GENETİK MÜHENDİSLİĞİ (Rekombinant DNA Teknolojisi)

(1)

GENETİK MÜHENDİSLİĞİ (Rekombinant DNA

Teknolojisi)

 Bilimsel medikal ya da endüstriyel amaçlar doğrultusunda genetik materyalin

deneysel düzenlenmesi olarak tanımlanır.

 Genetik mühendisliği çalışmaları ile

biyoteknolojik üretimlerde kullanılacak biyolojik materyal oluşturulur.

(2)

Moleküler Klonlamada Kullanılan Konukçular

Büyük miktarda klonlanmış DNA eldesi için kullanılacak konukçuda, aşağıdaki

özelliklerin olması istenir.

Ucuz bir besiyerinde hızlı bir şekilde üreyebilmelidir.

Patojen olmamalıdır.

DNA alma özelliğine sahip olmalıdır.

Kültürde genetik yapısı stabil olarak kalmalıdır.

Genetik yapısı iyi bilinmelidir.

Vektör replikasyonu için uygun enzimlere sahip olmalıdır.

(3)

Prokaryot konukçular

Gram negatif E. coli;

bazı suşlarının patojen olması,

patojen olmayan suşlarının endotoksin üretebilmesi,

periplazmik proteinlerinin rekombinant proteinlerin izolasyonunu ve

saflaştırılmasını zorlaştırmaları,

elde edilen ürünü kontamine etmeleri gibi özerllikleri, konukçu olarak kullanımlarını kısıtlamaktadır.

Klonlama çalışmalarında modifiye E. coli suşları kullanılarak bu problemler

giderilmeye çalışılmaktadır.

(4)

Prokaryot konukçular

Gram pozitif B. subtilis

patojen değil

endotoksin üretmez

sporlu

Periplazmalarının olmaması ve

doğal olarak hücre dışına protein salgılama yeteneğine sahip olmaları

Klonlamada B. subtilis için kullanılan en uygun yöntem transformasyondur.

Dezavantajı

Plazmidlerinin stabil olmaması ve yabancı DNA’ yı hücrelerinde tutamamalarıdır.

(5)

Ökaryot konukçular

Saccharomyces cerevisiae mayası

 Prokaryot plazmidlerin çoğunu hücrelerinde çoğaltamaz

 Maya yapay kromozomu (YAC) gibi plazmid vektörler bu maya ile yapılan klonlama

çalışmalarında kullanılmaktadır.

 Posttranslasyonal sistemlere sahip

Memeli hücre kültür sistemleri (insan genetiği, kanser, enfektif hastalıklar ve fizyolojik çalışmalarda)

Dezavantajı, pahalı ve büyük çapta üretimi zordur Bitki hücre ve doku kültürleri ile bitkilerin kendisi

Zirai çalışmalarda genetik manupilasyonlara uygun bitkiler büyük önem taşımaktadır.

(6)

Ökaryot hücrelerin transfeksiyonu

Ökaryot mikroorganizmalar, hayvan ve bitki hücreleri, prokaryotlardaki

transformasyona benzer şekilde

hücrelerine yabancı DNA’ yı alabilirler.

Memeli hücrelerindeki kanser oluşumunda rol oynayan

transformasyon ile karıştırılmaması için, ökaryot hücrelerde gerçekleşen bu olaya transfeksiyon adı

verilmiştir.

(7)

Bakterilerde Memeli Genlerinin Yorumlanması

Memeli genine ait olgun mRNA’ dan ters

transkriptazla komplementer DNA (cDNA) yapılmaktadır.

 mRNA, 3’ ucundaki poly A uzantısı ile diğer RNA’ lardan ayrılarak izole edilmektedir.

 poly A’ ya komplementer oligo-dT primeri

kullanılarak ters transkriptaz enzimi ile RNA’ dan cDNA in vitro koşullarda sentezlenmektedir.

 cDNA’ nın 3’ ucunda hairpin yapısı bulunur.

 Bu uç diğer DNA ipliğinin sentezi için primerdir

 Nükleaz enzimleriyle gerekli kesimler yapılarak, istenen gene ait intron içermeyen çift iplikli DNA elde edilir.

 Başlama kodonu içeren ancak mRNA’ ya transkribe edilemediği için promotor bölge içermeyen bu DNA, bir vektöre bağlanarak klonlama yapılır.

(8)

Biyoteknolojide Genetik Mühendisliği Uygulamaları

in vitro koşullarda genetik yapısı değiştirilmiş organizmalar (GMO)’ lar elde edilmiştir.

Bazı mo lar ile insülin, interferon, büyüme hormonları, viral antijenler gibi pek çok proteinin üretimi sağlanmıştır.

Günümüzde tıp ve ziraatte, endüsteriyel fermentasyonların geliştirilmesinde, biyoremediasyon ve diğer çevre biyoteknolojisi alanlarında GMO’ ların kullanımı üzerine çalışmalar devam etmektedir.

(9)

Biyoteknolojide Genetik Mühendisliği Uygulamaları

GM GM Bitkilerde Bitkilerde böceklere böceklere etkili etkili B.thuringiensis toksini ürettiriliyor.

B.thuringiensis toksini ürettiriliyor.

1. Böceklerde bu toksine direnç oluşabilir.

2. Toksinli bitkiyi tüketen insanlarda alerjik 2. Toksinli bitkiyi tüketen insanlarda alerjik

reaksiyonlar oluşabilir.

GMO nun ürettiği yeni bir protein, insan GMO nun ürettiği yeni bir protein, insan sağlığını etkileyebilir.

sağlığını etkileyebilir.

(10)

Memelilere ait ürünlerin GMO’ larca üretimi

İlaç olarak kullanılan insan proteinlerinin üretimi biyoteknolojinin en önemli alanıdır.

Bu proteinler normal dokuda çok az

miktarda bulunur. Bu nedenle de normal dokulardan eldesi çok zordur.

Hücre kültürlerinde üretimleri ise çok pahalıdır.

Bu ürünler genetik olarak modifiye edilmiş mikroorganizmalarda yüksek verimle ve ucuz olarak üretilmektedir.

(11)

İnsülin üretimi

İnsülin geninden önce protein salgılanması için gerekli bir sinyal dizi içeren

preproinsülin olarak adlandırılan uzun bir polipeptid üretir.

Preproinsülinden proinsülin üretilir.

Proinsülinde 21 amino asit içeren A zinciri, aradaki 35 amino asitlik bir dizi ve 30 amino asit içeren B zinciri bulunmaktadır.

A ve B polipeptidlerinin proinsülinden önce ayrılıp sonra tekrar birbirleriyle birleştirilmesi ile, enzimatik olarak insülin üretilir.

(12)

İnsülin üretimi

Genetik mühendisliği teknikleri kullanılarak insülin üretiminde, önce polinükleotidler

sentezlenmekte daha sonra uygun bir restriksiyon enzimi ile kesilmekte ve bir plazmid vektöre aktarılmaktadır.

Konukçu hücrelerden proinsülin izole edilir, aradaki parça çıkarılır, A ve B zincirleri

disülfit bağlarıyla kimyasal olarak birbirine bağlanıp insülin üretilir.

(13)

Aşı üretimi

Virülenslikten sorumlu genler patojenden kesilip çıkarılmaktadır.

Vücuda verildiğinde immün sistemi uyaran

ancak patojen olmayan bu aşı, rekombinant canlı zayıflatılmış aşı olarak adlandırılır.

Vektör aşı üretiminde çiçek virüsü kullanılır.

Patojen bir virüsün immünojenik bir kılıf proteinini kodlayan gen, çiçek virüsüne aktarılır.

Rekombinant çiçek virüsü hayvan hücresini enfekte edince patojen virüse ait kılıf proteini üretilir ve immün sistem uyarılır.

(14)

Aşı üretimi

 altünite aşı olarak adlandırılan rekombinant aşılar üretilir.

 Hepatit B aşısı bu şekilde üretilir.

 Hepatit B virüsünün yüzey antijenini kodlayan gen prokaryot bir konukçuda çoğaltılır.

 Daha sonra posttranslasyonal modifikasyon için maya hücrelerinde bu gen yorumlanıp virüsün yüzey antijen proteinleri fazla

miktarda üretilir.

 Daha sonra saflaştırılan bu proteinler aşı olarak kullanılır.

(15)

Aşı üretimi

DNA aşıları üretilir.

Patojenin immünojen proteinini kodlayan gen plazmid ya da viral bir vektörde klonlanıp hayvan

hücresine verilir.

Hayvan bu proteini üretir ve immün sistem uyarılır.

(16)

Transgenik hayvanlar

Rekombinant DNA teknolojisi ve

mikroenjeksiyon tekniklerini kullanarak, ticari öneme sahip hayvanlara ve

laboratuvar hayvanlarına pek çok yabancı gen aktarılmıştır.

Yabancı gen taşıyan bu hayvanlar

transgenik hayvanlar olarak adlandırılır.

Transgenik hayvanların, hayvanların hastalıklara direncinin arttırılmasında,

üretkenliğin artışında, farmasötik değere sahip proteinlerin üretiminde ve insan

proteinlerinin üretimi için kullanılabileceği düşünülmektedir.

(17)

Transgenik bitkiler

Bitki hücrelerine doğal gen aktarım sistemleriyle aktarılamayan,

yabancı DNA’ lar genetik mühendisliği teknikleriyle

aktarılarak transgenik bitkiler (Genetik yapısı değiştirilmiş bitkiler) üretilmektedir.