Boğmacanın Moleküler Tanısı İçin Laboratuvar
Yapımı Bir PCR Yönteminin Geliştirilmesi ve
Optimizasyonu
Development and Optimization of an In-House PCR Method
for Molecular Diagnosis of Pertussis
Dilek GÜLDEMİR1, Efsun AKBAŞ1, Selin NAR ÖTGÜN1, Alicem TEKİN2, Berrin ESEN1
1Refik Saydam Hıfzıssıhha Merkezi Başkanlığı, Salgın Hastalıklar Araştırma Müdürlüğü, Ankara.
1Refik Saydam National Public Health Agency, Department of Communicable Diseases Research, Ankara, Turkey.
2Dicle Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Diyarbakır.
2Dicle University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Diyarbakir, Turkey.
ÖZET
Bordetella pertussis’in etken olduğu boğmaca, her yaştan duyarlı bireyi, özellikle de çocukları etki-leyen, akut, bulaşıcı bir solunum sistemi enfeksiyonu olup, ağır bir klinik tablo ile karakterizedir. Tanı-da kullanılan geleneksel kültür yönteminin özgüllüğü yüksek olmasına rağmen, duyarlılığı düşüktür. Bu nedenle boğmaca tanısında duyarlı, özgül ve hızlı bir tanı yöntemine gereksinim vardır. Polimeraz zin-cir reaksiyonu (PCR), boğmaca tanısında son yıllarda kullanılmaya başlanan yeni bir yaklaşımdır ve kül-tür yönteminden daha duyarlı olduğu gösterilmiştir. Çeşitli çalışmalarda PCR için seçilen hedef gen böl-geleri arasında; pertusis toksin geni (ptxA-Pr), insersiyon sekans genleri (IS481 ve IS1001), adenilat sik-laz geni, yapısal genlerden porin ve flajellin geni yer almaktadır. Bu araştırmada, ptxA-Pr ve IS481 gen bölgelerine özgül primerlerin kullanıldığı bir “in-house” PCR tanı yönteminin geliştirilmesi ve optimi-zasyonu amaçlanmıştır. Çalışmada, ptxA-Pr genine özgül PTp1/PTp2 primerleri ve IS481 genine özgül PIp1/PIp2 primerleri ve çeşitli standart bakteri suşlarının DNA’ları kullanılarak bir “in-house” PCR yön-temi geliştirilmiştir. Sağlıklı 45 bireyden alınan boğaz sürüntüsü ile azalan konsantrasyonlarda B.pertus-sis standart bakteri suşu karıştırılmak suretiyle oluşturulan “temsili nitelikte klinik örnekler” ile yöntemin duyarlılığı ve özgüllüğü test edilmiş ve optimizasyon yapılmıştır. PTp1/PTp2 primerlerinin kullanıldığı “in-house” PCR yönteminin özgüllüğünün yüksek, duyarlılığının ise düşük [34.4 cfu/Rm (koloni oluş-turan ünite/reaksiyon karışımı)] olduğu görülmüştür. PIp1/PIp2 primerlerinin kullanıldığı “in-house” PCR yönteminin ise B.pertussis ile B.bronchiseptica arasında çapraz reaksiyon vermesi nedeniyle özgül-lüğünün düşük olmasına rağmen, yüksek duyarlılık (1.12 cfu/Rm) gösterdiği tespit edilmiştir. Temsili
Geliş Tarihi (Received): 08.11.2010 • Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 14.07.2011
İletişim (Correspondence): Mik. Uzm. Dilek Güldemir, Refik Saydam Hıfzıssıhha Merkezi Başkanlığı, Salgın Hastalıklar Araştırma Müdürlüğü, Moleküler Mikrobiyoloji Araştırma ve Uygulama Laboratuvarı, Sıhhiye, Ankara, Türkiye.
nitelikteki klinik örnekler ile yapılan “in-house” PCR denemelerinden de benzer sonuçlar elde edilmiş-tir. Ayrıca yaptığımız eş zamanlı kültür çalışmasında, yöntemin B.pertussis saptama duyarlılığı 2 x 103 cfu/ml olarak saptanmıştır. Çalışmamızda, IS481 genini hedef alan PCR’nin duyarlılığı yüksek bulunur-ken, ptxA-Pr genini hedef alan PCR’nin özgüllüğü yüksek bulunmuş; bu nedenle boğmacanın molekü-ler tanısında, IS481’i hedef alan PCR ile ön tanı konulması, ptxA-Pr’yi hedef alan PCR’nin de konfirmas-yon amaçlı kullanılmasının uygun olacağı kanısına varılmıştır.
Anahtar sözcükler: Bordetella pertussis; boğmaca; moleküler tanı; in-house PCR; IS481; ptxA-Pr.
ABSTRACT
Pertussis (whooping cough), caused by Bordetella pertussis is a severe, acute contagious disease of the respiratory system and it affects mostly children and also susceptible individuals of all ages. Altho-ugh the conventional culture method used for diagnosis is highly specific, it has a lower sensitivity. Therefore, there is a need for a sensitive, specific and rapid method for diagnosis of pertussis. Polyme-rase chain reaction (PCR), introduced recently as a new approach for diagnosis of pertussis, has been shown to be more sensitive than culture method. Pertussis toxin gene (ptxA-Pr), insertion sequence genes (IS481 and IS1001), adenylate cyclase genes and structural porin and flagellin genes were cho-sen as targets for PCR, in different studies. This study aimed to develop and optimize a diagnostic in-house PCR method by using primers specific for ptxA-Pr and IS481 gene regions. An in-in-house PCR met-hod was developed by using primer pairs of PTp1/PTp2 specific for ptxA-Pr gene and PIp1/PIp2 speci-fic for IS481 gene and DNAs of various bacterial reference strains. Throat samples obtained from 45 healthy individuals and B.pertussis reference strain with decreasing concentrations were mixed to cons-titute a group of “representative clinical samples” and used to test and optimize sensitivity and speci-ficity of the method. The in-house PCR with PTp1/PTp2 primers showed a very high specispeci-ficity but a low sensitivity with a value of 34.4 cfu/Rm (colony forming unit/reaction mixture). Whereas, the in-house PCR with PIp1/PIp2 primers exhibited a low specificity due to cross-reactivity with B. pertussis and B.bronchiseptica but much higher sensitivity with a value of 1.12 cfu/Rm. The experiments perfor-med with the representative clinical samples yielded similar results. Simultaneously applied cultivation studies indicated the detection limit of the PCR method as 2 x 103cfu/ml. Based on our results, the PCR targeting IS481 gene had high sensitivity while the PCR targeting ptxA-Pr gene had high specifi-city. It was concluded that, PCR method targeting the IS481 gene might be used for pre-diagnosis and then PCR for ptxA-Pr gene might be applied for the confirmation of B.pertussis in the molecular diag-nosis of pertussis.
Key words: Bordetella pertussis; whooping cough; molecular diagnosis; in-house PCR; IS481; ptxA-Pr.
GİRİŞ
Her yaştaki duyarlı bireyi etkileyebilen ve özellikle çocukluk çağında ağır klinik tablo ile seyreden boğmaca, Bordetella pertussis tarafından oluşturulan akut bir solunum siste-mi enfeksiyonudur. Dünyada her yıl 20-40 siste-milyon boğmaca olgusunun gözlendiği, 300.000’den fazla ölüme neden olduğu ve 50.000 hastada da uzun dönemli nörolojik sekel bıraktığı bilinmektedir1-3. Boğmaca tanısının erken dönemde konulması, tedavi ve
Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), boğmaca tanısında son yıllarda uygulanmaya baş-lanan yeni bir yaklaşımdır. PCR’nin kültürden çok daha duyarlı olduğu, çeşitli araştırma-larla gösterilmiştir7,8. B.pertussis’in PCR ile tespit edilmesine yönelik ilk çalışma 1989
yı-lında Houard ve arkadaşları9tarafından yapılmıştır. Seçilen hedef gen bölgeleri arasın-da; pertusis toksin geni (ptxA-Pr), insersiyon sekans [IS] genleri (IS481 ve IS1001), ade-nilat siklaz geni, yapısal genlerden porin ve flajellin geni yer almaktadır10-16. B.pertussis tanısında IS481 gen bölgesini hedef alan PCR yöntemi oldukça duyarlıdır; ancak
B.hol-mesii ile çapraz reaksiyonlara sık rastlanmaktadır. ptxA-Pr gen bölgesi hedeflendiğinde
ise PCR’nin özgüllüğü oldukça yüksektir, ancak duyarlılık IS481 PCR’den daha düşük bulunmaktadır. Bu nedenle çalışmamızda B.pertussis’in ptxA-Pr ve IS481 gen bölgeleri-ne yöbölgeleri-nelik primerler kullanılarak, “in-house” PCR’nin hem bir tanı yöntemi olarak ge-liştirilmesi ve optimize edilmesi hem de duyarlılığının ve özgüllüğünün artırılması amaçlanmıştır.
GEREÇ ve YÖNTEM
Bu çalışma, Kasım 2007-Nisan 2008 tarihleri arasında Refik Saydam Hıfzıssıhha Merkezi Başkanlığı, Salgın Hastalıklar Araştırma Müdürlüğü bünyesindeki Ulusal Boğ-maca Referans Laboratuvarında yürütüldü. Çalışmada, ptxA-Pr ve IS481 gen bölgele-rini hedef alan primerler kullanılarak “in-house” PCR yönteminin; (i) özgüllüğünün araştırılarak optimize edilmesi, (ii) duyarlılığının araştırılarak optimize edilmesi, (iii) temsili nitelikteki klinik örneklerde duyarlılığının araştırılması şeklinde üç ayrı etap iz-lendi.
Test Bakterileri ve Bakteri Süspansiyonları
PCR yönteminin özgüllüğü için, pozitif kontrol olarak B.pertussis Tohama phase I (B.
pertussis Tp-I), B.pertussis ATCC 9797, B.pertussis klinik izolatı; negatif kontrol olarak B.parapertussis ATCC 15311, B.bronchiseptica ATCC 4617, H.influenzae ATCC 49247, N. meningitidis RSKK 645, S.aureus ATCC 95106, S.epidermidis ATCC 12228, C.diphtheriae
varyant belfanti NCTC 10356, L.pneumophila serogrup 1 ATCC 43111, E.coli ATCC 25922, S.pyogenes ATCC 18615 suşları ile S.pneumoniae ve M.catarrhalis izolatları kulla-nıldı. B.pertussis Tp-I suşu ayrıca, PCR yönteminin özellikle temsili nitelikteki klinik örnek-lerdeki duyarlılığını araştırmak için kullanıldı.
Kullanılan suş ve izolatların taze pasajlarından birkaç koloni seçilip %0.85’lik NaCl, temsili nitelikteki klinik örneklerden ise pH: 7.2 PBS (phosphate buffer saline) içerisinde McFarland-1 yoğunluğunda bakteri süspansiyonları ile bakteri süspansiyonlarının 1/3’lük dilüsyonları ve ayrıca tüm süspansiyonların logaritmik dilüsyonları hazırlandı.
Bakteri Konsantrasyonlarının Tespiti
Duyarlılığı araştırmak için kullanılan hem B.pertussis Tp-I suşu hem de temsili nitelik-teki klinik örneklerden hazırlanan süspansiyonların 1.0-0.33 x 10-9oranlarında
B.pertussis üreme grafiğinde OD’ye karşılık gelen bakteri konsantrasyonu [cfu (koloni
oluşturan ünite)/ml] olarak tespit edildi.
Bakteri Süspansiyonlarından Kalıp DNA Hazırlanması
Özgüllük çalışmasında kullanılmak üzere izolatların taze pasajlarından hazırlanan bak-teri süspansiyonları ile duyarlılık çalışmasında kullanılmak üzere hazırlanan B.pertussis Tp-I süspansiyonları (4.3 x 109-1.4 cfu/ml arası), ekstraksiyon yapılmaksızın test gününe
ka-dar -20°C’de saklandı ve kalıp DNA olarak kullanıldı.
Temsili Klinik Örneklerden Kalıp DNA Hazırlanması
Duyarlılığının araştırılmasında B.pertussis Tp-I ile yapılan duyarlılık çalışmasının sonuç-ları esas alınarak, test edilecek konsantrasyon aralığı 5.5 x 106-5.5 x 102cfu/ml olarak
Tablo I. B.pertussis Tohama Phase I Suşu ve Temsili Klinik Örneklerden Hazırlanan Süspansiyonların Dilüs-yon Oranları ve Bu Oranlara Karşılık Gelen Bakteri KonsantrasDilüs-yonları
Bakteri konsantrasyonu (cfu/ml) B.pertussis Tp-I Temsili klinik örnek
No Dilüsyon oranı süspansiyonu süspansiyonları
belirlendi. B.pertussis içermeyen klinik örnekler elde etmek amacıyla, sağlıklı bireylerden rayon uçlu eküvyon ile 45 adet boğaz sürüntüsü örneği alındı ve belirlenen konsantras-yon aralığında dokuz ayrı bakteri dilüskonsantras-yonunun her biri beş farklı klinik örnekle test edil-di. Hazırlanan bakteri dilüsyonlarının her birinden beş ayrı, 1.5 ml’lik mikrosantrifüj tü-püne 50 µl konularak bunların içine birer adet klinik örnek eküvyonu batırıldı ve bakteri süspansiyonunu absorbe etmesi sağlandı. Eküvyonların absorbe ettiği bakteri süspansi-yonları kalıp DNA olarak kullanıldı. Ekstraksiyon işlemi QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, ABD) ile üretici firmanın önerileri doğrultusunda uygulandı.
Kontrol Ekimi Yapılması
Temsili nitelikteki klinik örneklerle ekstraksiyona devam etmeden önce her bir süspan-siyondan 50 µl alınarak BG (Bordet-Gengou) agar besiyerine ekim yapıldı ve uygun şart-larda inkübe edilerek inkübasyonun üçüncü ve yedinci günlerinde değerlendirildi. Üçün-cü günde plaklarda üreyen koloniler içerisinden B.pertussis şüpheli olanlar seçilerek BG agara pasaj yapıldı ve uygun şartlarda inkübasyona kaldırılarak üç gün sonra değerlen-dirildi. Buna göre 1 ile 30 arasında örnek numarasına sahip temsili klinik örneklerden ya-pılan ekimlerden bazılarında B.pertussis izole edilebildi. BG agar besiyerinde B.pertussis’in tespit edildiği en düşük bakteri konsantrasyonuna sahip olan plağa 30 no’lu örnekten ekim yapıldı. 30 no’lu örneğe karşılık gelen bakteri konsantrasyonu 2 x 103cfu/ml ola-rak hesaplandı (Tablo II). Temsili klinik örneklerle yapılan ekimlerin yedinci gün değer-lendirmesinde, üçüncü gün yapılan değerlendirmeye eklenebilecek başka şüpheli kolo-nilere rastlanmadı.
Hedef Gen Bölgeleri ve Reaksiyon Karışımı
B.pertussis ptxA-Pr gen bölgesinin (191 bp) amplifikasyonu için PTp1 (F; 5’-CCA ACG
CGC ATG CGT GCA GAT TCG TC-3’) ve PTp2 (R; 5’-CCC TCT GCG TTT TGA TGG TGC CTA TTT TA-3’) primer çifti ile IS481 gen bölgesinin (121 bp) amplifikasyonu için PIp1 (F; 5’-CCC ATA AGC ATG CCC GAT TGA C-3’) ve PIp2 (R; 5’-CGC ACA GTC GGC GCG GTG AC-3’) primer çifti kullanıldı. Hazırlanan kalıp DNA’lar her bir primer çifti ile ayrı ay-rı test edildi.
Her bir test için; 10X PCR tamponu [750 mM Tris HCI, pH: 8.8, 200 mM (NH4)2SO4, %0.1 Tween 20; MBI Fermentas], 25 mM MgCl2, 10 mM dNTP ve 50 pmol/µl primer ve Taq DNA polimeraz (5 U/µl, MBI Fermentas) reaktifleri kullanılarak reaksiyon karışımı hazırlandı. Bu reaktiflerin reaksiyon karışımı içerisindeki konsantrasyonları tekrarlayan de-nemelerle optimize edildi.
Bakteri DNA’larının Çoğaltılması ve Amplifikasyon Ürünlerinin Gösterilmesi
Tablo II.
Temsili Nitelikteki Klinik Örneklerde PTp1/PTp2 ve PIp1/PIp2 Primerleri Kullanılarak Uygulanan “In-House” PCR Yöntemi ve Kültür
ile Saptanabilen
B.pertussis T
ohama Phase I (Bp Tp-I) Suşunun Konsantrasyonları ve Duyarlılık Sonuçları
Kültür PCR değerlendirmesi değerlendirmesi Ekstraksiyon sonrasında Ekstraksiyon (kalıp DNA öncesinde ve olarak PTp1/PTp2 ile BG agarda BG agara kullanılan) pozitif saptama
PIp1/PIp2 ile pozitif
B.pertussis Örnek Dilüsyon Bp Tp-I ekilen Bp Tp-I Bp Tp-I oranları (%) saptama oranları (%) saptama no oranı (cfu/ml) (cfu/ml) (cfu/ml) +++ a ++ b + c T oplam +++ a ++ b + c T oplam oranı (%) 1-5 10 -3 5.5 x 10 6 6.1 x 10 5 9.3 x 10 5 5/5 0 0 5/5 5/5 0 0 5/5 2/5 (100) (100) (100) (100) (40) 6-10 0.33 x 10 -3 1.8 x 10 6 2 x 10 5 3.1 x 10 5 2/5 1/5 2/5 5/5 3/5 2/5 0 5/5 3/5 (40) (20) (40) (100) (60) (40) (100) (60) 11-15 10 -4 5.5 x 10 5 6.1 x 10 4 9.3 x 10 4 00 00 2/5 2/5 1/5 5/5 1/5 (40) (40) (20) (100) (20) 16-20 0.33 x 10 -4 1.8 x 10 5 2 x 10 4 3.1 x 10 4 00 0 0 5/5 0 0 5/5 3/5 (100) (100) (60) 21-25 10 -5 5.5 x 10 4 6.1 x 10 3 9.3 x 10 3 00 0 0 0 2/5 3/5 5/5 0 (40) (60) (100) 26-30 0.33 x 10 -5 1.8 x 10 4 2 x 10 3 3.1 x 10 3 00 0 0 0 0 2/5 2/5 1/5 (40) (40) (20) 31-35 10 -6 5.5 x 10 3 6.1 x 10 2 9.3 x 10 2 00 0 0 0 0 0 0 0 36-40 0.33 x 10 -6 1.8 x 10 3 2 x 10 2 3.1 x 10 2 00 0 0 0 0 0 0 0 41-45 10 -7 5.5 x 10 2 61 93 0 0 0 0 0 0 0 0 0
a: Kuvvetli bant pozitifliği (Resim 1’de görülen 1.-5. arası bantlar); b: Zayıf bant pozitifliği (Resim 1’de görülen 6.-8. arası bantlar) ; c: Çok zayıf bant pozitifliği (Resim 1’de
Amplifikasyon ürünleri 0.5 µg/ml etidyum bromür eklenmiş %2.5’lik agaroz jel (3:1 Nusieve agarose; FMC BioProducts, ABD; BioRad, İtalya) kullanılarak görüntülendi.
BULGULAR
Bu çalışmada “in-house” PCR yöntemi, ptxA-Pr ve IS481 genlerini hedef alan özgül PTp1/PTp2 ve PIp1/PIp2 primer çiftleri kullanılarak üç ayrı aşamada standardize edilmiş-tir.
1. Özgüllüğün Standardize Edilmesi
a. PTp1/PTp2 primerleri ile yapılan özgüllük çalışması: PTp1/PTp2 primer çifti ile
yapılan PCR’nin özgüllüğünü artırmak amacıyla; reaksiyon karışımı ve bakteri DNA’sının çoğaltılması basamakları ile ilgili değişkenler test edilmiştir. Elde edilen verilere göre; (i) Her test için reaksiyon karışımının toplam hacminin 50 µl olmasına ve DNA kalıp olarak 4 µl bakteri süspansiyonu kullanılmasına, (ii) Bu amaçla her bir reaksiyon tüpünde 5 µl 10X PCR tamponu [750 mM Tris HCI, pH: 8.8, 200 mM (NH4)2SO4, %0.1 Tween 20; MBI Fermentas], 2 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP, 0.5 pmol/µl primer ve 1.3 U Taq DNA polimeraz (5 U/µl, MBI Fermantas) bulunacak şekilde reaksiyon karışımı hazırlanmasına, (iii) Bakteri DNA’sının çoğaltılması için termal döngü (Touchgene Techne) cihazında, 95°C’de 5 dakika ilk denatürasyonu takiben 94°C’de 45 saniye denatürasyon, 57°C’de 45 saniye primer bağlanma ve 72°C’de 45 saniye uzama basamaklarından oluşan 35 döngü tamamlandıktan sonra, son uzama için 72°C’de 10 dakika bekletilerek amplifikas-yonun tamamlanmasına karar verilmiş ve reaktiflerin optimal konsantrasyonları ve amp-lifikasyon döngüleri bu şekilde optimize edilmiştir. Bu denemelerde üç pozitif
(B.pertus-sis Tohama phase I, B.pertus(B.pertus-sis ATCC 9797 ve B.pertus(B.pertus-sis klinik izolat) ve altı negatif (B.pa-rapertussis ATCC 15311, B.bronchiseptica ATCC 4617, H.influenzae ATCC 49247, N.me-ningitidis RSKK 645, S.aureus ATCC 95106 ve E.coli ATCC 25922) kontrol suşu
kullanıla-rak yöntemin özgül olduğu gösterilmiştir.
Yukarıda bahsi geçen üç pozitif kontrol suşu arasında herhangi bir farklılık görülmedi-ği için pozitif kontrol olarak çalışmaya B.pertussis Tohama phase I (Tp-I) ile devam edil-miştir. Bu aşamada özgüllük çalışmamıza negatif kontrol olarak S.epidermidis ATCC 12228, C.diphtheriae varyant belfanti NCTC 10356, L.pneumophila serogrup 1 ATCC 43111, S.pyogenes ATCC 18615 suşları ile S.pneumoniae ve M.catarrhalis de ilave edilmiş ve bunlarda da hiçbir çapraz bant pozitifliğine rastlanmamıştır. Böylece bu primer çifti ile yapılan özgüllük çalışmaları tamamlanmıştır.
b. PIp1/PIp2 primerleri ile yapılan özgüllük çalışması: PIp1/PIp2 primer çifti ile
12228, C.diphtheriae varyant belfanti NCTC 10356, L.pneumophila serogrup 1 ATCC 43111, S.pyogenes ATCC 18615 suşları ile S.pneumoniae ve M.catarrhalis’in de ilave edil-diği özgüllük çalışmaları yapılmış ve bu çalışmada da B.bronchiseptica ATCC 4617 ile çapraz bant pozitifliği gözlenmiştir.
Bu çalışmada, özgül ürünler elde etmeyi hedefleyerek çalışmalar en fazla bu primer çifti kullanılarak yapılan PCR’nin özgüllüğünün artırılması konusuna yoğunlaştırılmıştır. Ancak negatif kontrol suşu olan B.bronchiseptica ATCC 4617 ile oluşan çapraz bant po-zitifliği engellenememiştir.
2. Duyarlılığın Standardize Edilmesi
“In-house” PCR’nin duyarlılığı, B.pertussis Tp-I suşu ile araştırılmıştır. %0.85’lik NaCl’de McFarland-1 yoğunluğunda hazırlanan bakteri süspansiyonunun 650 nm dalga boyunda OD’si 0.123 olarak ölçülmüş ve Yuji Sato’nun geliştirmiş olduğu B.pertussis üreme grafi-ğinde bu OD’ye karşılık gelen bakteri konsantrasyonu 4.3 x 109cfu/ml olarak tespit
edil-miştir. Bakteri süspansiyonlarının ve 1/3 sulandırımlarının logaritmik dilüsyonları ile bu di-lüsyon oranlarına karşılık gelen bakteri konsantrasyonları hesaplanmıştır. PCR’nin duyarlı-lığının saptanmasında, özgüllük çalışmaları ile optimize edilen PCR tekniği kullanılmıştır.
a. PTp1/PTp2 primerleri ile yapılan duyarlılık çalışması: Bu çalışmalarda 1.-9.
bant-lar arasında sırayla azalan parlaklıkta pozitiflik saptanmıştır (Resim I). Dokuzuncu bant için dilüsyon oranı 10-4, buna karşılık gelen ve DNA kalıp olarak kullanılan bakteri
kon-santrasyonu 4.3 x 105cfu/ml olup; bu da 34.4 cfu/Rm [colony forming unit (koloni
oluş-turan ünite)/reaction mixture (reaksiyon karışımı)] olarak hesaplanabilir (9.-10. bantlar: 34.4-11.2 cfu/Rm olup; yapılan çalışmalarda ortalama olarak 9. bant).
b. PIp1/PIp2 primerleri ile yapılan duyarlılık çalışması: Bu çalışmalarda 1.-12.
bant-larda pozitiflik saptanmıştır (Resim II). On ikinci bant için dilüsyon oranı 0.33 x 10-5, bu-na karşılık gelen ve kalıp DNA olarak kullanılan bakteri konsantrasyonu 1.4 x 104cfu/ml
olup; bu da 1.12 cfu/Rm olarak hesaplanabilir (11.-12. bantlar: 3.44 - 1.12 cfu/Rm olup; yapılan çalışmalarda ortalama olarak 12. bant).
Resim 1. PTp1/PTp2 primerleri ile B.pertussis Tohama phase I suşu kullanılan “in-house” PCR yönteminin du-yarlılık çalışması [M: DNA Ladder (100 bp), 1-13: B.pertussis Tohama phase I’in sırasıyla 1-10-6dilüsyonları,
3. Temsili Klinik Örneklerde Duyarlılığın Araştırılması
Temsili nitelikteki klinik örneklerde “in-house” PCR’nin duyarlılığının araştırılmasında
B.pertussis Tp-I ile yapılan duyarlılık çalışmasının sonuçları esas alınarak, test edilecek
di-lüsyon aralığı 10-3-10-7olarak belirlenmiştir (Tablo II). B.pertussis Tp-I suşu ile pH: 7.2 PBS içerisinde McFarland-1 yoğunluğunda hazırlanan bakteri süspansiyonunun 650 nm dalga boyunda OD’si 0.145 olarak ölçülmüş ve Yuji Sato’nun geliştirdiği B.pertussis üre-me grafiğinde bu OD’ye karşılık gelen bakteri konsantrasyonu 5.5 x 109cfu/ml olarak tespit edilmiştir. Buna göre test edilecek dilüsyon oranları; 1-5 arası örnekler için 10-3,
6-10 arası örnekler için 0.33 x 10-3, 11-15 arası örnekler için 10-4, 16-20 arası örnekler için 0.33 x 10-4, 21-25 arası örnekler için 10-5, 29-30 arası örnekler için 0.33 x 10-5, 31-35 arası örnekler için 10-6, 36-40 arası örnekler için 0.33 x 10-6ve 41-45 arası örnekler
için 10-7olup, bunlara karşılık gelen bakteri konsantrasyonları sırasıyla 5.5 x 106, 1.8 x 106, 5.5 x 105, 1.8 x 105, 5.5 x 104, 1.8 x 104, 5.5 x 103, 1.8 x 103 ve 5.5 x 102 cfu/ml’dir (Tablo II).
Bu çalışmada eş zamanlı olarak, B.pertussis içermeyen klinik örnekler elde etmek ama-cıyla sağlıklı bireylerden alınan 45 adet boğaz sürüntüsü örneği, seçilen 10-3ile 10-7 di-lüsyon oranlarına karşılık gelen 5.5 x 106ile 5.5 x 102cfu/ml arası bakteri konsantras-yonlarında herbiri beş ayrı klinik örnekle test edilmiştir. Bu şekilde içinde normal flora üyeleri, sekresyonlar ve bilinen konsantrasyonlarda B.pertussis Tp-I suşu bulunan gerçek hasta örnekleri simüle edilmiştir. Test ettiğimiz aralıktaki her bakteri dilüsyonu ile hazır-lanan temsili nitelikteki klinik örnekler, ekstraksiyonun başlangıcında bir kez daha 1/9 oranında dilüe edilmiştir. Buradan ekstraksiyona devam etmeden önce her bir süspansi-yondan 50 µl alınarak BGA besiyerine ekim yapılmış ve ardından ekstraksiyon işlemine devam edilerek kalıp DNA hazırlanmıştır. Ekstraksiyon sonrasında yaklaşık 150 µl kalıp DNA elde edilmiş olup; bu kalıp DNA’lar için gerekli bakteri konsantrasyonları da hesap-lanmıştır (Tablo II).
Resim 2. PIp1/PIp2 primerleri ile B.pertussis Tohama phase I suşu kullanılan “in-house” PCR yönteminin du-yarlılık çalışması. [M: DNA Ladder (100 bp), 1-13: B.pertussis Tohama phase I’in sırasıyla 1-10-6
a. Temsili nitelikte klinik örneklerde PTp1/PTp2 primerleri ile duyarlılık çalışması:
Bu çalışmaların sonunda 1.-10. bantlarda pozitiflik saptanmıştır. 6.-10. bantlara karşılık gelen ve DNA kalıp olarak kullanılan bakteri konsantrasyonu 3.1 x 105cfu/ml olup; bu da
28.4 cfu/Rm olarak hesaplanabilir (Tablo II). Bu sonuçlara göre bu primer çifti ile
B.pertus-sis Tp-I kullanılarak yapılan duyarlılık çalışmalarının sonuçları ile temsili nitelikteki klinik
ör-neklerde B.pertussis Tp-I’i saptama duyarlılığı yaklaşık olarak birbirine eşit bulunmuştur.
b. Temsili nitelikte klinik örneklerde PIp1/PIp2 primerleri ile duyarlılık çalışması:
Bu çalışmaların sonunda 1.-28. bantlarda pozitiflik saptanmıştır. 26.-30. bantlara karşılık gelen ve DNA kalıp olarak kullanılan bakteri konsantrasyonu 3.1 x 103cfu/ml olup; bu
da 0.25 cfu/Rm olarak hesaplanabilir (Tablo II). Bu sonuçlara göre, bu primer çifti ile
B.pertussis Tp-I kullanılarak yapılan duyarlılık çalışmalarının sonuçları ve temsili
nitelikte-ki klinik örneklerde B.pertussis Tp-I’i saptama duyarlılığı birbirine yakın bulunmuştur.
TARTIŞMA
Boğmaca enfeksiyonunun morbiditesi, 1940’lı yıllardan itibaren ülkemiz de dahil ol-mak üzere dünyanın birçok ülkesinde uygulanan standart aşılama programlarıyla belir-gin azalma sağlamıştır. Ancak boğmaca, çocukluk çağı hastalıkları arasında halen önemi-ni korumaktadır1-3. Erken dönemde tanı konulması, tedavi başarısı ve bulaşın
önlenme-sinde son derece önemlidir6. DSÖ tarafından boğmacanın konfirmasyonu için “altın
standart” olarak değerlendirilen kültür yönteminin özgüllüğü %100 olmakla birlikte, du-yarlılığı hastalığın evresi, hastanın yaşı, uygulanan tedavinin etkinliği, örneğin alınması, taşınması ve kültür şartlarına göre %30-80 (ortalama %50) arasında değişmektedir5,11.
Kültür ile ancak, klinik örnekler öksürüğün başlamasından sonraki ilk 2-3 hafta içinde alı-nırsa başarı sağlanabilmekte ve en yüksek izolasyon oranı bebekler ve aşılı olmayan ço-cuklarda elde edilmektedir. Özellikle nükleik asit amplifikasyon testleri (NAT)’nin gelişti-rilmesiyle birlikte boğmaca tanısında tanısal ve analitik duyarlılık büyük ölçüde artmıştır. Grimprel ve arkadaşları11, kültür ve PCR’nin duyarlılığını bebek/çocuklarda sırasıyla
%54.1 ve %95.8, yetişkinlerde ise sırasıyla %15.4 ve %61.5 olarak bildirmişlerdir. Ayrı-ca kültür ile izolasyon ve konfirmasyon için uzun süre (3-12 gün) gerekmesi, boğmaAyrı-ca tanısında hızlı, özgül ve duyarlı tanı yöntemlerini gerekli kılmaktadır4. Bu amaçla PCR,
güncel bir yaklaşım olmakla birlikte henüz yeterli özgüllük ve duyarlılığa ulaşılamamış ve standardize edilememiştir. Ancak uygulamalardaki hızlı ilerlemeler PCR’ın gelecekte boğ-maca tanısında daha yaygın ve hızlı bir yöntem olarak kullanılabileceğini düşündürmek-tedir4,18. Bununla beraber PCR’nin duyarlılığı, örneğin kalitesi, hastalığın dönemi ve
an-timikrobiyal tedaviden etkilenmekte; nükleik asit ekstraksiyon yöntemine, amplifiye edi-len örneğin miktarına, amplifikasyon koşulları ve etkinliğine, hedef bölgeye ve DNA sap-tama formatına bağlı olarak değişiklik göstermektedir. PCR, örnekte az sayıda bulunan bakteriyi ve canlı olmayan organizmaları da tespit edebildiğinden kültüre göre daha yük-sek duyarlılığa sahiptir. Ek olarak hastalık süresince kültürden daha uzun süre pozitif ola-rak saptanabilir ve antibiyotik tedavisini takiben pozitif kalma olasılığı daha fazladır.
B.pertussis’in PCR ile tespitine yönelik 1989 yılında Houard ve arkadaşları9tarafından
PIp1/PIp2 primer çiftleri kullanılmış; daha sonra 1993 yılında Grimprel ve arkadaşları-nın11PTp1/PTp2 primer çifti ile yaptıkları çalışmada da destekleyici veriler elde edilmiş-tir. Her iki çalışmada da “in-house” PCR testinin yeterince özgül ve duyarlılığının 102
cfu/ml olduğu tespit edilmiştir. B.pertussis tanısında IS481 gen bölgesini hedef alan PCR yöntemi oldukça duyarlıdır; ancak bu dizi B.bronchiseptica, B.holmesii ve B.pettrii gibi di-ğer Bordetella türleri ile yüksek homoloji gösterdiği için çapraz reaksiyonlarla sık karşıla-şılmaktadır6,11,19-21. ptxA-Pr gen bölgesi hedeflendiğinde ise özgüllük oldukça yüksek
ol-makla birlikte; duyarlılık, IS481’i hedef alan PCR yönteminden daha düşüktür4,6,10,11. Bu nedenle tanı, genellikle IS481’i hedef alan PCR ile konulmakta ve ptxA-Pr’yi hedef alan PCR ile konfirmasyon yapılmaktadır22.
Çalışmamızda da, ptxA-Pr ve IS481’e yönelik primerler kullanılarak, “in-house” PCR, tanı yöntemi olarak standardize edilmiştir. Araştırmada, özgüllüğün standardizasyonu amacıyla PTp1/PTp2 primer çifti ile yapılan çalışmalarda, tüm pozitif kontrol suşları po-zitif, negatif kontrol suşları negatif olarak saptanmış; reaksiyonun özgül olduğu belirlen-miş ve reaktiflerin optimal konsantrasyonları ile amplifikasyon döngüleri buna göre stan-dardize edilmiştir. PTp1/PTp2 primer çifti ile özgüllük çalışmalarında elde ettiğimiz veri-ler, daha önceden yapılan çalışmaları destekler niteliktedir. Sonraki etapta, PIp1/PIp2 pri-mer çifti ile yapılan PCR’nin özgüllüğünün artırılmasına odaklanılarak; reaksiyon karışımı hazırlanması ve bakteri DNA’sının çoğaltılması ile ilgili değişkenler test edilmiştir. Reaksi-yonun özgüllüğünü artırmak amacıyla yapılan çalışmalar sonucunda, negatif kontrol suş-larından biri olan B.bronchiseptica ATCC 4617 ile oluşan çapraz bant pozitifliği engelle-nememiştir. Bu veriler doğrultusunda ve bu konuda yapılan araştırmalar temel alınarak, PIp1/PIp2 primer çifti ile yapılan PCR testlerinde yeterli düzeyde özgüllük sağlanamaya-cağı sonucuna varılmış ve PTp1/PTp2 primer çifti için optimize ettiğimiz oranlardaki re-aksiyon karışımı bileşenleri ve amplifikasyon döngülerinin PIp1/PIp2 primer çifti ile yapı-lan PCR testlerinde de kulyapı-lanılmasına karar verilmiştir. Bu çalışmadan elde ettiğimiz veri-ler, bu konuda yapılan diğer çalışmaları destekler niteliktedir4.
B.pertussis IS481 ve IS1001 bölgelerini hedef alan “in-house” PCR çalışmalarında
yön-temin analitik duyarlılığı 1 cfu/Rm (bakteri konsantrasyonu/reaksiyon karışımı) olarak sap-tanmış; IS481’i hedef alan PCR’nin özgüllüğü ise bu konuda yapılan diğer çalışmalardan farklı olarak %100 oranında belirlenerek bu yüksek özgüllüğün kullanılan yönteme bağlı olduğu ifade edilmiştir10,19. Van der Zee ve arkadaşları14da, IS481 ve IS1001 genlerini he-def alan primerler kullanmışlar ve amplikonların “dot blot” hibridizasyon ile tespit edildi-ği bu “in-house” PCR yönteminin analitik duyarlılığını B.pertussis için 1 cfu/Rm olarak sap-tamışlardır. Özellikle son 10 yılda ortaya çıkan ilerlemeler sonucu kullanılan ekstraksiyon, amplifikasyon, hibridizasyon ve tespit yöntemlerinde önemli gelişmeler olmuştur. Gerçek zamanlı [Real-time (Rt)]-PCR gibi yeni kuşak sistemler ile birlikte kontaminasyon olasılığı azalmış, prob ve primerlerin birarada kullanılması ve özgül floresan boyaların uygulama-ya girmesi ile özgüllük ve duuygulama-yarlılığın artışı sağlanmıştır4,18. “Real-time multiplex
Çalışmamızın sonraki aşamasında, “in-house” PCR yönteminin duyarlılığı araştırılmış ve bu amaçla, özgüllük çalışmaları ile standardize edilen PCR prosedürü kullanılmıştır.
ptxA-Pr bölgesini hedef alan PTp1/PTp2 primerleri ile yaptığımız analitik duyarlılık
çalış-malarında, yöntemin özgüllüğünün yüksek, duyarlılığının ise düşük (34.4 cfu/Rm) oldu-ğu görülmüştür. Elde edilen değer 6.9 x 102cfu/ml olarak hesaplanabilir. Bu bölgeyi he-def alan çeşitli PCR çalışmalarında da reaksiyonun duyarlılığı düşük ve 102-3 x 102cfu/ml değerleri arasında tespit edilmiştir4,11. IS481 bölgesini hedef alan PIp1/PIp2 primerleri ile
yaptığımız analitik duyarlılık çalışmalarında ise, reaksiyonun duyarlılığı 1.12 cfu/Rm ola-rak saptanmış; konu ile ilgili diğer çalışmalarda bu değerin 0.75-1 cfu/Rm aralığında bu-lunduğu görülmüştür10,14,19,23. Elde ettiğimiz değerlerin, diğer çalışmalardan elde edilen sonuçlara yakın olmakla beraber biraz daha düşük bulunması, diğer çalışmalarda kulla-nılan LC-PCR-IS gibi tekniklerin daha duyarlı olmasından kaynaklanmış olabilir.
Çalışmamızın son basamağında, elde edilen verilerin klinik örnekler için geçerli olup olmadığı, temsili nitelikte klinik örneklerin kullanıldığı bir araştırma ile desteklenmiştir. Bu amaçla temsili klinik örneklere, ptxA-Pr ve IS481 genlerini hedef alan primerler kullanıla-rak “in-house” PCR uygulanmış ve elde edilen duyarlılık sonuçları, önceki duyarlılık ça-lışmamızın sonuçlarını destekler nitelikte bulunmuştur. Ayrıca yaptığımız eş zamanlı kül-tür çalışmasında; yöntemin B. pertussis saptama duyarlılığı 2 x 103cfu/ml olarak saptan-mıştır. Bu sonuç aynı zamanda PCR yönteminin duyarlılığının kültürden daha yüksek ol-duğunu gösteren pek çok araştırmayı destekler niteliktedir7,8,10,11,13,24,25. Dolayısıyla bir-çok laboratuvarda PCR, kültürün yerini almaya başlamıştır. Bu durum, B.pertussis’in mo-leküler tanısında standardizasyonun sağlanması gereğini ortaya koymuş ve yapılan bir araştırmada EQA (External Quality Control) programına katılan Avrupa laboratuvarları-nın performansları karşılaştırılmıştır4. Değerlendirmeye katılan toplam 11 laboratuvarın verilerine göre; en duyarlı (3 x 101-3 x 102cfu/ml) ve yüksek özgüllükteki (%100)
so-nuçların gerçek zamanlı (Rt)-PCR ile alındığı, bunu “in-house nested” PCR ve “in-house single” PCR yöntemlerinin izlediği görülmektedir4,26.
Boğmacanın tanısında, mükemmel bir standart yöntem olarak düşünebileceğimiz tek bir laboratuvar testi yoktur. Kültüre göre duyarlılığı daha yüksek olan NAT’ın en önemli sınırlamaları; potansiyel kontaminasyona bağlı yanlış pozitif sonuç alınması, ölçümler arasında standardizasyonun olmaması ve kültür ile bakterinin saptanamadığı durumlar-da pozitif sonuçların yorumlanmasındurumlar-daki zorluktur. Bu nedenle B.pertussis tanısındurumlar-da tek başına PCR pozitifliğinin, klinik ve epidemiyolojik verilerle bir arada değerlendirilmesi ge-rekmektedir. Nitekim CDC (Centers for Disease Control and Prevention), PCR’nin kültür ile birlikte ve hızlı bir şekilde ön tanıya gidilebilmesi amacıyla kullanılmasını önermekte-dir27.
Çalışma-mızda, konu ile ilgili diğer çalışmaların sonuçlarına paralel olarak, IS481 gen bölgesini hedef alan primerler ile yapılan PCR testinin duyarlılığı yüksek bulunmuş ancak,
B.bronc-hiseptica ATCC 4617 ile çapraz reaksiyonlara rastlanmıştır. ptxA-Pr gen bölgesi
hedeflen-diğinde ise, yine diğer çalışmalarda belirtildiği gibi yeterli özgüllük sağlanmış, ancak du-yarlılık IS481’i hedef alan PCR yönteminden daha düşük bulunmuştur. Bu nedenle boğ-macanın moleküler tanısında, genellikle IS481’i hedef alan PCR ile ön tanı konulması ve
ptxA-Pr’yi hedef alan PCR ile konfirmasyon yapılması önerilmektedir18,22. Çalışmamızda
elde edilen deneyimler sonucunda, biz de bu düşünceyi paylaşmaktayız. Sonuç olarak verilerimiz, B. pertussis enfeksiyonlarının tanısında PCR’nin hızlı ve duyarlı bir yöntem olarak kullanılabileceğini düşündürmektedir.
TEŞEKKÜR
Metnin İngilizce özet kısmını düzenleyen Dr. Bio. Fatma Filiz Arı’ya teşekkür ederiz.
KAYNAKLAR
1. World Health Organization. Pertussis surveillance: A global meeting. 16-18 October 2000, Geneva. 2001, WHO, Geneva. Available from: www.who.int/vaccines-documents/DocsPDF01/www605.pdf
2. World Health Organization. WHO Recommended Surveillance Standards. WHO/CDS/CSR/ISR/99.2, A37.0 Pertussis (Whooping Cough). WHO, Geneva.
3. World Health Organization. WHO vaccine-preventable disease: monitoring system. 2006 Global Summary. WHO, Geneva.
4. Muyldermans G, Soetens O, Antoine M, et al. External quality assessment for molecular detection of Bor-detella pertussis in European laboratories. J Clin Microbiol 2005; 43(1): 30-5.
5. Reizenstein E, Lindberg L, Möllby R, Hallander HO. Validation of nested Bordetella PCR in pertussis vaccine trial. J Clin Microbiol 1996; 34(4): 810-5.
6. Knorr L, Fox JD, Tilley PA, Ahmed-Bentley J. Evaluation of real-time PCR for diagnosis of Bordetella pertussis infection. BMC Infect Dis 2006; 6: 62.
7. Ewanowich CA, Chui LW, Paranchych MG, Peppler MS, Marusyk RG, Albritton WL. Major outbreak of per-tussis in northern Alberta, Canada: analysis of discrepant direct fluorescent-antibody and culture results by using polymerase chain reaction methodology. J Clin Microbiol 1993; 31(7):1715-25.
8. Dragsted DM, Dohn B, Madsen J, Jensen JS. Comparison of culture and PCR for detection of Bordetella per-tussis and Bordetella paraperper-tussis under routine laboratory conditions. J Med Microbiol 2004; 53(Pt 8): 749-54.
9. Houard S, Hackel C, Herzog A, Bollen A. Specific identification of Bordetella pertussis by the polymerase cha-in reaction. Res Microbiol 1989; 140(7): 477-87.
10. Farrell DJ, McKeon M, Daggard G, Loeffelholz MJ, Thompson CJ, Mukkur TK. Rapid-cycle PCR method to detect Bordetella pertussis that fulfills all consensus recommendations for use of PCR in diagnosis of pertus-sis. J Clin Microbiol 2000; 38(12): 4499-502.
11. Grimprel E, Bégué P, Anjak I, Betsou F, Guiso N. Comparison of polymerase chain reaction, culture, and western immunoblot serology for diagnosis of Bordetella pertussis infection. J Clin Microbiol 1993; 31(10): 2745-50.
12. Glare EM, Paton JC, Premier RR, Lawrence AJ, Nisbet IT. Analysis of a repetitive DNA sequence from Borde-tella pertussis and its application to the diagnosis of pertussis using the polymerase chain reaction. J Clin Microbiol 1990; 28(9): 1982-7.
14. Van der Zee A, Agterberg C, Peeters M, Schellekens J, Mooi FR. Polymerase chain reaction assay for pertus-sis: simultaneous detection and discrimination of Bordetella pertussis and Bordetella parapertussis. J Clin Mic-robiol 1993; 31(8): 2134-40.
15. Douglas E, Coote JG, Parton R, McPheat W. Identification of Bordetella pertussis in nasopharyngeal swabs by PCR amplification of a region of the adenylate cyclase gene. J Med Microbiol 1993; 38(2): 140-4. 16. Hozbor D, Fouque F, Guiso N. Detection of Bordetella bronchiseptica by the polymerase chain reaction. Res
Microbiol 1999; 150(5): 333-41.
17. Imaizumi A, Suzuki Y, Ono S, Sato H, Sato Y. Effect of heptakis (2,6-O-dimethyl) beta-cyclodextrin on the production of pertussis toxin by Bordetella pertussis. Infect Immun 1983; 41(3):1138-43.
18. Riffelmann M, Wirsing von König CH, Caro V, Guiso N; Pertussis PCR Consesus Group. Nucleic acid ampli-fication tests for diagnosis of Bordetella infections. J Clin Microbiol. 2005; 43(10): 4925-9.
19. Farrell DJ, Daggard G, Mukkur TK. Nested duplex PCR to detect Bordetella pertussis and Bordetella paraper-tussis and its application in diagnosis of perparaper-tussis in nonmetropolitan southeast Queensland, Australia. J Clin Microbiol 1999; 37(3): 606-10.
20. Reischl U, Lehn N, Sanden GN, Loeffelholz MJ. Real-time PCR assay targeting IS481 of Bordetella pertussis and molecular basis for detecting Bordetella holmesii. J Clin Microbiol 2001; 39(5): 1963-6.
21. Lingappa JR, Lawrence W, West-Keefe S, Gautom R, Cookson BT. Diagnosis of community-acquired pertus-sis infection: comparison of both culture and fluorescent-antibody assays with PCR detection using elect-rophoresis or dot blot hybridization. J Clin Microbiol 2002; 40(8): 2908-12.
22. Herwegh S, Carnoy C, Wallet F, Loïez C, Courcol RJ. Development and use of an internal positive control for detection of Bordetella pertussis by PCR. J Clin Microbiol 2005; 43(5): 2462-4.
23. Sloan LM, Hopkins MK, Mitchell PS, et al. Multiplex LightCycler PCR assay for detection and differentiati-on of Bordetella pertussis and Bordetella parapertussis in nasopharyngeal specimens. J Clin Microbiol 2002; 40(1): 96-100.
24. Loeffelholz MJ, Thompson CJ, Long KS, Gilchrist MJ. Comparison of PCR, culture, and direct fluorescent-antibody testing for detection of Bordetella pertussis. J Clin Microbiol 1999; 37(9): 2872-6.
25. Heininger U, Schmidt-Schläpfer G, Cherry JD, Stehr K. Clinical validation of a polymerase chain reaction as-say for the diagnosis of pertussis by comparison with serology, culture, and symptoms during a large per-tussis vaccine efficacy trial. Pediatrics 2000; 105(3): E31.
26. Muyldermans G, Soetens O, Lauwers S. Second External Quality Assessment for the molecular detection of Bordetella pertussis, p: 7-14. In: Second External Quality Assessment in Belgian Laboratories Performing Molecular Microbiology. Organised by the Working Group of Molecular Microbiology of the National Com-mittee for Molecular Diagnostics, 2004. Available from: http://webhost.ua.ac.be/cmd/files/ 2nd%20EQA%20Microbiology%2002062004.doc
