Scytalidium thermophilum
’dan Ksilanaz Üretiminin Đstatistiksel
Optimizasyonu, Enzimin Biyokimyasal Karakterizasyonu ve Atık
Biyokütleden Ksilooligosakkarit Üretim Potansiyelinin Taranması
Didem SUTAY KOCABAŞa, Neslihan ÖZBENb
aKaramanoğlu Mehmetbey Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü, 70100 Karaman a
Karamanoğlu Mehmetbey Üniversitesi Kamil Özdağ Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü, 70100 Karaman *Yazışma yapılacak yazar : Didem SUTAY KOCABAŞ, Karamanoğlu Mehmetbey Üniversitesi
Mühendislik Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü, 70100 Karaman, didemkocabas@kmu.edu.tr
ÖZET— Bu çalışmada, Scytalidium thermophilum’dan ksilanaz üretim koşulları Box-Behnken deney tasarım yöntemi kullanılarak Tepki Yüzey Metodolojisiyle istatistiksel olarak optimize edilmiştir. Çalışmada tarımsal bir atık olan mısır koçanları fermantasyon ortamında karbon kaynağı olarak kullanılmıştır. Optimum koşullarda gerçekleştirilen fermantasyon sonucunda başlangıç enzim aktivitesinin iki katı seviyesinde aktiviteye ulaşılmıştır. Ksilanaz aktivitesi ve dayanımına pH etkisi incelendiğinde, en yüksek aktivite pH 7-7,5 aralığında elde edilmiş ve enzim pH 7’de 4 saat inkübe edildiğinde aktivitesinin %70’ini korumuştur. Ksilanaz aktivitesi ve dayanımına sıcaklığın etkisi incelenmiş ve en yüksek aktivite 70ºC sıcaklıkta tespit edilirken, enzim 50°C sıcaklıkta 1 saat inkübasyon sonucunda aktivitesinin %75’ini korumuştur. Ham enzimin Km ve Vmax değerleri sırasıyla 1,93 mg/mL ve 347,1 IU/mL olarak tespit edilmiştir. Enzimin denenen farklı lignoselülozik atık biyokütle kaynaklarından ağırlıklı olarak ksiloz ve ksilobiyoz üretebildiği belirlenmiştir. Şeker pancarı küspesi ve buğday kepeğinden sadece ksiobiyoz açığa çıkarması, enzimin ksilooligosakkarit üretimi için avantajlı olduğunu göstermiştir.
Anahtar Kelimeler: Scytalidium thermophilum, ksilanaz, tepki yüzey metodolojisi, biyokimyasal karakterizasyon, ksilooligosakkarit
1. GĐRĐŞ
Bitki hücre duvarında bulunan ksilan, dünya üzerindeki yenilenebilir organik karbonun üçte-birini oluşturmaktadır [1]. Ksilan, hücre duvarının temel yapısal polisakkaritidir ve ksilanazın ana substratır. Ksilanazlar (EC 3.2.1.x), ksilan molekülünün hidrolizinden (depolimerizasyonundan) sorumlu olan enzim grubudur [2]. Ksilanın karmaşık ve yüksek derecede dallanmış heteropolimerik yapısını kırmak için ksilanazlar, polisakkaritlerin hidrolizinde görev alan diğer enzimlerle birlikte çalışır. Bu sinerjik etki “ksilanolitik enzim sistemi” olarak adlandırılır. Bu sistemin ama enzimleri endo-1,4-β-ksilanaz ve β-ksilosidazdır [2,3]
Ksilanazlar birçok mikroorganizma tarafından üretilir ancak temel üretim kaynakları bakteri ve küflerdir [1]. Ksilanazlar, kağıt, gıda, ilaç gibi endüstriyel alanlarda ve lignoselülozik biyokütlenin şeker, etanol ve katma değerli ürünlere dönüştürülmesinde kullanılmaktadır. Ksilooligosakkaritler de bu katma değerli ürünlerden biridir. Ksilooligosakkaritler ksiloz monomerlerinden oluşan şeker oligomerleridir. Sindirilemeyen gıda bileşenleridir ve prebiyotik etkiye sahiptirler [4]. Ksilooligosakkaritler ksilan içeren lignoselülozik maddelerden kimyasal veya enzimatik yollarda üretilirler [5].
Bu noktalardan hareketle, çalışma kapsamında termofilik bir küf olan S. thermophilum’dan ksilanaz üretimi istatistiksel olarak optimize edilmiş, enzim karakterize edilmiş ve tarımsal atık olan lignoselülozik biyokütleden ksilooligosakkarit üretim potansiyeli araştırılmıştır.
2. DENEYSEL ÇALIŞMALAR
Scytalidium thermophilum’dan ksilanaz üretim koşulları, Box-Behnken deney tasarım yöntemi ile
beş bağımsız değişken; aşı miktarı, sıcaklık, pH, karbon ve azot kaynağı konsantrasyonu için Tepki Yüzey Metodolojisiyle istatistiksel olarak optimize edilmiştir. Veriler Minitab programı ile analiz edilmiştir.
Enzimin ksilooligosakkarit üretim potansiyelinin incelenmesi için yedi farklı lignoselülozik atıktan; iki tip mısır koçanı, pamuk sapı, ayçiçek sapı, şeker pancarı küspesi, buğday kepeği ve ayçekirdeği kabuğundan alkali özütleme yöntemiyle hemiselüloz fraksiyonu (ksilan içeren kısım) ayrılmıştır. Elde edilen ksilan tiplerinin enzim ile degredasyonu gerçekleştirilerek, oluşan ürünler (ksilooligosakkaritler) ince tabaka kromatografisi (TLC) ile incelenmiştir.
3. SONUÇLAR VE TARTIŞMA
Optimizasyon çalışmalarında, çalışılan aralıkta en uygun fermantasyon koşulu 1 ml aşı miktarı, 50˚C sıcaklık, 7,0 pH, 20 g/L mısır koçanı ve 5 g/L maya özütü olarak belirlenmiştir. Optimum koşullarda gerçekleştirilen fermantasyon sonucunda 134,09 IU/mL ksilanaz aktivitesi tespit edilmiştir. Bu sonucun, geliştirilen model eşitliğinden hesaplanan 133,91 IU/mL değeriyle uyumlu olduğu belirlenmiştir. En yüksek ksilanaz aktivitesi pH 7-7,5 aralığında70ºC sıcaklıkta gözlemlenmiştir. Ham enzimin Km ve Vmaxdeğerleri sırasıyla 1,93 mg/mL ve 347,1 IU/mL olarak tespit edilmiştir. Enzimin 70ºC sıcaklıkta en yüksek aktiviteyi göstermesi, kağıt endüstrisindeki gibi yüksek sıcaklık uygulamaları için uygun olabileceğini göstermiştir. Ayrıca, enzim üretim ortamında yenilenebilir atık bir kaynak olan mısır koçanlarının değerlendirilmesi de üretimin sürdürülebilirliğine katkı ve atık bir yan-ürüne katma değer sağlayabilecektir.
Enzimin, denenen farklı lignoselülozik atık biyokütle kaynaklarından ağırlıklı olarak ksiloz ve ksilobiyoz üretebildiği belirlenmiştir. Ayçiçek sapı ve ayçekirdeği kabuğu ile gerçekleştirilen tepkimeler sonucunda ksilozun yanında yüksek karbon içerikli ksilooligosakkaritlerin de varlığı tespit edilmiştir. Şeker pancarı küspesi ve buğday kepeğinden sadece ksilobiyoz açığa çıkarması, enzimin belirtilen kaynaklardan ksilooligosakkarit üretimi için avantajlı olduğunu göstermiştir. KAYNAKLAR
[1] R.A. Prade, Xylanases: from biology to biotechnology, Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 13 (1996) 101-132. [2] T. Collins, C. Gerday, G. Feller, Xylanases, xylanase families and extremophilic xylanases, FEMS Microbiol. Rev. 29 (2005) 3–23.
[3] M.L.T.M. Polizeli, A.C.S. Rizzatti, R. Monti, H.F. Terenzi, J.A. Jorge, D.S. Amorim, Xylanases from fungi: properties and industrial applications, Appl. Microbiol. Biotechnol. 67 (2005) 577-591.
[4] D. Chapla, P. Pandit, A. Shah, Production of xylooligosaccharides from corncob xylan by fungal xylanase and their utilization by probiotics, Biores. Tech., 115 (2012) 215–221.
[5] A.A. Aachary, S.G. Prapulla, Xylooligosaccharides (XOS) as an emerging prebiotic: microbial synthesis, utilization, structural characterization, bioactive properties, and applications, Comp. Rev. Food Sci. F., 10 (2011) 2– 16.
TEŞEKKÜR
