266
Türk Mikrobiyol Cem Derg (2003) 33:266-268
Hepatit C ‹nfeksiyonu fiüpheli Olgularda Enzim
Immuno-assay (EIA) ve COBAS AMPLICOR
HCV-RNA Test Sonuçlar›n›n Karfl›laflt›r›lmas›
Banu BAYRAKTAR(*), Ayfer EREN fiENSOY(**), Emin BULUT(*), Alper GÜNDÜZ(**), Engin SEBER(**)
ÖZET
Hepatit C virusu ( HCV) infeksiyonu geçirdi¤inden flüphe edilen 95 hastadan al›nan serum örnekleri çal›flmaya dahil edilmifl-tir. 73 anti-HCV pozitif, 22 anti- HCV negatif örnekte PCR yöntemiyle vireminin araflt›r›lmas› amaçlanm›flt›r. Seroloji ve PCR metodlar›n›n her ikisiyle 75 örnekte uyumlu sonuç elde edilmifltir.Bu sonuçlardan 58’i pozitif ,17’si negatiftir. Anti- HCV po-zitif oldu¤u halde, 14 örnekte HCV-RNA saptanmam›flt›r. HCV-RNA popo-zitif iki örnekte anti-HCV negatif bulunmufltur. Anti-HCV EIA ile Anti-HCV-RNA PCR sonuçlar› % 82,4 oran›nda uyumlu saptanm›flt›r.
Anahtar kelimeler: HCV infeksiyonu tan›s›, HCV RNA, PCR, Seroloji SUMMARY
Comparison of Enzyzme Immunoassay ( EIA) and COBAS AMPLICOR HCV- RNA Test Results in Patiens with suspec-ted Hepatitis C Infection
Serum samples obtained from 95 patients with suspected HCV infection were analyzed. 73 anti-HCV positive, 22 anti –HCV negative samples were examined with PCR for the absence or present of viremia. Serology and PCR methods gave concor-dant results for 75 samples, 58 of them were positive and 17 of them were negative in both assays. In 14 anti- HCV posi-tive cases HCV- RNA was detected negaposi-tive . A negaposi-tive result in the HCV- EIA was observed in two HCV- RNA posiposi-tive samples. When compared to the patients serological status, as assesed by anti-HCV EIA, the results of PCR showed an ove-rall concordance rate of 82,4%.
Key Words: Diagnosis of HCV infection, HCV RNA, PCR, Serology
(*) fiiflli Etfal E¤itim ve Araflt›rma Hastanesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Laboratuvar›, ‹stanbul (**) fiiflli Etfal E¤itim ve Araflt›rma Hastanesi Enfeksiyon Hastal›klar› ve Klinik Mikrobiyoloji Klini¤i, ‹stanbul
G‹R‹fi
HCV infeksiyonlar›n›n tan›s›n›n, tek bafl›na HCV EIA kullan›larak güvenilir bir flekilde yap›lmas›, her zaman mümkün olmamaktad›r (1, 2, 3).
Her ne kadar Anti-HCV antikorlar›n›n varl›¤› , bire-yin HCV ile karfl›laflm›fl oldu¤unu göstermekteyse de, tekbafl›na akut bir infeksiyon varl›¤›n› göster-mekte yetersiz kalmaktad›r. Akut bir infeksiyonda antikorlar›n saptanabilir düzeylere ulaflmas› alt› haf-tay› bulabilmektedir. Ayr›ca serolojik testlerle düflük risk gruplar›nda çapraz reaksiyon veren antikorlara ba¤l› yalanc› pozitif sonuçlar, serokonversiyon önce-si dönemde ve ba¤›fl›kl›¤› bask›lanm›fl hastalarda
yalanc› negatif sonuçlar al›nabilmektedir ( 1, 3, 4, 5).
HCV infeksiyonlar›n›n kesin tan›s› için HCV-RNA’n›n varl›¤›n›n gösterilmesi esast›r. Bu amaç-la kulamaç-lan›amaç-lan moleküler biyolojik yöntemlerden olan in-house PCR testleri teknik olarak zor, amp-likon kontaminasyonuna aç›k ve standardizasyon-dan yoksundur (1,2,6). COBAS AMPLICOR amplifikasyon ve saptama ifllemlerini otomatik olarak yapan, standardize bir sistemdir. ‹çerdi¤i urasil-N-glikozilaz enzimi ile önceki reaksiyon-lardan kalan amplikonlar›n yok edilmesi oluflabi-lecek kontaminasyonlar›, di¤er bir deyiflle yalanc›
B. Bayraktar ve ark., Hepatit C ‹nfeksiyonu fiüpheli Olgularda Enzim Immunoassay (EIA) ve COBAS AMPLICOR HCV-RNA Test Sonuçlar›n›n Karfl›laflt›r›lmas›
267 len serumlar efl zamanl› olarak EIA ve COBAS AMPLICOR yöntemleriyle incelenmifltir. 95 serum örne¤i için anti-HCV ve HCV-RNA sonuçlar›n›n karfl›laflt›rmalar› Tablo 1 de gösterilmifltir. Örnek-le-rin dördünde (% 4) PCR inhibe oldu¤undan sonuç al›namam›flt›r. ‹nhibisyon saptanan dört serum örne-¤inden yap›lan ikinci ekstraksiyon ve PCR sonucu de¤ifltirmemifltir.
Tablo 1. COBAS AMPLICOR ( HCV- RNA) ile elde edilen so-nuçlar›n, EIA ( Anti- HCV) sonuçlar› ile karfl›laflt›r›lmas›. TARTIfiMA
HCV infeksiyonu tüm dünyada yayg›n , majör bir
sa¤l›k sorunudur. Dünya nüfusunun %3’ü Anti HCV pozitifken, ülkemiz için bu rakam yaklafl›k %1’dir. HCV akut viral hepatitlerin %20’sinden, kronik hepatit-lerin % 70’inden sorumludur. Olgular›n yaklafl›k % 85’inde hastal›k kronikleflmektedir. Bu nedenle, HCV infeksiyonu tan›s›n›n erken dönemde, do¤ru olarak ko-nulmas› ve takibi son derece önemlidir (8, 9, 10). EIA testleri, kullan›m›n›n kolay ve ucuz olufllar› nede-niyle tan›da ilk tercih edilecek testlerdir. Bugüne kadar HCV tan›s› için üç kuflak EIA testi gelifltirilmifltir. Bi-zim de kulland›¤›m›z üçüncü kuflak testler, ikinci kuflak testlerden farkl› olarak kor ( c22- 3) ve NS3 ( c-33-c) bölgesinden proteinler yan›nda NS5 bölgesinden bir re-kombinant protein içerir ( 10). Ancak üçüncü kuflak testlerle bile serokonversiyonun saptanmas› 5- 6 hafta-y› bulmaktad›r. Anti – HCV pozitifli¤i saptansa bile akut bir infeksiyonun mu yoksa persistan bir infeksiyo-nun mu göstergesi oldu¤u ay›rt edilememektedir ( 1). Bu nedenle PCR ile serumda HCV- RNA’n›n araflt›r›l-mas›, viral replikasyonun ve aktif infeksiyonun varl›¤›-n› göstermede çok önemli bir parametre olarak kabul edilmektedir (4). Ayr›ca PCR ile HCV-RNA, infeksiyo-pozitiflikleri önlemektedir. Ayr›ca bu kitlerde
ör-ne¤e ba¤l› inhibisyonu saptamaya yarayan inter-nal kontrol (IC) mevcuttur ( 2, 6, 7).
GEREÇ VE YÖNTEM
Serum Örnekleri: HCV infeksiyonu geçirdi¤in-den flüphe edilen, transaminazlar› yüksek (alani-naminotransferaz > 45U/I) ya da sar›l›k,üst abdo-minal a¤r› gibi klinik bulgular› olan ya da kronik hemodiyaliz, kan transfüzyonu gibi parenteral ge-çifle sebep olabilecek risk faktörlerine sahip 95 hastan›n kan örnekleri çal›flmaya al›nm›flt›r. Has-talar›n 49’u erkek ,45’i kad›nd›r. Serum örnekleri uygun koflullarda ayr›ld›ktan sonra test edildikleri güne kadar -70°C de saklanm›flt›r.
Serolojik Test: Anti-HCV EIA; Innotest HCV Ab IV(Innogenetics,Belçika) kiti ile üretici firman›n önerileri do¤rultusunda uygulayarak tüm serum örneklerinde anti-HCV varl›¤› araflt›r›lm›flt›r. COBAS AMPLICOR HCV-RNA PCR ( Roche Diagnostic): Serum örnekleri üretici firman›n önerileri do¤rultusunda COBAS AMPLICOR HCV-RNA PCR ile incelenmifltir. 200 ml serum örne¤i internal kontrol (IC) içeren lizis buffer ile inkübe edilmifltir. Daha sonra RNA izopropanol ile santrifüj edilerek çöktürülmüfltür. Pellet, %70’lik etanol ile bir kez y›kanm›flt›r ve 200 ml dilüent içinde tekrar süspanse edilmifltir. HCV ge-nomunun iyi korunmufl 5’UTR ( untranslated regi-on) bölgesinin 244 bp’lik bölümü KY 78 (Biyotin-le iflaretli), KY 80 primer(Biyotin-leri i(Biyotin-le amplifiye edilmifl-tir. Amplifikasyon sonras›nda cihaz otomatik ola-rak çift iplikli ürünü denatüre etmifltir. Biyotinle iflaretlenmifl olan ürün, HCV(veya IC) için spesi-fik oligonükleotid proplarla kapl› magnetik parti-kül süspansiyonu taraf›ndan tutulmufltur. Ba¤lan-mam›fl olan materyal y›kanarak uzaklaflt›r›lm›flt›r. Biyotin iflaretli amplikon, avidin-horseradish pe-roxidase conjugate-tetramethyl benzidine H2O2
kolorometrik reaksiyonu ile saptanm›flt›r. Her ör-ne¤in 660 nm’deki absorbans› önceden belirlen-mifl cut-off de¤eri ile karfl›laflt›r›larak hem HCV hem de IC için pozitif ve negatif sonuçlar saptan-m›flt›r.
BULGULAR
HCV infeksiyonu flüphesi olan hastalardan elde
edi-Anti- HCV Pozitif 58 (%63.7) 14 (%15.4) 17 (%18.7) 2 (%2.2) Pozitif HCV-RNA Negatif Negatif
Türk Mikrobiyol Cem Derg (2003) 33:266-268
268
nun bafllang›c›ndan 1-2 hafta gibi k›sa bir süre sonra saptanabilmektedir ( 1, 4, 10).
Çal›flmam›zda EIA ve PCR yöntemlerinin her ikisiyle de 58 örnekte pozitif, 17 örnekte negatif sonuç elde edilmifltir. 14 örnekte anti- HCV pozitif oldu¤u halde, HCV-RNA saptanmam›flt›r. Bu durum latent veya inak-tif infeksiyonda seropoziinak-tifli¤in devam etmesi, HCV vi-remi düzeyinin kullan›lan yöntemin sapta-yabildi¤i dü-zeyden düflük olmas› veya HCV virusunun aral›kl› ola-rak sirkülasyona sal›n›m›yla ayn› hasta için de¤iflken PCR sonuçlar› elde edilmesi ile aç›klanabilir ( 2, 6). COBAS AMPLICOR testinin önemli bir özelli¤i IC içermesidir. Normal koflullarda IC’ün her reaksiyonda amplifiye olmas› beklenir. Ancak herhangi bir nedenle PCR reaksiyonu inhibe olursa internal kontrol ço¤al-maz. IC, sentetik bir RNA transkripti olup primer ba¤-lanma bölgeleri HCV hedef dizisi ile ayn›, internal zisinin uzunlu¤u ve baz kompozisyonu hedef HCV di-zisine benzerdir. Özel prob ba¤lanma bölgesi IC’ü he-def amplicondan ay›rmaya yarar (2). Bizim örnekleri-mizin dördünde (%4) inhibisyon saptanm›flt›r. IC var-l›¤› bu hastalara yalanc› negatif sonuç vermemizi engel-lemifltir (2,6,7). PCR reaksiyonunun inhibe oldu¤u se-rumlar hemodiyaliz hastalar›na aittir. Diyaliz s›ras›nda hastalara heparin verilmektedir. Heparinin PCR reaksi-yonunu doza ba¤l› olarak inhibe etti¤i ve HCV kopya say›s› düflük örneklerde bu etkinin daha fazla görüldü-¤ü gösterilmifltir ( 11).
‹ki olguda anti-HCV negatifken HCV-RNA pozitif bu-lumufltur. Olgular›n her ikisi de hemodiyaliz hastas›d›r. Schroter ve ark (3,12) seronegatif hemodiyaliz hastala-r›n›n %5’inde HCV-RNA saptam›fllar ve hemodiyaliz hastalar›nda HCV infeksiyonu tan›s›nda PCR’›n gerek-li oldu¤unu vurgulam›fllard›r. HCV-RNA pozitifken se-rolojik test sonucunun negatif oluflu diyaliz hastalar›n›n immun sistemlerinin bask›lanm›fl olmas›yla aç›klan-m›flt›r.
Sonuç olarak, anti-HCV pozitif hastalarda HCV-RNA’n›n rutin olarak araflt›r›lmas› takip ve tedavi aç›-s›ndan gereklidir. Anti-HCV negatif olsa bile Hepatit C infeksiyonu flüphesi devam eden , ba¤›fl›kl›¤› bask›lan-m›fl hasta gruplar›nda HCV-RNA bak›lmas› uygundur.
KAYNAKLAR
1- Krajden M, Zhao J, Bourke C et al: Detection of he-patitis C virus in second–generation enzyme immunoassay-seropositive blood donors by using matched pairs of fresh frozen plasma and pilot tube sera. J Clin Microbiol 34: 2191 (1996).
2- Albadalejo J, Alonsa R, Antinozzi R et al: Multicenter evaluation of the COBAS AMPLICOR HCV assay , an in-tegrated PCR system for rapid detection of HCV –RNA in the diagnostic laboratory. J Clin Microbiol 36 :862 (1998). 3- Schröter M, Feucht H, Schafer P et al: Definition of false –positive reactions in screening for HCV antibodies. J Clin Microbiol 37: 233 (1999).
4- Arslan H ,Tunçbilek S ,H›zel N:HCV infeksiyonunda Anti-HCV ile HCV-RNA iliflkisi. Vir Hepa Derg 1:1 (1998). 5- Çolak D, Ö¤ünç D, Gültekin M ve ark: HCV infeksi-yonunun tan›s›nda EIA, IB ve PCR yöntemlerinin karfl›lafl-t›r›lmas›. Vir Hepa Derg 1:5 (1998).
6- Kessler H H, Jungk›nd D, Stelzl E et al: Evaluation of AMPLILINK software for the COBAS AMPLICOR system.
J Clin Microbiol 37: 436 (1999).
7- Gerken G, Rothaar T, Rum› M G et al: Performance of the COBAS AMPLICOR HCV MONITOR test, version 2.0, an automated reverse transcription – PCR quantitative system for HCV load determination. J Clin Microbiol 38: 2210 (2000).
8- Akk›z H, Epidemiyoloji ve Korunma: “ K K›l›çturgay, S Badur ( ed ) Viral Hepatit 2001 , 1. Bask›” Kitab›nda , s 193- 208. Viral Hepatitle Savafl›m Derne¤i, ‹stanbul (2001). 9- Ökten A, HepatitC- Girifl. “ K K›l›çturgay, S Badur ( ed ) Viral Hepatit 2001, 1. Bask›” Kitab›nda , s 180-181. Vi-ral Hepatitle Savafl›m Derne¤i, ‹stanbul (2001).
10- Türko¤lu S , Vi roloji ve Seroloji. “ K K›l›çturgay, S Badur ( ed ) Viral Hepatit 2001 , 1. Bask› “ Kitab›nda , s 182- 192. Viral Hepatitle Savafl›m Derne¤i, ‹stanbul (2001). 11-Miyachi H, Masukawa A,Ohshima T et al.Monitoring of inhibitors of enzymatic amplification in polymerase cha-in reaction and evaluation of efficacy of RNA extraction for the detection of hepatitis C vrrus using the internal control. Clin Chem Lab Med 36:571 (1998).
12-Schroter M, Feucht HH, Schafer P et al.High percen-tage of seronegative HCV infections in hemodialysis pati-ents:the need for PCR. Intervirology 40: 277 (1997).
