Başlık: DANA VE BUZACILARDA VİRAL ENTERİTİsLER I- VİRUS İZOLASYONU ÜZERıNDE ÇALIŞMALARYazar(lar):BURGU, İbrahim;AKÇA, Yılmaz;ÜNSÜREN, HikmetCilt: 30 Sayı: 1 DOI: 10.1501/Vetfak_0000000148 Yayın Tarihi: 1983 PDF

Ankara Oniv. Vet. Fak. Derg.

30 (1) : 45-53, 1983.

DANA VE BUZACILARDA VİRAL ENTERİTİsLER I- VİRUS İZOLASYONU ÜZERıNDE ÇALIŞMALAR

İbrahim Burgu

*

Yılmaz Akça** Hikmet Ünsüren •••

Viral enteritis of Calves I. StudiesOD the virus isolation.

Summary: In this studyfeeal samples were eolleetedfrom 26 suckling calves

andyoung calves sl!Jferingfrom dianhea. These animals between iday - 8 months of age, belonged to the difJerent part of Ankara and were brought to veterinary Faeulty, Internal Disease Clinic for treatment.

Feeal samples were diluted in i : io P BS containing io x antibiotic solu-tion. T wo parts of each feeal samples were mixed i part of i, I, 2-Tri

chlor-triflourethene and were shaked 5 minutes. These mixtures were eentrifugated ir.

3000 rpm for 3° minutes to remove debris. The supernatants were taken and

af ter the sterilization control, they were storaged at -80 oC., till use.

From eaeh sample 0,2 ml. was inoClllated in two tubes of MDBK ceU

cultıtre and they incubated al 37

oc.

These culture tubes were examined daily for 7 days to determine the eytopathogenic effeet (CP E). All samples

Wt!Tepas-saged 3 times in MDBK cell CIlltures.

In 5 out of 26 feeal samples, eytopathic changes were observed and they were regarded as positive. These positive samples were passaged up to 9 th in MDBK, twıee in prımary ca(f testes and Jetallamb muscle epıthel ana one time in fetal lamb kidney ana fetal cal] kidney eell ckltures.

The ıitm of the isolated viruses were Jound between TCID50 = 103,25

to 108ımı. in MDBK cell eultures.

Studies on the identification oj these isolatea viruses will be contmued.

Özet: Fakült£miz iç hastalıkları kliniğine enteritis semptomları ile

• Doç.Dr. A.Ü. Veteriner Fakültesi Viroloji Bilim Dalı, Ankara

** Dr.Med.Vet. A.Ü. Veteriner Fakültesi Viroloji Bilim Dalı, Ankara •• * Doç.Dr. Veteriner Fakültesi İç Hastalıklar Bilim Dalı, Ankara.

İ. BURGU-Y. AKÇA-H. UNSUREN

getirilen 1 günlükle 8 aylık arası 26 buzağı ve danadan gaita numuneleri

toplandı.

Bu numunelerden MDBK hücre kültürlerine yapılan inokulasyonlar sonunda sitopatolojik effekt meydana getiren 5 virus izole edildi.

Giriş

Buzağı ve danalarda, diyarelienfeksiyonların etkenIeri arasında viral ajanlarında bulunduğu bilinmektedir. Özellikle viral nedenli enteritisler büyük ekonomik kayıplara neden olmaktadır. Buzağı ve danalarda Bovin Viral Diarrhae-Mucosal Disease (BVD-MD) (2,7, 13,14), Enterocytopathogenie Bovin Orphan (ECBO) (7,11), ve sığır Adeno viruslarından (2,7,14) ileri gelen entiritis olayları yanında son yıllarda yapılan çalı~malar, Rota viruslar (1,5,8,10,12,16), Corana viruslar (5,10,16) ve Parvo virusların da (10,17,18) diyareli

hastalık-lara neden olduklarını ortaya koymu~tur. .

Finci (6) Türkiye'de yaptığı çalı~mada danalardan BVD-MD virusunu izole ettiğini bildirmi~tir. Bunun dı~ında ülkemizde buzağı ve danalarda enteritis olaylarına neden olan viruslarla ilgili herhangi bir izolasyon çalı~ması mevcut değildir.

Bu çalı~mamızda, Fakültemiz İç Hastalıkları Kliniğine akut enteritis semptomları ile getirilen i günlük ile 8 aylık buzağı ve da-nalardan sağlanan gaita numunelerinden enteritislere neden olan vi-ral ajanlar izole etmeyi amaçladık.

Materyal ve Metot

Klinik tanı:

Fakültemiz iç hastalıkları kliniğine enterıtıs semptomları ile. getirilen buzağı ve danaların, yapılan klinik muayenelerinde, bitkin-lik, durgunluk, yürürnede isteksizlik, çevreye olan ilgi azlığı, merme-rin kuruması, ka~eksi, dehidrasyon, kulak, burun Ve exremite u~la-rında soğuma, konjuktivalarda hiperemi ve vücut ısısında geniş var-yasyonlar (37,3°C-41,4 OC) ortak semptomlar olarak görüldü. Klinik muayencsi yapılan ve gaıtalarında bol miktarda mukus b\llunan dana ve 'buzağıların 2 tanesinde askaridosiz, 3 tanesinde koksidiosiz 3 tanesinde diyare ile bırlikte bronchopneumonie tesbit edildi. Uygu-lanan antibiyotik sağıumları sonunda 4 hayvanın kesinlikle sağıtıma cevap vermedikleri saptandı.

pANA VE BUZAGILARDA VİRAL ENTERİTlsLER 47

Gaita numuneleri:

Entcritisli 26 adet buzağı ve danaya ait gaita numuneleri steril petri kutularına veya ucu pamuklu steril çubuklar (swab) yardımı ile steril tüplere alındı.

Doku kültürü:

Gaita numunelerinden virus izolasyonu ve vimsların enfeksiyö-zite güçlerinin saptanm(l,sı için MDBK (Madin-Darby Bovine Kid-ney) devamlı hücre kültürleri kullanıldı. Ayrıca fötal dana böbrek, fötal kuzu böbrek, fötal ku7.U kas epitel hücre kültürleri ile primer dana testis hücre kültürlerinde de virus üretme denemeleri yapıldı. MDBK hücre kültüründe hücre üretme vasatı olarak

%

ı 5 inaktif dana semmlu Eagle MEM vasatı, fötal ve primer hücre kültürlerin-de kültürlerin-de %ro inaktif dana serumlu Hank's yasatı kullanıldı.

Gaitaların ekime hazırlanışı:

Steril petri kutuları ve tüpler içine alınan gaita numunelerinin ekime hazırlanmasında Frey ve arkadaşlarının (8) bildirdikleri yön-temden yararlanıldı. Bu amaçla gaita numuneleri önce içinde ıo x , Antibiyotik solüsyonu (roo LE. penicillinelml., roo gamma strcp-tomycine

ımı',

0,005 mg kanamycine

ımı)

bulunan PBS (Phosphat Buffer Solution pH 7,4) içinde iIro oranında süspanse edildiler.

Bu gaita süspansiyonları, 2 kısım gaita süspansiyonu

+

i kısını I, 1,2- Trichortrifluorethan

*

ile karıştırıldılar ve 5 dakika süı;e ile çalkalandılar. Daha sonra bu karışım 30 dakika süre ile 3000 devirde santrifuj edilerek üst kısım pipetle çekildi ve steril tüplerde -80°C de inokulasyon zamanına kadar saklandı. İnokulasyon için hazırlanan bütün gaita numuneleri sterilite kontroluna alındı.

Doku kültüriine inokulasyon:.

Gaita numunelerinden virus izolasyonu için, MDBK hücrekül. türleri io mI'lik vidalı kapaklı doku kültürü tüplerinde 3X i05hücre

I

mL. hesabıyla üretildiler. Yirmidört saat içinde üremesini tamamlayan hücre kültürlerinin üretme vasatları döküldü ve hücre yüzeyleri iki defa PBS-M ile yıkandı.

Daha sonra her bir gaita numunesi için iki adet hücre kültürü tüpüne 0,2 mL.inokulasyon yapıldı. 37 oC de i saatlik (l,dsorbsiyon süre-sinden sonra gaita inokulumları dökülerek hücre yüzeyleri yeniden

48 İ. BURGU-Y. AKÇA-H. ÜNSÜREN

iki defa PBS-M ilc yıkandı ve tüplere 2 ml (%50 Earle Laktalbu-min+%50 Eagle MEM+%5 fötal dana serumu) virus üretme va-satı konuldu.

Doku kültürü tüpleri 37

oc

lik etüvlere kaldırılarak hergün sito-patolojik effekt (CPE) yönünden kontrol edildi. Hücre kontrol bir-likte uygulandı. Bu yöntemle gaita numuneleri MDBK hücre kültür-lerinde üç defa pasajlandı,

Virus izolasyonu:

MDBK hücre kültürlerinde yapılan üç pasaj sonunda 26 adet gaita numunesinden 5 adeclin de Gaita (7) (Protokol No: 433), Gaita (8) (Protokol No: 464), Gaita (ıo) (Protokol No: 483), Gaita (13) (Protokol No: 551), Gaita (I4) (Protokol No: 553) CPE görülmesi üzerine bu gaita numuneleri 100 ml'lik doku kültürü şişelerinde üre-tilen MDBK hücre kültürlerinde g.cu pasaja kadar yeniden pasaj lan-dılar. Ayrıca aynı gaita numuneleri ile i pasaj fötal kuzu böbrek, 1 pasaj fötal dana böbrek, 2 pasaj primer dana testis ve 2 pasaj fötal kuzu kas epitel hücrelerinde adsorpsiyon tekniği ile üretim yapıldı. izole edilen viruslann enfeksiyözite güçlerinin tesbiti:

MDBK hücre kültürlerinde yapılan pasajlar sonu 5 gaita nu mu-nesinden izole edilen virusların enfeksiyözİte güçleri Burgu (3) ve Gürtürk ve arkadaşlarının (g) bildirdikleri mikrotitrasyon yöntemi ile MDBK hücre kültürlerinde saptandı.

Bulgular

Fakültemiz iç hastalıkları kliniğine akut enteritis semptomları ile getirilen çeşitli ırklara mensup buzağı ve danalardan alınan 26 adet gaita numunesinden MDBK hücre kültürlerine yapılan düzenli pasajlar sonunda 24-48 saat içinde tam bir CPE meydana getiren 5 virus izole edilmiştir (Gaita No: 7, No: 8, No: ıo, No: 13, No: 14)

(Resim ı).

Diğer gaita numunelerinden ba~lları birinci MDBK pasajında toksik etki göstermişler, diğer pasajlarda herhangi bir hücre dejenc-rasyonu oluşturmamışlardır.

Bazı gaita numuneleri ise birinci pasajdan İtibaren hiç bir hücre dejenerasyonu göstermemişlerdir. MDBK hücre kültürlerinde 5 gaita-dan izole edilen viruslar 3.cÜ pasajgaita-dan itibaren MDBK hücre

kültür-I" .

,

..

DANA VE BUZAGILARDA VİRAL ENTERİTİsLER 49

Resim i: Enfekte edilmiş MDBK hüere kültürü ve Gaita numunelerinden izole edilen virusların oluşturdukları CPE görünümü.

50 1.BURGU-Y. AKÇA-H. ÜNSÜREN .

lerinde yapılan g.cu pasaja kadar düzenli ePE oluşturmuşlardır. Aynı izolatlar 3.cÜ MDBK pasajından itibaren fötal kuzu kas hücre-sinde 2 defa pasajlanmışlardır.

Bu pasajlar sonunda 7 ve 8 no'lu viruslar tam bir ePE oluştur-muş 10,13 ve 14 nolu viruslar aynı hücre kültüründe ePE meydana getirmemişlerdir. Primer dana testis hücre kültüründe 3.cÜ MDBK pasajından yapılan iki pasajda'da 13 ve 14 no'lu viruslar tam bir ePE oluşturmuşlar, 7,8 ve lO no'lu viruslar ePE meydana getirmemişler-dir. Fötal kuzu böbrek ve fötal dana böbrek kültürlerine 3.cÜ MDBK pasajından yapılan inokulasyonlar sonunda gaitadan izole edilen 5 virusunda tam ePE oluşturdukları gözlenmiştir (Şekil i), MDBK hücre kültüründe yapılan 3.cÜ pasajdan elde edilen 5 izolatın aynı hücre kültürlerinde mikrotitrasyon yöntemi ile yapılan enfeksiyozite gücü ölçümıerinde No: 7 DKID50

=

106,7

ımı.,

No: 8 DKIDso

=

103,25/m!., No: loDKIDso =105,25/ml., No: 13 DKID50 = 107,5/ml.

ve No: 14 DKID50 = 108

,01

mL. değerlerine ulaştıkları gÖ71enmiştir

(Tablo ı).

Tartışma ve Sonuç

Fakültemiz iç hastalıkları kliniğine getirilen entcritisli buzağı ve da-nalardan sağlanan 26 gaita numunesinden MDBK hücre kültürlerinde

gerçekleştirilen 5 virus izolasyonu bu hayvanlarda enteritislere neden olan viral hastalıkların etyolojisi yönünden büyük önem taşımakta-dır. Frey ve arkadaşlarının (8) aynı yöntemle MDBK hüere

kültür-lerinde gerçekleştirdikleri rota virus izolasyonu gibi, izole ettiğimiz viruslarda ı.pasajdan itibaren MDBK hüere kültürlerinde düzenli ePE oluşturarak üremişlerdir.

Frey ve arkadaşları (8), Rota virus izolasyonu 14 günlüğün al-tındaki buzağılardan topladıkları gaita numunelerinden başarmış-lardıf. hole ettiğimiz 5 virus protokol kayıtlarına göre 41) günlüğün üzerindeki enteritisli hayvanlardan alınan gaita numunelerinden elde edilmiştir.

Bu d urum, izolatların özellikle rota, parvo Ve corana viruslar olabileceği ihtimalini azaltmaktadır. Diğer taraftan EeBO viruslar Adenoviruslar ve BVD-MD virus izolasyonları bu yaş ve daha yakın yaşlardaki hayvanlardan sık gerçekleştirilmiştir (4,7,11,13,14). Fa-kat BVD-MD virusunun MDBK hücre kültürlerinde ürememesi izole edilen virusların BVD-MD virusu olma şansını da azaltmaktadır (ıS).

ŞEKİL i:GAİTA NUMUNELERİNDEN İZOLE EDİLEN VİRUSLARIN DOKU KÜLTüRLERİNDE ÜRETİLME SONUÇLARI

GAİTADAN VİRUS İZOLASYONU

ci

>

z

i

MDBK

>

Pasaj I-II-III _<: tTı

i

c:ıc:: N

i

GAİTA No. 7

_{i i}

GAİTA No. 8

_i

ı

GAİT~ No. Lo

i

ı

GAİTA+ No.13

i

GAİTA+No. 14-

>

_o<

+ + _F

>

1MDBK

i

:;tl Pasaj: 3-9

+

+ -i- +

+

cı

>

<: .L ~~~~~_~UZU KAS

i

₊

₊

~

>

t'" tTı

ı

FÖTAL KUZU BÖBREK

i

+

+

+

+

+

~tTı Pasaj: i .

a

ı-l

-ÇI)

i

FÖTAL DANA BÖBREK

i

t'"

+

+

₊

tTı

l)asaj: i

,.

:;tl

ı

PRİ:vı:ER DANA TESTİs

ı

+

Pasaj: 1-2

+

CPE Pozitif

52

ı.

BURGU-Y. AKÇA-H. ÜNSÜREN

Tablo i: İzole edilen virusların MDBK hüere kültüründe mikrotitrasyon yöntemi ile ölçiden enfeksiyözite değerleri.

İ ZOLATLI\R ENFEKSİYOZİTE DEGERLERİ (DKID..,/ı,o mL)

GA1TA No. ₇ 106'7

GA1TA No. 8 lo~'2S

GAİTA No. ıo 105125

GAtTA No. 13 ]071$

GAİTA No 14. ıo'

Sonuç olarak ülkemizde ilk kez i günlük ile 8 aylık enterıtıs semptomlu buzağı ve danalardan alınan gaita numunelerinden virus izole edilmesi ve toplam 26 numuneden 5 inde ePE oluşturan ajana rastlanması bu tür klinik tal)loya neden olan viral enfeksiyonların ülkemi,,:de yaygın olabileceği kanısını uyandırmıştır.

İzole edilen viruslar üzerİndeki identifikasyon ve tiplendirme çalışmaları devam etmektedir.

Literatür

1- Msar, A.U.R.A.Tadayon (1979): Rotavirus in diarrhoeie ealvesIIIIran. Vet.Ree.

100-4°°.

2- Aınstuu, H.E. (1965): Oeeurenee and Etiology oj injeetious eaif diarrhea.j.Am.Vet.Mcd. Assoc. 147: 1360-1363.

3- Burgu,t.(1979):Kqyunlarda abort yapan orbiviruslara dahil bir serotipin özellikleri ile

Tür-kiye'deki durumu üzerine araştırmalar. A.Ü.Vet.Fak.Derg. XXVI, (3,4): 135-15°.

4- Daniels, L.B., D.Fıneberg, J.M., Cockrill, Q., Hombsy, H.P., Peterson and L. Stratton (1977): Use oj trimethoprimsu/jadiazilZe in eOlZtrol/mg Caif Seoıırs. Vet.Med. Smal1.Anım.Clme. 72: 93-95.

5- Durham, P.J.K., B.C.Farguharson o.B.J. Stevenson (1979): Rota ulZd Coranaviren

bei klilberdiarrhoen. New zeel. Vet.]. 27, 266, 271-272.

6- Finci, E. (1972): Türkiye'de Mueosal Disease (VD) üzerinde çalışmalar. A.Ü.Vet.Fak. Doçentlik Tezi.

7- Frank, F.W. (197°): New eoııeeptsiııeaif Seours-Agri. Sci.Rev. USDA, 8: 36-4°. 8- Frey, H.R., H.J. Marschall und B.Liess (1979): RotauirusinjektiolZelı in norddeulsehen

kiilberbestlinden: Naehweis mittels Elektronmikroskopie und Virusanzüchtung in <el/kulturen.

DANA VE BUZAGILARDA ViRAL ENTERİTİsLER 53

9- Gürtürk, S., E. Finci ve I. Burgu (1974): Yurdumuz sılırlaruıda Enfeksiyöz rhinotrac-!ıdtis (IBR) üzerinde araştırmalar. I. Türkiye'de sılırlarda IBR vimsuna karşı atııikor Iilresi.

A.Ü.Yet.Fak.Derg. XXII, (3-4): 104-111.

10- Hofınann, W. und M. Arento; (1981): CoTOna-Rola und Parvovirus-!rifeetiollell bcim kalb aus klirıiseher sıchı. Dtsch.tierarztl Wschr. 99, 3i6-32ı.

11- Huck, R.H., S.F. Cortwnght: Isolation and classifieation of vimses froııı catlle durıng

out breaks of mıld respiratory disease and from lzerds with repreduetive dısorders.J.Com.Path.

74 (1964) 346.

12- Koves, B. (1979): Isolati of eytopathogenie rotavims from ııeonalal ealves. Acta Microhio!. Acad.Sci.Hung. 26, 255--23i.

13- Laınbert, G. and A.L. Fernelius (1968): Bovine viral diarhea and }.'seherie!ıia eoli in neonlal eaif enteritis. Can.,}. Comp. Med. 32: 440-446.

14- Paterson, A.B. (1962): Vims diseases of ealves. Vet.Rcc. 74: 1384-1389'

15- Rolle, M. und Mary A (1978): M!krobiologrc, lnfekıioııs-uııd Seuelteızle!ıreFerdillOlıd Erıke Verlog Stutlgart 417-420.

16- Sibalm, M., H. Szekely U.F. Burki (I980): RolavirusiJifeetion irı einellZgöreseren Riıı-derbestand. Wien.Tierarztl. Wschr 67, 122-/27.

17- Ston, J.etal. (1978): Parvovirus !rifeetion oftlte boviııefetus. Amer j.Vet.Rcs. 39,1099-1102.

18- Woso, Lo, R.H. Joanson, i. GoodchUd U.P. Bachınann (1979): Isolation of boviııe parvonirus type i in Auslralia. Austral. Yet.,}. 55, 199-200.