IDENTIFICATION OF SEMEN IN STAINS.

Lekelerde Sperm

İdantifikasyonu

SEVlL

ATASOY

İstanbul Üniversitesi Adli Tıp Enstitüsü ve Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Biokimya Anabilim Dalı;

Adli Tıp Kurumu, İstanbul, Türkiye.

IDENTIFICATıoN OF SEMEN IN STAINS Summary

. Methods for the identification of human seminal fluid and its stains are reviewed. Mcthods that can be used in medicolegal practiee are dealt with in more detail and compared. The tests were classified as prcliminary and confirmatory. The classical crysıal method s for the detection of choline

and spermine in seminal stains were found umeliablc. The author proposed the application of the acid phosphatase test and to add lcucine amino peptidase, y-glutamyltransferase, glycylproline dipeptidyl aminopeptidase, choline, spermine or zinc analysis for confirmation of semen in roUline investigations. if the absence of spermatozoa in stains in spite of positive preliminary tests is encountered, the detection of semen specific protcins such as p30 (prostatic anıigen, y-seminoprotein) by immunological method s should be the only absolute proof for the final idcnıificaıion of semen in stains.

Key words : Sperm . Semen analysis . Sexual en me -ldenlifieaıion . Body fluid - Semen specific

proleins

Özet

Seminal sıvı lekelerinin idantifikasyonu amacıyla adli olaylarda kullanılmak üzere önerilen değişik yöntemler iki sınıfa ayrılarak (ön inceleme ve testler ile kanıtlayıcı testler ;. gözden geçirilmiş, bunların bazılarının uygulaması hakkında ayrıntılara girilmiş ve bulgular yorumlanmıştır. Ön incelemeler ve testler grubunda yer alan ve kristallendirmeye dayanan Florence (1896), Barberio

(191 I) ve Puranen (1936 )'in klasik yöntemlerinin özgüllükten uzak olduğu; yanlış negatif sonuç vermeleri nedeniyle kesinlikle kullanılmamaları gerektiği bildirilmektedir. Ön inceleme ve test olarak asid fosfataz testinin mUllaka uygulanması gerektiği, ancak bunun aminopeptidaz testi ya da kolin, spermin, çinko gibi bir ön deney ile desteklenmesi gerektiği vurgulanınıştır. Spermatozoitlerin mikroskopla görülmesine dayanan ve genclde bii- kanıtlayıcı test olarak kabul edilen yöntemin, eski lekeler ilc azospermik ya da vazeklomize kişilerin oluşturduğu lekelerle negatif sonuç vermesi nedeniyle güvenilir olmadığı belirtilerek, spcrmatozoitlerin görülemediği koşullarda mutlaka seminal sıvıya özgü p30 ( ,·seminoprotein, prostatik antijen ) proteininin immunolojik yöntemlerle aranmasının idantifikasyon için en kesin çözüm olduğu bildirilmiştir.

Adli Tıp Derg. 5,49·66 (1989)

İ TIP DERGİSİ

Journal of Forensic Medicine

Adli T

ıp Dergisi 1989; 5(1-2): 49-66

50

S.ATASOY

GİRİŞ

İnsan

semina

l

sıvısının ve bunun oluşturduğu

lekelerinin

idanlifikasyonu

amacıyla geliştirilen

yöntemlerin

çok uzun bir

geçmişi bulunur. Spermatozoitle

r

in mikroskop

yardımıyla görü

lmesi yöntemlerin en güveniliri

olmakla

birlikte, şüpheli mate

r

yalde

spermatozoi

t

görü!ememesi

incelenen

örneğin seminal sıvı olmadığını

gös

t

ermez.

Çünkü

a

zos

permi

k lekelerI e ya da üzerinden çok zaman

geçmiş sperm

l

ekele

ri

ile

çalışıldığında, spermatozoillerin görülememesi doğaldır. Halbuki adli olay

l

arda

sıvının

ya da

l

ekeni

n

spe

r

matozoit içerip

içermediği değil, vesica seminalis'ten kaynaklanıp kaynaklanmadığı

önem

taşır.

Bu öneml

i

sakıncası

yüzünden, seminal

sıvının ve

lekelerinin idantifikasyonunda kimyasal yöntemler, spermatozoitlerin görülmesine

dayanan

mikroskobik

yöntemlere

t

ercih edi

li

rler.

Ayrıca

kimyasal yöntemlerin

.

uygulanışı çok daha kolaydır.

Kimyasal yöntemlerin en

klasiği,

Florence

(ı)'ın geliştirdiği ve seminal kolini

kristallendirmeye dayanan mikroskobik yöntemdir.

Barberino (2)

ve Puramen

(3)

de

seminal le

ke

lerde

spermin 'in

tanınmasına yarıyan

kristalagrafik yöntemler

geliştirmişkrdir. Bu klasik yöntemler gerek uzun sürmeleri gerekse

yeterince

güvenilir

olmamaları

nedeniyle, günümüzde yaygın

bir şekilde kulIanılmamaktadırIar.

Sperm

i

dantifikasyon

u

amacıyla kullanılan öncül yöntemlerin

t

ümü, seminal s

ıvıda

bulunan

ve derişimi organizmanın diğer

vücut sıvı ve dokulardakine o

ranl

a çok yüksek

olan

bir

ki

myasal

bileşiğin

ya da enzimin belirtimine dayanır

.

Bu

nu

nla b

ir

l

ikte,

semina

l

sıvıda yüksek derişimde

bulunan her

kimyasal

bileşik ya

da

enz

im

, adli amaçlarla

kullanılabilen

bir kimyasal

işaret

(marker) olarak

değerlendirilemez.

Bir kimyasal bileşiğin ya da proteini

n

,

marker olarak kabul edile

bi

lmesi

için, bu

bileşiğin aranmasında kullanılacak

deneyin bas

i

t olması gerekir. Hatta deney sonucun

u

n

çıplak gözle bile okunabilmesi hedeflenir. Bu nedenle herhangi bir yöntemin sperm

i

dantifikasyonu

i

çi

n

geçerli olabilmesinin

ilk

koşulu, deneyin mümkün olduğunca

basit

gereçler

le

uygulanabilmesi; gaz kromatografı, amino asid analizleyicisi, yüksek

verim

sıvı kromatografı

ya da kütre

spektrografı

gibi

karmaşık

gereçlere gereksinim

göstermemesi ve

hızlı bir şekilde gerçekleştirilmesidir. Uygulanması kolayolmakl

a

birlikte ince tabaka kromatografisi ve elektroforez teknikleri bile

uzun

sürmele

ri

nedeniyle tercih edilmezler.

İkinci

temel

koşul ise maliye

t

düşüklüğüdür.

Radioimmunoassay

teknikleri

geneııik­

le çok duyarlı ve hızlı olmalarına karşın,

çok pahalı olduklarından spe

r

m

idantifikasyonu

amacıyla kullanılmazlar. Öte yandan deneylere gereken

özgül antikorlar piyasadan

sağlanamadığında, bunl,ırın laboratuvarıarda

üretimi de gerekir.

Üçüncü

koşul ise, idantifikasyonda kullanılan küçük bir lekede, ar

a

nan k

i

myasa

l

bileşik

ya da enzimin mutlak düzeyinin, uygulanan yönte

m

in

duyarlılık sınırları

içe

ri

sine girebilecek kadar yüksek olmasıdır. Ku

llanılacak yön

temde a

ranaıı. bir diğer

özell

i

k

ise,

bi

r r

enk reaks

i

yonu olması

ve deneyin sonunda

çıplak gözle

farkedilebilir

Lekelerde Sperrn Idarıtifikasyonu 51 İncelencn

le

keler

genellikle

sarımsı olduğunudan, kullanılan

yöntem

eğer

bir

renk

reaksiyonu

ise,

seminal

sıvı varlığında oluşacak

rengin

sarı olmamasına

dikkat edilir.

Sperm

varlığında

koyu

kırmızı,

mor, ya da

uzun

dalga

boylarında

absorbans

gösteren

ma vi gib

i

r

enklerin

meydana

gelmesi,

çıplak

gözle de fark

edildiğinden

daha

k

II

il

al11şlıdır.

Y Önlem

seç

i

minde

üzerinde

özellikle

durulan

beşinci koşul

ise,

idantifikasyonda

işe yarıyan

kimyasal

bileşik

ya da enzimin mümkün

olduğunca dayanıklı olmasıdır.

Bu

niteliği taşıyan

yöntemler eski

lekelere de

uygulanabildiğinden

tercih

edilir.

Yöntemlerde

bulunması

gereken bu özellikler dikkate

alındığında,

adli

amaçlarla

senIİnal sıvı

idantifikasyonunda

güvcnilerek

kullanılacak

inceleme

tekniklerini

şu ~ekilde sınıflamak olasıdır:

ı.Ön

inceleme ve testler

1.

ı

.

Mo

r

-ötesi (UV)

ışık

1.2.

Asid

fosfataz

1.3.

Lösin aminopeptidaz

1

.4. Gama-g1ütamiltransferaz

1.5. Glisilprolin

dipepıidil aminopepıidaz

1.6.

Kolin

1.

7.

Spermi

n

1.8

.

Çinko

1.9.

Diğer

öncü! deneyler

2.Kanıtlayıcı

testler

2.1. Spermatozoitlcrin mikroskop ilc görülmesi

2.2

.

Laktat

dehidrogenaz izozim X (LDH-X)

2.3

.

Sperm

varlığının

immunolojik

yöntemlerle belirtill1i

1.

ÖN

İNCELEME

VE TESTLER

ı.l.

MOR -

ÖTESİ

(UV)

IŞIK

Elbise,

halı, çarşaf

gibi

gcniş

alanlar üzerindeki seminal lekelerin gösterilmesinde,

250-365 nm dalga

boylarında

mor

ötesi

ışık

genellikle yeterli olur. Bu dalga

boylarındaki ışık altında

seminal lekeler soluk mavi-beyaz fluoresans verirler.

Ancak

günümüzde bu yöntem her zaman geçerli olamamaktadu.

Çünkü

tekstil

sanayiinde, nuoresans verme

özelliğine

sahip

çok

sayıda

kimyasal üründen

beyazlatıcı

olarak

yararlanılmakıadır.

Bu tür bir

kumaşta

sperm lekelerini mor-ötesi

ışık kaynağı kuııanarak

aramaya

çalışmak anlamsızdır. Öte yandan, kumaş boyamasında kullanılan bazı

boyalar, sperm lekeIcrinin nuoresans

özelliğini

ortadan

kaldırmaktadır.

52 S. ATASOY

S

emina

l

lekeleri

n

Duoresans

özelliği,

insan sperm

sıvısında doğalolarak

b

ulunan

ve flavin adenin dinükleotid ilc flavin adenin mononükleotid ' i

n

yapısında

yer alan

Davin

l

erde

n

kaynaklanır

(4).

Diğer

Duoresan

bileşiklerin,

öze

ll

ikle

m

avi fuoresans

vere

n

lerin

niteliği

h

enüz bili

n

memektedir.

1.2.

ASİD

FOSFATAZ

1

.

2.1. Prensip

A

sitfosfataz (EC 3.1.3.2) enzimi, memeli

canlıların

tüm doku ve vücud

sıvılarında yaygın

olarak bulunmakla birlikte, insan seminal

sıvısındaki etkinliği diğer

doku ve

sıvılardakine

oranla çok yüksektir.

Kanıtlanmasının kolayoluşu

ve yüksek

etkinliği

nedeniyle, insan sperminin gösterilmesinde

yaygın

bir

şekilde kullanılmıştır (5). Söz

konusu enzimin temel

işlevinin, İnsan

spe

r

mine fazla miktarda

salgılanan

fosforiIkolini

hidrolizlemek

olduğu

kabul edilmektedir (5).

Asid fosfataz

etkinliğinin

gösterilmesinde, fenil fosfat, p-nitrofenil fosfat ve

a-naftil fosforik asid gib

i

yapay substratlar

kullanılır. Oluşan

fendI ya

d

a naftoller ,

diazonium

bileşikleriyle

tepkimeye

sokulduğunda

renkl

i

ürünler meydana gelir.

S

ubstrat

olarak a-naftil fosforik asidin

kullanıldığı

ve tepkime ürününün o-dianisidin ile

menekşe

renk

verdiği

yöntem güvenilerek

kullanılabilir.

1.2.2. çözeltiterin IIazırlanmasl

a) Tampon çözeltisi: 5.9 g sodyum sitrat ( 2 x H20 ) destile suda çözülür ve 100 mL'ye tamamlanır. 4.2 g sitrik asid ( 1 x H20 ) destile suda çözülür ve 100 mL'ye tamamlanır. lki çözelti , pH değeri 5.0 olacak şekilde birbirine karıştırılır.

b) Ayıraç çözeltisi: Hazırlanan tampon çözeltinin 100 mL içerisinde 0.2 g (l·naftil fosforik asid ve 0.4 g diazoniyum o-dianizidin çözüıür. Hazırlanan ayıraç çözeltisi kahverengi olup. buz dolabında 1 hafta dayanıklıdır. Örnek üzerine doğrudan damlatma ya da püskürtme şeklinde kullanılacaksa. ayıraç çözeltisinin tampon çözeltisi ile 1:8 oranında seyreltilmesi gerekir.

1.2.3. Deneylerin Yapılışı

lncelenen materyalden kesilen küçük bir parça, porselen kapsüle ya da cam parçası üzerine konur. Şüpheli leke üzerine seyreltilmiş ayıraçtan 1 damla damlatılır. 1-2 saniye içinde görülen koyu pembe-menekşe renk, enzim etkinliğinin yüksek olduğunu gösterir. Aynı rengin 10-20 saniye içinde alınması orta derecede, 1 dakikadan uzun bir sürede alınması zayıf asid fosfataz etkinliği bulunduğunu gösterir. Lekeli bölgenin kesilerek ayrılması mümkün değilse, lekenin bulunduğu bölgeye, destile suyla ıslatılmış beyaz süzgeç kağıdı bastırılır. Böylelikle leke ekstre edilir, süzgeç kağıdına seyreltilmiş ayıraç püskürtülerek deney tamamlanır.

Lekelerlle Spcmı ldantifikasyonu 53

1.2.4.

Bulguların Yorumlanması

Asid fosfataz

deneyi çok

duyarlıdır.

Sperm

lekelerinin 64 kat

sulandırılmış şekilleriyle yapılan

incelemelerde bile pozi

tif reaksiyon

alınır.

Deney sonucunun pozitif

olması

için, rengin

ı

dakikadan

kısa

bir süre içinde

oluşması

gerekir. Vajinal

sıvı,

idrar

ve

dışkı

genellikle

ı

dakikadan uzun bir süre sonra pozitif sonuç verirler (6). Bu nedenle,

bulgular

değerlendirildiğinde,

inkübasyon süresi mutlaka dikkate

alınmalıdır.

20

yılın

üzerindeki sperm lekelerinin bile

ı

dakikadan uzun inkübasyon sürelerinde

pozitif reaksiyon

verdiği gözlenmiştir. Karnıbahar

(Brassica oleacea bot

r

ytis ) gibi kimi

bitkiler, insan sperm lekelerine benzer

şekilde

güçlü pozitifreaksiyon verirler (5, 6). Bu

sakıncalarına rağmen, kolaylığı

ve

duyarlılığı

nedeniyle asidfosfataz

deneyi günümüzde

yaygın

oIarak

kullanılmaktadır.

1.3.

LÖSİN AMİNOPEPTİDAZ

1.

3

.

1

.

Pre

nsi

p

İnsan

seminaI

plazmasında

L-lösin-f3-naftilamid

'in hidrolizini kataIizleyen ve

etkinliği

çok

y

üksek olan bir enzimin;

lösin aminopeptidaz

'ın

(EC 3.4.11.

1)

bulunduğu bildirilmiştir

(7).

Bu enzimin

insan spermindeki

etkinliği, diğer

vücud

sıvılarına,

hayvan sperm

i ile

sebze ve meyva

sularındakine

oranla çok daha yüksek

oluşu

(8), sperm

lekeleri

nin

idantifikasyonuna yarayan basit bir yöntemin

geliştirilmesine

yo

l

açmıştır.

(9).

Yöntem, histokimyasal bir

tekniğe dayanır

(lO). Seminal

sıvı

içerisindeki enzimin,

L-lösin-f3-naftilamid 'den

f3-naftilamin

'i

serbestleştirmesi sağlandıktan

sonra, f3-naftilamin

bir diazonium tuzu olan Fast Carnet CBC

ilc kenetlenerek çözünmeyen

kırmızı-pembe

renkte bir aza boyar

ımıelde oluşturulur.

1.3.2. çözelti/erin lIazırlanması

aJ J\yıraç çözeltisi (1) : 5 mg L-ıösiı·~·naftilamid IlCı ıo mL destile suda çözüıür. çözelti buzdolabmda ı ay dayanıklıdlL

b) J\yıraç çözeltisi (2) : 20 mg rast Garnet GBC tuzu, deney yapılmadan hemen önce, LO mL 0.2 M Tris IlCI (pIl 7.1) tamponunda çözüıür.

54

S.ATASOY

1.3.3. Deneylerin Yapı.lı.ş'.

Lekeli materyal porselen kapsiile alınır. Üzerine (i) ve (2) ayıraçlarının 1:1 karışımıyla oluştunılan çözeltiden damlatılır. 5 dakika içerisinde belirgin pembe-kırmızı rengin oluşması ort.amda

lösin aminopeptidaı etkinliğinin bulunduğunu gösterir.

1.3.4. Bulgulann

Yorumlanması

Sperm

lekelerin

i

n 8

kat

sulandırılması

halinde

bile, test poziti

f

sonuç

verir.

Oda

sıcaklığında

2

yıl

kadar tutu

l

an lekelerden de pozitif sonuç almak mümkün

olmuştur. Dışkı, karnıbahar

ve

bazı

mant

ar

lar

hafif pozitif

reaksiyo

n

veri

r

le

r.

V

ajinal

sıvı

kesinlikle

pozitif rea

k

siyo

n

vermediğinden ırza

t

ecavüz

olaylarının

incelenmesinde

güvenilerek

kullanılabilir.

Domuz,

sığır,

köpek, at ve

m

aymu

n

sperm

l

ekeleri pozitif sonuç vermez

.

Seminal

lösİn

aminopeptidaz

'ın kaynağı

prostat

olduğundan

(11),

vazektom

i

ze

kişilerin bıraktığı

lekelerin incelenmesinde

kullanılabilir.

Son

yıllarda lösİn arnİnopeptidaz 'ın

immunoloji

k

belirtimine dayanan bi

r

yön

t

em

geliştirilmiştir

(12).

Yöntem, her nekadar antiserum

üretimini ve elektroforez

ile

çöktürülmesini gerekt

i

riyorsa da, 32 kat

seyreltilmiş

sper

m

lekeleriyle de poz

i

tif sonuç

vermes

i

nedeniyle histokimyasal yöntemden daha

duyarlıdır.

1.4.

y-

GLUTAMİL

TRANSFERAZ

1.4.1.

Prensi

p

İnsan

seminal

plazmasında

y

-

glütarnil tranferaz

etkinliği

(EC

2.3.2.2; eski

adı

y-glü/arnİl transpeptİdaz

)

diğer

dok

u

ve vücud

sıvıIarına

oranla daha yüksektir (13).

Asid fosfataz

'dan daha

dirençli

b

ir enzim

olduğu

öne

sürülınektcdir

(

1

4, IS).

Substrat o

l

arak

y-glütamil-a-naftilamid

'i

n

kullanıldığı

(16)

ve

histokimyasal bir

yönteme dayanan (17) bir inceleme

geliştirilmiştir.

Enzim etkisiyle

serbetleşen

a-n(lftilamin

, Fast Garnet GEC

tuzu

ile

kcnetlendiğinde, kırmızı-kahverenkli

bir

ürün

oluşur.

1.4.2. Çözeltilerin Jl azırtanması

a) Aytraç çözeltisi (1) : 5 mL destile su içerisinde ıoO°C'ye ısıtılarak 20 mg N-y-glütamil-a -narıiJamid ve 100 mg glisilglisin-HCl çözüıür. Soğutuldukıan sonra çözeltinin PI! değeri IM NaOII ilc 7.2-7 .8'c ayarlanır.

b) Ayıraç çözeltisi (2) : 5 ınL destile su içerisinde 5 mg Fast Gamct GBe çözülür. ller iki ayıraç buz dolabında 2 harıa kadar dayanıklıdır.

Lekelerde Spcrm ldantifikasyonu 55 1.4.3. Deneylerin Yapıtışı:

Şüpheli materyalden alınan küçük bir parça, bir deney tübünün dip kısmına yerleştirilir. Üzerine damla (1) ayıracı ve 1 damla (2) ayıracı damlatılır, 37°C'lik su banyosunda 5-10 dakika inhibe edilir. Kontrololarak aynı işlemler, materyalin lekesiz kısmından bir parça alınarak tekrarlanmalıdır.

!nkübasyon sonucunda çıplak gözle görülebilen kuvvetli kahverengi-kırmızı renk

r-glüıamillrans!eraz etkinliğinin bulunduğunu gösterir.

1.4.4.

Bulguların Yorumlanması

Yapılan araştırmalar bu

d

eneyin,

en az 4

kat

sulandırılmış

sperm

lekeleriyle pozitif

son

uç

verdiğini göstermiştir.

Oda

sıcaklığında

11-23

yıl bekletitmiş

ola

n

11

sperm

.lekesi

örneğinden yalnız

biri

n

egatif sonuç

vermiştir.

Bu bulgular

y-glütamiltranferaı

deney

i

nin

beklemiş

sperm lekelerinin ince

l

enmesinde k

ul1anılabileceğ

in i gösteri

r.

9 insan sü

t

lekesinin

Tsi, o

l

dukça kuvvetli

bir renk

oluşturmuştur. İncelenen

1

5

vajinal

sıvı örneğinin

3'ü pozitif sonuç

vermişse

de,

oluşan

renk çok

h

afifti

r.

Değişik

meyva ve scbzelerle

yapılan çalışmalar

sonucunda,

asidfosfataı

deneyiyle

poz

it

if sonuç veren

karnıbaharın,

bu deneyde

negatif soruç

verdiğini göstermiş;

ancak

fasulye,

soğan,

elma, erik ve çilekle hafif pozitif

r

eaksiyon

alınmıştır.

1.5.

GLiSİL PROLİN DİPEPTİDİL AMİNOPEPTİDAZ

1.5.1. Prensip

İnsan

seminal

plazması

yüksek etkinlikte glisilpro/in dipeptidil

aminopeptidaı

(EC

3.4.14.-)

enzimi içerir (18,19).

Histokimyasal

bi

r

tekniğe dayanılarak

(20)

geliştirilen

bir yöntemde enzim,

glisil-L-prolin-4-metoksi-f3-naftilamid 'in hidrol

i

zini

katalizlemekte, 4-metoksi-f3-naftilamin

serbestleşmektedir.

Bu ürün

tetraıotlanmış

o-dianizidin

i

lc

kenetlendiğinde

kahverengi-kırmızı

bir

r

enk

oluşur.

1.5.2. Çözelti/erin /lazırlanması

a) Ayıraç çözeltisi (1) : LO mg glisil-L-prolin-4-metoksi-j3-naftilamid LICL, 5 mL O.IM Tris HCl tampon çözeltisinde (pH 8.0) çözüıür.

b) Ayıraç çözeltisi (2) : 10 mg o-dianizidin (tetrazoılanmış) 5 mL destile suda çözülür. 1.5.3. Deneylerin Yapı/ışı

56 S. ATASOY birer damla (1) ve (2) ayıraçlarından damlatılır. 37°C'lik su banyosunda 5-10 dakika kadar inkühe edilir. Aynı büyüklükte lekesiz kısımdan alınan hir parça kontrololarak kullanılır ve benzer işlemlerden geçirilir. Tnkiibasyondan sonra çıplak gözle görülebilen kahverengi-kırmızı renk,

glisilprolin dipeptidil aminopeptidaz etkinliğinin bulunduğunu gösterir.

1.5.4. Bulguları

n Yorumlanması

Duyarlılık

ile ilgili olarak

yapılan araştırmalar,

4 kat

sulandırılmış

leke

örneklerinin

pozitif sonuç

verdiğini göstermiştir. Glisilprolin dipepıidil aminopepıidaı tıpkı

lösin

aminopepıidaz

ve

y-glüıamiltransferaı

gibi

diğer

aminopeptidazlara benzer

şekilde

lekelerde oldukça

dayanıklıdır.

Oda

sıcaklığında

5

yıl beklemiş

tüm sperm lekesi

örnekleriyle pozitif sonuç

alınmıştır.

6-24

yıl

eski örneklerin

bazıları

negatif

sonuç

vermiştir.

Vajinal

sıvı, dışkı,

fasulye,

soğan

ve çilekle

yanlış

pozitif sonuç almak mümkündür.

Ancak

oluşan

renk çok daha hafiftir.

Dışkıda yanlış

pozitif reaksiyon

alınmasının

nedeni, memeli ince

bağırsak fırçamsı

kenar

zarında

ghsilprolin

dipepıidil

aminopeplidaz

etkinliğinin bulunmasından kaynaklanmaktadır

(21)

1.6.

KOLİN

1.6.1. Prensip

İnsan

sperminin

olağanüstü

yüksek düzeylerde

(0.9-

1

.4

mg/mL

seminal

sıvı)

kofin

içerdiği

bilinir (22). 1896

yılında Florence

(1),

insan seminal çekitlerinin mikroskop

lamı

üzerinde iyod çözeltisiyle

karıştırılması

sonucunda kahverengi

kristaııerin oluştuğunu gözlemiş

ve bu reaksiyonun sperm

idantifikasyonu

için

kuııanılabileceğini bildirmiştir.

Bu deneye

kısa

bir zaman sonra

karşı çıkılmış

ve

yanıltıcı olduğu

iler

i

sürülmüştür.

Kolin ve spermin gibi küçük protein

molekül1erinin,

enzim proteinle

r

ine

olan

üstünlüğü, ısı,

asid,

yaşlanma

gibi

koşullara

çok daha dirençli

olmalarından kaynaklanır.

Seminal

sıvıda

kolin belirtimine

yarıyan

enzimatik yöntemler

geliştirilmiştir

(22,

23).

Bu yöntemlerin birinin prensibi

şu şekildedir:

a) önce,

kolin

varlığında, koZin

oksidaza bağımlı

olarak

hidrojen peroksid

oluşturulur,

b) daha sonra

hidrojen peroksid

oluşumuna bağlı

olarak

peroksidaı varlığında, N-etil-N-(3-meıilfenil)­ N'aseıileıilendiamİn

(EMAE) ve

4-aminoanıipirin

'den kuvvetli

menekşe

bir

renk

meydana getirilir (22).

1.6.2. Çözeltilerin IIazırlanması

a) Tampon Çözeltisi: 1.4 g monobazik potasyum sülfat 100 mL destile suda çözÜıür. 5M KOlI ile çözeltiııin pH'sı 7.4'e ayarlanır.

Lekelerde Sperrn İdantifikasyonu

57

b) Ayıraç çözelt;si (1) : 2 mg E.\TAE ve 2 mg 4-amino-antipirin, 5 mL tampon çözelti içinde çözülerck hazırlanır.

c) Ayıraç çözellisi (2) 2 mg turp pcroksidazı ve 2 mg kolin oksidaz 5 mL tampon çözelti içinde çözülcrck hazırlanır.

1.6.3. Deneylerin Yapılışı

Şüpheli materyalden alınan bir parça porselen kapsül üzerine yerleştirilir. Üzerine birer damla (i) ve (2) ayıraçlarından katılır. 5-10 dakika sonra kuvvetli pembe-menekşe rengin oluşması ortamda kolin bulunduğunu gösterir. Önerilen sistem otooksidasyona uğramadığından kontrol çalışılması gerekli

değildir.

1.6.4.

Bulguların Yorumtanması

Yukarıda

prensibi

açıklanan

enzimatik

tepki me 8 kat

sulandırılmış

tem sperm

lekeleriyle pozitif reaksiyon verir. 5

yıl bekletilmiş

sperm lekelerinin tümü ile pozitif

sonuç

alınmakla

birlikte, 6-24

yıl bekletilmiş olanların

bir bölümü negatif

sonuç·

vermiştir.

Sperm

dışındaki

insan vücud

sıvılarından

hiç biri pozitif sonuç vermez. Azospermik

seminal

sıvılar

ile

yapılan çalışmalarda,

pozitif sonuç

alınmıştır. İncelenen değişik

sebze

ve meyvalardan;

karnıbahar, salatalık,

fasulye,

kıvırcık

lahana ve

salatanın

hafif pozitif

sonuç

verdiği, meyvaların

hiç birinin renk

oluşturmadığı gözlenmiştir.

Serbest

kolinin temel

kaynağı

olan

josjorilkolin seminal veziküllerde

sentezlcndiğinden

(24),

söz konusu

yöntem

vazektomize

kişilerin

seminal

lekelerinin

incelenmesine de uygundur..

1.7.

SPERMİN

1.7.1. Prensip

İnsan

sperm sıvısındaki

spcrmin

derişimi diğer

doku ve vücud

sıvılarındakine

oranla

daha

yükseklİr

(24). İnsan seminal sıvısının

idantifikasyonu için

kullanılan

ve

spcrmin'

in kristalIendirilmesine dayanan

klasikleşmiş

yöntemler

bulunur

(2,

3). Öte yandan

spcrmin

'in

tanımında kağıt

ve ince tabaka kromatografisine dayanan teknikler de

bildirilmiştir (25-28).

Sığır

plazma

amin

oksidazz

'nın (EC

1.4.3.6)

spermin

ile reaksiyonuna dayanan bir

yöntem de

vardır.

Bu yöntemde daha

sonra

2',7'-diklorof/uoressin, turp (Armoracia

lapathijolia ) pcroksidaz

'ı varlığında

2

',7'-diklorof/uoressein

'e

dönüştürülür

ve

açık yeşil

bir renk elde edilir

(29).

58 S. ATASOY

1.7.2. Çözeltilerin II azırlanması

a) Tampon çözeltisi: 1.2 g Tris (hidroksimetil) aminometan, 0.62 g borik asid ve 3.7 mg EDTA 100 ınL destile suda çözülür ve IM HCl ile çözeltinin pH'si 7.0'a ayarlanır.

b) Ayıraç çözeltisi (1) :1 mg 2',T-diklorofluoressin diasetat 3 mL O.IM NaOII içinde çözüıür. Çözeltinin pH'sı 0.3M nCl ile Tye ayarlanır. Çözeltinin hacmi tampon ile 10 mL'ye tamamlanır.

Çözelti kullanımdan hemen önce hazırlanmalı ve karanlıkta tutulmalıdır.

e) Ayıraç çözeltisi (2) : 2 mg turp peroksidazı ve 2 mg sığır plazma amin oksidazı ( 22 lU/mg, Worthington Biochem. Corp., Freehold, NJ) 10 mL tampon çözeltisi içinde çözüıür.

1.7.3. Deney/erin Yapı/ışı

Lekeli materyalden alınan küçük bir parça bir deney tübünün dip kısmına yerleştirilir. Üzerine (1) ve (2) ayıraçlanndan ikişer mL katılır ve karanlıkta 37 °Clik su banyosunda 5-10 dakika inkübe

edilir. Materyalin lekesiz kısmından kontrol çalışılması gereklidir. Inkübasyon sonucunda yeşil

rengin oluşması deneyin pozitif olduğunu gösterir.

1.

7.4.

Bulguların Yorumlanması

Deneylerde

kullanılan

2',7'-diklorofluoressin ,

oldukça

dayanıksız

ve

özelli

k

te

ışıkta

otooksidasyona

ço

k

yatkın

bi

r

bileşiktir. lşlemlerin

mümk

ü

n

olduğunca ışıktan uzakta yapılması

ge

r

ekir.

Bu

nu

n

l

a b

i

rlikte

1

n

g

spermin

'i bi

l

e

beli

rt

m

ek

mümkün

olduğundan

çok

duyarlıdır.

8

kat

sulandırılmış

spe

r

m

lekeleriy

l

e

poziti

f

sonuç

almır.

5

yıl bekletilmiş

spe

r

m

lekeleri

ni

n

he

p

s

i

yle

pozitif

sonuç

alınmış,lI

-20

yıl bekletilmiş

LO

örneğin yalnız

biri

nega

t

if

sonuç

vermiştir.

Tüm

bu bu

lg

ular spermin 'in spe

nn

lekele

ri

nde çok

dayanıklı

olduğunu kanıtlar.

İncelenen

vücud

sıvılarından yalnız

30 i

dr

ar ö

rneğinden

iki

si poziti

f

sonuç vern

1iştir.

Buna da

idrann

sper

m

ile

bulaşması

yo

l

açmış

o

la

bilir.

Diğer

vücut

sıvı

ve

dokularının

hiç bir

i

b

u

reaksiyo

nu

ve

r

memektedir. Seminal spermin

büyük

ö

l

çüde

pro

stat

kaynaklı

olduğundan

(24),

deney

i

vazektomize

kişilerin

sperm leke

l

er

in

e

uygu

l

am

ak

mümkün-dür.

1.8.

ÇİNKO

1

.

8.1.

P

rensip

İnsan

s

p

erm

i

ndeki

çinko

düzeyle

r

inin

memeli

canlılarm diğer vüeud sıvı

ve

dokularının

büyük

bir

b

ölümündekinden daha yüksek

olduğu

bil

i

nm

e

k

l

e

birl

i

kte (24,

30)

,

spe

rm

in

b

u

özelliğinden yararlanılarak geliştirilen

yöntemler

çok

azdır.

Lekelerde Spcnn ldantifikasyonu 59

Çinko

ile renk

oluşturmak amacıyla kelatlaştırıcı bileşik

olarak

1-(2-piridil-azo·2-nai/ol (PAN)

'ın kullanıldığı,

kali

t

atif amaçla

uygulaması

çok kolay

bir

çalışma

bulunur (31).

1.8.2. Çözeltiterin llazırlanması

a) Tampon çözeltisi: 3.0 g Tris (hidroksimetil) aminometan 50 mL destile suda çözÜıür.

b) PAN çözeltisi: ı mg PAN, 0.2 mL Triton x-ıoo içinde, cam çubukla karıştmlarak çözüıür. PAN

çözeltisi buzdolabında 2 hafta dayanıklıdır.

1.8.3. Deneylerin Yapılışı

Lekeli materyalden alınan küçük bir parça deney tübünün dibine yerleştirilir. Leke üzerine 2 damla PAN çözeltisi eklenir, hafifçe çalkalanır. 2 dakika kadar sonra kuvvetli ktrmızı rengin oluşması deneyin pozitif olduğunu gösterir.

1.8.4.

Bulguların Yorumtanması

İncelenen

sperm lekes

i

örneklerinin

büyük

bir

bölü

m

ü

4

kat

sulandırmaya

kadar

pozitif

sonuç verir.

Duyarlılık

alt

sınır

2-3 nmol

çinko 'dur.

O

d

a

sıcaklığında değişik

süreler tutulan tüm

sperm örnekleri, 25

yıl b

ekle

tilenler

dahilolmak üzere pozitif

son

uç

vermiştir.

İnsan

vücudunun

diğer

vücud

sıvıları

ve

yaygın

se

b

ze

ve

meyvaların

hi

ç biri pozitif

reaksiyon vermez. ÖLe yandan

azospermik

seminal

sıvılar

da

pozitif

son

uç

verİr.

Deney

yalnız

inceleme örneklerinde faz

l

a

miktarda

bakır

ve

nikel

bulunması

halinde

ön

ayırma basamakları

(32) gerek

ti

rir

ki,

sper

m

içi

n

bu

söz konusu

değildir. Kanlı

örneklerde

demir

ile

kontaminasyo

n

olu

r.

2

değerlikli

demir, PAN ile kahverenkli bi

r

ürün

oluşturur,

3

değerlikli demir

ise hiç renk ve

rm

ez.

Çinko,

PAN

ile

koyu

kırmızı

bi

r

renk

oluşturduğundan,

deney

kanlı

örneklere

de

g

üv

e

nilerek

uygulanab

il

ir.

1.9. DiGER ÖN TESTLER

1948

yılında

B

erg

(33), klas

i

k bir biyolojik yöntem ku

ll

anarak, i

n

san semina

l

sıvısında diamin oksidaı

(EC L.4

.

3.6)

etkinliğinin

çok

yüksek

olduğunu göstermiştir.

Son

yıllarda

diamin

oksidaı

deneyinin

duyarlılığı yükseltilmiş

ve

b

u

amaçla

fl

uoro-metrik

bir yöntem

gelişttirilmiştir

(34).

Yapılan

kantit

a

tif

çalışmalar,

Berg

'in

bulgu-larının

aksine,

sperm

sıvısı

lekelerindeki

diemin

oksidaı etkinliğinin

yeterli

olmadığını

S. ATASOY

1964'de Grzffiths ve Lehmann (35), sperm idantifikasyonunda kreatin kinaz 'dan

(EC2.7.3.2)

yararlanılabileceğini bildirmişlerse

de, bu yöntem

yaygınlaşmamıştır.

lnsan seminal

sıvısında diğer

vücud

sıvı

ve

dokularıldakinden

dah

a

yüksek düzeyde

yer alan pek çok

bileşen

bulunur (30).

Örneğin

hiyalüranidaz (36) ve akrasin (37),

lekelerde spermatozoidlerin gösterilmesi için uygun birer biyokimyasal belirteçtir.

Ancak

günümüzde bu

bileşiklerin

belirtiminde

kullanılabilen

yöntemlerin hiç biri adli

amaçlarda gerekli olan

koşulları

yerine getirememekte

olduğundan,

pratik

kullanımları

yoktur.

Son

yıllarda yapılan çalışmalar,

insan spermindeki

anjiatensin-dönüştürücü

enzim

(EC 3.4.15.1)

etkinliğinin

çok yüksek

olduğunu

(3.40 mikromol/mL/dak)

göstermiştir

(38).

Ancak bu bulgu da henüz adli uygulamalar için yeterli güvenilirlikte

değildir.

Terasawa ve Takatari (39) seminal sitrat

'1

belirtmek için basit bir enzimatik

yöntem

geliştirmiş

ve adli incelemelerde

kullanılabilirliğini araştırmışlaçdıL

lnsan

scrnİnal sıvısında

sitrat düzeyleri çok yüksek olmakla birlikte (30

.

8 mikromol/mL),

meyvaların

büyük bir bölümü de fazla miktarda

sitrat

içerdiğinden

pratik önemi yoktur.

,

_{KANıTLAYıCı}

_TESTLER

2.1

SPERMATOZOİTLERİN MİKROSKOP İLE GÖRÜLMESİ

2

.1.

1. Prensip

Hiç

kuşkusuz

spennatozoitlerin mikroskop ile görülmesi, bir lekenin sperm lekesi

olarak idantifikasyonu için en güvenilir yöntemdiL Spermatozoid1erin fuksin ,

hemataksilin ve eazin , gentian maru ve metiten mavisi gibi

boyalarla

görünürleştirilmesine

dayanan pek çok yöntem bulunur. En

yaygın

olarak

kullanılan

yöntemlerden biri Baecchi (40)'ye aittir ve asi d ortamda

0/0

1 'lik asidfuksin

ilc

0/0l'lik

meıilen

mavisi

karışımından yararlanılarak gerçekleştirilir.

Spcrmatozoid1erin

baş kısmı kırmızı, kuyrukları

maviye

boyanır.

2.1.2. Çözeltilerin llazırlanması

a) AYITaç çözeltisi (1) : % 1 'lik asid fuksin , % 1 'lik metilen mavisi ve % 1 'lik HCl çözeltisi 1 : 1 : 40 oranında birbirine karıştırılır.

b) Ayıraç çözeltisi (2) : % l'lik ILCI çözeltisi

Lekelerde Spcnn Idantifikasyonu 61

d) Ksilen.

e) Kanada balzamı.

. 2.1.3. Deneylerin Yapılışı

Şüpheli materyalden alınan küçük bir parça deney tübüne konur. Üzerine serum fizyolojik ekleniı ve cam bir çubukla kanştırılarak spemıatozoitler ekstrc edilir. Çözelti başka bir deney tübüne alınıı ve 5 dakika 3000 rpm'de santrifüjlenir. Üst faz uzaklaştmlır, kalıntı pipelle lam üzerine alınır. Hafif alcvde kurutulan kalıntı üzerinc bir kaç damla (1) ayıracı eklcnir. 15-20 dakika sonra lam, (2) ayıracı ilc hafifçe yıkanır. Örnek daha sonra giderek artan derişimlcrde alkolden geçirilerek dehidratc edilir. J30yanan kalıntı üzerine i damla ksikn katıldıktan sonra üzeri lamel ile örtülür, Kanada balzamı ilc fikse edilir ve mikroskop altında incelenir. Spennatozoitlerin baş kısmı kınnızıya kuyruklan maviye boyanır.

2.2. LAKTAT

DEHİDROGENAZ İzozİM

X

(LDH-X)

2.2.1. Prensip

Laktat dehidrogenaz

(LDH) (EC L.1.1.27), anacrob glikolizde görevli,

Zakıaı

'tan

pirüvat

oluşumunu kaıalizleyen,

kalp ve

karaciğer hastalıklarının,

aynca kanserlerin

tanınması amacıyla

klinik incelemelerde rutin olarak incelenen bir enzimdir.

LDH jel elektroforezi ile 5 izozime

ayrılabilir.

(LDH 1-5). 1963

yılında

insan testis

ve spermatozoitlerinin elektroforezinde yeni bir LDH

bandı görülmüş

ve LDH-X olarak

adlandırılmıştır.

B u izozimin

yalnız

spermatozoitlere özgü

olduğu bildirildiğinden

(41,42), mikroskobik incelemeye

eşdeğer

bir idantifikasyon gücü

bulunduğu

kabul

edilmektedir. Ancak gözönünde

bulundurulması

gereken önemli

bir

husus, LDH-X

izoziminin

diğer

memeli testislerinde de

bulunduğudur.

Ancak

bunların elektro[oreıik

mobititeleri insan izoziminkinden

farklıdır

(43).

Nişastajel elcktro[orezi tekniğine

dayanarak

gerçekleştirilen

LDH-X

ayırımı yaygın

olarak

kullanılmaktadır

(44-47).

2.2.2. Çözeltilerin lIazırlanması

a) Jel Tamponu : 9.27 g Iris (hidroksimetil) aminometan ve 1.05 g sitrik asid IL destile suda çözülür, pH 8.6'ya ayarlanır.

b) Tank Tamponu : 18.6 g borik asid ve l.5 g NaOH IL destile suda çözülür, pH 8.6'ya ayarlaııır. c) Boyama Jeli : 112 mg agar i 1.2 mL 0.05M Iris IICL, pH 7.4, tampona katılır. Karışım, agarın tamamen çözülebilmclmesi için 100°C'ye kadar ısıtılır vc 50°C'ye soğutulur. Karışıma 0.8 mL 2M sodyuIll 1aklat, 1 mL fenazin metosülfat çözeltisi ( 2 mg/mL), 8.0 mg nikotin amid adenin diııüklcotid

62

s.

ATASOY

ve 6.0 mg nitroblue tetrazolium (N 6876, Sigma Chemical Co., Sı. Louis, MO) katılır. Karışımın

akışkanlığını koruması için SO'C'de tutulması gerekir.

2.2.3. Deney/erin Yapı/ışı

Nişasta jel tamponu içerisinde i OO°C'ye ısıtılarak % ıo'luk hidrolizlenmiş nişasta jeli hazırlanır. 15 cm x ıS cm x OA cm boyutlannda plastik kap üzerine dökülür. Yeterli polimerleşrneden sonra; en az 30 dakika süre ile serum fizyolojik ile ıslatılmış, 8 mm x 3 mm boyutlarındaki şüpheli materyal parçası jel içine yerleştirilir. Plak başına 20 mA akım vererek, 4 'C'de 2 saat elektroforez uygulanır. Elektroforezden sonra jel, enine 0.2 cm kalınlık verecek şekilde kesilir. Ayıraçların hazırlanışı bölümünde tarif edildiği şekilde hazırlanan boyama jeli, nişasta jeli üzerine dökülür ve plaka 37'C'de 2 saat tutulur.

2.2.4.

Bulguların Yorumlanması

Duyarlılıkla

ilgili olarak

yapılan çalışmalarla,

LDH-X

izozimının

en

az

4

kat

sulandırılmış

sperm

lekelerinde

gösterildiği anlaşılmıştır. İzozim ısıya

o

l

dukça

dayanıklıdır.

30 dakika 84

'C'ye

kadar

ısıtılan

spe

r

m örnekler

in

den

b

ile

ayrılması

mümkündür. Oda

sıcaklığında

4 hafta

bekletilmiş

sperm

lekele

r

i

nde

bulunabilmiştir.

!zozim

yalnız

spennatozoidlere

özgü

olduğundan

azospermik ya da vazek

t

omize

kişilerin bıraktığı

lekelerde

kullanılamaz.

LDH izozimlerinin

ayırımı

disk

jel elektroforezi

ile de

gerçekleştirilebilir.

Ancak

disk

elektroforez

tekniğinin ayırım

gücü

nişasta

elektroforezine

göre

daha iyi olmakla

birlikte,

LDH-5

izozimini

ayıramaz.

2.3. SPERM VARLlG

I

NIN

İMMUNOLOJİK

YÖNTEMLERLE

GÖSTERİLMESİ

2.3.1. Prensip

Azospermik ve vazektomize

kişilerden

elde

edilen

seminal

lekelerde, ya da

spermatozoitlerin tamamen

parçalanmış olduğu

l

eke

örneklerinde,

ne

mikroskobik

inceleme

ne de LDH-X

izozimini

ayırmaya

yönelik

t

eknikler

işe

yarar.

B

u

koşullarda

bir

lekenin insan sperm lekesi

olduğunu

söyleyebilmek içi

n

geçe

rli

olan

tek yöntem,

y-seminoprotein gibi ( Japon literatüründe y-seminoprotein

şeklinde adlandırılan

protein, büyük

bir

olasılıkla A.B.D.

de genellikle

p30

ya

da

prostatik

antijen olarak

tanımlanan

proteine

eşdeğerdir

), sperme özgü proteinlerin immu

n

olojik olarak

idantifikasyonudur

(48).

Erkeğe

özgü seminal

protein p30'un

semin

a

l

plazmadaki

derişimi

orlalama

ı

.55

ıng/mL dolayındadır.

Gerek

norınal

gerekse vazektomize

erkeklerin spcnnlerinde yüksek

derişlınde

bulunur.

Lekelerde Spcnn İdarıLifika,yonu 63

Erkek

idrarındaki

düzeyi

olduk~~a düşükıÜr

( ortalama 260 ng/mL

). Coitus'tan 27

saat sonra

bile vajinal

sıvıda

p30

anlijeni

saptanabildiği

halde, asiLl fosfataz

için bu

süre

14 saat

kadardır

(49).

Özellikle

mospermik lekelerin incelenmesinele

p30'Ull belirtimi

çok büyük önem

taşımaktadır

(50). Agar jel elektrofürezi ile

uygulanan

ve insan

spermine

karşı

üretilen ( ya

da

satın alınan)

anliserumun

kullanıldığı

basit,

tekrarlanabilir elektrü[oretik

çöktürme

yöntemleri bulunur (51,52).

2.3.2. insan Sperııı Sıvısına Karşı Antiseruıııun llazırlantşı

İnsan spenn sıvısına karşı üretilen tavşan ve keçi anLiserumlan piyasadan satın alınabilir (Cappel Laboratories ya da Cooper Biomedical, Malvemc, PA). Ancak anıizerumların özgiillıiğiirııirı kullanılnıadan önce kontrol edilmesi gerekir.

1.0 mL insan spenni 1.0 mL Freund tam adjuvanı ile karışunlır. Bu karışımdan alınaıı birer mL, 8 hafıa boyunca her hafıa bir lavşanın her iki femoral kasırıa enjekte edilir. Son immLini/,asyondan 10

gıirı sonra kan alll1lr, bir kaç saat 4"C'dc tutulur ve 5 dakika sLire ilc 3000 rpm'de çcvrilir. Elde edilen serum 56"C'de 30 dakika tlllulur. Hacminin 1/5'i oranında insan serumu ilc karıştırılır ve 1-2 saat 3rC'de inkLibe edilir. 8 saat süre ilc 4°C'de tutulur, özgülolmayan antikorlann uzaklaştırılması

amacıyla 10 dakika 3000 rpm'de çevrilir. Elde edilen anLİserum, hacminin I/lO'u oranında % l'lik sodyum azicl ilc karışlırıllL

2.3.3. Agaroz Tahakalarının I!azırlanışı

1.84 g barbiıal ve 10,3 g sodyum barbitalIL destile suda çözülür. Bu çÖLelti 1 : 2 oranında destile su ilc seyreltildikıen sonra 100 mL'si içerisinde kaynar su banyosu üzerinde 1.2 g ;\garoz A (l'harınacia Fine Chemieals, Uppsala, İsveç) çözüllir, Jel çözeltisi 7.0 mL'lik kısınılara ayrılarak 4°C'de birkaç ay konınabilir. Kullanımdan önce eriıilif. 7 cm x 7 em boyutlarında bir cam plak eLil alkolle temi/.!cndikten sonra 6 mL critilıniş agar üzerine dökülerek i mm kalınlığında bir tabaka elde edilir. Agar jel tabaka li/,eriııde her biri 3 mm çapında, birbirinden 5 mm uzaklıkta 2 paralel oluk açılır.

2.3.4. Elektroforezin Uygulanışı

2 mm x 2 mm boyutlarında sperın lekesi içeren materyal elcktroforczden 30 dakika kadar iince serum fizyolojik ile ıslaullL ;\nod oluklan insan serumuna karşı oluşturulan anıiserum ilc, kaıod

olukları senım fi/,yolojik çekiti ve i : 2 oranında seyrelliImiş barbital tampon ilc doldurulur, Elektroforez gerecinin tankı seyreltilmemiş barbiıal tampon ilc doldurulur. Tabaka genişliğinin her santimine 1.2-1.5 mA akıın gelecek şekilde doğru akım uygulaniL Soğukta 20 -30 dakika slire ilc

gerçekleştirilen cleklroforezdcn sonra, jel ıabakası bir gece boyunca serum fizyolojik içersinde ıuıulur. Presipitin bandlan yandan diişen aydlııJaımada görülür. Psödopresipiıin bandları yıkama ilc ortadan kaldırılır. Tabaka, % O,rlik sodyum azid içeren serum fizyolojik içerisinde bir hafıa boyunca korunabiliL

2.3.5.

Bulguların Yorumlaııması

Deneyin

duyarlılığı kullanılan antiseruınun tİtrine bağlıdır. Iınm

x Imm

boyuLImiılda

bir leke,

genellikle

kolayca

görülebilen

sperıne

özgü

proteinlerin

oluşturdu­ ğu

presipitin

banellarını

ortaya

çıkarınaya

yeterlidir.

64 S. ATASOY

SONUÇ

B

u

derlemede, insan sperm lekele

r

inin idantifikasyonunda

a

dli amaçlarla

kullanılabilecek

yöntemler gözden

geçirilmiştir.

Kido

(53), m

i

kroskobik olarak

s

p

ermatozoitlerin

varlığı kanıtlanan

30

ırza

tecavüz

olayında,

sperm idantifikasyonu için

kullanılmakta

olan yöntemleri

denemiştir.

Elde

ettiği

bulgu

l

ara gö

r

e,

F

lorenee

yöntemiyle 14 negatif, Barberio yöntemiyle 27 negatif, Puranen yöntemiy

l

e 18 negatif,

asid fosfataz

i

ncelemesiyle

O

negatif, lösin aminopeptidaz ile

1

negatif, y-glütamil

transferaz

ile

1

negatif, koZin incelemesiyle

O

negatif, spermin ile

6

negatif ve

L

DH-X

izoziminin görülmesiyle 4 neg

a

tif sonuç elde

etmiştir.

Görüldüğü

gibi tüm klasik kristallendirmeye dayanan yöntemler özgüllükten

uzaktır

ve fazla mik

t

arda

yanlış

negati

f

sonuç vermektedir. Bu nedenle bu yöntemlerin

kesinlikle

kullanılmaması

ve

bunların

yerine yeni kolin ve spermin

t

estler

i

nin

yapılması şarttır.

Daha önce

ayrıntıları bellirtildiği

üzere bu

bileşikler

enzimatik

yöntemlerle belir

ti

lirle

r.

Öncm testler arasında

asid fosfataz

deneyi diğerlerinden daha duyar

lıdır ve daha

yaygın

olarak

kullanılmaktadır.

Ancak pek çok

değişik

örnek uzun süreli inkübasyondan

"oma renk verdiğinden, sonuçların değerlendirilmesinde

çok dikkatli olmak gerelsir. Öte

yandan insan spermi

dışında

pozitif reaksiyon veren çok

sayıda

biyolojik

sıvı

ve

organizmanın bulunması

deneyin önemli

sakıncalarını oluşturur.

Bu nedenle ruti

n

adli

in

celemelerde

asidfosfaıaz yanısıra

bir

diğer

öncül deney

i

n daha

yapılması

gereklidir.

L

ösin aminopeptidaz , y-glütamil transferaz

ve glisilprolin dipeptidil aminopeptidaz

deneyleri ile kofin , spe

r

min

v

e çinko 'yu içeren öncül deneylerin her b

i

ri

aynı kolaylıkta

ve

duyarlılıktadır.

Aminopeptidaz

'ların

h

er üçü de

yaşlanmaya karşı aynı direnci gösterirler. Eger bir

aminopeptidaz

kullanılacaksa,

v

aj

i

nal yaymalar için Zösin aminopeptidaz

'ın,

anal

yaymalar için y-gZütamil-transferaz

'ın kullanılması

gerekir.

Küçük mo

l

eküllerle ilgili

diğer

üç testten, çinko be

l

irtimi ile

i

lgili

olanı,

hiç bir

şekilde yanlış

pozitif sonuç

vermediğinden, ayrıca

20

yılın

üzerindek

i

sperm lekeleriyle

de

başarılı

sonuçlar elde

edildiğinden

tercih edilebilir. Hatta vajinal çinko

derişimIerinin,

cinsel

ilişkinin işareti

olarak

değerlendirilebileceğini

öne süren

araştırmalar

da bulunur.

Rogers ve ark.

'nın

b

u

çalışması

seminal

sıvıdaki

çinko

düzeylerinin çok yüksek,

vajinal

sıvıda

i

se çok

düşük olmasına dayanır

(54). PrecoitaZ (cinsel

ilişkiden

l

lsaat

ve daha uzun süre sonra

)

vajinal çinko

düzeylerinin

1.

2-15 mg/m

L

arasında bulunmasına karşılık,

posteoitaZ

(cinsel

ilişkiyi

izleyen 5 saat içerisinde)

koşullarda

b

u

değer

4.0-135 mg/mL

arasındadır.

İnsan

sperminin kesin olarak

kanıtlanmasında,

spermatozoitlerin mikroskop ile

görülmesi

kullanılmalıdır.

Bununla

b

irlikte pozitif öncm deneylere

rağmen,

mikroskopta spermatozoit görülmemesi de

olasıdır.

Bu durumda, LDH-X deneyi de

n

egatif olur. Bunun nedeni ya azospermi, vazektomi ya da spermatozoitle

r

in tamamen

parçalandığı

eski

b

ir leke olabilir. Bu tür örneklerin kesin olarak idantifikasyonu

Lekelerde Spenn ldantifikasyonu 65 amacıyla

immunolojik deneyle

r

kullanılmalıdır.

Enz

im

immunoassay yöntemleri

kullanılarak,

12.800 kez

seyreltilmiş

insan seminal

plazmasında,

256 kez

seyreltilmiş

seminallekelerde ve 12

yıl beklemiş

lekelerde y-seminoprotein

(p30~

prostat spesi

f

ik

antijen)

saptandığı

b

ildirilmektedir (55).

Aynı araştırıcı

grubunun

gerçekleştirdiği

bi

r

diğer çalışmada

da, seminal

sıvı

proteinleri

kaplanmış

boncuklarla uygulanan enzim

immunoassay yöntemi ile, 16

yıl beklemiş

sperm l

e

kelerini

n

1:64 ve 1: 128

k

ez

sulandırılmış şekillerinin

bile idanti

f

iye

edilebildiği

ileri sürülmektedir (56).

Bazı araştırma grupları

sperm idantifikasyonu için yen

i

yöntemler

geliştirmeye,

ya

da var

olanların duyarlılığını arttırma

gayreti içindedirler. Bu derlemede de

açıklandığı

gibi, çok

hızlı

ve basit olan öncül deneyler

vardır.

Bu nedenle, konu ile ilgi

li

araştırmaların amacı

yeni öncül deneyler bulmak yerine, bilinen

kanıtlayıcı

deney

l

erden

daha basit

olanlarını geliştirmeye

yönelik

olmalıdır.

KAYNAKLAR

Florence, A. (1896) Arch. Anıhrop. Crinm. Criminol. Psych. Norm. Paıh., 11, 37-46. 2 Barberio, M. (1911) DIsch. Med. Wochenschr., 37, 214-217.

3 Puranen, U.H. (1936) DIsch. Z. Gesamle GerichIL. Med., 26, 366-38L.

4 Suyama, H. (1964) Jp;'. i Leg. Med., 18, 166-172.

5 Kind, S.S. (1964) in Melhods of Forensic Sciences ( A.S. Curry, ed ) Interseienee, London. 6 Kido, A., Oya, M., Katsumata, Y. et aL. (1979) Acla Crim. Med. Leg. Jpn., 45, 127-130.

7 Krampitz, G. and Deopfmcr, R. (1961) Klin. Wochenschr., 39, 1300-1301.

8 Oya, M., Kido, A., Suzuki, O., Katsumaka, Y., Yada, S. (1978) Acta Crim. Med. Leg. Jpn., 44, 150-156.

9 Oya, M., Kido, A., Suzuki, O., Katsumaka, Y., Yada, S. (1979) Z. Rechtsmed., 83, 115-226. 10 Burstone, M.S., Folk, J.E. (1956) J. Hislochem. Cytochem., 4, 217-226.

11 Oya, M., Kido, A., Katsumata, Y., Suzuki, D., Mizutanı,S. (1979) Ferlil. Sleril., 31, 693-695. 12 Oya, M., Kido, A. (1984) Z. Rechısmed., 91, 269-278.

13 Rosalki, S.B., Rowe, J.A. (1973) Lanceı,I, 323-324.

14 Nakanishi, K. (1976) Jpn. J. Leg. Med., 30, 281-287.

15 Nakanishi, K. (1977) Jpn. J. Leg. Med., 31, 99-103.

16 Suzuki, O., Oya, M., Kido, A. et aL. (1980) Z. Rechlsmed., 86, 35-39. 17 Albert, Z., Orlowski, M., Szewezuk, Z. (1961) Nalure, 191, 767-768. 18 Hamada, K. (1982) Jpn. J. Leg. Med., 36, 452-460.

19 Suzuki, O., Hatlori, H., Katsumata, Y. et aL. (1981) Jpn. J. Leg. Med., 35, 356-359.

20 Monis, B., Wasserkrug, H., Seligman, A.M. (1965) J. Histochem. Cytochem., 13, 503-509.

21 Svensson, B., Danielsen, M., Staun, M., Jeppeson, J., Noren, O., Sjöström, H. (1978) Eur. J.

B iochem., 90, 489-498.

22 Takatori, T., Tomii, S. and Tanaka, T. (1981) Forensic Sci. ını., 17, 79-84.

23 Suzuki, O., Matsumoto, T., Oya, M., Katsumata, Y., Asano, M. (1981) J. Forensic Sci., 26,

410-415.

24 Mann, T. (1964) The Biochemisıry of Semen and of the Male Reproducıive Tracı, Methuen, London.

25 Levonen, E. (1960) i Forensic Sci., 5, 102-109.

26 Hessel, D.W., Modglin, F.R., Webster, L.G. (1967) J. Forensic SC; 12, 554-557. 27 Halleoek, R.R. (1974) J. Forensic Sci., 19, 172-174.

66 S. ATASOY

29 Suzuki, O., Oya, M., Katsumata, Y., Matsumoto, T. Yada, S. (1980) J. Forensic Sci., 25,99-102.

30 Manıı, T., Lutwak-Mann, e. (1981) Male Reproduclive Function and Semen, Springer-Verlag, Berlin.

31 Suzuki, O., Asano, M., Kido, k, Oya, M. (1983) Forensic Sci. ını., 22, 231-235. 32 Carter, P. (1974) Clin. Chim. Acıa, 52, 277-286.

33 Berg, S.I'. (1948) DIsch. Z. Ce.l'amle Cerichıl. Med, 39, 89-107.

34 SUZlIki, O., Oya, M., Katsumata, Y., Yada, S. (1979) Jpn. J. Leg. Med., 33, 1-6. 35 Oriffiths, P.D., Lehınaıın, II. (1964) Jı,[ed. Sci. Law, 4, 32-34.

36 Waibel, R., C; iıısberg, L.e., fiesor, G. (1984) J. JJistochem. Cytochem.,32, 63-66.

37 Anderson, Jr., R.A., Maek, S.R., Beyler, S.A., Zaneveld, L.J.D. (1984) Comp. Biochem.

Physiol.,77il, 707-713.

38 Hayakari, M., Hashimoto, Y., Murakami, T. (1984) Abstracts of the 68th Confercnee

of the Medieo-Lcgal Soeiety of Japan, No. 119.

39 Terasawa, K., Takatori, T. (1983) Jpn. 1. Leg. Med., 37, 644.

40 Baeeehi, B. (1912) Vierteljahr. Gerichtl. Med. Oeff. Sanitaeıswes., 43, 1-27. 41 Blanco, A., Zinkham, W.H. (1963) Science, 139, 601-602.

42 Goldberg, E. (1963) Scienee, 139, 602-603.

43 Zinkham, W.II., Blanco, A., Kupchyk, L. (1963) Seience, 142, 1303-1304. 44 Oya, M., Kido, A., Yada, S., Asano, M. (1977) Arch. Krim., 160, 34-38. 45 Oya, M. Kido, A., Yada, S. (1977) Areh. Krim., 160, 115-118.

46 Kido, A. (1978) Jpn. J. Leg. Med., 32, 251-257. 47 Poulik, M.D. (1957) Nalure, 180, 1477-1479.

48 Tsuda, R., Ihra, M., Sagawa, K. (1984) Jpn. 1. Leg. Med., 38, 83-87.

49 Graves, ıı.e.B., Sensabaugh, G.F., Blake, E.T., (1985 ) N. Engl. 1. Med .,312, 338-343. 50 Stubbings, N.A., Newall, P.J. (1985) J. Forensic Sci .,30, 604-614.

51 Culliford, LU. (1964) Naıure, 201, 1092-1094.

52 hya, 1., Tsugawa, N., Sawada, ır., Yada, S. (1970) Rep. Nat. Res. Inst. Poliee Sci., (Tokyo) 23,

214-220.

53 Kido, A. (1983) Acla Crim. Med. Leg. Jpn., 49, 5-8.

54 Rogers, e., Bernstein, G., Nakamura, R. (1988) 1. Forensic Sei., 33, 77-83. 55 Tsııda, R., Hara, M., Inoue, T. (1983 ) Jpn. 1. Leg. Med .,37, 336-341. 56 Tsuda, R., T1ara, M., Inoue, T. ( 1988 ) Jpn. J. Leg. Med .,41,426-433.

Ayrı baskı için: Prof:Dr.Sevil Atasoy

İstanbul Üniversitesi Adli Tıp Enstitüsü