T.C.
GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ
Bilimsel Araştırma Projeleri KomisyonuSonuç Raporu
Proje No: 2010/32
Deneysel Timpanoskleroz Üzerine Melatonin Ve C Vitamininin Etkisi:
Ratlarda Yapılan Deneysel Bir Çalışma
Proje Yöneticisi
Yrd. Doç. Dr. Sema Koç
Kulak Burun Boğaz ve Baş Boyun Cerrahisi ABD
Araştırmacılar ve Birimleri Arş. Gör. Ceyhun Aksakal
Kulak Burun Boğaz ve Baş Boyun Cerrahisi ABD
ÖZET*
Deneysel Timpanoskleroz Üzerine Melatonin Ve C Vitamininin Etkisi: Ratlarda Yapılan Deneysel Bir Çalışma
Bu çalışmada ratlarda miringotomi sonrası oluşan timpanoskleroz üzerine melatonin ve C vitamininin olası etkisini histopatolojik ve biyokimyasal olarak göstermeyi amaçladık.
Çalışmamız randomize prospektif çift kör bir çalışmadır. 24 adet rata standart miringotomi ve orta kulaklarına hasar yapıldı ve ratlar rastgele üç gruba ayrıldı. Sekiz rata (grup 1) 5 mg/ kg melatonin, sekiz rata (grup 2) 75 mg/ kg C vitamini, sekiz rata (grup 3) oral salin çözeltisi (% 0,9 NaCl) verildi; bu işleme 10 gün devam edildi. Biyokimyasal analiz için iki adet kan örneği alındı. 28. günde bütün ratlara ötenazi uygulandı ve ratların temporal kemikleri çıkarıldı. Ortalama TAS değerleri tüm rat gruplarında tedavi öncesi peryotta benzer idi. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında melatonin ve C vitamini grubunda ortalama TAS değerleri yüksek idi fakat melatonin ve C vitamini rasındaki fark istatistiksel olarak anlamlı değil idi (p<0,001). Minimum ve maksimum duvar kalınlıkları kontrol grubuna göre melatonin ve C vitamini gruplarında daha düşüktü ancak farklar istatistiksel olarak anlamlı değildi. Miringotomi sonrası gelişen timpanoskleroz üzerine melatoninin TAS düzeylerini artırarak etkisinin olabileceği düşünüldü.
Anahtar Kelimeler: Timpanoskleroz, Melatonin, C vitamini
(*) Bu çalışma Gaziosmanpaşa Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu tarafından desteklenmiştir (Proje No: 2010/32).
ABSTRACT*
The effect of melatonin and vitamine C treatment on experimentally induced tympanosclerosis: A study in rats
We aimed to investigate and compare the possible preventative effects of melatonin and Vitamin C on tympanosclerosis in rats by using histopathology and determination of total antioxidant status (TAS). Randomized prospective single blind study. Standard myringotomy and standart injury were performed in the middle ear of 24 rats. Then, the animals were randomly divided into three groups. Eight rats (group 1) received 5 mg/kg melatonin, eight rats (group 2) received 75 mg/kg Vitamin C, and remaining eight rats (group 3) received oral saline (0.9 % NaCl) solution; these were continued for 10 days. For biochemical analysis, two blood samples were obtained. On the 28th day, all animals were euthanized and temporal bones were removed. The mean values of TAS were similar in the all study groups before the treatment period. The mean values of TAS were significantly higher in the melatonin and vitamin C groups compared to control group but vitamin C with melatonin groups were similar after the treatment period (P<0.001). Minimum and maximum wall thicknesses were lower in the melatonin and
vitamin C groups compared to the control group but the differences were insignificant. The administration of melatonin increased TAS level and might have some effect on tympanosclerosis that develops after myringotomy.
Keywords: Tympanosclerosis, Melatonin, Vitamin C
(*) This study was supported by Gaziosmanpaşa University Scientific Research Projects Commission (Project No: 2010/32).
İ Ç İ N D E K İ L E R Sayfa ÖZET ... i İÇİNDEKİLER DİZİNİ ... ii 1. GİRİŞ VE AMAÇ ... 1 2. GEREÇ VE YÖNTEM ... 2
2.1. Çalışma prosedürleri ve deney grupları ...3
2.2. Biyokimyasal Analiz ...3
2.3. Doku toplama ve histopatolojik analizler ... 4
2.4. İstatiktiksel Analiz ... 4
4. TARTIŞMA ... 5 5. SONUÇ ... 7 6.KAYNAKLAR………..8 1. GİRİŞ VE AMAÇ
Timpanoskleroz (TS), orta kulak enfeksiyonlarının iyileşme dönemindeki bir sekelidir. Orta kulakta, kulak zarında ve nadiren de mastoid kavitede kalsifiye hyalen plaklar ile karakterizedir. TS tekrarlayan akut otitis media (AOM) veya efüzyonlu otitis media (EOM) geçirenlerde ve miringotomi uygulanan hastalarda sıklıkla görülmektedir. Klinik olarak beyaz plaklar, sınırlı bir noktada olabileceği gibi at nalı şeklinde manibrium malleiyi çevreleyebilir. TS plakları sadece kulak zarında ise bu duruma miringoskleroz (MS) denmektedir ve bu hastalarda işitme genellikle çok az etkilenmektedir (Polat S,2004; Song CM, 2010). Epitimpanik bölgede malleus başı ve inkus gövdesinin veya oval pencerede stapesin TS plakları ile fiksasyonu sonucu ileri derecede iletim tipi işitme kaybı oluşabilir. TS otik kapsülü etkileyerek sensörinöral işitme kaybına da neden olabilir. Plakların temizlenmesi ve oluşan kemikçik hasarının cerrahi olarak düzeltilmesi her zaman mümkün olamamaktadır. Temizlenen olgularda ise operasyon sonrası erken dönemde çoğunlukla refiksasyona bağlı olarak işitme kaybı tekrarlamaktadır. Stapesin tutulduğu olgularda hyalen plaklar lameller tarzda ise daha rahat temizlenebilmektedir. Stapes tabanı veya bacaklarının tutulduğu olgularda stapedotomi-stapedektomi, teflon piston ile işitme onarımı yapılabilmektedir. Ancak iatrojenik sensörinöral işitme kaybı riski hala yüksek oranlardadır. Mobilizasyon yapılan olgularda cerrahi yeni bir doku travması oluşturduğundan bir süre sonra yeniden
TS plağı oluşarak işitmeyi bozmaktadır. Bu nedenle TS'un henüz kalıcı bir tedavisi malesef bulunmamaktadır (Forséni Flodin M, 2002).
Timpanosklerozun patogenezi tam olarak anlaşılmamakla beraber, araştırmacılar bunun orta kulakta meydana gelen non spesifik ve geri dönüşümsüz inflamasyon sonucu oluşan hastalık tablosu olduğu konusunda birleşmişlerdir. Yapılan çalışmalarda, oksidatif stresin TS patogenezisinde önemli bir rolü olduğu gösterilmiştir. Organizmada fizyolojik olaylar sırasında oksidan ve antioksidanlar arasında bir denge vardır. Endojen ve eksojen faktörlere bağlı olarak üretilen serbest oksijen radikallerini (SOR) organizmada antioksidan savunma sistemleri dengelemeye çalışır. Antioksidan savunma sisteminde her hangi bir yetersizlik, dengenin oksidanlar lehine kaymasına neden olmaktadır (Song JJ, 2007; Kazikdas KC 2006; Uneri C 2006; Gorur K). Pineal bezden salgılanan melatonin güçlü bir antioksidan ve serbest radikal temizleyicidir. Aynı zamanda monosit sitokinleri, fibroblastlar ve growth hormon yolu ile immune sistem üzerine de etkilidir (Taysi S, 2005; Ersoz N, 2009; Demirbag S, 2005; Koc O, 2009; Celebi S 2012).
Bu çalışmanın amacı; miringotomi yöntemiyle timpanoskleroz modeli geliştirilen olan ratlarda temporal kemikteki histopatolojik değişiklikleri saptamak ve bu değişiklikler üzerine antioksidan etkili melatonin ve C vitaminin etkisini araştırmaktı. Bu şekilde nisbeten sık olarak görülen bir kulak patolojisi olan timpanoskleroza dikkat çekmeyi ve eğer bu patoloji üzerinde melatonin ve C vitamininin koruyucu etkisi olduğu ispatlanırsa tam anlamıyla farmakolojik spesifik bir tedavisi olmayan bu duruma yeni bir tedavi yaklaşımı ortaya koymayı hedefledik.
Çalışma Gaziosmanpaşa Üniversitesi Tıp Fakültesi Histoloji Anabilim Dalı Laboratuarı’nda gerçekleştirildi. Çalışmaya başlamadan önce Gaziosmanpaşa Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu’nun onayı alındı (2009-HADYEK-036numaralı karar). Bu çalışma Gaziosmanpaşa Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonunun 2010/32 numaralı kararı ile desteklendi.
Çalışmada, 250-300 gr ağırlığında Wistar-Albino cinsi 24 adet sıçan kullanıldı. Deney sürecinde sıçanlar sabit ısılı bir odada (22 ± 3°C), 12 saat aydınlık 12 saat karanlık döngüsüne maruz bırakıldı.
2.1. Çalışma prosedürleri ve deney grupları
Bütün müdahaleler steril koşullar altında gerçekleştirildi. İntramüsküler olarak 30 mg/kg ketamin hidroklorür enjeksiyonu ile yapılan anestezi sonrasında otomikroskop altında aural spekulum kullanılarak bütün ratların timpanik membranlarının üst posterior kadranlarına 3-4 mm uzunluğunda her iki kulakta benzer biçimde olmak üzere miringotomi yapıldı. Ardından orta kulaklarına standart bir travma uygulandı. Hayvanlar üç gruba (grup 1, grup 2, grup 3) ayrıldı. Sekiz sıçana (grup 1) 5 mg/kg melatonin sekiz sıçana (grup 2) 75 mg/kg C vitamini ve sekiz sıçana (grup 3) %0,9 NaCl solüsyonu verildi. Bu uygulamaya 10 gün boyunca devam edildi. Melatoninin tedavi dozu literatüre göre belirlendi (Ersoz N, 2009; Hemmati AA 2008).
2.2. Biyokimyasal analiz
Biyokimyasal analiz yapmak için miringotominin yapıldığı ilk gün ve 28. gün hayvanların sakrifiye edildiği anda intrakardiyak yolla alınan kan örnekleri kullanıldı. Total antioksidan status (TAS)
TAS seviyeleri, ticari kit (Rel Assay) kullanılarak ölçüldü. Yeni otomatize edilen metod, daha stabil renk ABTS
(2,2′-azino-bis[3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]) radikal katyonun antioksidantlar tarafından karakteristik renginin açılması temeline dayanır. Kit 660 nm ölçüm yapılan kolorimetrik bir yöntemdir. Sonuçlar, mmol Trolox equivalent/L olarak ifade edildi.
2.3. Doku Toplama ve Histopatolojik Analizler
28.günde tüm hayvanlara intraperitoneal yüksek doz fentobabital (80 mg/kg) yardımıyla ötenazi uygulandı. Ratların temporal kemikleri çıkarıldı, numaralandırıldı ve orta kulak boşluğu, timpanik membran ve dış kulak kanalı olarak izole edildi. Örnekler %4 formaldehitte fikse edildi ve sonrasında 0,1 mol/l ethlenediamine tetra asetik asit (EDTA) kullanılarak dekalsifiye edildi. Doku bloklanmasını takiben 3m lik kesitler alındı. Hematoksilen-Eozin ve Masson Tricrom boyalar histopatolojik değerlendirme amaçlı kullanıldı. Orta kulaktaki lamina proprianın kalınlığı tek aşamalı okülerli Olympus BX83 ile ölçüldü. Eksuda kalınlığı lamina proprianın kalınlığına dahil edilmedi.
2.4. İstatiktiksel Analiz
Tüm istatiktiksel analizler için SPSS 15 for Windows kullanıldı. Student t veya Mann Whitney U testi, iki grup arasında sürekli değişkenleri karşılaştırmak için kullanıldı. Devamlı değişkenler ortalama (standart sapma [SD]) veya medyan (çeyrekler arası aralık [IQR]). olarak sunuldu. 0,05 ten az A P değeri istatiktiksel olarak anlamlı kabul edildi.
3. BULGULAR
TAS ortalama değerleri tüm gruplarda tedavi öncesi benzerdi. TAS ortalama değerleri melatonin ve C vitamini grubunda kontrol grubuna göre istatiksel olarak anlamlı
bulundu ama bu değerler C vitamini ve melatonin gruplarında benzer olarak bulundu (p<0,001). Minimum ve maksimum duvar kalınlıkları kontrol grubuna göre melatonin ve C vitamini gruplarında daha düşüktü ancak fark anlamlı bulunmadı. Minimum ve maksimum duvar kalınlıkları melatonin ve C vitamini gruplarında benzer bulundu.
4. TARTIŞMA
Çalışmamızda orta kulaktaki standart travmayı takiben serbest radikalleri temizleyici etkisi olduğu bilinen melatoninin timpanoskleroz üzerine olan etkilerini araştırmayı hedefledi. Bu, literatürde timpanoskleroz üzerine melatoninin etkisini araştıran bilinen ilk çalışmadır.
Serbest oksijen radikalleri aerobik koşullar altında, normal metabolizma sırasında üretilen oksijen içeren moleküllerdir. SOR (O2 • -), hidrojen peroksit (H2O2), hidroksil radikali (• OH) ve tek bir oksijen (1O2) süperoksit anyon radikallerini içerir. SOR oldukça reaktif ve geri dönüşümsüz hücre yıkımına neden olacak kapasiteye sahiptir. Antioksidan sistemler endojen SOR ürünlerinin zararlı etkilerine karşı enzimatik ve enzimatik olmayan mekanizmalar içerir (Bonnefont-Rousselot D, 2010). Enzimatik sistemi süperoksit dismutaz (SOD), katalaz (CAT) ve glutatyon peroksidaz (GSH-Px) içerir. Askorbik asit, glutatyon, β-karoten, tokoferoller ve ürik asit enzimatik olmayan savunma sistemlerine dahil edilebilir (Kiroglu AF, 2006; Koc S 2011). Serbest oksijen radikallerinin oluşumu ve sistemden atılımı oksidatif denge olarak bilinen bir denge tarafından sağlanmaktadır. Oksidatif denge korunduğu sürece SOR organizmaya zarar veremez. Eğer oksidatif denge bozulursa, SOR yükselir ve bunun sonucunda oksidatif stres oluşur (Chung DH, 2012). Bu antioksidan parametrelerin serumda ölçülmesi mümkündür. Antioksidan parametrelerinin additif etkileri mevcuttur,
bu nedenle antioksidan parametrelerin bireysel ölçümü yerine total antioksidan statusun (TAS) ölçümü antioksidan durumu değerlendirmek için daha uygun bir işlemdir (Hao W, 2012).
Timpanoskleroz tekrarlayan akut otitis media, kronik otitis media, immünolojik aşırı duyarlılık reaksiyonu, genetik yatkınlık, veya seröz otitis media tedavisinde kullanılan ventilasyon tüplerinin travmatik etkisi sonucunda ortaya çıkar. Son çalışmalarda miringotomi sonrasında miringoskleroz oluşumu araştırıldı ve timpanoskleroz ile serbest oksijen radikallerinin oluşumu arasındaki ilişkiye dikkat çekildi(Polat S, 2004). Solunan havadaki %10 luk oksijen konsantrasyonu ile % 5 oranındaki orta kulak boşluğu oksijen konsantrasyonu karşılaştırıldığı zaman orta kulaktaki oksijen konsantrasyonun düşük olduğu gözlenir. Miringotomi orta kulak boşluğundaki oksijen konsantrasyonu artırarak nisbeten hiperoksik bir duruma yol açar. Hiperoksi böylece inflamatuar süreci tetikleyerek SOR üretimini artırır (Hellstrom S, 2003; Ozcan C, 2002). SOR artışı ve antioksidan savunma mekanizmalarının düşüklüğü skleroz oluşturan fibrozis, hiyalin dejenerasyonu, ve kalsiyum ve fosfor içeren agregasyon birikimi doku hasarına neden olur. SOR temizleyicilerinin adezyon formasyonunu azaltarak inflamatuar reaksiyonların gerilemesine neden olduğu gösterilmiştir (Song JJ, 2007; Kazikdas KC 2006; Uneri C 2006; Gorur K). Bu nedenle antioksidan tedavinin timpanoskleroz oluşumunu önlediği ve reformasyonu sağladığı varsayılmıştır.
Melatonin güçlü bir antioksidan ve serbest radikal temizleyicisidir (Ersoz N, 2009). Melatoninin hem doğrudan hem de dolaylı antioksidan etkileri rapor edilmiştir. Melatonin SOD ve GSH-Px aktivitelerini indükleyici etkisi ile dolaylı bir antioksidan etkiye sahiptir (Bonnefont-Rousselot D, 2010). Buna ilaveten melatonin trombositlerin
agregasyon ve sekresyonunu, prostoglandin sentezini ve fibroblast proliferasyonunu inhibe etkisi etkisi ile sklerozu engeller (Aksakal O, 2010). Rosa ve ark. (2010) melatoninin sirotik sıçanlarda SOD ve GSH-Px gibi antioksidan enzimlerin yükseltilmesi suretiyle oksidatif stresin neden olduğu yıkım ve fibrozisi azalttığını bildirmiştir.
Miringoskleroz ve TS için tam küratif bir tedavi henüz tanımlanmadı. Çeşitli antioksidanlar tedavide kullanılmıştır ve miringosklerozu azalttıkları kanıtlanmıştır (Kazikdas KC 2006; Uneri C 2006; Gorur K). Emir ve ark. (2009) ginkgo bilobanın antioksidan ve antiinflamatuar etkisiyle miringotomi yapılan sıçanlarda miringosklerozu inhibe ettiğini bildirmişlerdir. Kazıkdaş ve ark. (2006) alfa tokoferolün miringosklerozu azalttığını biyokimyasal ve histopatolojik olarak gösterdiler.
Çalışmamızda miringotomi uygulanan ratlarda timpanoskleroz üzerinde C vitamini ve melatoninin etkisi biyokimyasal ve histopatolojik olarak değerlendirildi. Bu çalışmada TAS ortalama değerleri tedavi öncesi tüm çalışma gruplarında benzer idi. TAS ortalama değerleri melatonin ve C vitamini verilen gruplarda kontrol grubuna göre yüksek idi fakat melatonin ve C vitamini arasında anlamlı olarak fark yoktu(p<0,001). Minimum ve maksimum duvar kalınlıkları kontrol grubuna göre melatonin ve C vitamini verilen gruplarda daha düşüktü ancak fark anlamlı bulunmadı. Minimum ve maksimum duvar kalınlıkları melatonin ve C vitamini gruplarında benzer idi. 5. SONUÇ
Bu çalışma melatoninin TAS düzeyini artırarak miringotomi sonrası gelişebilecek timpanosklerozu engellemede etkisi olabileceğini göstermektedir fakat veriler istatistiksel olarak anlamlı değildir. Bizim çalışmamızda sınırlı sayıda denek kullanıldı ve melatonin sadece tek dozu uygulandı. Bu nedenle timpanosklerozu
engellemede melatoninin etkisini ortaya koyabilmek için daha fazla denekle ve farklı dozlarda melatonin kullanarak daha kapsamlı çalışmalara ihtiyaç vardır. Çalışmamız melatonin ve timpanosklerozla ilgili olarak yapılan ilk ve tek çalışma olması nedeniyle diğer çalışmalara ışık tutacağını düşünmekteyiz.
KAYNAKLAR
1. Polat S, Oztürk O, Uneri C, Yüksel M, Haklar G, Bozkurt S et al (2004) Determination of reactive oxygen species in myringotomized tympanic membranes: effect of vitamin e treatment. Laryngoscope. Apr;114(4):720-5.
2. Song CM, Park MH, Kim YH, Lee JH. Factors affecting the extrusion rate of ventilation tubes. Clin Exp Otorhinolaryngol. 2010 Jun;3(2):70-5.
3. Forséni Flodin M, Hultcrantz M (2002) Possible inflammatory mediators in tympanosclerosis development. Int J Pediatr Otorhinolaryngol 63:149-154
4. Song JJ, Kwon SK, Cho CG, Park SW (2007) The effect of caffeic acid phenethyl ester on the prevention of experimentally induced myringosclerosis. Int J Pediatr Otorhinolaryngol 71:1287-1291
5. Kazikdas KC, Uguz MZ, Erbil G et al (2006) The anti-oxidant effect of alpha-tocopherol in the prevention of experimentally induced myringosclerosis. Otol Neurotol 27:882-886
6. Uneri C, Bağlam T, Yazici M (2006) The effect of Vitamin E treatment on the development of myringosclerosis after ventilation tube insertion. Int J Pediatr Otorhinolaryngol 70:1045-1048
7. Gorur K, Ozcan C, Polat A, Unal M, Tamer L, Cinel I (2002) The anti-oxidant and anti-apoptotic activities of selenium in the prevention of myringosclerosis in rats. J Laryngol Otol 116: 426-429
8. Taysi S, Ucuncu H, Elmastas M, Aktan B, Emin Buyukokuroglu M (2005) Effect of melatonin on lipid peroxidation, glutathione and glutathione-dependent enzyme activities in experimental otitis media with effusion in guinea pigs. J Pineal Res 39:283-286
9. Ersoz N, Ozler M, Altinel O, et al (2009) Melatonin prevents peritoneal adhesions in rats. J Gastroenterol Hepatol 24:1763-1767
10. Demirbag S, Cetinkursun S, Tasdemir U et al (2005) Comparison of hyaluronate/carboxymethylcellulose membrane and melatonin for prevention of adhesion formation in a rat model. Hum Reprod 20:2021-2024
11. Koc O, Duran B, Topcuoglu A, Bugdayci G, Yilmaz F, Dönmez M (2009) Intraperitoneal administration of single dose type I collagen or low dose melatonin to prevent intraperitoneal adhesion formation: a comparative study. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 145:209-213
12. Celebi S, Gurdal MM, Ozkul MH, Yasar H, Balikci HH (2012) The effect of intratympanic vitamin C administration on cisplatin-induced ototoxicity. Eur Arch Otorhinolaryngol Aug 21. [Epub ahead of print]
13. Hemmati AA, Nazari Z, Ranjbari N, Torfi A (2008) Comparison of the preventive effect of vitamin C and E on hexavalent chromium induced pulmonary fibrosis in rat. Inflammopharmacology 16:195-197
14. Bonnefont-Rousselot D, Collin F (2010) Melatonin: action as antioxidant and potential applications in human disease and aging. Toxicology 278:55-67
15. Kiroglu AF, Noyan T, Oger M, Kara T (2006) Oxidants and antioxidants in tonsillar and adenoidal tissue in chronic adenotonsillitis and adenotonsillar hypertrophy in children. Int J Pediatr Otorhinolaryngol 70:35-38
16. Koc S, Aksoy N, Bilinc H, Duygu F, Uysal IÖ, Ekinci A (2011) Paraoxonase and arylesterase activity and total oxidative/anti-oxidative status in patients with chronic adenotonsillitis. Int J Pediatr Otorhinolaryngol 75:1364-1367
17. Chung DH, Lee KH, Kim SW, Shin SY, Cho JS (2012) Comparison of pre- and post-operative stress levels in patients with allergic rhinitis and non-allergic rhinitis. Eur Arch Otorhinolaryngol 269:2355-2359
18. Hao W, Zhu Y, Meng L, Ni C, Yang J, Zhou H (2012) Serum paraoxonase, arylesterase activity, and oxidative status in patients with nasal polyp. Eur Arch Otorhinolaryngol Dec 13. [Epub ahead of print]
19. Hellstrom S, Spratley J, Eriksson PO, Pais-Clemente M (2003) Tympanic membrane vessel revisited: a study in an animal model. Otol Neurotol 24:494-499 20. Ozcan C, Polat G, Görür K, Talas DU, Bağdatoğlu O, Cinel I (2002) The effect of local administration of N-acetylcysteine in perforated rat tympanic membrane: an experimental study in myringosclerosis. Pharmacol Res 45:5-9
21. Aksakal O, Yilmaz B, Gungor T et al (2010) A randomised controlled trial on melatonin and rosiglitazone for prevention of adhesion formation in a rat uterine horn model. Arch Gynecol Obstet 282:55-61
22. Rosa DP, Bona S, Simonetto D, Zettler C, Marroni CA, Marroni NP (2010) Melatonin protects the liver and erythrocytes against oxidative stress in cirrhotic rats. Arq Gastroenterol 47:72-78
23. Emir H, Kaptan ZK, Samim E, Sungu N, Ceylan K, Ustun H (2009) The preventive effect of ginkgo biloba extract in myringosclerosis: study in rats. Otolaryngol Head Neck Surg 140:171-176
24. Karlidağ T, Ilhan N, Kaygusuz I, Keleş E, Yalçin S (2004) Comparison of free radicals and antioxidant enzymes in chronic otitis media with and without tympanosclerosis. Laryngoscope 114:85-89
