

4.2. Su stresi uygulamalarının askorbat peroksidaz aktivitesi üzerine etkisi ... 29

4.3. Su stresi uygulamalarının katalaz aktivitesi üzerine görülen etkisi ... 33

(12)

Bitkiler hareketsiz olduklarından dolayı istenmeyen çevresel koşullara maruz kalırlar. Kuraklık, aşırı sıcaklık, tuzluluk, radyasyon, manyetik ve elektriksel alanlar, metal toksitesi, kirlilik ve patojenler, bitki büyümesi, gelişmesi ve ürün verimliliğini olumsuz bir şekilde etkilemektedirler. Tarımsal üretim alanlarında su eksikliği, toprakların verimliliğini olumsuz yönde etkileyen ve bitkisel verimi sınırlandıran en önemli faktördür.

Dünya üzerindeki kullanılabilir alanlar stres faktörlerine göre sınıflandırıldığında, doğal bir stres faktörü olan kuraklık stresi % 26’lık payıyla en büyük dilimi içermektedir. Bunu % 20 ile mineral stresi ve % 15 ile soğuk ve don stresi takip etmektedir. Bunların dışında kalan diğer tüm stresler % 29’luk bir pay içinde yer alırken, yalnızca % 10’luk bir alan herhangi bir stres faktörüne maruz kalmamaktadır (Blum, 1986). Bu durumda, kuraklık stresi büyümeyi ve verimi etkileyen en önemli çevresel faktörlerden biridir.

Bitkiler yaşamlarını sürdürürken topraktan kendileri için gerekli olan besin elementlerini kökleri vasıtasıyla bünyelerine alabilmektedirler. Toprağın yapısında değişik oranlarda bulunan besleyici özelliğe sahip çeşitli elementlere çimlenme, fide gelişimi, çiçeklenme ve meyve oluşturma safhalarında gereksinim duyulur. Bitkilerin bu elementlerden yeterince faydalanabilmeleri için toprak içinde bulunan su miktarı oldukça önemlidir.

Dünyada Papaver cinsine ait yaklaşık 110 (Kapoor, 1997) türün 50 taksonunun ülkemizde bulunduğu bildirilmiştir (Davis 1988, Seçmen ve ark., 1995, Güner ve ark., 2000). Papaver somniferum L. ülkemizde ticari olarak yetiştirilen önemli bir tıbbi bitkidir. Papaveraceae familyasına ait tek yıllık bir bitki olan Papaver somniferum tohum, yağ ve önemli alkaloitleri için üretilir. 2008 yılı itibari ile yasal olarak 175.000 alana ekimi yapılıp 8000 ton afyon üretimi gerçekleştirilmiştir (Anonim, 2009).

(13)

Haşhaş en eski bilinen narkotik analjeziklerden biridir aynı zamanda değişik alkaloitlerin kaynağıdır. Modern tıpta analjezik ilaç ve öksürük ilacı olarak kullanılmaktadır (Peter, 2001).

Zengin alkoloit içeriği nedeniyle Papaveracea familyasına ait seksiyonların tıbbi alanda kullanımı önemlilik arz etmektedir. Papaver somniferum kodein ve morfin eldesi Papaver bracteatum ise tebain kaynağı amacıyla kullanılmaktadır (Parmaksız, 2004).

Bu tez çalışmasında ülkemizde yetiştirilen 17 tescilli Papaver somniferum L. çeşidinin su ile enzim aktivitelerinin ilişkilendirilmesi amaçlanmıştır.

(14)

2.1. Stresin Tanımı

Bir çevrede devamlı olarak, ya da arada sırada meydana gelen çok sayıdaki olumsuz, fakat hemen öldürücü olmayan koşullar stres olarak bilinir. Bir başka yaklaşımla; bitkide metabolizmayı, büyüme ve gelişmeyi etkileyen veya engelleyen, uygun olmayan herhangi bir durum veya madde stres olarak kabul edilir (Güler ve Avcıoğlu, 2004). Levitt’e (1972) göre stres, bitkinin büyümesini ya da gelişmesini azaltabilen veya tersine değiştirebilen çevresel durumlardaki olumsuz değişimdir.

2.2. Stres Faktörleri

Bitkiler yaşamları sürecinde pek çok stres olayları ve çok sayıda stres faktörleri ile karşılaşmaktadırlar. Bitki üzerinde ender olarak tek başlarına etki yapabilen bu stres olayları veya faktörleri, genellikle etkilerini eş zamanlı olarak gerçekleştirmektedirler. Stres faktörleri, orijinlerine göre değişik şekillerde sınıflandırılabilirler. Stresörlerin “biyotik” ve “fizikokimyasal” olarak iki grupta ele alındığı sınıflandırmada biyotik faktörler, enfeksiyon oluşturan mikroorganizmaları (fungus, bakteri, virüs), zararlıları (böcek, nematod) ve diğer organizmalarla rekabeti içermektedir. Fizikokimyasal faktörler ise, sıcaklık, su, radyasyon, kimyasal, manyetik, elektriksel etkiler gibi çevre parametrelerindeki sapmalar olarak belirlenmektedir. Diğer bir sınıflandırma şeklinde ise stres faktörleri, doğal ve antropogenik olarak gruplandırılmaktadır. Bu durumda, doğal stres faktörleri; yüksek ışık, ısı, üşüme, don, su azlığı ve fazlalığı, mineral eksikliği ile böcek ve patojenleri kapsamaktadır. Antropogenik stres ise herbisitler, fungusitler, pestisitler, havayı kirletici maddeler, ozon, fotooksidanlar, asit yağmurları, toprak ve su, aşırı N uygulaması, ağır metaller, artan UV radyasyonu ve CO2 seviyesi gibi faktörleri içermektedir (Güler ve Avcıoğlu, 2004).

Çevresel stres, çok az veya çok fazla enerji girdisi ile ya da kimyasalın çok hızlı veya yavaş olarak dolaşımı ile ortaya çıkmaktadır (Lichtenthaler, 1996; Edreva, 1998).

(15)

Stres faktörleri arasında kuraklık stresi bitki büyümesi, gelişmesi ve bitki verimliliğini kısıtlayan en önemli abiyotik stres faktörlerinden biridir (Zhang ve Jiang, 2002; Chaves ve ark., 2003; Martinez ve ark., 2007; Sankar ve ark., 2008).

Asraf ve Foolad (2007), dünya tarım alanlarının yaklaşık % 45’nin kuraklık stresine maruz kaldığını belirtmişlerdir.

2.3. Stresin Teşvik Ettiği Fazlar

Stres faktörleri, bitkilerin strese karşı üç tepki fazını ve eğer zarar çok şiddetli değilse, bu stresörlerin uzaklaştırılmasından sonra dördüncü olarak da rejenerasyon fazını geçirmelerine yol açmaktadırlar. Böylelikle stres süresince organizma, karakteristik bir fazlar dizinini izlemektedir (Larcher, 1995; Lichtenthaler, 1996)

2.3.1. Tepki Fazı: Katabolizmanın anabolizmaya üstün olduğu bir stres reaksiyonu ile başlayan bu fazda normal yaşamsal etkinlikler için gereksinim duyulan yapısal (protein, biyo-membranlar) ve fonksiyonel (biyokimyasal olaylar, enerji metabolizması) koşullarda sapmalar meydana gelir. Ayrıca bu fazda canlılıkta gerilemektedir.

2.3.2. Onarım Fazı: Eğer uyartıların yoğunluğu değişmez ise protein veya koruyucu maddelerin sentezi gibi tamir olayları bu fazda gerçekleşir. Ayrıca bu fazda adaptasyon olayının gerçekleşmesi sağlanarak devam eden stres koşulları altında kuvvetlenmenin arttığı bir dayanıklılık fazına geçiş meydana gelir.

2.3.3. Bitiş Fazı: Eğer stres dönemi fazla uzun sürerse veya stres faktörünün yoğunluğu artarsa, bitiş fazı ortaya çıkmaktadır. Tolerans limitlerinin aşıldığı ve adaptif kapasitenin aşırı yüklendiği durumlarda, kalıcı zararlar ve hatta ölüm de meydana gelebilmektedir.

2.3.4. Rejenerasyon Fazı: Senesens olaylarının dominant hale gelmelerinden önce ve zararın çok yüksek olmadığı durumlarda stresörler uzaklaştırılırsa, bitkide fizyolojik

(16)

fonksiyonların kısmi veya tam rejenerasyonu gerçekleştirilip zarar tamir edilebilmektedir (Edreva, 1998; Gürel ve Avcıoğlu, 2004).

2.4. Bitkilerde Su Stresi

Kuraklık, genel anlamda meteorolojik bir olgu olup toprağın su içeriği ile bitki gelişiminde gözle görülür azalmaya neden olacak kadar uzun süren yağışsız dönemdir. Yağışsız dönemin kuraklık oluşturması; toprağın su tutma kapasitesi ve bitkiler tarafından gerçekleştirilen evapo-transpirasyon hızına bağlı olarak gerçekleşmektedir (Kozlowski ve Pallardy, 1997; Gürel ve Avcıoğlu, 2004). Bitki bünyesinde su eksikliği, daimi transpirasyonun köklerle su alımını aştığı zaman ortaya çıkar. Örneğin şiddetli transpirasyon koşullarında topraktan kullanılabilir suyun az olması halinde veya köklerde metabolizmanın durması durumunda bitki su içeriği düşer (Aktura, 1990).

Son yıllarda, özellikle artan sıcaklık ve bunun beraberinde CO2 etkisiyle yeryüzünün iklimi gittikçe değişmektedir. Bu değişmeler, fotosentezden başlayarak bitki büyüme gelişimini ve fonksiyonlarını da etkilemektedir. İklimsel değişimlerin etkisiyle oluşan çevresel streslerin en önemlilerinden birisi kuraklık stresidir (Drake ve ark., 1997).

Bitkiler, sınırlı çevresel koşullara adapte olmayı sağlayacak bazı tolerans mekanizmaları geliştirirler. Çoğu bitkide çeşitli kuraklık sakınma mekanizmaları gelişmiştir. Stresten sakınma mekanizmalarından ilki çöl bitkilerinde görülür. Çölde kısa ömürlü olan bitkiler yeterli yağmur periyodu sırasında büyür ve ürerler. Kuraklık periyodunda ise dormant tohumlar meydana getirirler. Diğer bir sakınma mekanizması sukkulent bitkilerde görülür. Bu bitkiler kuraklığa karsı sukkulent dokularında su depolayarak su kaybını en az oranda tutarlar ve böylece uzun bir süre canlılıklarını sürdürebilirler (Salisbury ve Ross, 1992).

Kuraklığı, ağır (akut), sürekli (kronik) ve fizyolojik kuraklık olmak üzere üçe ayırmak mümkündür (Eriş,1990).

(17)

Akut (ağır) kuraklık, atmosferik değişiklikler sonucu (sıcaklığın artması, nemin hızlı bir şekilde azalması gibi) ortaya çıkmaktadır. Akut kuraklık sonucu sürgün uçlarında kuruma, büyüme ve gelişmede yavaşlamalar görülür. Kuraklığın ilk belirtisi solgunluktur. Solgunluk noktası aşılmadığı sürece, bitkiye su verildikçe solgunluk geçer (Çırak ve Esendal, 2006).

Sürekli (kronik) kuraklık, toprakta taban suyunun düşmesi sonucu görülen kuraklıktır. Sürekli kuraklığa maruz kalan bitkilerde önce solgunluk, daha sonrada kuruma görülür. Kuruma, metabolizma ve hücre yapısının tamamen bozulmasına ve enzimle katalizlenen reaksiyonların durmasına neden olabilecek aşırı miktardaki su kaybı olarak tanımlanabilir (Eriş, 1990; Smirnoff, 1993; Kalefetoğlu ve Ekmekçi, 2005).

Fizyolojik kuraklık ise toprakta yeterli miktarda su olmasına karşın, bitkinin bu sudan faydalanamaması olarak tanımlanır. Toprağın su tutma kapasitesi, bitkinin emme kuvvetinden fazla olması durumunda bitkiler suyu alamayarak kuraklık stresine girmektedir. Toprakta meydana gelen yüksek tuz konsantrasyonu, toprak çözeltisinin ozmotik değerini artırarak toprak suyunun bitkiler tarafından alınımını güçleştirmekte, böylece bitkinin fizyolojik kuraklık ile karşı karşıya kalmasına neden olmaktadır (Çırak ve Esendal, 2006).

2.5. BİTKİLERDE KURAKLIK STRESİNİN ETKİLERİ

2.5.1. Kuraklık Stresinin Mekanik Etkileri

Levitt (1980), kuraklık stresinin mekanik etkilerini, bitki hücrelerinden belirgin su kaybı gerçekleştiği zaman bitkide turgor kaybıyla kendini gösteren birincil stres olarak tanımlamıştır. Hücreden su kaybıyla beraber membran yapısı değişikliğe uğrar ve hücre özsuyu konsantrasyonu artar. Stres altındaki plazma membranında gerçekleşen çökme yırtılmalara, zarlar üzerine yerleşmiş olan hidrolitik enzimlerin serbest kalarak sitoplazmanın otolizine neden olur. Bu zarar, normal hücresel metabolizmayı genelde kalıcı olarak bozar. Oluşan bu etki sonucunda büyümede yavaşlama ve tugorda azalma

(18)

meydana gelmektedir (Güler ve Avcıoğlu, 2004; Kalefetoğlu ve Ekmekçi, 2005). Karakaş ve ark. (1997), tütün bitkisinde yapılan bir çalışmada kuraklık stresi sonucunda bitkilerin kuru ağırlıkların % 56 ile % 60 arasında değiştiğini bildirmişlerdir.

Bezelye bitkisinde yapılan bir çalışmada PEG 6000 kullanarak oluşan kuraklık stresinde bezelye epikotillerinin gelişiminde önemli azalmalar olduğu, gelişim ve ozmotik düzenleme ile turgor düzenlemesi arasında bir korelasyon olduğu belirlenmiştir (Sanchez ve ark., 2004).

Quercus ilex türünde yapılan bir deneyde bitkiler 14 gün süresince kurak koşullarda yetiştirilmiştir. Yaprak su potansiyeli stres başlangıcında -0,72 MPa iken, stresten 7 gün sonra -0,99 MPa; 14 gün sonra ise -1,50 MPa’ya düşmüştür. 0. günde % 49,31 olan RWC değerleri stresin 14. gününde % 40,77 düzeyine gelmiştir (Echevarri´a-Zomeno ve ark., 2009).

Kiraz domatesinin 5 çeşidinde yapılan bir çalışmada kuraklık stresinin, bitki gelişimi, biyomas üretimi ve yaprak oransal su içeriğinin (RWC) olumsuz etkilendiğini, APX ve CAT enzim aktivitelerinin ise artış gösterdiği belirlenmiştir (Sanchez-Rodriguez ve ark., 2010).

Mahdavi-Damghani ve ark., (2010) Papaver somniferum L. bitkisinde su stresinin büyüme, gelişme ve ürün oluşumu üzerine etkisini araştırmışlardır. Su stresinin su kullanma verimini artırdığını kısa vegetatif fazın su kullanma verimi üzerinden etkisi olmadığını ancak alkoloid üretimini düşürdüğünü belirtmişlerdir. Su eksikliğinin terlemeyi ve stomal iletkenliğini önemli oranda azalttığını, bununla beraber su tutumuyla birlikte biyokütle üretimini artırdığını belirtmişlerdir. Çiçeklenmeden önce yetersiz sulama bitkide suyu tutma ve yaprak gelişiminde indirgemeyi gerçekleştirir. Dolayısıyla çiçeklenmeden önce %15 sulama çiçeklenmeden sonra normal süreci devam ettirebileceğini belirtmişlerdir.

(19)

2.5.2. Kuraklık Stresinin Metabolik Etkileri

Hücre içeriğinin büyük bir kısmını oluşturması, taşıyıcı olması, hücresel reaksiyonlar ve işlevler için çözücü rolü oynaması gibi fonksiyonel özelliklerinden dolayı suyun, hücreden kaybı durumunda, normal regülasyon devam edemez ve metabolizma bozulur. Su kaybına bağlı olarak gerçekleşen iyon-birikimi, membran bütünlüğünün ve proteinlerin yapısının bozulmasına yol açarak hücreye zarar verebilir (Kalefetoğlu ve Ekmekçi, 2005). Su kaybı sonucunda; proteinlerin yapısında bulunan hidrofobik ve hidrofilik amino asitlerin su ile etkileşimleri bozulur (Campbell, 1991) ve bu durum da protein denatürasyonlarına ve enzim inhibisyonlarına neden olur (Bray, 1997).

Su stresi esnasında meydana gelen başka bir hasar ise, DNA ve RNA gibi nükleik asitlerin degradasyonudur. Kuraklık stresine maruz kalmış olan yapraklarda RNAaz aktivitesi artmakta ve bu da enzimin bağlı durumdan serbest duruma geçmesinden kaynaklanmaktadır (Kessler, 1961).

Halep çamı ile yapılan çalışmalar sonucunda kuraklık boyunca yapraklar önemli ölçüde etkilenmiş ve Ca2+

, Mg, Mn konsantrasyonları yükselmiş P, N ve K konsantrasyonları ise indirgenmiştir (Thiec ve Manninen 2003).

Yuan-yuan ve ark. (2009), PEG uygulanan yapraklarda Ca2+ seviyesinin kloroplast ve nükleusta arttığını, stres uygulamasının devam etmesi ile kloroplast ve nükleusta Ca2+ seviyesinin artışına devam ettiğini bildirmişlerdir. Araştırıcılar Ca2+’nın kuraklığa dayanımda önemli bir role sahip olduğunu ancak şiddetli kuraklık streslerinde kloroplastlarda meydana gelen bozulmaların Ca2+ birikimini azaltabileceğini ifade etmişlerdir.

2.5.3. Kuraklık Stresinin Oksidatif Etkileri

Serbest radikallerin, özellikle aktif oksijen türlerinin (süperoksit molekülü, singlet oksijen, hidrojen peroksit ve hidroksil radikallerinin) oluşumunu içerir. Serbest

(20)

radikaller, eşleşmemiş elektron içeren moleküller olup oldukça reaktiftirler. Bu radikaller; plazma membranı, mitokondri, ER membranlarında da oluşabilir (Mckersie ve Lehsem, 1994).

Suyun kısıtlı olduğu periyotlarda, vejetatif bitki dokularında oksidatif stresin en yaygın nedeni kloroplastta gerçekleşen ışık-klorofil etkileşimleridir (Farrant, 2000).

Bitki su kaybetmemek için, genelde, stomalarını kapatır. Bu da fotosentezle fiksasyon için gerekli CO2’nin alımının kısıtlanmasına neden olur. Bu durum da fotosentetik reaksiyon merkezlerindeki enerjinin aşırılığına neden olur (Stuhlfauth, 1990). Bu durumda; NADP+ (fotosentezdeki e- akseptörü) kısıtlı hale gelir ve ferrodoksin NADP+ yerine oksijeni redükler; böylece, fotosistem I (PSI)’in elektronları O2’ye transferi sonucunda reaktif O2ˉ radikali üretilir (Mehler reaksiyonu) (Tambussi, 2000). Birçok türde su stresi altında artan O2ˉ oluşum hızı lipid peroksidasyonuna, yağ asidi doygunluğuna ve sonuçta membranların bütünüyle zarar görmesine neden olur (Sgherry ve ark., 1996). Süperoksitin kendisi fazla reaktif değildir ve daha çok H2O2 ve daha sonra ˙OH oluşturmak suretiyle etkili olur (Halliwel ve Gutteridge, 1989). Hidrojen peroksit Calvin döngüsünün birçok enziminin inaktivasyonuna yol açmaktadır (Kaiser, 1979; Charles ve Halliwel, 1980). Süperoksit ve hidrojen peroksidin ˙OH radikalini oluşturmak üzere tepkimesi sırasında (Haber-Weiss reaksiyonu), artan demir ya da bakır gibi diğer geçiş metalleri, bu reaksiyonları hızlandırmak suretiyle oksidatif hasarı daha da artırabilir (Fenton reaksiyonu) (Smirnoff, 1993). Bunların yanı sıra, fotosistem II (PS II)’deki suyu parçalayan bölgede de serbest radikal oluşabilir. Bitkilerde, oksidatif zararın yol açtığı yıkıcı etkilerle mücadele etmek için, yağda çözünen ve membrana bağlı antioksidanlar, suda çözünen antioksidanlar (˙O2 ve H2O2’nin detoksifikasyonunda rol oynayan glutatyon ve askorbat) ve enzimatik antioksidanlar (süperoksit dismutaz, katalaz, peroksidaz, askorbat peroksidaz ve glutatyon redüktaz)’dan oluşan karmaşık bir antioksidan koruyucu sistemine sahiplerdir. Kuraklık stresine maruz kalan bitkiler antioksidant savunma sistemlerin bazılarının ya da tamamının aktivasyonu ile oksidatif stresin üstesinden gelebilirler (Srivalli ve ark., 2003; Jung, 2004; Ramachandra ve ark., 2004; Pinheiro ve ark., 2004). Bununla beraber, uzun süreli ve akut; hatta bazen kısa süreli stres durumunda bile, savunma

(21)

mekanizmalarının kapasiteleri aşılır ve bu durum, gözle görülür zararlara ve hatta bitki ölümüne neden olabilir (Alexieva, 2003).

2.6. Kuraklık Stresinin Fotosentez Üzerine Etkisi

Kuraklık bitkide fotosentezi büyük oranda azaltmaktadır. Kuraklık stresi ile toplam yaprak alanı azalmakta ve fotosentez yavaşlamaktadır. Kuraklık stresi koşullarında fotosentez stomaların kapanmasına bağlı olarak sınırlanırken, uzun süreli ve şiddetli streslerde stomalar dışındaki faktörlerce engellenmektedir.

2.6.1 Stomal Sınırlamalar

Kuraklık stresi altında fotosentezdeki ilk azalma stomaların kapanması ve CO2 absorbsiyonunun azalmasıyla ortaya çıkar (Lima, 2002). Kuraklık stresine maruz kalan bitkiler hidrolik sinyaller (yaprak su potansiyeli, hücre turgoru) ve kimyasal sinyaller (absisik asit) nedeniyle stomalarını kapatır. Köklerde sentezlenen ve transpirasyon akıntısıyla bekçi hücrelerine taşınan absisik asit (ABA), bekçi hücrelerindeki ABA reseptörüne bağlanarak, su stresi koşulları altında stomaların kapanmasını sağlar (Teiz ve Zeiger, 1998).

2.6.2. Stomal Olmayan Sınırlamalar

Fotosentez genel olarak kloroplastlarda meydana gelmektedir. Fotosentez, kloroplastik faktörler nedeniyle de azalmaktadır. Kloroplastların stoma bölgesinde CO2’yi fiske eden ve indirgeyerek organik bileşiklere dönüşmesini sağlayan ribuloz bisfosfat karboksilaz gibi enzimlerin su kaybı ile aktiviteleri azalmakta, dolayısıyla CO2 fiksasyonu zarar görmektedir. Başlangıçta fotosentez stomal faktörler tarafından azaltılmakta ise de, kuraklık stresinin devam etmesi ve şiddetinin artmasıyla kloroplast ve enzim aktivitesi depresyona uğramakta, bundan dolayı fotosentez stomalar dışındaki faktörler tarafından azaltılmaktadır. Ayrıca kuraklığın ileri safhalarında mezofil

(22)

hücrelerinin hücre duvarının difüzyon direnci artmakta ve böylece mezofil hücrelerine CO2 girişi önlenmektedir (Çırak ve Esendal, 2006).

Fotosentezin stomatal olmayan sınırlanması; kloroplast lipidlerinin, pigmentlerinin ya da proteinlerinin oksidatif olarak hasar görmesiyle ilişkili olabilir (Tambussi, 2000). Bitkilerde fotosentetik kapasite, ortamın ışık yoğunluğu ve oransal su kapsamının değişimine bağlı olarak da etkilenmektedir.

Asraf ve ark. (2002), kuraklık stresi sonucu fotosentezin, stomaların kapanması ve fotosentezde görevli enzimlerin engellenmesi sonucu azaldığını ifade etmişlerdir.

Xu ve Zhou (2008), kuraklık stresi altında fotosentezde meydana gelen sınırlamanın stomal ve stomal olmayan faktörler sonucu meydana gelebileceğinin, bu etkinin stresin şiddetine ve çeşit özelliğine bağlı olarak değişebileceğini ifade etmişlerdir. Araştırıcılar su stresinin fotosentez ve stoma yoğunluğunu etkilediğini, çimde yaptıkları bir çalışma sonucunda orta şiddette devam eden su stresi koşullarında stoma sayısının arttığı ancak çok şiddetli su stresi karşısında stoma sayısının da azalma eğilimi gösterdiğini bildirmişlerdir. Stoma boyutu kuraklık stresi ile azalırken, stoma yoğunluğunun stoma geçirgenliği, net CO2asimilasyon oranı ve su kullanım etkinliği ile pozitif bir ilişkisi olduğunu bildirmişlerdir.

2.7. Bitkilerin Stres Koşullarına Verdikleri Cevaplar

Bitkilerde stres faktörlerine karşı iki farklı tepki gözlenmektedir: Bunlar; stres faktörlerinden kaçınma veya bunlara karşı toleranstır (Cruz de Carvalho ve ark., 1998).

2.7.1. Kaçınma

Stres faktörlerinin bitki dokularına girişinin önlenmesini veya azaltılmasını ifade etmektedir. Stresten kaçınma mekanizmasından ilki bitkinin çevre ile temas halinde olduğu yüzeylerinde morfolojik ve kimyasal kompozisyondaki değişimlerdir. Bu

(23)

değişimler yaprak ayasının alanı ve kalınlığı, stomaların büyüklüğü ve yoğunluğu, kütikulanın kalınlığı ve kimyasal kompozisyonu, yaprak ve kök salgılarında toksik ve engelleyici komponentlerin oluşumunu içermektedir.

Stresten kaçınma mekanizmasından ikincisi olan ontogenetik değişmeler ise stres olayından önce dormant ontogenetik faza (tohum, yumru oluşumu) geçiş sağlanarak, bitki üretkenliği garantili hale getirmektir.

2.7.2. Tolerans

Stres faktörlerinin etkisini elimine etme, azaltma veya tamir etme mekanizmalarını ifade etmektedir. Bu tepki tipi, doku seviyesindeki değişiklikleri (sakızların, yara periderminin oluşumu gibi), subselüler seviyedeki değişiklikleri (duvar ilavelerinin; membran, kloroplast ve hücre duvarı modifikasyonlarının oluşumu gibi), moleküler (sekonder metabolitlerin, polisakkaritlerin, fenol polimerlerinin ve stres proteinlerinin sentezi) ve submoleküler seviyedeki değişiklikleri kapsamaktadır (Edreva, 1998).

2.8. Antioksidant Sistem

Antioksidantlar, hem doğrudan hem de dolaylı olarak ilaçların, karsinojenlerin ve bazı toksik radikal reaksiyonlarının istenmeyen etkilerine karşı hücreleri koruyan maddelerdir. Vitamin A, C, E, beta-karoten, metallotionin, poliaminler, melatonin, NADPH, adenozin, koenzim Q-10, ürat, ubikinol, polifenoller, flavonoidler, fitoöstrojenler, sistein, homosistein, taurin, metiyonin, s-adenozil-L-metiyonin, resveratrol, nitroksidler, GSH, bu gruba giren antioksidantlar arasındadır (Mercan, 2004).

Bitkiler antioksidant sistem sayesinde kendilerini çevrenin zararlı etkilerinden (sıcaklık, radyasyon, ağır metal kirliliği vb.) korurlar. Süperoksit dismutaz, katalaz ve peroksidazlar gibi bitki antioksidant sisteminin parçası olan bir grup protein, kuraklığın neden olduğu oksidatif stres sonucu hızla aktive edilir. Antioksidant sistem antioksidant

(24)

enzimler ve antioksidant bileşiklerden oluşmaktadır. Antioksidant enzimler; süperoksit dismutaz, katalaz, askorbat peroksidaz ve glutatyon redüktaz gibi çok sayıda enzimi içermektedir. Antioksidant bileşikler ise karotenoidler, ksantofiller, askorbik asit, glutatyon ve tokoferoller gibi çok sayıda bileşikten meydana gelir. Olumsuz çevre şartları bitkilerde stres metabolitlerinin birikimini artırır. Prolin, stres metabolitleri içinde en yaygın olanıdır. Bitkiler su eksikliği, yüksek tuzluluk, soğuk, sıcaklık ve ağır metallere maruz kaldıklarında, prolin içeriğinin arttığı görülmüştür. Prolin birikimi, çevresel stres indikatörü olarak değerlendirilmektedir (Chen et al. 2003).

2.8.1. Katalaz (E.C.1.11.1.6)

Katalaz enzimi, konsantrasyonu yüksek olan hidrojen peroksitin su ve oksijene kadar parçalanmasını sağlar. Bu enzim yapısında prostetik grup olarak porfirin içerir ve molekül ağırlığı yüksek olan bir enzimdir. Katalaz genellikle bitkilerin yaprak, kotiledon ve kök hücrelerinde peroksizom ve glioksizomlarında bulunur. Bundan farklı olarak ise mısırda bulunan CAT III ise hücrelerin mitokondrilerindedir (Öztürk, 2002).

Katalaz enziminin ana fonksiyonu, moleküler oksijen varlığında hücre metabolizmasının bazı basamaklarında sentezlenen, radikal özellikli hidrojen peroksit veya ROOH gibi herhangi bir peroksitin radikal özelliğini gidererek oluşturabilecekleri geri dönüşümsüz hasarların önüne geçmektir. Zira hidrojen peroksit, potansiyel bir singlet oksijen ve hidroksil radikali (OH-) kaynağıdır (Öztürk, 2002).

2.8.2. Peroksidaz (E.C.1.11.1.7)

Peroksidaz enzimleri, hidrojen peroksit substratını kullanarak pek çok organik ve inorganik maddenin oksidasyonunu katalizleyen enzim grubudur. Peroksidazların molekül ağırlıkları genellikle 35-100 kDa arasında değişmektedir. Peroksidaz enzimleri, fenoller, hidrokinonlar, hidrokinoidaminler (yalnızca benzidin türevi olanlar) gibi pek çok sayıda aromatik komponentlerin dehidrojenasyonlarınıda katalizlemektedirler.

(25)

Peroksidazlar, çesitli aromatik bileşikleri substrat olarak kullanarak metabolizmanın sonucunda meydana gelen hidrojen peroksiti etkisiz hale getirirler (Öztürk, 2002).

2.8.3. Askorbat peroksidaz (EC 1.11.1.11)

Askorbat peroksidaz hücrelerde meydana gelen fizyolojik olaylar sonucunda ortaya çıkan hidrojen peroksitin hasarlarını ortadan kaldırır. Bu enzim baskın olarak sitoplazmada, mitokondrilerde ve kloroplastlarda bulunur. Askorbat peroksidaz, hidrojen peroksiti nötralize etmek için askorbatı bir elektron vericisi olarak kullanır. Bu enzim askorbat-glutatyon döngüsündeki ilk enzimdir. Askorbat peroksidaz hidrojen peroksitin suya redüksiyonunu katalizler ve bir redüktant olarak askorbata karşı yüksek bir afinitesi ve spesifikliği vardır (Asada,1999).

2.9. Papaveraceae Familyasının Genel Özellikleri

Papaveraceae familyasına ait türler genellikle Kuzey Yarımkürenin ılıman ve subtropik bölgelerinde yayılış göstermektedir. Bu familyada 28 cins ve yaklaşık 250 tür vardır. Ülkemizde bu familyaya ait 5 cins bulunmaktadır (Seçmen ve ark., 1995; Güner ve ark., 2000).

2.9.1 Papaver somniferum L. Bitkisinin Genel Özellikleri

Haşhaş bitkisi, narkotik ve analjezik morfin ve kodein gibi benzilizokinolin alkaloitlerinin büyük bir kısmını üreten, tohum ve yağından yararlanılan ve aynı zamanda tıbbi amaçla veya süs bitkisi olarak da kullanılan çok yönlü bir bitkidir (Facchini ve ark., 2007). Ticari öneminden dolayı Türkiye’ de üretimi kontrol altında olup, belirli bölgelerde yetiştirilmesine izin verilmiştir.

(26)

2.9.2. Türkiye’de Tescil Edilen Bazı Haşhaş Çeşitleri

Türkiye’de ilk defa, 1984 yılında Ege Üniversitesi Ziraat Fakültesinde Prof. Dr. Şükrü Emiroğlu tarafından Emiral-84 çeşidi haşhaş tescil ettirilmiştir. Bu çeşit gri-nefti tohum renkli ve kırmızı çiçeklidir. Tohumluk üretimi yoktur.

Toprak Mahsulleri Ofisince geliştirilen bazı haşhaş çeşitleri;

Ofis-95, Afyon-95, Ofis-96 çeşitleri çiftçi populasyonundan seleksiyonla elde edilmişlerdir. Sarı tohumludurlar. Çeşitli bölgelere adaptasyon kabiliyetleri yüksektir. Morfin oranları %0,55-0,75 arasındadır.

Ayrıca Danimarka kökenli, mutlak yazlık, küçük kapsüllü Bolvadin-95 çeşidi tescil ettirilmiş olup ıslahta melezleme materyali olarak kullanılmaktadır. Morfin oranı çok yüksektir.

Eskişehir-Anadolu Tarımsal Araştırma Enstitüsünde ıslah edilen çeşitler;

Anayurt-95 ve Kemerkaya-95 çeşitleri sarı tohumludur. Çiftçi populasyonundan seleksiyonla elde edilmişlerdir. Adaptasyon kabiliyetleri iyidir. Morfin oranları %0,40-0,60 arasındadır.

Ankara-Tarla Bitkileri Merkez Araştırma Enstitüsünde Islah Edilen Çeşitler;

Beyaz Tohumlu Çeşitlerden Ankara-94 seleksiyonla ıslah edilmiştir. Tohum verimi yüksek, erkenci ve geniş adaptasyon kabiliyetine sahiptir. Kışlık ve yazlık olarak ekilebilir. Morfin oranı %0,40-0,60 arasındadır.

Kocatepe-96 ise melezlemeyle ıslah edilmiştir, morfin oranı yüksek bir çeşittir. (%0,60-0,85) Kışlık ve yazlık ekilebilir. Yazlık ekimlerin sulanabilir yerlerde yapılması gereklidir.

(27)

Beyaz haşhaş tohumları iç tüketimde börek, çörek ve tatlı imalinde ve pastacılıkta tercih edilir. Ayrıca ihracata uygundur.

Sarı Tohumlu Çeşitler Afyon 95 ve Karahisar-96’dır. Bunlardan Afyon Kalesi-95 melezleme ile ıslah edilmiştir. Kapsül, tohum ve morfin verimi üstün bir çeşittir. (Morfin oranı %0,55-0,85) Geniş adaptasyon kabiliyeti gösterir. Kışlık ve yazlık ekilebilir. Yazlık ekimlerin sulanabilir alanlarda yapılması uygundur. Karahisar-96 ise; Melezleme ile elde edilmiştir. Adaptasyon kabiliyeti yüksek ve verimli bir çeşittir. Morfin oranı %0,55-0,80’dir.

Sarı tohumlu çeşitler iç tüketimde börek-çörek yapılmasında ve yağ elde edilmesinde tercih edilir.

Mavi Tohumlu Şuhut-94, seleksiyonla elde edilmiştir. Morfin oranı yüksektir (%0,50-0,90). Kışlık ve yazlık ekilebilir. Kışlık ekimlerin taban tarlalarda yapılması, yazlık ekimlerin ise sulanabilir şartlarda yapılması uygundur. Camcı-95 ise, melezleme ile elde edilmiştir. Morfin oranı yüksektir (%0,58-0,85). Morfin verimi, tohum ve kapsül verimleri iyi durumda olan bir çeşittir. Kışlık ve yazlık ekilebilir. Yazlık ekimlerin sulanabilen yerlerde olması tavsiye edilir. Adaptasyon kabiliyeti iyidir. Mavi haşhaş tohumları ihracata uygundur.

Ankara Tarla Bitkileri Merkez Araştırma Enstitüsünde geliştirilen çeşitlerin ıslahçısı Dr. Hüseyin CAMCI, Afyon Kocatepe Tarımsal Araştırma Enstitüsünde çalışmaktadır. Haşhaş Islahı ve tohumluk üretimi çalışmalarına bu enstitüde devam edilmektedir.

(28)

3.1. MATERYAL

Araştırmada tescili haşhaş (Papaver somniferum L.) bitki çeşitleri materyal olarak kullanılmıştır. Çalışmamızda bitki materyalleri Toprak Mahsulleri Ofisinden (TMO) ve Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Öğretim Üyelerinden Prof. Dr. Neşet ARSLAN’ dan temin edilmiştir. Otoklavda sterile edilerek viyollere konan toprak karışımına (% 40 torf, % 40 toprak, %20 kum) doğrudan tohum ekimi gerçekleştirilmiştir. Viyollerdeki bitkiler, sera koşullarında kontrollü olarak yetiştirilmiştir. Haşhaşlar yeterli büyüklüğe geldiklerinde 40 kg’lık kasalara aktarılmıştır. Beş aylık büyüme periyodu sonunda kasa içerisindeki haşhaşlar 3 günde bir olmak üzere 4 farklı dozda (%100, %80, %40, %20) 20 gün boyunca sulanmıştır. Su uygulamasının hemen ardından hasat edilen genç yapraklar sıvı azot ile dondurulmuş ve alüminyum folyolara sarılarak, analizlerin yapılacağı zamana kadar saklanmak üzere -80 °C dondurucuya kaldırılmıştır.

(29)

Araştırma’da Kullanılan Haşhaş Çeşitleri Çizelge 3.1. Haşhaş Çeşitlerinin İsimleri

Örnek No Çeşit Adı Örnek No Çeşit Adı

1 KOCATEPE-96 10 OFİS-8 2 ANKARA-94 11 CAMCI-95 3 OFİS-4 12 OFİS-95 4 ŞUHUT-94 13 KEMERKAYA-95 5 ANAYURT-95 14 OFİS-96 6 TMO-1 15 KARAHİSAR-96

7 TMO-3 16 AFYON KALESİ

8 TMO-2 17 OFİS-3

(30)

3.2. YÖNTEM

3.2.1. Çalışmada kullanılan kimyasal maddeler;

1. Potasyum di-hidrojen fosfat (KH2PO4) 2. Hidrojen peroksit (H2O2)

3. Askorbik asit 4. Guiacol

5. Sülfosalisilik asit

6. Coomassie brillant blue G-250 7. Sığır serum albumini

8. Etanol

9. Hidroklorik asit 10. Sodyum hidroksit

3.2.2. Çalışmada Kullanılan Cihazlar

1. Etüv: Nüve (Ankara, Türkiye)

2. Hassas/Analitik terazi: Shimadzu (Osaka, Japonya) 3. Manyetik karıştırıcı: Heidolph (Almanya)

4. Spektrofotometre: Jasco V- UV/VIS 5. Otomatik pipetler: Ephendorf (Almanya)

6. Soğutmalı mikrosantrifüj: Hettich R22 (Almanya) 7. Santrifüj: Nüve (Ankara, Türkiye)

8. pH metre: Hanna (Romanya)

(31)

3.2.3. Kullanılan Çözeltiler 3.2.3.1. Homojenat Tamponu

1. 50 mM KH2PO4 (pH=7)

3.2.3.2. Katalaz Aktivitesinin Ölçülmesi için Kullanılan Çözeltiler

1. 50 mM KH2PO4 (pH=7) (aktivite tamponu) 2. 30 mM H2O2 (substrat çözeltisi)

3.2.3.3. Peroksidaz Aktivitesinin Ölçülmesi için Kullanılan Çözeltiler

1. 50 mM KH2PO4 (pH=6,5) (aktivite tamponu) 2. 22,5 mM H2O2 (substrat çözeltisi)

3. 30 mM Guaiacol (substrat çözeltisi)

3.2.3.4. Askorbat Peroksidaz Aktivitesinin Ölçülmesi için Kullanılan Çözeltiler

1. 50 mM KH2PO4 (pH=6) (aktivite tamponu) 2. 2.5 mM Askorbik Asit (substrat çözeltisi) 3. 10 mM H2O2 (subsrat çözeltisi)

3.2.3.5. Protein Miktarının Belirlenmesinde Kullanılan Çözeltiler

(32)

3.2.4. Katalaz, Peroksidaz, Askorbat Peroksidaz Aktivitesinin ve Protein Miktarının Belirlenmesi için Homojenat Hazırlanması

Enzim aktivitelerinin ve protein miktarının belirlenebilmesi için 0,3 g yaprak dokusu 1,5 ml 50 mM KH2PO4 (pH=7) tamponu içerisinde porselen havanda homojenize edilmiştir. Homojenat eppendorf tüplerine aktarılarak +40

C’de 15000 x g’de 20 dakika süresince santrifüj edildi. Santrifügasyon sonucunda elde edilen süpernatantlar buzdolabında saklanmış ve enzim aktivite ölçümlerinde kullanılmıştır.

3.2.5. Katalaz Aktivitesinin Belirlenmesi

Katalaz aktivitesi spektrofotometrik olarak Bergmeyer (1970) yöntemine göre belirlenmiştir. Katalaz hidrojen peroksitin su ve oksijen ’e parçalanmasını katalizleyen bir enzimdir. Aktivite ölçümü ise bu reaksiyon sırasında H2O2’nin su ve oksijene parçalanması sırasında meydana gelen renk açılmasının 240 nm’de izlenmesi esasına dayanır. Aktivite ölçümünde 3 ml’lik reaksiyon karışımına, 50 mM potasyum fosfat tamponu (pH 7,0), 30 mM H2O2 ve 30 μl homojenat konulmuş ve 2 dakika boyunca spektrofotometrede absorbansı ölçülmüştür. Ölçümlerde lineer olarak absorbans azalması olan aralıktan dakika başına düşen absorbans hesaplanmıştır. 240 nm’de, bir dakika içerisinde 1 μmol H2O2’nin parçalanmasını sağlayan enzim miktarı 1 ünite olarak belirlenmiştir. Sonuçlar hesaplanırken bulunan enzim ünitesi miktarları belirlenen protein miktarına oranlanarak spesifik aktivitesi hesaplanmıştır.

3.2.6. Peroksidaz (E.C.1.11.1.7) Aktivitesinin Belirlenmesi

Peroksidaz aktivitesinin belirlenmesi için aktivite ölçümünde 3 ml’lik reaksiyon karışımı 50 mM potasyum fosfat tamponu (pH 7.0), 22,5 mM H2O2, 30 mM guaiacol ve 20 μl enzimekstraktından oluşacak şekilde hazırlanmıştır. Reaksiyon aktivite ölçüm ortamınaen son olarak enzim çözeltisinin ilave edilmesiyle başlanmıştır ve 470 nm’de 2 dakika boyunca optik dansitesi kaydedilmiştir. Bir enzim ünitesi bir dakikada 1 μmol guaiacol’u katalizleyen enzim miktarı olarak hesaplanmıştır. (Angelini ve ark., 1990).

(33)

Sonuçlar hesaplanırken bulunan enzim ünitesi miktarları belirlenen protein miktarına oranlanarak spesifik aktivitesi hesaplanmıştır.

3.2.7. Askorbat Peroksidaz Aktivitesinin Belirlenmesi

Askorbat peroksidaz aktivitesi spektrofotometrik olarak Nakano ve Asada (1981) yöntemine göre belirlenmiştir. Spektrofotometrik olarak askorbat peroksidaz aktivitesinin belirlenmesi için aktivite ölçümünde 3 ml’lik reaksiyon karışımı 50 mM fosfat tamponu (pH=7), 10 mM H2O2, 2.5 mM askorbik asit ve 50 μl enzim ekstraktından oluşacak şekilde hazırlandı. Reaksiyon aktivite ölçüm ortamına en son olarak hidrojen peroksitin ilave edilmesiyle başladı ve 2 dakika boyunca 290nm’de absorbansı kaydedildi. Enzim aktivitesi askorbatın ekstinksiyon katsayısı kullanılarak hesaplandı (2.8 mM-1 cm-1) (Karabal et al., 2003). Sonuçlar hesaplanırken bulunan enzim ünitesi miktarları belirlenen protein miktarına oranlanarak spesifik aktivitesi hesaplanmıştır.

3.2.8. Protein Miktarının Belirlenmesi

Yapraklardaki protein miktarı Bradford (1976) yöntemine göre belirlenmiştir. Bu yöntemde kullanılan boya (Coomassie brillant blue G-250) negatif yüklüdür ve protein üzerindeki pozitif yüklere bağlanır. Bu boyanın kırmızı (Amax=465 nm) ve mavi (Amax=595 nm) formları mevcuttur. Boya ile proteinin bağlanması kırmızı formun mavi forma dönüşümünü sağlar. Hızlı ve tekrarlanabilir olan bu yöntemde meydana gelen renk, stabilitesini bir saat kadar koruyabilir.

Protein miktarının belirlenebilmesi için 0,3 g yaprak dokusu 1,5 ml 50 mM KH2PO4 (pH=7) tamponu içerisinde porselen havanda homojenize edilmiştir. Homojenat eppendorf tüplerine aktarılarak +4 °C’de 15000 x g’de 20 dakika santrifüj edilmiştir. Süpernatanttan 20 μl alınarak üzerine 2,5 ml Coomassie brillant blue G-250 ilave edilmiştir. Her bir tüp votekslenerek 10 dakika inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyonun ardından tüplerin 595 nm’deki absorbansları ölçülerek, standart grafik yardımıyla yapraklardaki protein miktarı belirlenmiştir.

(34)

Standart grafik için ilk önce 1ml’sinde 1 mg protein çözeltisi ihtiva eden sığır serum albumin çözeltisi hazırlanmıştır. Hazırlanan bu stok çözeltiden tüplere sırasıyla 0, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 μl pipetlenmiş ve son hacimler saf su ile 100 μl’ye tamamlanmıştır. Her bir tüpün üzerine 2,5 ml Coomassie brillant blue G-250 ilave edilip ve vortekste karıştırılarak ve 10 dakikalık inkübasyondan sonra 595 nm’de absorbansları ölçülmüş ve her bir protein miktarına karşılık gelen absorbanslara standart grafik hazırlanmıştır.

Şekil 3.2 Protein tayininde kullanılan BSA standart grafiği 3.2.9. İstatistik Analiz

Denemeler, üç tekrarlı yapılmıştır. Çalışma sonucunda elde edilen verilerin istatistiki analizleri, SPSS for Windows 15.0 Evaluation Version istatistik programı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Kontrol ve uygulama grupları arasındaki farklılıklar Duncan çoklu aralık testine göre p<0,05 önemlilik değerinde yapılmış ve bu farklılıklar, tek yönlü varyans analizi (one-way ANOVA) ile analiz edilmiştir (Duncan, 1955).

y = 0,013x + 0,009 R² = 0,989 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 0 20 40 60 80 100 Abso rba ns ( 595nm )

(35)

4.1. Su Stresi Uygulamalarının Toplam Protein Miktarı Üzerine Etkisi

Çalışmamızda tescilli haşhaş (Papaver somniferum L.) çeşitlerinin beş aylık fidelerinde su stresi (%100, %80, %40, %20 oranında sulama) uygulamalarının toplam protein miktarı üzerindeki etkisi ile elde ettiğimiz bulgular Çizelge 4.1. ve Şekil 4.1.’de gösterilmiştir.

Sonuçlar Şekil 3.2. ‘de gösterilen standart grafiğe göre mg/ml cinsinden hesaplanmıştır. Hafif kuraklık stresine (%80 sulama) maruz kalan bitkilerde protein miktarı artarken orta (%40 sulama) ve şiddetli (%20 sulama) kuraklık stresine maruz kalan bitkilerde protein miktarı azalmıştır. Buna rağmen Afyon Kalesi, Ankara94 çeşitlerinde protein miktarı azalma gözlenmezken, Ofis 96 ve Kemerkaya 96 çeşidinde %80 ve % 20 sulama gruplarında önemli bir artış gözlenmiştir.

Çizelge 4.1. Su stresi uygulamasının tescilli haşhaş (Papaver somniferum L.) çeşitlerinin 5 aylık gelişen bitkilerinde toplam protein miktarı (mg/ml) üzerine etkisi

Protein Miktarı (mg/ml) Kontrol

Grubu

%80 Sulama %40 Sulama %20 Sulama

Afyon 95 1,69 4,68 4,34 Afyon Kalesi 4,62 4,98 4,86 Anayurt 95 5,01 4,83 4,64 2,89 Ankara 94 1,32 3,93 5,32 Camcı 95 3,22 5,07 2,08 Karahisar 96 4,44 6,15 5,90 3,07 Kemerkaya 96 3,73 8,41 2,47 7,21 Kocatepe 96 2,41 5,16 4,27 3,39 Ofis 3 4,07 4,76 3,40 2,54 Ofis 4 3,67 4,25 2,61 2,11 Ofis8 3,44 4,15 5,79 2,91 Ofis 95 4,86 4,61 2,55 Ofis 96 1,67 3,85 1,88 3,94 Şuhud 94 4,25 4,17 3,78 5,92 Tmo 1 4,16 5,69 4,25 2,48 Tmo 2 3,08 4,13 1,13 2,56 Tmo 3 2,20 3,05 3,69 1,78

(36)

(37)

Şekil 4.1. Su stresi uygulamasının tescilli haşhaş (Papaver somniferum L.) çeşitlerinin 5 aylık gelişen bitkilerinde toplam protein miktarı (mg/ml) üzerine etkisi.

b a _a 0 2 4 6

Kontrol Grup %80 Sulama %40 Sulama %20 Sulama

Pr otei n Mi kta rı (m g/ m l) Afyon 95 a a a 0 2 4 6

Pr otei n Mi kta rı (m g/ m l) Afyon Kalesi a a _a b 0 5 10

Pr otei n Mi kta rı (m g/ m l) Anayurt 95 b a a 0 2 4 6 8

Pr otei n Mi kta rı (m g/ m l) Ankara 94 b a b 0 2 4 6

Pr otei n Mi kta rı (mg /ml Camcı 95

(38)

Şekil 4.1. (devam) a a a a 0 5 10

Pr otei n Mi kta rı (m g/ m l) Karahisar 96 bc a c ab 0 5 10 15

Pr otei n Mi kta rı (m g/ m l) Kemerkaya 96 b a ab ab 0 2 4 6 8

Pr otei n Mi kta rı( mg /ml ) Kocatepe 96 a a a a 0 2 4 6 8

Pr otei n Mi kta rı( mg /ml ) Ofis 3 ab a bc _c 0 1 2 3 4 5

Pr oei n Mi kta rı (m g/ m l) Ofis 4

(39)

Şekil 4.1. (devam) bc b a c 0 2 4 6 8

Pr otei n Mi kta rı (m g/ m l) ofis 8 a a b 0 2 4 6

Pr otei n Mi kta rı (m g/ m l) Ofis 95 b a b a 0 1 2 3 4 5

Pr otei n Mi kta rı (m g/ m l) Ofis 96 a _a a a 0 2 4 6 8

Pr otei n Mi kta rı (m g/ m l) Şuhud 94 ab a _ab b 0 2 4 6 8

Pr otei n Mi kta rı (m g/ m l) TMO 1

(40)

Şekil 4.1. (devam)

4.2. Su Stresi Uygulamaların Askorbat Peroksidaz Aktivitesi Üzerine Etkisi

Çalışmamızda 17 tescilli haşhaş (Papaver somniferum L.) çeşidinin beş aylık fidelerinde su stresi (%100, %80, %40, %20 oranında sulama) uygulamalarının askorbat peroksidaz aktivitesi üzerindeki etkisi sonucunda elde ettiğimiz bulgular Çizelge 4.2 ve Şekil 4.2’de gösterilmiştir. Sonuçlar hesaplanırken bulunan enzim ünitesi miktarı belirlenen protein miktarına oranlanmıştır.

Elde edilen sonuçlar doğrultusunda kontrol grubuna göre %80 sulama yapılan bitkilerin tümünde APX aktivitesinde azalma gözlenmiştir. %40 sulama yapılan Camcı 95, Kemerkaya 96, Ofis 95, Ofis 96 ve TMO 2 çeşitlerindeki APX aktivitesi kontrol grubuna göre artmış, Afyon 95’te değişmemiş diğerlerinde ise azalma gözlenmiştir. % 80 sulama yapılan grupla karşılaştırıldığında APX aktivitesinde artış belirlenmiştir. % 20’lik sulama grubu kontrol grubu ile karşılaştırıldığında APX aktivitesinde belirgin bir artış bulunmaktadır. Ankara 94 ve Ofis 3 çeşitlerinde APX aktivitesi azalmıştır.

ab a b ab 0 2 4 6

Pr otei n Mi kta rı (m g/ m l) TMO 2 b a a b 0 1 2 3 4 5

Pr otei n Mi kta rı (m g/ m l) TMO 3

(41)

Çizelge 4.2. Su stresi uygulamasının tescilli haşhaş (Papaver somniferum L.) çeşitlerinin 5 aylık gelişen bitkilerinde askorbat peroksidaz (EU/g yaprak) üzerine görülen etkisi

Su stresinin askorbat peroksidaz üzerine etkisi

%100 Sulama %80 Sulama %40 Sulama %20 Sulama

Şekil 4.2. Su stresi uygulamasının tescilli haşhaş (Papaver somniferum L.) çeşitlerinin 5 aylık gelişen bitkilerinde askorbat peroksidaz aktivitesi üzerine görülen etkisi.

a b b 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

En zi m Ün ites i ( EU/ g yap rak ) Afyon 95 a a a 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

En zi m Ün ites i ( EU/ g yap rak ) Afyon Kalesi

(42)

Şekil 4.2. (devam) b b b a 0 0,5 1 1,5 2 2,5

En zi m Ün ites i ( EU/ g yap rak ) Anayurt 95 a a a 0 0,2 0,4 0,6 0,8

En zi m Ün ites i ( EU/ g yap rak ) Ankara 94 a b a 0 0,5 1 1,5

En zi m Ün ites i ( EU/ g yap rak ) Camcı 95 b b b a 0 0,5 1 1,5

En zi m Ün ites i ( EU/ g yap rak ) Karahisar 96 b _b a a 0 0,5 1 1,5 2

En zi m Ün ites i ( EU/ g yap rak ) KemerKaya 96

(43)

Şekil 4.2. (devam) b ab b a 0 0,5 1

En zi m Ün ites i (EU /g y ap rak ) Kocatepe 96 a a a a 0 0,2 0,4 0,6 0,8

En zi m Ün ites i ( EU/ g yap rak ) Ofis 3 b b _b a 0 0,5 1 1,5

En zi m Ün ites i ( EU/ g yap rak ) Ofis 4 b b b a 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

En zi m Ün ites i (EU /g y ap rak ) Ofis 8 c b ab a 0 0,2 0,4 0,6 0,8

En zi m Ün ites i ( EU/ g yap rak ) Ofis 96

(44)

Şekil 4.2. (devam) b b b a 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

En zi m Ün ites i ( EU/ g yap rak ) Şuhud 94 b b b a 0 0,2 0,4 0,6 0,8

En zi m Ün ites i ( EU/ g yap rak ) TMO 1 a a _a a 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

En zi m Ün ites i ( EU/ g yap rak ) TMO 2 b b b a 0 0,5 1 1,5 2

En zi m Ün ites i ( EU/ g yap rak ) TMO 3

(45)

4.3. Su Stresi Uygulamalarının Katalaz Aktivitesi Üzerine Etkisi

Çalışmamızda kullanılan 17 tescilli haşhaş (Papaver somniferum L.) çeşitlerinin beş aylık fidelerinde su stresi (%100, %80, %40, %20 oranında sulama) uygulamalarının katalaz aktivitesi üzerindeki etkisi ile elde ettiğimiz bulgular Çizelge 4.3 ve Şekil 4.3’de gösterilmiştir.

Sonuçlar hesaplanırken bulunan enzim ünitesi miktarı belirlenen protein miktarına oranlanmıştır. Hafif kuraklık stresine (%80 sulama) maruz kalan bitkilerde kontrol grubuna göre katalaz enzim aktivitesi Afyon Kalesi, Camcı 95, Karahisar 96, Ofis 3, TMO 1 bitkileri dışındaki tüm bitkilerde artmıştır. Orta kuraklık stresine (%40 Sulama) maruz kalan bitkilerde katalaz aktivitesi kontrol grubuna göre Afyon Kalesi, Anayurt 95, Ankara 94, Kemerkaya 96 ve TMO 1 çeşitleri dışındaki tüm bitkilerde artma gösterirken, şiddetli (%20 sulama) kuraklık stresine maruz kalan bitkilerde katalaz aktivitesi Kocatepe 96, Ofis 3 ve Ofis 8 haricindeki çeşitlerde artış göstermiştir.

Çizelge 4.3. Su stresi uygulamasının tescilli haşhaş (Papaver somniferum L.) çeşitlerinin 5 aylık gelişen bitkilerinde katalaz (EU/g yaprak) aktivitesi üzerine görülen etkisi

Su stresinin katalaz üzerine etkisi

(46)

Şekil 4.3. Su stresi uygulamasının tescilli haşhaş (Papaver somniferum L.) çeşitlerinin 5 aylık gelişen bitkilerinde katalaz aktivitesi üzerine etkisi.

b _b a 0 5 10 15

En zi m Ün ites i ( EU/ g yap rak ) Afyon 95 a b _b 0 10 20 30

En zi m Ün ites i (EU /g y ap rak ) Afyon Kalesi b a b ab 0 5 10 15

En zi m Ün ites i (EU /g y ap rak ) Anayurt 95 b a c 0 5 10 15 20 25

En zi m Ün ites i (EU /g y ap rak ) _{Ankara 94} ab b a 0 20 40 60 80 100

En zi m Ün ites i (EU /g y ap rak ) Camcı 95

(47)

Şekil 4.3. (devam) b c b a 0 20 40 60 80

En zi m Ün ites i ( EU/ g yap rak ) Karahisar 96 b b b a 0 10 20 30 40 50

En zi m Ün ites i ( EU/ g yap rak ) Kemerkaya 96 a a a a 0 5 10 15 20

En zi m Ün ites i ( EU/ g yap rak ) Kocatepe 96 ab a b a 0 0,51 1,52 2,53

En zi m Ün ites i(E U/ g yap rak ) Ofis 3 b _b a a 0 20 40 60 80 100

En zi m Ün ites i ( EU/ g yap rak ) Ofis 4

(48)

Şekil 4.3. (devam) b b a b 0 50 100

En zi m Ün ites i (EU /g y ap rak ) Ofis 8 b b a 0 5 10 15

En zi m Ün ites i ( EU/ g yap rak ) Ofis 95 b b a b 0 20 40 60 80 100

En zi m Ün ites i ( EU/ g yap rak ) Ofis 96 a a a a 0 1 2 3 4 5 6

En zi m Ün ites i ( EU/ g yap rak ) Şuhud 94 ab ab b a 0 5 10 15 20 25

(49)

Şekil 4.3. (devam)

4.4. Su Stresi Uygulamalarının Peroksidaz Üzerine Etkisi

Çalışmamızda tescilli haşhaş (Papaver somniferum L.) çeşitlerinin beş aylık fidelerinde su stresi (%100, %80, %40, %20 oranında sulama) uygulamalarının peroksidaz aktivitesi üzerindeki etkisi ile elde ettiğimiz bulgular Tablo 4.4 ve Şekil 4.4’de gösterilmiştir. Sonuçlar hesaplanırken bulunan enzim ünitesi miktarı belirlenen protein miktarına oranlanmıştır. % 80 sulama uygulanan gruplarda kontrol grubuna göre POD aktivitesi Afyon Kalesi, Anayurt 95, Kocatepe 96, Ofis 8, Ofis 95, Ofis 96, TMO 1 ve TMO 2 çeşitlerinde artış gözlenmiş ancak diğer çeşitlerde azalma gözlenmiştir. % 40 sulama yapılan gruplarda kontrol grubuna göre TMO 1 ve TMO 2 dışındaki tüm çeşitlerde POD aktivitesinde azalma belirlenmiştir. Bununla birlikte % 80 sulama yapılan çeşitlerle karşılaştırdığımızda POD aktivitesinde % 40’lık grupta belirgin bir azalmanın olduğu belirlenmiştir. % 20 sulama yapılan grupta ise kontrol grubuna göre Anayurt 95, Karahisar 96, Kemerkaya 96, Ofis 96 ve Tmo 2 bitkilerinde POD aktivitesi artmıştır. b b a ab 0 10 20 30 40

En zi m Ün ites i ( EU/ g yap rak ) TMO 2 b a a _a 0 5 10 15 20

(50)

Çizelge 4.4. Su stresi uygulamasının tescilli haşhaş (Papaver somniferum L.) çeşitlerinin 5 aylık gelişen bitkilerinde Peroksidaz (EU/g yaprak) üzerine görülen etkisi.

Su stresinin peroksidaz üzerine etkisi

Afyon 95 0,71 1,00 0,50 Afyon Kalesi 0,32 0,61 0,20 Anayurt 95 _0,46 _0,63 _0,31 _0,62 Ankara 94 1,20 0,13 0,04 Camcı 95 _0,46 _0,27 _0,27 Karahisar 96 _0,95 _0,73 _0,07 _0,13 Kemerkaya 96 0,48 0,43 0,30 0,13 Kocatepe 96 _0,24 _0,72 _0,09 _0,16 Ofis 3 1,69 1,24 0,30 0,20 Ofis 4 _2,43 _0,34 _0,16 _0,10 Ofis8 0,41 3,52 0,37 0,32 Ofis 95 _0,58 _0,62 _0,39 Ofis 96 _0,13 _0,47 _0,32 _0,17 Şuhud 94 _0,35 _0,30 _0,10 _0,29 Tmo 1 _0,26 _0,33 _0,27 _0,11 Tmo 2 0,05 0,72 0,76 0,07 Tmo 3 _0,56 _0,27 _0,06 _0,37

Şekil 4.4. Su stresi uygulamasının tescilli haşhaş (Papaver somniferum L.) çeşitlerinin 5 aylık gelişen bitkilerinde peroksidaz aktivitesi üzerine etkisi.

a a b 0 0,1 0,2 0,3 0,4

En zi m Ün ites i Afyon 95 a b b 0 0,2 0,4 0,6 0,8

En zi m Ün ites i Afyon Kalesi

(51)

Şekil 4.4. (devam) a a a a 0 0,5 1

En zi m Ün ites i Anayurt 95 a b b 0 0,5 1 1,5

En zi m Ün ites i (EU /g y ap rak ) Ankara 94 a a a 0 0,2 0,4 0,6

En zi m Ün ites i ( EU/ g yap rak ) Camcı 95 a ab b b 0 0,5 1 1,5

En zi m Ün ites i Karahisar 96 a a a a 0 0,2 0,4 0,6 0,8

En zi m Ün ites i Kemerkaya

(52)

Şekil 4.4. (devam) b a b b 0 0,2 0,4 0,6 0,8

En zi m Ün ites i Kocatepe 96 a a b _b 0 1 2 3

En zi m Ün ites i(E U/ g yap rak ) Ofis 3 a b b b 0 1 2 3 4

En zi m Ün ites i Ofis 4 b a b _b 0 1 2 3 4 5

En zi m Ün ites i Ofis 8 a a a 0 0,2 0,4 0,6 0,81

En zi m Ün ites i Ofis 95

(53)

Şekil 4.4. (devam) a c b c 0 0,2 0,4 0,6

En zi m Ün ites i Ofis 96 a a b a 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

En zi m Ün ites i Şuhud 94 a a _a a 0 0,2 0,4 0,6

En zi m Ün ites i Tmo 1 a b a b 0 0,5 1

En zi m Ün ites i TMO 2 b a c ab 0 0,2 0,4 0,6 0,8

En zi m Ün ites i TMO 3