Cumhuriyet Üniversitesi
Tıp Fakültesi
Sivas İl Merkezinde 2(2 Gönüllüde Psödokolinesteraz Aktivitesi Ve Genetik
Var-yantları Araştırması
Pseudocholinesterase Activith and Genetic Variants At 202 Volunteers in Sivas
GülcanKAYA*, Ahmet AKEF *, Atilla ATALAY **
ÖZET
Türk toplumunda kolinesteraz varyantlarının sıklığının a-raştırılmasında bir katkı amacıyla, 18-50 yaşlan arasında 202 normal gönüllüden kan örnekleri toplandı ve psödokolinesteraz aktiviteleri ve genetik varyantları çalışıldı. Genetik varyantları tanımlamak için benzoilkolin klorür substrat olarak kullanılıp kolinesteraz aktivitesi ölçülürken, dibukain-HCI ve sodyum florür inhibitör olarak kullanılıp dibukain ve florür numaraları, Kalow ve Lindsay yöntemi ile tayin edildi. Böylece genetik varyantlar tanımlandı.
Dibukain rezistan varyantı dışında heterozigot varyant gö-rülmedi. Bu varyantın (EıuEıa) sıklığı %3.47 olarak ve gen
fre-kansı ise 0.017 olarak hesaplandı.
Anahtar Sözcükler: Psödokolinesteraz, genetik varyant,
enzim
SUMMARY
We aimed to investigate the freguency of cholinesterase variants in Turkish population and blood samples were collected
from normal volunteers (n=202), betvveen 18 years old and 50
years old and pseudocholinesterase activities were investigated using benzoylcholine chl oride as a substrat e. in order t o
defined the genetic variants, dibucaine and fluoride numbers of serum cholinesterase were determined by the method of Kalovv
and Lindsay using benzoylcholine chloride as a substrate and dibucaine-HCI and sodium fluoride as inhibitors.
There w ere no heterozygous vari ant observed except
the dibucaine resistant variant. The freguency of this variant (EıuEıa) was estim ated to be 3.47 per cent of the population
and frequency of the gen was 0.017.
Key Words: Pseudocholinesterase, genetic variant,
enzyme
C. Ü. Tıp Fakültesi Dergisi 22 (2): 93 - 97, 2000 GİRİŞ VE AMAÇ
Serum kolinesteraz aktivitesinin tayini, biyokim-yada birçok alanda yararlı olmakla birlikte (1-4), gü-nümüzde bu enzim aktivitesinin tayininin temel amacı, anestezide yaygın olarak kullanılan ve kısa etkili kas gevşeticisi olan suksametonyum'un (suksinildikolin, skolin) yol açtığı uzamış apne periyodu riski taşıyan bireylerin belirlenmesidir (5-9).
Serum kolinesteraz aktivitesi üremi, şok, anemi, tüberküloz, kanser, malnutrisyon, kaşeksi, kronik kara-ciğer hastalıkları, organik fosforlu insektisitlerle olan zehirlenmelerde ve hamilelikte düşüktür (6-9). Normal
Uzm.Dr. Afyon Devlet Hastanesi Biyokimya Laboratuvarı, AFYON Prof.Dr. C.Ü. Tıp Fak. Biyokimya Anabilim Dalı, SİVAS
Sivas İl Merkezinde 202 Gönüllüde Psödükolinesteraz Aktivitesi Ve Genetik Varyantları Araştırması
koşullarda enzimin normal (usual) formu ile 3-4 daki-kada gerçekleşebilen suksametonyum hidrolizi, bu tür hastalıklar nedeni ile düşük aktiviteye sahip bireyler ve genetik olarak enzimin atipik şeklini taşıyan kişilerde yavaşlar ya da hiç gerçekleşmez. Dolayısıyla bu birey-lerde 3-4 saate ulaşabilen apne periyodları gelişir (10-15). Bu durum, hastayı riske sokar ve özel aletlerle müdaheleyi gerektirir (15). Böyle kişilerin önceden tesbit edilerek, suksametonyum uygulanmaması çok önemlidir. Ayrıca, diğer aile bireylerinin de taranarak, duyarlı kişilerin saptanması gerekmektedir. Günümüz-de, gelişmiş toplumlar, enzimin atipik şekillerini taşıyan kişilere verilen özel kartlar ile anestezistleri bu duruma karşı uyarmaktadırlar (16-17).
1960'lı yıllardan başlayarak gerek ülkemizde ge-rekse değişik ülkelerde yöresel yada toplumsal olarak psödokolinesteraz varyantları üzerine çalışmalar yapıl-mıştır. (18-20) Her ne kadar son yıllarda (son 10 yılda) yeni ve modern kas gevşeticilerin kullanıma sunulma-sıyla süksinülkolin'in anestezide kullanımı ve değeri azalmıştır. Ama gerek ülkemiz koşullarında süksinilkolin kullanımının halen devam etmesi gerekse kolinesteraz varyant analizinin toplumsal katmanların belirlenme-sinde bir parametre olarak değerlendirilebilmesi açısın-dan halen gündemdedir ve bu konuda çalışmalar bu-gün de süregelmektedir.
GEREÇ VE YÖNTEM
Bu çalışmada, yaşlan 18 ile 50 arasında değişen her iki cinse ait 202 (102 kadın ve 100 erkek) kan örneği kullanıldı. Denekler seçilirken, enzim aktivitesini değiştirecek bir ilaç kullanıyor olmamasına, enzim aktivitesini etkileyecek bir harabiyet olmamasına, kadın deneklerin oral kontraseptif kullanıyor olmamalarına ve hamile olmamalarına dikkat edildi. Deneklere bu doğ-rultuda bir anket formu uygulandı.
Alınan kan örnekleri 2000 g'de, Heraus Minifuge 2 soğutmalı santrifüjünde 30 dakika santrifüj edildikten sonra, ayrılan serumlar cam tüplere alındı. Ölçümlerin çoğu taze serumla yapıldı. Hemen çalışılamayan se-rumlar, çalışma anına kadar derin dondurucuda, -25 °C'de saklandı. Atipik enzime ait sonuçlar ya da şüpheli sonuçlarda testler, en az iki kez yinelendi.
Pseudokolinesteraz aktiviteleri spektrofotometıi Kalovv ve Lindsay yöntemi ile saptandı (9). Bu yön-temde, substrat olarak benzoilkolinklorür kullanılarak, azalan substrat miktarı 240 nm'de izlenip dakikadaki enzim aktivite hızı |jmol/dak olarak saptanmaktadır, Benzoilkolin 235 nm'de absorbsiyon piki göstermesine karşın serum da aynı dalga boyunda absorbsiyon gös-terdiğinden, interferasyonu önlemek için okumalar 24( nm'de yapılmaktadır. Genetik varyantları saptamak için normal deney ortamına dibucain-HCI ve sodyum florür ayrı ayrı eklenerek % inhibisyon değerleri bulunmakta-dır.
AA/dak 200 1000
Enzim Aktivitesi (kU/L) = --- x --- x --- =AA/dak. x 30.33
1 0 00
Normal değerler: 25°C'de 0.6-1.4 kU/L
l ü n i t e e n z i m , d a k i k a d a l u m o l benzoilkolinklorürü hidroliz olan enzim aktivitesi olarak tanımlanmaktadır.
Dibukain ve florür sayılarının saptanması için aynı deney ortamına ayrı ayrı l mi dibukain HCI veya sod-1 yum florür çözeltisi eklendi ve aynı şekilde okundu, Lehman ve Liddell'in Tablo l'deki değerleri referans alınarak genetik varyantlar bulundu (10).
AA/dak.inhibitörlü Dibukain / Florür sayısı (%) = l- --- x 100
AA/dak. inhibitörsüz
Sonuçların değerlendirilmesinde, normal ve atipik genetik varyantlar için ortalama değerler ve standart sapmalar hesaplandı. Genetik varyantlar toplum içinde %1 olarak değerlendirildi. Atipik gen frekansı, ko-dominant genetik sistemlerde kullanılan formül ile saptandı (11).
BULGULAR
Bu çalışmada, Sivas il merkezinde yaşayan birey-ler arasından seçilen, yaşları 18-50 arasında değişen 102 kadın ve 100 erkek, toplam 202 deneğin serum kolinesteraz aktiviteleri ölçüldü. Bütün serumların dibukain ve florür sayıları saptandı. Lehman ve Liddell'in Tablo l'deki değerleri referans alınarak ge-netik varyantları belirlendi (10). Deneklerin serum
94
20
Kaya ve Ark.
kolinesteraz aktivitesi ile dibukain ve florür sayılarının
ortalama ve standart sapma değerleri Tablo 2'de
su-nulmu
ştur.
Tablo l : Psödokolinesteraz varyantlarının dibukain ve florür num araları (10) Di b u kain
Florür
GENOTÎP
N u ma ra sı
Numarası
HOMOZİGOT
EıV
77-83
57-68
Eıa E!a
15-25
20-25
E/E/
64-67
34-35
Tablo 3. EıuEıa varyantları ihtiva eden kişilerin enzim aktiviteleri
ve inhibisyon num araları
Aktivite (kU/L)
Dibukain numarası
Florür numarası
0.9090
67
53
0.8787
66
47
0.6363
55
55
0.6810
65
55
0.5454
65
52
0.8787
62
53
1.0450
68
54
HETEROZİGOT Eı"E/ 52-59 71-78 77-83 42-55 50-55 57-68
Araştırmamızda 7 kişide atipik heterozigot (EıaEıu) varyantına rastlandı ve bu total olarak
sapta-nan sayının %3.47'si olup, atipik gen frekansı 0.017'dir.
E,'E/
47-53
31-39
r aç s
EiEı
15-25
20-25
Efe
64-67
34-35
Tablo 2: EıuEıu ve EıuEıa varyantları bulunan numune
serumla-rındaki enzim aktiviteleri ve inhibisyon numaralarının değerleri
EluElu Numune numarası 195
Ortalama aktivite (±SD) kU/L 1.000±0.027 0.796±0.07 Dibukain numarası (±SD) 82.1±0.2 64.0±1.66 Florür numarası (±SD) 64.4±0.3 52.9±1.1
Homozigot Eı"Eıu olan serumların ortalama
aktiviteleri 1.000±0.027 kU/L, dibukain sayıları 82.1±0.2 ve florür sayıları 64.4±0.3 olarak saptandı. Heterozigot EıuEıa olan serumların ortalama aktiviteleri
0.796±0.07 kU/L, dibukain sayıları 64.0±1.66 kU/L ve florür sayıları 52.9±l.l'dir. Araştırmamızda EıuEıu
dışında tek varyant EıuEıa
idi. Bu atipik varyanta sahip bireylerin serum ChE aktiviteleri ve dibukain ile florür sayıları Tablo 3'de gösterilmiştir.
TARTIŞMA VE SONUÇ
Bu çalışmada, Sivas il merkezinde oturan 202 ki-şilik bir grup, ChE polimorfizmi yönünden incelenmiştir. Böylece, ChE varyantlarının Türk toplumundaki sıklığı ile ilgili bulgulara küçük bir katkı olması düşünülmüş-tür. İncelememiz sırasında, normal inhibisyon değerleri gösteren ancak ChE aktivitesi düşük olan 6 kişi sap-tanmıştır. Düşük aktivitenin, bu kişilerin hastanemize başvurma nedeni olan primer hastalıklarından kaynak-landığı düşünülmektedir. Bu hastaların yakın aile çev-relerinin taranması olanağı bulunmadığından hangi gen heterozigotları olduğu söylenememektedir.
Psödokolinesterazın diğer ender varyantlarına rastlanmamıştır. Bu, çalışma grubumuza dahil edilen bireylerin sayısının az olmasına bağlanabilir. Çok ender rastlanan genler olduklarından, çok daha fazla sayıda kişi içeren bir grupta yapılacak bir çalışma, nadir psödokolinesteraz varyantları hakkında daha detaylı bilgiler edinmemize yardımcı olacaktır. Ayrıca çalışma-mızda kullanılan dibukain ve sodyum florür gibi inhibitörlerin yanına başka inhibitörler de ilave edilerek daha kesin sonuçlar elde edilebilir.
Çalışmamızda daha çok C.Ü. Hastanesi ve C.Ü. Mediko Sosyal Merkezi'ne başvuran kişiler kapsanıldığı için Sivas İline ya da Türk toplumuna yönelik bir ge-nelleme yapılamamaktıdır. Bununla birlikte çalışmamız
9
5
EluElaSivas İl Merkezinde 202 Gönüllüde Psödokolinesteraz Aktivitesi Ve Genetik Varyantları Araştırması
Türkiye'deki psödokolinesteraz varyantları hakkında bir örnek oluşturmaktadır.
Çalışmamızda, atipik psödokolinesteraz varyantları ile ilgili olarak bulunan %3.47'lik heterozigotluk oranı, daha önce çeşitli beyaz ırk toplumları için rapor edilenlerle uyumludur (21,22). Türkiye'de İ.Sayek, A.M. Karahasanoğlu ve P.Özand, 1967'de 725 kişilik bir grupta yaptıkları bir araştırmada, atipik varyant heterozigotluk yüzdesini %5.9 olarak bulmuşlardır (18).
Psödokolinesteraz polimorfizmi ile ilgili olarak de-ğişik toplumlarda yapılan çalışmalar ilginç bir durumu açığa çıkarmıştır. Anormal varyantlar arasında en sık olarak "atipik varyanta" rastlanmıştır ve Eıa
alleli, en sık olarak beyaz ırkta bulunmaktadır. Atipiklik oran, diğer bütün ırklarda düşüktür (23). Ayrıca, tüm psödokolinesteraz varyantları, zenci ırkta çok enderdir (24,25).
Psödokolinesteraz varyantlarının ?:'iksametonyum duyarlılığı gösterenlerin önceden saptanması zordur. Atipik enzim bakımından homozigot (EıaEıa
) bireylerin, süskametonyuma son derece duyarlı oldukları bilin-mektedir. Bu bireylerdeki apne periyodu 2-4 saati aşmaktadır EısEıs homozigotları, daha yüksek derecede
duyarlılık gösterirler. E/Eıf varyantlarının ise orta
dere-cede duyarlı oldukları saptanmıştır. Bu bireylerdeki apne periyodu 20-40 dakika dolayında sürmektedir (5,26).
Genotipi normal ancak, daha önce sözü edilen hastalıklar nedeni ile kolinesteraz aktiviteleri düşük olan bireylerde, süksamentonyum duyarlılığı nedeniyle oluşan apnenin süresinin 12 dakikayı aşmadığı göste-rilmiştir (25).
Özetlersek, cerrahi operasyon sırasında süksametonyum duyarlılığı nedeniyle uzamış apne periyodları geçiren hastaların, genetik psödokolinesteraz varyantları yönünden araştırılması gerekmektedir. Bu işlem, yakın aile çevresine de uy-gulanmalı ve pozitif sonuca sahip olanlar bir daha süksemetonyum almamaları yönünden uyarılmalıdır.
Hastanelerin çoğunda, maliyet yüksekliği, yer darlığı ya da az sayıda olgu başvurusu nedeniyle bu tür hizmetler verilmemektedir. Yine bu nedenlerle cerrahi
işlemleri sırasında süksametonyum alacak tüm hastan rın taranması konusu da tartışmalıdır (26).
Araştırmamızda saptanıldığı üzere (kendi çalış-» mamız + literatür verileri), ülkemizde del psödokolinesteraz varyantlarından "atipik" olanın,! ender olmadığı görülmüştür (18-22,27-29). Dolayısıyla,! psödokolinesteraz konusunda bilgi ve eğitim amacıyla! birtakım düzenlemelerin ülkemizde de yapılmasının l yararlı olacağı kanısındayız. Çünkü, kendilerinde psökolinesteraz varyantlarından birinin bulunduğu saptanan kişilerin eğitilip bilinçlendirilmeleri ve by kişilere ya da ailelerine, bu durumları ile ilgili olarak bir kart ya da bilezik verilmesi yaşamsal önem taşımakta-1 dır.
KAYNAKLAR
1. De La Huerga J, Yenisicik C, Popper H. Colorimetric
method for the determination of serum cholinesterase, Am J Cün Pathol 22: 112-3, 1952.
2. Lepage L, Schiele F, Gueguen R, Sieat G. Total cholinesterase in plasma: biological variations and
reference limits. Clin Chem 31: 546-50, 1985.
3. Dietz AA, Rubinstein HM, Lubrano T. Colorimetric determination of serum cholinesterase and its genetic
variants by the propionylthio-choline-diothiobis
(nitrobenzoik acid) procedure. Clin Chem 19 : 1309-13, 1973.
4. Venkataraman BV, Naga Rani MA, Andrade C, Thangam J.
Improved Colorimetric method for cholinesterase activity. Indian J Physiol Pharmacol 37: 82-4, 1993.
5. Lubin AH, Owen GM. Apnea in an atypical-fluoride resistant (Eıa
E/) heterozygote for serum cholinesterase.
Anesthesiology 39: 346-8, 1973.
6. Oropollo AT. Abronmal pseudocholinesterase levels in a surgical population. Anaesthesiology 48: 284-6, 1978.
7. Garry PJ. Serum cholinesterase variants: examination of
several differential inhibitors, salts and buffers used to
measure enzyme activity. Clin Chem 17: 183-91, 1971.
8. Milligan KR, Hayes TC, Huss BKD, Beattie B. Atypical plasma cholinesterase. Anaesthesia 41: 841-3, 1986.
9. Kalovv W, Lindsay HA. Determination of cholinesterase.
lesterase r J C l i n . ". Plasma ı|e-region ıning for jtom ated 159-162, test for 32: 281-22. Grunbaum BV of gene frequ 22 human blc Forensic Sci 2 23. Brock A, Br variation in h vveight, sex, t Environ Conta 24. Steegmüller \ pseudocholine 1975. 25. Garda LH, Dic
