T.C.
FIRAT ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
Farklı Kromozomlara (XX ve XY) Sahip Erkek Gökkuşağı Alabalığı (Oncorhynchus mykiss)
Spermlerinin Dölleme Kalitesi
Halil YAVUZ YÜKSEK LİSANS TEZİ
Anabilim Dalı: Su Ürünleri Yetiştiriciliği Danışman: Doç. Dr. Kenan KÖPRÜCÜ
T.C.
FIRAT ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
Farklı Kromozomlara (XX ve XY) Sahip Erkek Gökkuşağı Alabalığı
(Oncorhynchus mykiss) Spermlerinin Dölleme Kalitesi
YÜKSEK LİSANS TEZİ
Halil YAVUZ
Tezin Enstitüye Verildiği Tarih: 21.06.2012
Tezin Savunulduğu Tarih: 19.07.2012
Tez Danışmanı: Doç. Dr. Kenan KÖPRÜCÜ (F.Ü.) Diğer Jüri Üyeleri: Prof.Dr. Metin ÇALTA (F.Ü.) Doç. Dr. Seyfettin GÜR (F.Ü.)
I
ÖNSÖZ
Bu çalışmanın planlanması, yürütülmesi, bulguların değerlendirilmesi ve tezin yazımı sırasında yardımlarını esirgemeyen danışman hocam sayın Doç. Dr. Kenan KÖPRÜCÜ’ye, Yüksek Lisans Tezime sağladıkları katkılarından dolayı Fırat Üniversitesi Su Ürünleri Fakültesi Temel Bilimler Anabilim Dalı Öğretim Üyesi Prof. Dr. Metin ÇALTA’ya ve Fırat Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dölerme ve Suni Tohumlama Anabilim Dalı Öğretim Üyesi Doç. Dr. Seyfettin GÜR’e, tezde kullanılan araç ve gereçleri, sarf malzemelerini, balık materyalini sağlayan ve denemelerin yapılması için yer imkanı sunan Uzunyayla Alabalık Üretim Çiftliği (Pınarbaşı/Kayseri)’ne ve Kent Alabalık Yaz Yumurtası Üretim Ltd. Şti. (Pınarbaşı/Kayseri)’ne, denemenin yürütülmesinde yardımlarını gördüğüm Su Ürünleri Mühendisi Sayın Yaşar TUR’a ve tüm emeği geçenlere teşekkürü bir borç bilirim. Bunun yanında tez çalışmam süresince desteğini her zaman yanımda hissettiğim değerli eşim Fatma YAVUZ’a ve tüm aile fertlerime sonsuz şükranlarımı sunarım.
Halil YAVUZ Elazığ-2012
II
İÇİNDEKİLER Sayfa No ÖNSÖZ ... I ÖZET ... VI SUMMARY ... VII ŞEKİLLER LİSTESİ ... VIII TABLOLAR LİSTESİ ... X
1. GİRİŞ ... 1
2. SPERM - YUMURTA KALİTESİ VE DEĞERLENDİRME KRİTERLERİ ... 5
2.1. Sperm Morfolojisi ... 5
2.2. Yumurta Morfolojisi ... 7
2.3. Döllenme Öncesi Kalite Değerlendirme Kriterleri ... 9
2.3.1. Sperma ... 9
2.3.1.1. Spermanın makroskopik muayenesi ... 10
2.3.1.1.1. Spermanın miktarı ... 10
2.3.1.1.2. Spermanın rengi ... 10
2.3.1.1.3. Spermanın kıvamı ... 10
2.3.1.2. Spermanın mikroskopik muayenesi ... 10
2.3.1.2.1. Kitle hareketi ... 11
2.3.1.2.2. Spermatozoa motilitesi ... 12
2.3.1.2.3. Spermatozoa yoğunluğu ... 12
2.3.1.2.4. Ölü-canlı spermatozoon oranı... 13
2.3.1.3. Spermanın fiziksel ve kimyasal özelliklerinin muayenesi ... 14
2.3.1.3.1. pH değeri ... 14
2.3.1.3.2. Dayanıklılık testi ... 14
2.3.1.3.3. Spermanın bileşimi ... 15
2.3.2. Yumurta ... 15
III
Sayfa No
2.5. Embriyo Yaşama Oranı ... 19
3. MATERYAL VE METOT ... 20 3.1. Materyal ... 20 3.1.1. Çalışma Yeri ... 20 3.1.2. Balık Yemi ... 20 3.1.3. Sarf Malzemeleri ... 20 3.1.4. Kullanılacak Araç-Gereçler ... 20
3.1.5. Anaç Balık Materyali ... 21
3.2. Metot ... 22
3.2.1. Denemenin Planlanması ve Uygulanması ... 22
3.2.2. Araştırmada Kullanılan Kaynak Suyunun Analizi ... 22
3.2.3. Gökkuşağı Alabalığında Dişiden Erkekleştirme İşlemi ... 22
3.2.4. Damızlıklarda Cinsel Olgunluğun Belirlenmesi ... 23
3.2.3.1. Sperma kontrolü ... 23
3.2.3.1.1. Cortland sıvısı ... 24
3.2.3.2. Yumurta kontrolü ... 25
3.2.4. Anaç Balıkların Sağımı ... 25
3.2.4.1. Elle sağılarak yumurta ve spermaların alınması ... 26
3.2.5. Sperma Kalitesi... 26
3.2.5.1. Döllemede kullanılan sperma kalitesinin belirlenmesi ... 26
3.2.5.2. Spermanın hacim ve pH’sının belirlenmesi ... 26
3.2.5.3. Spermatozoa hareketlilik oranı ve hareketlilik süresinin belirlenmesi ... 27
3.2.5.4. Spermatozoa yoğunluğunun belirlenmesi ... 28
3.2.6. Gonadosomatik İndeks ... 28
IV
Sayfa No
3.2.8. Dölleme ... 29
3.2.9. Yumurta Dolaplarının Düzenlenmesi ve Hazırlanması ... 29
3.2.10. Dölleme Oranı ... 30
3.2.11. Gözlenme Oranı ... 31
3.2.12. Kuluçka Süresi ve Larva Çıkış Oranı ... 31
3.2.13. Larva Yaşama Oranı ... 31
3.2.14. Verilerin Değerlendirilmesi ... 32
4.BULGULAR ... 33
4.1. Araştırmada Kullanılan Suyun Sıcaklık, Çözünmüş Oksijen ve pH Değerleri... 33
4.2. Anaç Balıkların Canlı Ağırlıkları İle İlgili Bulgular ... 33
4.3. Gonadosomatik İndeks (GSİ) Değerlerine İlişkin Bulgular... 33
4.4. Sperma Özelliklerine Ait Bulgular ... 34
4.4.1. Spermanın Makroskopik Muayenesine Ait Bulgular ... 34
4.4.2. Spermanın Mikroskopik Muayenesine Ait Bulgular ... 35
4.5. Sipermanın Fiziksel ve Kimyasal Özelliklerinine Ait Bulgular ... 35
4.6. Mutlak ve Nisbi Yumurta Verimliği İle Yumurta Çapına Ait Bulgular ... 39
4.7. Yumurtaların Döllenme ve Fizyolojik Gelişimleriyle İlgili Bulgular ... 39
5. TARTIŞMA VE SONUÇ ... 42
5.1. Kullanılan Suyun Sıcaklık, pH ve Çözünmüş Oksijen Değerleri ... 42
5.2. Gonadosomatik İndeks... 42
5.3. Spermatolojik Özellikler ... 42
5.3.1. Spermanın Makroskopik Muayenesi ... 42
5.3.2. Spermanın Mikroskopik Muayenesi ... 43
5.4. Döllenme Oranı ... 44
V
Sayfa No
5.6. Döllenen Yumurtalardan Larva Çıkış Oranları ... 45
5.7. Besin Keseli Larvalarda Yaşama Oranları ... 46
6. ÖNERİLER ... 47
KAYNAKLAR ... 49
VI ÖZET
Hızla artan dünya nüfusu ve teknolojik gelişmelerdeki artışa paralel olarak çevre kirliliği ve ekolojik sorunların artması hayvansal protein kaynaklarının azalmasına neden olmaktadır. Bu sorunlar birim alandan daha fazla hayvansal protein elde edilmesini zorunlu hale getirmiştir. Bu noktada su ürünleri yetiştiriciliği ön plana çıkmaktadır. Yetiştiricilikte verimi artırmaya yönelik çalışmalar son yıllarda oldukça önem kazanmıştır. Özellikle bu yönde yapılan biyoteknolojik çalışmalar büyük öneme sahiptir. Bu çalışmalar arasında ıslah araştırmaları her zaman birinci sırada gelmektedir. Bu çalışmada, XX ve XY kromozomlarına sahip erkek gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss) spermlerinin dölleme kalitesi tespit edildi. Bu amaçla, sperma kalitesi (sperma hacmi, sperm yoğunluğu, hareketlilik oranı, hareketlilik süresi, pH ve toplam sperm sayısı), gonadosomatik indeks değeri ile birlikte iki spermanın yumurtayı dölleme oranları incelendi. Ayrıca, bu spermlerle döllenen yumurtaların döllenme, gözlenme, larva çıkış oranları ile larva çıkış süreleri belirlendi.
Denemede, ortalama ağırlıkları 1550±50 g olan 3 yaşındaki XY kromozomlu (normal) erkek ve 3 yaşındaki 1470±35 g ağırlığında olan XX kromozomlu (dönüştürülmüş) erkek balıklar ile 4 yaşındaki ve ortalama ağırlığı, 2685±55 g olan dişi damızlık balıklar kullanıldı. Bu dişi balıkların mutlak ve nispi yumurta verimliliklerine ait ortalama değerler sırasıyla 4730±50 ve 2156±18 adet olarak hesaplandı. Bu yumurtalar spermlerin dölleme kalitesinin belirlenmesinde kullanıldı. Çalışmada, incelenen sperm kalite parametreleri (sperma hacmi, spermin yoğunluğu, ilk hareketlilik oranı, hareketlilik süresi ve toplam sperm sayısı), döllenen yumurtalarda döllenme, gözlenme ve larva çıkış oranları bakımından en iyi sonuçlar XX kromozomlu balık spermlerinden elde edildi (P<0,05). Aynı zamanda, XX kromozomlu balıkların gonadosomatik indeks değerlerinin, XY kromozomlu balıklarınkine göre önemli derecede yüksek olduğu (P<0,01) belirlendi. Bununla birlikte, yumurtanın gözlenme süresi ve larva çıkış süresine ait farklılıklar önemsiz (P>0,05) bulundu.
Bu çalışmada, alabalık üretiminde XX kromozomlu sperm ile döllemenin XY kromozomlu sperm ile döllemeden daha verimli olduğu açıkça görülmüştür. XX kromozomlu olan damızlık erkek gökkuşağı alabalıklarının ülke genelinde üretimde kullanılması durumunda; verimlilik artacak, daha yüksek sayı ve kalitede yavru elde edilebilecektir.
VII SUMMARY
Fertilization Quality of Sperm with Different Chromosomes (XX and XY) from Male Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss)
An increase in the levels of environmental pollution and ecological problems due to rapidly growing global population and technological developments leads to a decrease in the sources of animal protein. These problems make it necessary to obtain more animal protein from a unit area. At this point, aquaculture comes to the forefront. In recent years, the studies aiming to increase the yield in aquaculture have gained cosiderable importance. Especially, biotechnological studies in this way have a great importance. Among these studies, breeding researches have always the first place. In this study, the fertilization quality of the sperms with XX and XY chromosomes from male rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) was determined. For this purpose, the quality of the sperms (semen volume, sperm density, sperm motility ratio, sperm motility duration, pH and total sperm number), gonadosomatic index value and fertilization ratio of the sperms for two ovum were investigated. In addition, fertilization, eyed and hatching rates of eggs and hatching duration of larvae fertilized by these sperms were observed.
In the experiment, it was used the ovum from female brood fish which were identified to be 2685±55 g at age 4 and male with XY chromosomes (ordinary) with mean weight of 1470±35 g at age 3 and male with XX chromosomes (transformed) weighting 1470±35 g and at age 3. The mean values for absolute and relative fertility rates in these females were 4730±50 and 2156±18 respectively. These ova were used to determine the sperm’s quality to fertilize. In this study, the best results with regard to the sperm quality parameters (semen volume, first motility ratio, motility duration, and total sperm numbers) examined, fertilisation, eyed and hatching rates of eggs and hatching duration were obtained from the sperms with XX chromosomes (P<0.05). It was also found that the gonadosomatic index values of the fish with XX chromosomes were significantly higher than those of the fish with XY chromosomes (P<0.01). However, eyed and hatching duration of eggs were not found to be significant statistically (P>0.05).
In this study, it is obvious seen that fertilisation by sperms with XX chromosomes is more productive than fertilization by sperms with XY chromosomes in the trout culture. When the brood male rainbow trout with XX chromosomes are used throughout the country, the yield will substantially increase. This will provide in higher number and quality offspring. Key words: Rainbow Trout, Brood, Fertilization, Quality, Chromosome, Sperm.
VIII
ŞEKİLLER LİSTESİ
Sayfa No Şekil 1.1. 2009 Yılı itibariyle, Türkiye’de balık yetiştiriciliği üretiminin türlere göre
dağılımı (TÜİK, 2010) ... 2
Şekil 2.1. Gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss)’na ait olgun bir spermium ... 5
Şekil 2.2. Gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss)’na ait olgun bir spermium’un ışık mikroskopunda şematik görünüşü ... 6
Şekil 2.3. Olgun bir gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss) yumurtası ... 7
Şekil 2.4. Mikroskop altında sperm hareketlerinin değerlendirilmesi ... 11
Şekil 2.5. Yumurta, sperma ve larva kalitesini etkileyen faktörler ... 17
Şekil 2.6. Döllenmiş gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss) yumurtasının; yandan (A) ve üstten (B) görünüşü ... 19
Şekil 3.1. Anaç gökkuşağı alabalıklarının lateral görünüşü ... 21
Şekil 3.2. XX Kromozomlu erkekten sperm alımı: A) Gonadların balıktaki konumu B) Gonadların görünümü ... 24
Şekil 3.3. Anaç balıkların sağımı A) Yumurta sağımı B) Sperm (XY) sağımı ... 25
Şekil 3.4. Dölleme için ölçülerek hazırlanmış spermalar ... 27
Şekil 3.5. Spermatozoa hareketlilik oranı ve hareketlilik süresinin belirlenmesi. ... 28
Şekil 3.6. Gökkuşağı alabalığı yumurtasının: A) Izotonik solüsyonla yıkanması B) Sperm katılması C) Döllenmesi ... 29
Şekil 3.7. A) Dikey konumlu yumurta kuluçka dolabı B) Yumurta tablasına yerleştirilmiş olan döllenmiş yumurtaların görünüşü ... 30
Şekil 3.8. A) XX kromozomlu spermle döllenen yumurtalar B) XY kromozomlu spermle döllenen yumurtalar... 31
Şekil 3.9. Larvaların görünüşü: A) Kuluçka dolaplarında B) Tava (kaset) içerisinde ... 32
Şekil 4.1. XX ve XY kromozomlu damızlık gökkuşağı alabalığı gonatlarının görünüşü... 34
Şekil 4.2. XX ve XY kromozomlu damızlık gökkuşağı alabalıklarından alınan spermlerin renk görünüşü... 35
IX
Sayfa No Şekil 4.3. Farklı kromozomlara ait gökkuşağı alabalığı sperma hacmi ... 37 Şekil 4.4. Farklı kromozomlara ait gökkuşağı alabalığı sperminin başlangıç hareketlilik
oranı ... 37
Şekil 4.5. Farklı kromozomlara ait gökkuşağı alabalığı spermlerinde toplam sperm sayısı ... 38 Şekil 4.6. Farklı kromozomlara ait gökkuşağı alabalığı sperminin hareketlilik süresi ve
%’de oranı ... 38
Şekil 4.7. A) Yumurta seçme makinası ve yumurta boyutu B) Döllenmiş gökkuşağı
alabalığı yumurtasının kuluçka tablasındaki görüntüşü ... 39
Şekil 4.8. XY ve XX kromozomlu gökkuşağı alabalığı spermleriyle döllenen yumurtalarda döllenme, gözlenme, larva çıkış ve keseli yavru yaşama
X
TABLOLAR LİSTESİ
Sayfa No Tablo 1.1. 2009 Yılı verilerine göre, Türkiye’de yetiştiriciliği yapılan balık türleri ve
üretim miktarları ... 2
Tablo 2.1. Gökkuşağı alabalığı, deniz levreği, çipura ve kalkan anaçlarının yumurta verimleri ile yumurtaların döllenme ve çıkış oranları ... 16
Tablo 4.1. Kaynak suyunun aylara göre ortalama sıcaklık, çözünmüş oksijen ve pH değerleri ... 33
Tablo 4.2. XY ve XX kromozomlu damızlıklarda gökkuşağı alabalıklarının gonadosomatik indeks değerleri ... 34
Tablo 4.3. XY ve XX kromozomlu damızlıklarda gökkuşağı alabalığı spermalarının kalite parametrelerine ait değerler ... 36 Tablo 4.4. XY ve XX kromozomlu gökkuşağı alabalığı spermleriyle döllenen
1 1. GİRİŞ
Gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss), ekonomik değerinin yüksek oluşu nedeniyle üzerinde en fazla araştırma yapılan balık türlerinden birisidir. Muhtemelen sazan (Cyprinus carpio) dan sonra kültürü yapılan ilk türdür. Yetiştiriciliği ile ilgili ilk çalışmaları, Kuzey Amerika'da 1874 yılında gökkuşağı alabalığı yumurtalarının, McCloud Irmağı'ndan Kuzey Kaliforniya'daki özel bir kuluçkahaneye taşınarak kuluçkalanmasıyla başlamıştır. Daha sonraları ise 1877 yılında Japonya'ya, 1885 yılında İngiltere ye getirilmiştir (Akhan ve Canyurt, 2005).
Türkiye'de gökkuşağı alabalığı üretimi, 1970'li yıllarda dışarıdan getirilen yumurtalarla başlamıştır (Canyurt, 1985). Günümüzde ise gökkuşağı alabalığı kültürü yapılan en önemli tür konumundadır. Gökkuşağı alabalığı üretimi, gerek potansiyel su kaynaklarının üretime alınması gerekse yetiştiricilikte karşılaşılan problemlerin (kaliteli yem, hastalıklara karsı mücadele, vb.) çözülmüş olması nedeniyle her geçen yıl artarak devam etmektedir (Akhan ve Canyurt, 2005).
Hızla artan dünya nüfusu ve teknolojik gelişmelerdeki artışa paralel olarak çevre kirliliği ve ekolojik sorunların artması hayvansal protein kaynakların azalmasına neden olmaktadır. Bu sorunlar birim alandan daha fazla hayvansal protein elde edilmesini zorunlu hale getirmiştir. Bu noktada su ürünleri yetiştiriciliği ön plana çıkmaktadır. Yetiştiricilikte verimi artırmaya yönelik çalışmalar da son yıllarda oldukça önem kazanmıştır. Bu yönde yapılan biyoteknolojik çalışmalar büyük potansiyele sahiptir. Elde edilecek başarı, bu konuda yapılacak daha fazla sayıda ve detaylı çalışmalar ile artacaktır (Dreanno vd., 1999b; Okumuş, 2003).
Kültür balıklarının türlere göre dağılımında en yüksek yetiştiriciliği yapılan balık, içsulardaki alabalık miktarı olup, toplam su ürünleri yetiştiriciliğinin %47.66’sını oluşturmaktadır. Bunu %29,33 ile levrek, %17,87 ile çipura takip etmektedir (Şekil 1.1). Midye, alabalık (deniz) ve aynalı sazan (iç su) üretimleri de diğerlerini takip etmektedir. Yine 2009 yılında elde edilen istatistiki verilere göre (Tablo 1.1); Türkiye’deki toplam balık yetiştiriciliği miktarının türlere göre dağılımına baktığımızda, yine alabalığın en önemli tür olduğu görülmektedir.
2
Şekil 1.1. 2009 Yılı itibariyle, Türkiye’de balık yetiştiriciliği üretiminin türlere göre dağılımı (TÜİK, 2010).
Tablo 1.1. 2009 Yılı verilerine göre, Türkiye’de yetiştiriciliği yapılan balık türleri ve üretim miktarları (TÜİK, 2010).
İçsu Deniz Toplam
Alabalık Aynalı Sazan
Deniz Alabalığı
Çipura Levrek Midye Diğir
Ton/Yıl % Ton/ Yıl
% Ton/ Yıl
% Ton/Yıl % Ton/Yıl % Ton/ Yıl
% Ton/ Yıl
% Ton/Yıl %
75657 47,7 591 0,4 5229 3,3 28362 17,9 46554 29,3 89 0,1 2247 1,4 158729 100
Ülkemizdeki su potansiyelinin değerlendirilmesiyle birlikte tatlı sularda alabalık (O.
mykiss), denizde ise çipura (Sparus aurata) ve levrek (Dicentrarchus labrax) yetiştiriciliği her
geçen yıl artarak sürdürülmektedir. Ancak, üreticiler yetiştiricilikle ilgili birçok sorunu çözmüş olsalar bile halen damızlık ve damızlıklardan elde edilen kaliteli gamet temininde sorunlar yaşamaktadırlar (Okumuş, 2003; Emre ve Kürüm, 2007).
Günümüzde su ürünleri üretimi yapan kuluçkahane sayısı binlerle ifade edilecek sayıya ulaşmıştır. Yetiştiricilerin genel eğilimi daha fazla yavru üretmektir. Bu nedenle, üretimde kullanılan damızlıkların verim özellikleri dikkate alınmamaktadır. Üretim yapılacak yeni potansiyel alanların giderek azalması, su ürünleri yetiştiriciliğindeki artış hızını ileride sınırlandıracaktır. Bu nedenle üretimin sürdürülebilmesi için üretimde üstün verim özelliklerine sahip gamet kullanılması zorunlu olacaktır. Yetiştiricilikte kaliteli gametler, ıslah edilmiş hatlardan veya biyoteknolojik olarak manipüle edilmiş hatlardan elde edilmektedir.
3
Örneğin; kısa sürede büyüyen ve hastalıklara karsı dayanıklı ve yem değerlendirme katsayısı yüksek gökkuşağı alabalığı hatları geliştirilmiştir. Aynı zamanda erkek alabalığa kıyasla daha fazla karkas ağırlığına sahip, % 100 dişi populasyon üretiminde kullanılan, XX kromozomlu erkek (dişiden dönüştürülmüş erkek) damızlıklar üretilebilmektedir (Aegerter, 2004).
Bundan önce ise XY kromozoma sahip, 2–3 yaşlı erkek damızlıklar kullanılmış ve halen kullanılmaktadır. Alabalıklarda genellikle erkekler, dişilerden daha erken cinsel olgunluğa ulaşırlar. (Büyükhatipoğlu ve Holtz, 1984; Billard, 1995). XY kromozoma sahip erkeklerin spermaları testisin kanal boşluklarında toplanır ve uygun çevre şartları oluşuncaya kadar dinlenme durumunda kalırlar. Erkek balık üreme mevsiminde gonadotropinlerin etkisi ile sperma vermeye hazır hale gelir. Testislerde hareketsiz durumda bulunan spermatozoa in vitro koşullarda su ile temasa geçince hareket kabiliyeti kazanır. Spermatozoanın suda aktif olduğu periyot oldukça kısadır ve su sıcaklığına bağlı olarak bu süre yaklaşık 30 saniye ile 2 dakika arasında değişim göstermektedir. Bu familyaya ait balıkların çoğunluğunda sperma üretimi oldukça yüksektir (5 x 1012 spermatozoon /kg vücut ağırlığı). Ancak, doğal şartlarda balık tarafından üretilen spermanın %20-40’ı kullanılabilmekte, kalan kısım ise vücut tarafından emilmektedir (Aegerter, 2005). Salmonidae familyasına ait balıklarda sperma miktarı farklı cinslere göre değişim göstermektedir. Bunun yanında aynı cinsin bireyleri arasında da farklılıklar olabilmektedir. Yine üreme sezonunun başı, ortası ve sonunda spermanın diğer kalitatif özelliklerinde olduğu gibi miktarında da farklılıklar gözlemlenmektedir. Gökkuşağı alabalığında ortalama sperma miktarı 6-12ml arasında değişmektedir. Ancak, bu miktar birçok faktöre bağlı olarak değişmektedir. Bunların başında suyun sıcaklığı, sperma sağım aralığı, yaş ve özellikle de bakım ve besleme şartları sperma miktarı üzerinde oldukça etkin faktörler olarak bildirilmektedir (Büyükhatipoğlu ve Holtz, 1984). Gökkuşağı alabalığında sperma miktarındaki değişim aralığı oldukça yüksektir.
Erkek gökkuşağı alabalıkları, yıl içerisinde 22 hafta süreyle sperma üretme yeteneğine sahiptirler. Yıl içerisindeki toplam sperma verimleri ortalama 129 ml olup, sağım başına ortalama 12-15 ml düşmektedir. Ayrıca, bu sperma hacminde toplam 991x109 spermatozoon bulunmaktadır. XY kromozoma sahip damızlıklardan abdominal masaj ile toplanan sperma örneklerinde üre kontaminasyonu (sperm kanalı ve üriner kanalın yakınlığından dolayı) kaçınılmazdır. Bundan dolayı sperm yoğunluğu ve seminal plazma kompozisyonundaki değişim yanlış yorumlanabilir (Aegerter, 2005). Bu konuda yapılan araştırmalar, üre kontaminasyonunun spermanın konsantrasyonunu %80’lere varan oranda seyreltebildiğini ve osmotik basıncını azalttığını ortaya çıkarmıştır. Bu tür kontaminasyonlar seminal plazmanın iyonik konsantrasyonunu değiştirmektedir. Örneğin; üre kontaminasyonu sonucunda Atlantik
4
salmon (Salmo sala) balığının seminal plazmasındaki K+ konsantrasyonu 1382 mg/L’den 792 mg/L’ye düşmüştür (Breton vd., 1990; Bromage vd.,1994; Aegerter, 2005).
Üretim açısından bakıldığında, kullanılan spermanın üstün dölleme özelliklerine sahip balık hatlarından veya XX kromozoma sahip erkek damızlıklardan elde edilen spermalar üretim için kullanılmalıdır. Yetiştiriciliği yapılan alabalıkların üreme dönemi çevresel şartlara bağlı olarak Kasım-Mart ayları arasında gerçekleşmektedir. Ancak birçok işletmede dişi ve erkek damızlıklar arasında, üreme döneminde görülen senkronizasyon bozukluğu nedeniyle bazen dişilerden yumurta alındığı halde erkek bireylerden sperma alınamamakta veya bunun tersi olmaktadır. Bu durumda üretici, dişilerden yumurta sağımı yaptığında erkek anaçlar sperma vermediği için, sağılan yumurtalar döllenememektedir. Sonuç olarak, yumurtalar ziyan olmakta veya erkekler olgunlaştığı halde dişilerden yumurta alınamadığında ise sperma kaybı söz konusu olmaktadır. Bu da üreticilerin, ekonomik kayıplara uğramasına yol açmaktadır (Canyurt vd., 2005). Üretici için çok fazla işgücü ve maliyete neden olan XY kromozomlu erkek damızlıklardan ziyade, %100 dişi ve XX kromozoma sahip dişiden dönüştürülmüş olan erkek damızlıklar kullanılabilir. Bu damızlıkların vücudundaki bütün hücreler XX kromozom taşıyor olsa da, dıştan verilen testosteron hormonu sonucu gelişen testislerin ürettiği spermlerin yapısındaki kromozomlar X cinsiyet kromozomudur. Bu alabalık yavrularının erkekleştirilmesi için, ilk yem almaya başlayan yavrulara 17 α-metil-testosteron hormonu içeren yemlerle 750 GD (Gün Derece) yemlenir. Daha sonra balık cinsel olgunluğa kavuşuncaya kadar normal yemle beslenir. Bu yavrular yaklaşık iki yıl sonra cinsel olgunluğa erişir. Gerçek erkek damızlıklar ile bu erkek damızlıkları birbirlerinden ayırt etmenin tek yolu, sağım işlemini gerçekleştirmektir. Sağım sonucunda, gerçek erkekler sperma verirken; erkekleştirilmiş dişiler, testislerin anormal olması ve boşaltım kanallarının bulunmaması nedeniyle sperma veremeyeceklerdir. Bunlardan sperma temin etmek için, bir bistüri yardımıyla, sekonder olarak, gelişen testisler karnın açılması ile alınır. Testisten alınan sperma sıvısından küçük bir damla, mikroskop altında kontrol edilir. Elde edilen spermin canlılığına, yoğunluğuna bakıldıktan sonra yumurtanın döllenmesi için kullanılır (Akhan ve Canyurt, 2005; Emre ve Kürüm, 2007).
Bu nedenle, çalışmada; farklı kromozomlara (XX ve XY) sahip erkek gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss) spermlerinin dölleme kalitesi araştırıldı. Böylece, gökkuşağı alabalığı üretiminde hangi kromozoma sahip anaç erkeklerin kullanılmasının daha uygun olacağı belirlenmeye çalışıldı.
5
2. SPERM - YUMURTA KALİTESİ VE DEĞERLENDİRME KRİTERLERİ Biyolojik olarak yaklaşılırsa, gametin kalitesi; dölleyebilme, döllenebilme ve normal bir embriyoya dönüşebilme yeteneği olarak tanımlanabilir. Bu nedenle; erkek germ hücresi (spermium) küçük ve çok hareketlidir. Dişi germ hücresi (ovum) aynı zamanda gelişecek yavru için bir besin deposu görevi de yapmaktadır. Bu nedenle de büyük ve haraketsizdir (Kayalı vd., 1992; Dreanno vd., 1999c). Bununla birlikte, gametlerin kalitesi; çekirdek transferi ya da androgenez gibi gametlerin kullanımına bağlı olarak, yapılan uygulamalardaki özel biyoteknik farklılıklarla da açıklanabilir. Yumurta ve sperma kalitesini miktar olarak değerlendirmek için kullanılan bir çok kriter vardır. Bunlardan bazıları tür-özellikli ya da uygulama-özelliklidir. Bu bölümde, döllenme öncesi gamet kalite değerlendirme krıterleri ele alınmaktadır (Kayalı vd., 1992).
2.1. Sperm Morfolojisi
Spermium adı verilen erkek germ hücresi, 1677 yılında Johann Ham tarafından ilk defa görülmüştür. Baş, orta parça ve kuyruk olmak üzere üç kısımdan oluşan ve canlı iken çok hareketli bir cisimciktir (Şekil 2.1).
Şekil 2.1. Gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss)’na ait olgun bir spermium (Kayalı vd., 1992).
6
Baş: Karşıdan bakıldığında oval, yandan bakıldığında armut biçimindedir. Taze preparatlarda ışığı çok kırıcıdır, bu nedenle de parlak olarak görünür. Boyanmış preparatlarda ise, başın arka kısmı nüve boyaları ile çok koyu olarak boyanır. Çünkü başın bu kısmında çok miktarda DNA bulunmaktadır. Başın bu kısmının, spermium epitelinde olgunlaşırken ortaya çıkan enzimleri taşıdığı ve bu nedenle de fertilizasyonda önemli bir rol oynadığı kabul edilmektedir (Holtz vd., 1984).
Orta parça: Boyun ve birleştirici kısım olmak üzere iki bölümden oluşmuştur.
Boyun çok kısadır ve baş plagı (Noduli anteriores) ile ara kitle (Massa intermedia)den yapılmıştır. Işık mikroskopunda baş plağı; Başın hemen altında yerleşmiş iki cisimcik ile onları birbirine birleştiren, enine diske bağlayan homojen bir kitle görünümündedir. Boyun,bir oynak görevi yapmaktadır. Baş bu sayede spermiumun geri kalan kısımlarına karşı hareket yeteneği kazanmaktadır. Birleştirici kısımda şu oluşumlar vardır (Holtz vd., 1984): 1. Enine disk (Discus transversalis): Ara kitlenin (Massa intermedia) hemen altında bir
plâktan yapılmıştır.
2. Son halka: Dip çemberi veya kapatıcı halka da denir. Arka sentriolden oluştuğu kabul edilen bir plâktır.
3. Eksen ipliği: Bu iplik enine diskten başlayarak kuyrukta da devam eden bir lifçikten oluşmuştur.
4. Spiral iplik: Eksen ipliginin etrafında bulunan, ince plasmatik kılıfı saran, mitokondrilerden yapılmıs, 8-9 kıvrımlı bir ipliktir.
5. Sitoplasmik kılıf: En dışta bulunan ince bir zardır.
Kuyruk: Spermium’un en uzun fakat aynı zamanda en ince kısmıdır. Bir uzun esas parça (Pars principalis) ile bir de kısa son parçadan (Pars terminalis) oluşmuştur. Bütün kuyruk boyunca eksen iplikçiği uzanır (Şekil 2.2). Kuyruk, yılankavi hareketler ile spermiumun ileriye doğru hareket etmesini sağlar (Holtz vd., 1984; Munkıttrıck vd., 1987).
Şekil 2.2. Gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss)’na ait olgun bir spermium’un ışık mikroskopunda şematik görünüşü (Kayalı vd., 1992).
7
Spermium bir hücre olarak incelendiginde; baş, nüveye, bütün diğer kısımlar da hücre gövdesine uyar. Genlerin bulunması nedeniyle fekondasyon esnasında asıl önemli rolü oynayan baştır, enine disk ise sadece bir motor durumundadır. Bu plağın sağlam olması spermiumun hareket edebilmesi için şarttır. Kuyruk, geminin pervanesi gibi sadece hareketi sağlayan bir kısımdır. Başı bulunmayan bir spermium, eğer enine plağı sağlam ise hareket edebilir. Bundan anlaşılacağı üzere hareket yetenegi ile dölleme yeteneği farklı şeylerdir. Bir spermiumun yaşama süresi, içinde bulunduğu ortamın pH’ına bağlıdır. Spermiumlar asit ortamlarda çok çabuk hareket niteliklerini çok çabuk kaybeder ve ölürler (Munkıttrıck vd., 1987; Kayalı vd., 1992).
2.2. Yumurta Morfolojisi
Döllenmemiş yumurta ya da dişi gamet, ikinci mayotik bölünmenin metafazında yeralan sabit ovosittir. Bu metafaz 2 ovosit, oogenetik sürecin son ürünü olup, oogenetik boyunca ovaryum ile birlikte meydana gelir (Tata, 1986). Sonuç olarak, yumurtanın koordineli birleşimi bazı türlerde yıllara varan çok uzun bir süre devam edebilir. Bu yüzden, oogenetiğin sürecinde meydana gelen birleşim, sentez ve yumurta bileşenleri (Şekil 2.3); bir defa döllendiginde normal bir embriyoya dönüşecek iyi kaliteli bir ovositin düzenli oluşmasında anahtar rol oynamaktadır. Vitellojen süresince yumurta hacminin artması ile sonuçlanan yumurta sarısı (besin kesesi) proteinlerinin birleşmesini de içeren yumurta oluşumunun ana özellikleri üzerinde çalışılmıştır (Wallece ve Selman; 198, 1985; Brooks vd., 1997; Patino ve Sullivan, 2002; Mommsen ve Korsgaard, 2008).
8
Bunun yanı sıra, yumurta sarısı proteinleri ve ovosit (döllenmemiş yumurta), maternal mRNA, protein, vitamin ve hormonlar gibi birçok bileşen içerir. Günümüzde, döllenmemiş yumurtaların hormonal bileşikleri hakkındaki bilgiler sınırlıdır. Çeşitli cinsiyet steroidleri (Feist vd., 1990), tiroid hormonları (Tagawa ve Hirano, 1987) ve kortizol (Hwang vd., 1992) konularında birçok çalışma yapılmıştır. Yumurta içeriğinin hormonal durumunu kontrol etme amaçlı birçok çalışma yapılmasına rağmen, günümüze kadar yumurta içi hormon fonksiyonları üzerine yeterli düzeyde araştırmayapılmamıştır. Maternal olarak aktarılan mRNA’lar ve proteinler oogenesiz boyunca oositte birleşirler (Tata, 1986, Howley ve Ho, 2000; Pelegri, 2003). Zigotik transkripsiyonun başlangıcı “maternal embriyo değişimi (MET)” esnasında meydana gelir. Balıklar ve diğer omurgalılarda da olduğu üzere, MET orta-blastula safhasında meydana gelir bu durum ayrıca “orta orta-blastula değişimi (MBT)” adıyla anılır (Kane ve Kimmel, 1993). Son model genetik anaçların kullanılması ile yapılan çalışmalardaki moleküler analizler, bazı maternal mRNA’ların değişken kalitedeki yumurtalarda farklı miktarlar sergilediklerini göstermiştir (Aegerter vd., 2005; Bonnet vd., 2007b). Bu yüzden yumurtalarda bulunan maternal mRNA’ların yapısı ve miktarı, oxositin tam gelişimi için önemlidir. Aynı şekilde, özel maternal mRNA’ların oxosit içerisinde bulunduğu yer itibari ile embriyonun ön ve arka eksenlerinin tanımı için önemlidir (Bally-Cuif vd., 1998; Howley ve Ho, 2000). Bu son dönem çalışmaları, balık yumurtasının kalitesinin düzenlenmesi kapsamına giren moleküler mekanizmalar üzerinde yeni ipuçları sağlamıştır. Örneğin; gökkuşağı alabalığının yumurtasında ovulatör sonrası yaşlandırma sürecinde çekirdek plazmasının mRNA seviyelerinde hızlı bir düşüş gözlemlenmiştir ki bu süreçte yumurta kalitesi de sürekli bir düşüş halindedir (Aegerter vd., 2005). Çekirdek plazmasının nükleer yapılanmada ve embriyonik gelişmede önemli bir maternal etki geni olduğu sonucu çıkmaktadır (Burns vd., 2003; McHay ve Clarke, 2003). Aynı şekilde, gökkuşağı alabalığının değişik kalitelerdeki yumurtaları arasında değişken miktar gösteren prohibitin 2 mRNA’da gözlemlenmiştir (Bonnet vd., 2007b). Prohibitin 2 (Phb2) yüksek korumalı bir protein olup, aslında koruyucu protein olarak bilinir ve hücresel fonksiyonların geniş kapsamına yayılmıştır (Aegerter vd., 2005).
Maternal mRNA’lara ilaveten, oxosit oogenezis sürecinde sentezlenen proteinleri de içerir. Son dönemlerde, gelişen oxositin proteomik analizi, tam yetişkin bir zebra (Danio
rerio) ve çipura (Sparus aurata) balığının proteinlerinin tanımlanmasına öncülük etmiştir
(Knoll-Gellida vd., 2006; Zilli, 2003). Bu çalışmalar, döllenmemiş yumurtaların protein içeriğini göstermektedir. Bununla birlikte, yumurta kalitesinin düzenlenmesine katkı sağlayan proteinler konusunda daha çok çalışma yapılmalıdır.
9
2.3. Döllenme Öncesi Kalite Değerlendirme Kriterleri
2.3.1. Sperma
Aktif olan spermatozoanın yüzdesi, hareketlilik süresi, sperm konsantrasyonu ve spermatokrit ve seminal plazma kompozisyonu, sperma kalitesini ölçmede kullanılmaktadır (Billard ve Cosson, 1984; Köprücü ve Gür, 1999; Aegerter vd., 2005). Sperma kompozisyonu üzerine yapılan araştırmalar, spermatozoa konsantrasyonu ve seminal plazma kompozisyonunda büyük intraspesifik ve interspesifik değişimler olduğunu gösteriyor. Bu değişimler, genetik değişkenlik, spermatozoanın intratestiküler yaşı, mevsimler (Benau ve Terner, 1980), yumurtlama durumu ve stratejisine (Aegerter vd., 2005) göre olmaktadır.
Yumurtlama sezonu süresince levrek ve salmon balıklarının sperma kalitesinin arttığı belirlenmiştir. Diğer yandan, üreme mevsimi sonrası gökkuşağı alabalığı spermasının yoğunluğu düşmektedir (Büyükhatipoğlu ve Holtz, 1984).
Oncorhynchus mykiss, Salmo trutta, Salvelinus fontinalis ve Salmo salar üzerine
yapılan araştırmalar, bunların sperm hareketlilik süresinin mevsimlere göre değiştiğini göstermektedir. Yumurtlama mevsiminde aktif olan gökkuşağı alabalığı spermatozoaları 30-35 saniye hareketlidirler. Yumurtlama sezonu sonuna doğru hareketlilik süresi 15 sn gibi bir süreye düşer (Benau ve Terner, 1980). Ayrıca, gökkuşağı alabalıklarında yumurtlama sezonunda aktif olan spermatozoa oranı yumurtlama dönemi sonrası büyük oranda düşer (Büyükhatipoğlu ve Holtz, 1984).
Seminal plazmanın inorganik ve organik kompozisyonundaki değişimler (Benau ve Terner, 1980; Piironen ve Hyvarinen, 1983; Kruger vd., 1984; Munkittrick ve Moccia, 1987) aynı zamanda spermanın korunmasını da etkileyebilir. Sperm hareketliliği ile yakından ilgili olan K+ ve Na+ (Morisawa ve Suziki, 1980) gibi iyonların oranı ve konsantrasyonu mevsim sonunda düşer (Munkittrick ve Moccia, 1987).
Abdominal masaj ile toplanan sperma örneklerinde üre kontaminasyonu (sperm kanalı ve üriner kanalın yakınlığından dolayı) kaçınılmazdır. Bundan dolayı sperma vizkozitesi ve seminal plazma kompozisyonundaki değişim yanlış yorumlanabilir (Bromage ve Roberts, 1992; Dreanno vd., 1999b).
Bu konuda yapılan araştırmalar, üre kontaminasyonunun spermanın konsantrasyonunu %80’lere varan oranda seyreltebildiğini ve ozmotik basıncını azalttığını ortaya çıkarmıştır. Bu tür kontaminasyonlar seminal plazmanın iyonik konsantrasyonunu değiştirmektedir. Örneğin; üre kontaminasyonu sonucunda Salmo salar’ın seminal plazmasındaki K+ konsantrasyonu 1382 mg/L’den 792 mg/L’ye düşmüştür (Bromage ve Roberts, 1992).
10 2.3.1.1. Spermanın Makroskopik Muayenesi
2.3.1.1.1. Spermanın miktarı
Sperma miktarı bir sağımda dışarı verilen spermanın tamamının hacmidir. Sperma alma işleminden hemen sonra, genellikle derecelendirilmiş sperma toplama kadehlerinden okunarak, gerektiğinde ise ölçüm pipetleri veya silindirleri yardımıyla saptanır ve "ml" olarak belirtilir. Spermanın hacmi spermatozoa ve eklenti bezlerinin salgılarından oluşur. Hayvan türüne, ırkına, yaşına, çevre koşullarına ve sperma alma yöntemine bağlı değişiklik gösterebilir (Büyükhatipoğlu vd., 1984; Munkıttrıck vd., 1987; Alaçam vd., 1994).
2.3.1.1.2. Spermanın rengi
Hayvan türüne ve ırkına göre farklılıklar göstermekle beraber, normal sperma genellikle açık kremden koyu krem rengine kadar değişir. Rengin oluşmasında sperma içinde bulunan spermatozoa sayısının etkisi fazladır. Patolojik durumlar dışında sperma renginin olusmasında hayvan türüne ve beslenmeye bağlı, normal sayılabilecek farklılıklar izlenebilir. Spermada normalin dışında renklere de rastlanabilir. Bu durumlar, genital organlarda anormal bir durumun olduğunu veya spermaya yabancı maddelerin karıştığının belirtisidir. Spermanın sarı-yeşilimsi renkte gözükmesi, spermada irin bulunduğunu (pyospermie), sarı renkte olması idrar karıştığını, kırmızı-kahverengi olması kan karıştığını (hemospermie) gösterir, partikül veya benzeri tortuların gözükmesi ise dışkı veya diğer yabancı maddelerin bulunduğunun belirtisidir (Holtz vd., 1984; Alaçam vd., 1994).
2.3.1.1.3. Spermanın kıvamı
Spermanın akışkanlığını ve viskozitesini gösterir. Sperma sulu kıvamdan krem kıvamına kadar değişen viskozite gösterebilir. Spermanın kıvamı, büyük ölçüde içerdigi spermatozoa sayısıyla ilişkilidir. Örnegin; az yoğun bir sperma, açık krem renginde, sulu kıvamda ve akışkan oldugu halde, daha yoğun sperma (x109/ml) krem renginde, koyu süt kıvamındadır ve bunun akışkanlığı daha azdır (Büyükhatipoğlu vd., 1984; Munkıttrıck vd., 1987).
2.3.1.2. Spermanın mikroskopik muayenesi
Taze spermada muayeneler sperma alımından hemen sonra ve spermatozoonların çevre koşullarından en az etkileneceği bir ortamda (laboratuvar) sürdürülür. Muayene
11
sırasında spermanın temas edeceği lam, lamel, pipet, vb. gibi tüm malzemeler temiz, steril ve ortam sıcaklığında olmalıdır (Alaçam vd., 1994). Alabalık çiftliklerinde hehüz laboratuvar şeklinde tam teşekküllü bir çalışma alanları kurulmamıştır. Fakat laboratuvar ve malzemelerinin önemi gün geçtikçe artmaktadır.
2.3.1.2.1. Kitle hareketi
Spermatozoa yoğunluğu fazla olan spermalarda gözlemlenebilen bir hareket çeşididir. Kitle hareketi, spermada bulunan ileri yönlü, güçlü harekete sahip spermatozoonların yoğunluğuna ve motilitesine bağlı olarak oluşur. Spermada ileri yönde ve hızlı hareket eden spermatozoa sayısı çok fazla ve motilite çok iyiyse, kitle hareketi koyu hatlar halinde kaynama veya dalgalanma şeklinde görülür. Spermatozoa hareketleri yavaş veya az sayıda ileri yönlü ise kitle hareketi ya çok yavaş dalgalanma veya kaynama şeklindedir ya da hiç görülmez. Kitle hareketi 0-5 arasında puanlama ile değerlendirilir. Eğer spermada hiçbir kitle hareketi gözlenmiyorsa; 0 (sıfır), kitle hareketi çok hızlı, kalın hatlarla kaynama veya dalgalanma şeklinde ise 5 (beş) ile değerlendirilir. Değerlendirmeler türe özgü özellikler dikkate alınarak yapılır (Şekil 2.4). Muayene için yaklaşık mercimek büyüklügünde bir damla sperma, kapiller pipet veya bagetle lam üzerine konur. Hareketler mikroskobun küçük büyütmeli objektifiyle (x400), lamel kapatılmaksızın, doğrudan değerlendirilir. Muayene kısa sürede yapılmalı, gerektiğinde tekrarlanmalıdır (Alaçam vd., 1994).
Şekil 2.4. Mikroskop altında sperm hareketlerinin değerlendirilmesi: (0) Yok, (1) çok zayıf, (2) zayıf, (3) orta, (4) iyi, (5) çok iyi (Alaçam vd., 1994).
12 2.3.1.2.2. Spermatozoa motilitesi
Spermatozoa motilitesi;bir yönde ve güçlü hareket eden spermatozoonların, hareketsiz veya diğer hareket biçimi gösterenlere oranıdır. Bir yönde ve güçlü hareket niteliği gösteren tek hücreye ise, motil spermatozoon denir. Motil spermatozoonların spermadaki sayıları, toplam spermatozoa içindeki yüzde oranlarıyla hesaplanabilir. Yalnızca motil spermatozoonların dölleme (fertilizasyon) güçleri olduğu kabul edildiğinden, yapılacak muayenelerde motilite saptanması önemli yer tutar. Motilite oranının belirlenmesiyle, hem erkek hayvanların dölleme güçleri büyük ölçüde belirlenir hem de spermanın değişik amaçlarla kullanılması ve değerlendirilmesi olanağı sağlanır. Bu nedenle spermatozoa motilitesinin saptanmasında çok dikkatli olmak gerekir. Motilitenin düşük saptanması halinde spermadan daha az veya hiç yararlanılamayacağı, yüksek saptanması halinde ise infertilite veya steriliteye yol açabileceği düşünülmelidir (Büyükhatipoğlu vd., 1984; Munkıttrıck vd., 1987; Alaçam vd., 1994; Dreanno vd., 1999c).
Spermatozoa motilitesinin saptanmasında lam, lamel, ve pipet gibi malzemelerin temiz ve vücut sıcaklığında veya ortam sıcaklığında olmasına dikkat edilmelidir. Spermatozoa motilitesinin saptanması taze ve sulandırılmış spermada yapılır. Bunun için spermadan küçük bir damla alınarak lam üzerine konur ve bu damla üzerine lamel kapatılmadan ışık mikroskopunda genellikle orta büyütmede (x400), spermatozoonlar tek tek izlenerek bunların hareketlerinin değerlendirilmesi yapılır. Çoğunlukla, taze balık spermalarında yüksek motilite (%90) ve hareket hızına rastlanılır. Spermanın motil spermatozoa yönüyle değerlendirilmesi, toplam motil spermatozoa sayısı göz önünde bulundurularak yapılmalıdır. Spermada düşük motilite (%60) durumunda bu gibi spermalar dölleme için tercih edilmez. Kullanılması halinde dölleme oranı düşük olur (Büyükhatipoğlu vd., 1984; Munkıttrıck vd., 1987).
2.3.1.2.3. Spermatozoa yoğunluğu
Birim hacim spermada bulunan spermatozoa sayısı olarak tanımlanabilir. Spermanın bir mm3 veya cm3’ünde bulunan toplam spermatozoa sayısının bilinmesiyle ancak, motil spermatozoon oranı veya diğer spermatolojik özellikler sayısal olarak ifade edilebilir. Özellikle spermanın kullanılmasında ve değerlendirilmesinde spermatozoa yoğunluğu ve motilitesi yanında çok önemli bir spermatolojik özelliği oluşturur. Spermatozoa yoğunluğu çok değişik yöntemlerle belirlenebilirse de uygulamada genellikle üç temel yöntem kullanılır. Bunlar;
13
Hemositometrik Yöntem: Kan hücrelerinin sayımında olduğu gibi, spermada bulunan eşey hücrelerinin sayısal miktarının belirli oranlarda sulandırılması, eritrosit sayımında kullanılan pipetlerle yapılır. Spermatozoa sayımında çeşitli sayım lamları kullanılabilir. Ancak, daha çok kullanılanı "Thoma" sayım lamıdır. Thoma lamında biri üstte, diğeri altta olmak üzere iki sayım sahası vardır. Her sayım sahasında 16 büyük kare, her büyük karede ise 25 küçük kare bulunur. Thoma lamı her iki sayım sahasını örtecek şekilde özel lamelle kapatılır. Lamelin yapıştırılması, sayım sahalarının yanlarında bulunan ayakların hafif nemlendirilmesiyle sağlanır. Yapışmanın uygunluğu her iki yapışma yerinde oluşan Newton renk halkasıyla kontrol edilir. Sayım lamına sayım sahaları yanlarından önceden hazırlanmış solüsyon damlatılarak lam ve lamel arasında oluşan hacim tamamen doldurulur. Spermatozoonların çökmeleri için lam yaklaşık 5 dakika yatay konumda bekletilir. Spermatozoa sayımı, mikroskopta sahanın bulunması için önce küçük büyütmeli (x 400) objektifler kullanılarak yapılır.
Fotolemetrik Yöntem: Bu yönteme fotoelektrokolorometrik ya da nefalometrik adı da verilir. Oldukça yaygın kullanım sahası vardır. Pratik oluşu ve kısa sürede sonuç vermesi yönüyle tercih edilir.
Elektronik Sayaç Yöntemi: Spermatozoa yoğunluğu son zamanlarda geliştirilen elektronik aletlerle de belirlenebilmektedir. Bu yöntemde kullanılan alet, elektrolit bir sıvı içinde bulundurulan iki elektrod arasındaki elektrik akımının, ortamda bulunan partiküllerin sayısı ve büyüklüklerine göre değişmesi esasına göre çalışır.
2.3.1.2.4. Ölü-canlı spermatozoon oranı
Spermada yer alan ölü ve canlı spermatozoa oranını saptamak amacıyla araştırılır. Bu saptama, boyama testleriyle ölü spermatozoonların boyayı alma, canlı olanların ise, boyayı almama özelliğine dayandırılarak yapılır. Boyama işleminde genellikle eosin kullanılmakla beraber, eosin-nigrosin, opalblue ve fast green gibi boyalardan da yararlanılabilir. Ölü spermatozoon oranının saptanması spermatolojik özellikler bakımından ancak tamamlayıcı bilgi verir. Eğer spermada ölü spermatozoa oranı düşükse, bu çok şey ifade etmez. Çünkü yerinde sallanan, çember hareketliler de canlı spermatozoon özelliği gösterebilirler. Spermada yüksek miktarda bulunan ölüm oranı ise olumsuzluk işaretidir. Bu durumda diğer spermatolojik özellikler tekrar gözden geçirilmelidir. Spermada genellikle %20-25'in üzerinde ölü spermatozoa bulunması istenmeyen bir özelliktir (Labbe vd., 2001).
14
2.3.1.3. Spermanın fiziksel ve kimyasal özelliklerinin muayenesi
Spermanın fiziksel ve kimyasal özelliklerinin muayenesi kapsamında spermanın pH değeri ve dayanıklılığı (direnci) incelenmektedir (Büyükhatipoğlu vd., 1984; Munkıttrıck vd., 1987; Alaçam vd., 1994).
2.3.1.3.1. pH değeri
Spermanın pH değeri, taze spermada ve sulandırma işlemi sonrasında indikatör kağıtları veya pH ölçüm aletleriyle saptanır. pH ölçümü sırasında kullanılan ölçüm tekniğine kesinlikle uyulmalıdır. Spermada saptanan pH değeri değişimleri, spermaya dışarıdan herhangi bir maddenin karıştığının göstergesi olabilir. Ayrıca, spermatozoonların metabolik faaliyetler sonucu ortama verdikleri artık maddeler de (laktik asit gibi) pH değişimine yol açabilmektedir. Bilimsel çalışmalarda ve spermanın değişik amaçlı kullanımlarında spermatozoon metabolizmasına bağlı olarak belirli süre içinde pH değerinin değişmesi, spermanın değerlendirilmesinde krıter olarak kullanılabilmektedir (Büyükhatipoğlu vd., 1984; Munkıttrıck vd., 1987; Alaçam vd., 1994).
2.3.1.3.2. Dayanıklılık testi
Bu amaçla, "tuzlu su testi", "termorezistens testi" ve "soğuk şok testi" kullanılmaktadır.
Tuzlu Su Testi: Bu testte %1'lik tuzlu su ortamında tutulan spermatozoonların
aktivitelerini koruma süreleri araştırılır (Holtz vd., 1984; Munkıttrıck vd., 1987).
Termorezistens Testi: Bu deneyde, değişik sıcaklık ortamlarında belirli süre tutulan
spermalarda spermatozoa motilitesi ya da hareket biçimleri değerlendirilir. Spermatozoa hareketlerinin yanısıra morfolojik yapının da (özellikle akrozom yapısı) incelendiği testtir (Holtz vd., 1984).
Soguk Şok Testi: Gerek doğal, gerekse dondurulmuş spermaların değerlendirilmesinde
kullanılan testte spermanın soğuk ortamdan etkilenişi araştırılır. Bunun için sperma 0 °C’ye kadar soğutulur ve 10 dakika bekletildikten sonra sıcaklık tekrar +15°C’ye çıkarılır. Spermatozoonlar eosin ya da eosin-nigrosin gibi boyalarla boyama ile ölü-canlı oranına göre değerlendirilir (Büyükhatipoğlu ve Holtz vd., 1984; Munkıttrıck vd., 1987; Alaçam vd., 1994).
15 2.3.1.3.3. Spermanın bileşimi
Spermanın bileşimi, spermatozoa ve seminal plazmadan meydana gelir. Gerek spermatozoa gerekse seminal plazmayı oluşturan maddeler, hayvan türüne, ırkına hatta yaşa ve çevre koşullarına bağlı bir takım değişiklikler gösterir. Spermada yer alan elemanlar ve değerleri tıpkı kan ve serumunda olduğu gibi muayene edilebilmektedir. Günümüzde geliştirilmiş santrafüj ve filtrasyon teknikleriyle spermada bulunan spermatozoa ve plazma kısımları ayrılabilmekte, uygun biyokimyasal laboratuvar yöntemleriyle bunların analizleri yapılabilmektedir (Büyükhatipoğlu ve Holtz vd., 1984; Munkıttrıck vd., 1987; Alaçam vd., 1994).
Spermada bulunan elemanlar, spermatozoonlarda ve seminal plazmada değişik oranlarda yer alırlar. Ancak, hücre membranlarında oluşan herhangi bir bozukluk nedeniyle oranlar değişebilir. Bu durumlar plazmadan hücreye, ya da hücreden plazmaya madde geçmesine yol açar. Genellikle, hücreden seminal plazmaya magnezyum ve potasyum, plazmadan hücreye ise sodyum ve kalsiyumun geçtiği bildirilmiştir (Alaçam vd., 1994; Labbe vd., 2001). Spermatozoonda bulunan başlıca kimyasal bileşiklerden deoksiribonükleik asit (DNA) mukopolisakkarid, aldehidrogenik lipid (plasmalogen), keratin-protein, enzim ve koenzimler önemli yer tutarlar. Bu maddeler hayvan türleri arasında farklılıklar gösterirler.
2.3.2. Yumurta
Balık üretiminde, en yüksek sayı ve kalitede yumurta ve larva elde etmek temel amaçtır. Normal şartlar altında yumurtaların döllenmesi, embiryonal gelişimi ve çıkan larvaların yaşama oranı üzerinde, yumurta özellikleri olarak tanımlanan yumurta kalite parametreleri belirleyici rol oynamaktadır (Brooks vd., 1997). Kültürü yapılan veya yapılmaya çalışılan birçok balık türü için kaliteli yumurta üretimi önemli bir problemdir. Levrek, çipura, kalkan ve birçok yassı balıklarlara ait yumurtaların yaşama oranı oldukça düşük olup, bu oran genellikle %5’den daha azdır (Tablo 2.1). Salmon balıklarının yumurtaları ve dolayısıyla larvaları kaliteli olmakla birlikte, yumurtaların 2/3’si ve larvalar kuluçkalamada ilk birkaç ay esnasında kaybedilebilir (Bromage vd., 1992; Okumuş vd.,1998; Dreanno vd., 1999c; Zilli, 2003).
16
Tablo 2.1. Gökkuşağı alabalığı, deniz levreği, çipura ve kalkan anaçlarının yumurta verimleri ile yumurtaların döllenme ve çıkış oranları (Okumuş vd., 1997).
Tür Yumurta Verimi Döllenme Oranı (%) Çıkış Oranı (%) Larva (adet/kg anaç yıl)
Adet/kg anaç Anaç ağırlığı (%)
Alabalık 1.600 20 - 30 75 - 95 60 - 90 1.000
Levrek 300.000 20 - 25 90 – 95 75 - 85 220.000
Çipura 800.000 50 - 80 90 – 95 70 - 80 560.000
Kalkan 500.000 20 - 50 35 – 52 25 - 45 100.000
Gökkuşağı alabalıklarındaki fertilizasyon oranı, ya döllenmeden sonraki ilk 12 saatte ya da embriyonun gelişiminden 7 gün sonra oluşan ölü veya gelişmeyen yumurtaların belirlenmesiyle tespit edilebilir (Springate vd., 1984; Sower vd., 1992; Bromage vd., 1992; Brown vd., 1995). Sonuç olarak gözlenmiş ve döllenmiş oran arasındaki korelasyonun belirlenmesi ile kalite kontrolü yapılır. Yumurta kalitesi, çoğunlukla gözlenmiş yumurta oranı olarak kullanırlar (Terner, 1962; Withler vd., 1968; Willers., 1981; Bromage vd., 1992; Zilli vd., 2004).
Bununla beraber, deniz balıklarında yumurta kalitesini belirleme metotları açısından çok az ortak görüş vardır. Deniz balıklarına ait yumurtaların üstünlükleri genellikle deniz suyunda yüzme veya batma durumlarına göre tespit edilerek “düşük kaliteli” veya “iyi kaliteli” yumurta olarak ayrılırlar (McEvoy, 1984; Carrillo vd., 1989; Kjorsvik vd., 1990). Diğer yandan korion görünüşü, yumurta şekli, şeffaflığı ve yağ damlacıklarının dağılımı gibi bir çok faktörün yumurta kalitesi ile ilgili olduğu ileri sürülmektedir (Kjorsvik vd., 1990). Bununla birlikte, yassı deniz balıklarının morfolojik karakterlerinin de kalite ile ilgili olduğu bildirilmektedir (Labbe vd., 1995; Kime vd., 1996; Okumuş vd., 1997; Oda vd., 1998). Dölleme oranı, deniz salmonlarında yumurta kalitesinin iyi bir göstergesidir (Inaba vd.,1993; Itoh vd.,2003; Kjorsvik vd., 2003; King vd., 2003).
Balıklar ve diğer evcil hayvanların arasındaki önemli bir farklılık, balıkların yüksek fekunditeye sahip olması ve çok miktarda yumurta vermesidir. Balık türleri arasında da fekundite oldukça farklılık gösterebilir. Yassı deniz balıkları milyonlarca yumurta üretirken, salmonlarda bu değer binler düzeyindedir (Bromage, 1994; Caille vd., 2006). Ayrıca, çoğu deniz balıkları 2-3 ay sürebilen yumurtlama mevsiminde haftalık olarak yumurta üretirken, salmonlar yılda sadece bir kere yumurta üretebilirler. Anaç yönetimi ve planlaması salmonlar gibi düşük fekunditeye sahip olan balık türleri için büyük önem taşımaktadır (Büyükhatipoğlu vd., 1978; Bromage vd., 1994; Crespel vd., 2008).
17
Ayrıca, yumurta sayısı veya fekundite ile birlikte yumurta büyüklüğü de kalitenin belirlenmesinde kullanılmaktadır. Yumurta büyüklüğü yumurta kalitesini belirleyen önemli kriterlerdendir (Gillet, 1991; Dörücü vd., 2001). Anaç balığın büyüklüğü yumurta sayısını ve büyüklüğünü etkileyen en önemli faktördür. Genel olarak, balık büyüklüğü fekundite ve yumurta çapını artırır. Bu özellik salmonlarda belirgin olarak gözlenir. Bununla beraber gökkuşağı alabalıklarında, artan balık büyüklüğüyle birlikte fekonditede bir düşüş gözlenmektedir (Gillet vd., 1996; Koldros vd., 1996; Labbe vd., 1997). Fekundite ve yumurta büyüklüğü üzerinde; balığın büyüklüğü ve genotipi, stoklama yoğunluğu, stres oluşturan durumlar, besin kalitesi ve miktarı ile suyun fiziksel ve kimyasal özellikleri (Şekil 2.5) etkili olmaktadır (Bromage ve Roberts, 1995).
Şekil 2.5. Yumurta, sperma ve larva kalitesini etkileyen faktörler (Bromage ve Roberts, 1995).
Fekundite üzerine dolaylı etkilerine ilaveten, anaç balıkların günlük ve mevsimsel beslenme oranları da fekundite ve yumurta büyüklüğünü doğrudan etkilemektedir (Springate vd., 1984; Jensen, 1984; Lahnsteiner vd., 1992; Bromage vd., 1992; Kho vd., 2001). Bundan dolayı, tavsiye edilen günlük yemleme oranının yarısı veya çeğreği kadar yemle beslenen anaç alabalıkların yumurta sayısı %25 oranında azalmaktadır (Jones ve Bromage, 1987).
18
Mevsimsel değişimlere bağlı olarak sudaki besin maddelerinin kalitesi ve miktarındaki değişimler, düşük veya yüksek besleme oranları, balıkların olgunlaşma oranı ve fekunditesi üzerinde belirli etkilere sahiptir (Bromage vd., 1992; Labbe vd., 1996), üreme periyotlarının ilk 4 ayı için yüksek kalitedeki rasyonlarla beslemenin fekunditeyi arttırdığını, üretim döngüsünün daha sonraki safhalarında ise yüksek kalitedeki rasyonlarla beslemenin yumurta sayısında görünür bir etki yapmadığını bildirmiştir. Balık yumurtalarının olgunlaşması ve yumurta kalitesi arasında da bir ilişki mevcuttur. Döllenmemiş yumurtalar ovulasyonu takiben, yaygın bir şekilde olgunlaşma olarak tanımlanan bir gelişim dönemi geçirir (Kjorsvik vd., 1990; Bromage vd., 1994; Lansteiner vd., 1998; Labbe vd., 2001).
2.4. Dölleme ve Döllenme Başarısı
Döllenme başarısı, yumurta kalitesi ve bunun en belirgin değerlendirme kriteri olan sperm kalitesinin değerlendirilmesi için kullanılan erken değerlendirme kriteridir. Aslında; dölleme ve döllenebilme yeteneği gamet kalitesinin anahtar unsurlarından biridir. Bazı türlerde döllenme oranlarını kaydetmek kolaydır. Bu durum; morina (Gadus Morua), kalkan ve sarı kuyruklu dil balığı (Limanda ferruginea) gibi şeffaf yumurtalı balık türleri için geçerlidir. Bunun aksine, mat yumurtalı balık türleri için oldukça zordur. Geçmişte ‘döllenme oranı’ tabirini kullanan birçok çalışma, çok sonraki aşamalarda görülen yaşayan embriyo durumunu tasvir etmiştir. Bu durum; spermin dölleme yeteneğinin yüzde bazında gelişen embriyolara bakılarak kaydedildiği sperm çalışmaları için geçerlidir. Böylece, dölleme oranının erken gelişim dönemi için iyi bir kriter olduğu anlaşılmaktadır ancak türlere bağlı olarak bunun gözlemlenmesi zordur (Holtz vd., 1984; Munkıttrıck vd., 1987).
Ayrıca, birçok deniz türünde de görüldüğü üzere ileriki gelişim durumları için, döllenme başarısı çok belirleyici bir unsur değildir (Shields vd., 1997; Lahnsteiner vd., 2008). Döllenmeden sonra embriyo hücreleri bölünmeye başlar (Şekil 2.6). İlk embriyo hücrelerinin şekli ve anormal hücre bölünmelerinin meydana gelmesi şeffaf yumurtalı balıkların kalitesini gösteren bir kriterdir. Sarıkuyruklu dil balığında anormal klivaj erken embriyo ölümleriyle sonuçlanır (Büyükhatipoğlu vd., 1978; Beck vd., 1992; Contreras-Sanches vd., 1998; Avery ve Brown, 2005). Aynı zamanda blastomer şekli, sonraki aşamalarda görülen gelişimsel başarı ile ilişkindir (Shields vd., 1997; Kjorsvik vd., 2003; Inaba, 2008). Atlantik morinaları üzerinde yapılan son dönem çalışmaları; anormal klivaja uğrayan embriyoların yaşam süresinin normal embriyolarınkinden daha kısa olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, hem normal hem de anormal yumurtaların yaşama eğilimleri ve kuluçka başarıları arasında çok
19
ciddi farklılıklara rastlanmamıştır. Sonuç olarak anormal klivaj görünümünün embriyonik başarısızlıkla da sonuçlanmadığını ortaya koymuştur (Avery vd., 2008; Izguerdo vd., 2001). Sonuç olarak, pelajik yumurtalarının yüzebilir olması; tüm türler (Brooks vd., 1997) bazında olmasa da, mercan balığı (Pagrus major) (Takeuchi vd., 1982; Sakai vd., 1985) ve diğer türlerin (Hokanson vd., 1973; Kjörsvik vd., 2003) normal olarak gelişebilen yumurtaları için daha iyidir.
Şekil 2.6. Döllenmiş gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss) yumurtasının; yandan (A) ve üsten (B) görünüşü (Knoll-Gellida vd., 2008).
2.5. Embriyo Yaşama Oranı
Embriyonik aşamada; embriyonun hayatta kalması, başarılı bir biçimde gelişen yumurtanın döllenme ve spermatozoanın dölleme yeteneğini karakterize eden en yaygın dönemdir. Bu devrede hayatta kalma durumu; bir çok balık türünde görülen gözlenme aşaması, kuluçka, besin kesesi emilimi aşaması gibi özel aşamalarda değerlendirilebilir. Ayrıca bu durum; farklı deneysel çalışmaların arasında farklılık gösteren embriyonik yaşam sürelerinin karakterize edilerek gelişim süreçlerinde hayatta kalma durumunun izlenebilmesi için çok değerli bilgiler sunar (Campbell vd.,1992; Kopeika vd., 2003; Bonnet vd., 2007; Cosson., 2008).
20 3. MATERYAL VE METOT
3.1. Materyal
3.1.1. Çalışma Yeri
Çalışma, Kayseri Pınarbaşı İlçesinde bulunan Uzunyayla Alabalık Üretim Çiftliği’nde gerçekleştirildi. Çalışmada 5x1,5x1,2 m boyutlarındaki 2 adet ve 10x3x1,2 m boyutlarında olan 1 adet beton havuz kullanıldı. Balık yumurtalarının kuluçkalanması işlemi bu tesise ait kuluçkahanede gerçekleştirildi.
3.1.2. Balık Yemi
Araştırma süresince XY ve XX kromozomlu erkek ve dişi damızlık gökkuşağı alabalıkları’nın beslenmesinde; %50-52 ham protein, %18 ham yağ, 4150 kkal/kg toplam enerji içeren ve 12 mm çapında olan ticari bir alabalık damızlık yemi (Skretting Yem Üretim ve Ticaret A.Ş.) kullanılmıştır. Ayrıca yapılan ön çalışmada, dişiden erkekleştirme işleminde kullanılan yavrubalıkların beslenmesinde; %56 ham protein, %14 ham yağ, 4380 kkal/kg toplam enerji içeren ve 0,3-0,5 mm çapında olan ticari bir alabalık yavru yemi (Skretting Yem Üretim ve Ticaret A.Ş.) kullanılmıştır.
3.1.3. Sarf Malzemeleri
Potasyum klorit (KCI), sodyum klorit (NaCI), sodyum dihidrojen ortofosfat (NaH2PO4), magnezyum sülfat (MgSO47H2O), kalsiyum klorit (CaCI22H2O) ve sodyum
hidrojen karbonat (NaHCO3), glukoz (C6H12O6) ve kalsiyum klorür (CaCI) kullanıldı.
Balıkların anestezisi için; fenoksietanol kullanıldı. Yumurtaların dezenfeksiyonu için; kloramin –T ve formaldehid (%37) kullanıldı.
3.1.4. Kullanılan Araç-Gereçler
Sıcaklık, pH ve oksijen metre (OxyGuard marka Handy Alpha model), ışık mikroskobu (ZEIZZ Primo Star), lam ve lamel, 0,01 hassasiyetli hassas terazi (Sartorius gold OS – KA), 3 adet çiftli ve 10 sıralı yumurta dolabı (FET marka yuvarlak tepsi model), yumurta seçme makinası, kumpas, sağım malzemeleri (Tulum, eldiven, yün havlu, plastik leğen, dereceli mezür, huni, plastik kova, ağ kepçe vb.) kullanıldı.
21 3.1.5. Anaç Balık Materyali
Çalışmada kullanılacak olan anaç, XY kromozoma sahip erkek gökkuşağı alabalıkları, ticari bir balık işletmesinden temin edildi. XX kromozoma sahip olan dişiden erkekleştirilmiş balıklar ise daha önceden yapılan bir ön çalışma sonucunda elde edildi (Bkz. Bölüm 3.2.3). Aynı çalışmada 3. yaş grubunda olan toplam 30 adet XY, 30 adet XX kromozoma sahip erkek ve 4. yaş grubunda olan toplam 60 adet dişi gökkuşağı alabalığı (Şekil 3.1) kullanıldı.
A
B
C
Şekil 3.1. Anaç gökkuşağı alabalığının lateral görünüşü A) XY kromozomlu erkek B) XX kromozomlu erkek C) Dişi damızlık.
22 3.2. Metot
3.2.1. Denemenin Planlanması ve Uygulanması
Araştırma, Kayseri Pınarbaşı İlçesinde bulunan Uzunyayla Alabalık Üretim Çiftliği’nde gerçekleştirildi.
Deneme erkek anaç balıklar 5x1,5x1,2 m boyutlarındaki 2 adet beton havuza ayrı ayrı stoklandı. Dişi anaç balıklar ise 10x3x1,2 m boyutlarındaki beton havuza stoklandı. Stoklama yoğunluğu 5 kg/m3 olacak şekilde ayarlandı. Bu havuzlardaki anaçlar damızlık yemiyle beslendi. Damızlıkların kuru yöntemle sağılmasıyla elde edilen yumurtaların döllenip, yuvarlak yumurta dolaplarına stoklanması planlanmıştır. Kuluçka dolabına, ortalama sıcaklığı 10,4-11oC ve yaklaşık 9,6-11,2 mg/L çözünmüş oksijeni olan kaynak suyu kullanıldı.
Araştırmada; 4 yaşında olan dişi damızlıklardan sağılmış yumurtaları XX ve XY kromozoma sahip damızlık spermleriyle döllendi. Balıklara, ağırlıkları ile boylarının ölçülmesi ve sağım işlemlerinden önce anestezi (5 ml fenoksietanol /L) uygulandı (Werthemer, 1984; Rurangwa vd., 2001).
3.2.2. Araştırmada Kullanılan Kaynak Suyunun Analizi
Çalışmanın başlangıcında, anaçların (erkek ve dişi) stoklandığı ve kuluçka dolaplarında kullanılan kaynak suyunun fiziksel ve kimyasal kalite parametreleri belirlenecektir. Ayrıca, araştırma süresince araştırma havuzlarındaki suyun sıcaklığı 1 oC taksimatlı termometre, çözünmüş oksijen miktarı (mg/L) portatif oksijen metre ve pH’sı portatif pH metre kullanılarak günlük olarak tespit edildi (APHA, 1985).
3.2.3. Gökkuşağı Alabalığında Dişiden Erkekleştirme İşlemi
Belirtilen bu ön çalışmada, dişiden erkekleştirme işlemi aşağıda belirtildiği şekilde yapılmıştır: 17 α-metiltestesteronun uygulanmasının etkili olması zamana ve dozaja bağlıdır. Gerekli olan hormon miktarı 1 kg yem için 3 mg/kg yem’dir. Bu hormonu; 1kg yeme homojen bir şekilde karıştırmak için hormonu alkol içinde iki aşamada çözdük. Birinci aşama; 2 ml bütil-alkol içerisine konulan 17 α-metiltestesteron eriyene kadar beklendi. İkinci aşama; bu alkol hormon karışımı 150 ml olana kadar üzeri etil alkolle tamamlandı. Bu karışım 1kg yemle homojen bir şekilde karıştırıldı. 17 α-metiltestesteron karıştırılmış yem 24 saat kuru ve direk güneş ışığı almayan yerde kurutuldu. Besin kesesini tüketmiş olan yavruya 750 GD uygulandı. Bu yavrular anaç boya gelene kadar normal yemle yemlendi. Yapılan arakontroller
23
sonucu 24 ayda spermleri olduğu tespit edildi. Bu ön çalışma sonucu elde edilen 30 adet XX kromozomlu damızlık gökkuşağı alabalığı bu çalışmada kullanıldı.
3.2.4. Damızlıklarda Cinsel Olgunluğun Belirlenmesi
Cinsel gelişim safhasının tayini için öncelikle balığın dış görünüşüne bakılmaktadır. Erkek damızlık gökkuşağı alabalığında vücut daha yassı olup, üreme zamanı alt çene öne doğru uzamış bir kanca şeklinde yukarı kıvrılmıştır. Yanal çizgi boyunca daha koyu ve parlak kırmızı bir şerit taşırlar. Ayrıca, erkeklerde karın daha koyu renktedir. Dişi damızlıkların renkleri daha açık olup karın daha şişkin ve cinsiyet deliğinin yeri daha büyüktür (Morisawa vd., 1987; Ohta vd.,1993; Inaba vd., 1997; Nagler, 2000; Zilli vd., 2003; 2004).
Bu çalışmada, hem normal (XY), hemde fonksiyonel erkekler (XX) kullanıldığı için bu erkekleri de birbirinden ayırt edici özelliklerle ayırmak gerekmektedir. Bu çalışmada 3 yaşında XX kromozomlu erkekle, aynı şekilde 3 yaşında XY kromozomlu normal erkekler kullanılmıştır.
Normal erkek damızlık (XY) ile dönüştürülmüş erkek damızlıkların (XX) birbirinden ayrılmasında aşağıdaki özellikler saptanmıştır (Stickney, 1991; Mylonas vd., 1992):
- Cinsiyeti değiştirilmiş ergin damızlığın renginin yumurtlama mevsiminde normal damızlıktan daha koyu olduğu saptanmıştır.
- Balık sağıldığında normal erkeklerden (XY) sperm geldiği halde, dönüştürülmüş erkeklerden (XX) gelmediği gözlenmiştir.
- Balık sağıldığında sperm gelmeyen erkek balıkların otopsisinde, gonadlar incelendiğinde, testislerin beyaz, şişkin olduğu ve sperm kanalının olmadığı, varsa bile seyreltik bir sıvı içerdiği gözlenmiştir.
- Cinsiyeti değişen alabalıklarda testisler loplu yapıda, yuvarlak ve genellikle bir tek testis veya biri daha büyük olarak gözlenmiştir. Bu testislerin normal erkeğin testisinden daha büyük olduğu saptanmıştır (Şekil 3.2).
3.2.3.1. Sperma kontrolü
Sperma kontrolü için; erkeğin karnı yukarı gelecek şekilde çevrilip, anüs çevresi bir havlu ile silinerek kurutuldu. Erkek alabalıkların (XY kromozomlu) sperma vermeye hazır oldukları, göğüs yüzgeçleri ile anüs arasındaki karın bölgesine nazik bir şekilde basınç uygulanarak, spermanın sağılmasıyla anlaşıldı. Bu tip erkeğin spermasının ilk birkaç damlası yere sağıldı.
24
Dişiden erkekleştirilen (XX kromozomlu) damızlıklarda sperm kanalı olmadığı için, balığın kesilerek spermasının alınması işleminden önce balıklara anestezi uygulandı. Anestezi edilen balıklar bir bistüri yardımı ile otopsi yapılarak gonatları alındı (Şekil 3.2). Bu tip erkeklerin spermalarına kesinlikle idrar, dışkı ve kanın bulaşma riski yoktur. Fakat, XY kromozomlu erkeklerden alınan spermalarda bu risk her zaman vardır. Diğer yandan, XX kromozomlu erkeklerin 24 ayı doldurmuş olması gereklidir. Her iki şekilde elde edilen spermaların mikroskop altında canlılıkları ve hareket yetenekleri gözlemlendi (Morisawa, 1986; 1994; Breton vd 1990; Rurangwa vd., 2001).
A B
Şekil 3.2. XX Kromozomlu erkekten sperm alımı. A) Gonadların balıktaki konumu B) Gonadların görünümü
3.2.3.1.1. Cortland sıvısı
Cinsiyeti dönüştürülmüş olan erkek balıklardan (XX) sağım yöntemi ile sperm alınamadığından anestezi edilen balıklar bir bistüri yardımı ile kesilerek gonatları alındı. Bu gonadlar, 0oC buz üzerinde bulunan kuru bir kaba bırakıldı. Daha sonra, Cortland sıvısı ile 5:1 oranında (sulandırıcı: sperm) seyreltme yapıldı.
Cortland sıvısının hazırlanması:
1. Solüsyon………gr/L Potasyum Klorit KCI 9,00 Sodyum Klorit NaCI 2,35 Sodyum dihidrojen ortofosfat NaH2PO4 0,51
Magnezyum sülfat MgSO47H2O 0,29
