G‹R‹fi
Bordetella bronchiseptica, bo¤maca hastal›¤›n›n etkeni olan Bordetella pertussis ile büyük benzer-lik gösteren ancak daha çok evcil ve vahfli me-meli hayvanlar ile seyrek olarak insanlarda ve özellikle immun yetmezli¤i olanlarda solunum yolu enfeksiyonlar› oluflturan bir bakteridir. B. pertussis’in nazl› ve zor üreyen bir bakteri
ol-mas›na karfl›n, B. bronchiseptica kültür ortam›nda kolay ve h›zl› üreme özelli¤ine sahiptir (1,2). Bununla beraber, B. bronchiseptica pertussis tok-sin (PT) d›fl›nda, B. pertussis ile benzer virulans faktörlerine sahip olup bu faktörler bafll›ca ade-nilat siklaz hemolizin (AC-Hly), dermonekrotik toksin (DNT), filamentöz hemaglutinin (FHA), pertaktin, fimbriyalar ve d›fl membran porin pro-teinleridir (2). Adenilat siklaz-hemolizin (AC-Hly), hemolitik ve sitotoksik aktiviteye sahip, ökaryotik hücrelerde kalmodulin ile aktive olarak
De¤iflik Bordetella bronchiseptica Sufllar›nda Virulans
Faktörleri ve ‹mmünojenik Özellikler
(*) Refik Saydam H›fz›ss›hha Merkezi, Afl›-Serum Üretim ve Araflt›rma Bölümü, Ankara (**) Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dal›, Ankara
‹letiflim:Erkan Özcengiz
e-posta: erozcengiz@yahoo.com
Özlem BÜYÜKTANIR (*), Mehmet AKAN (**), Erkan ÖZCENG‹Z (*)
ÖZET
De¤iflik Bordetella bronchiseptica sufllar›nda virulans faktörleri ve baz› antijenlerin sentezlenme durumlar› ile sufllar›n im-münolojik özelliklerinin araflt›r›ld›¤› bu çal›flmada, patojenitede önemli derecede rolleri olan filamentöz hemaglütinin (FHA), adenilat siklaz hemolizin (AC-Hly), pertaktin, fimbriya (FimD), 36 kDa protein ve fimbriya komponentlerinin B. bronchisep-tica sufllar›nda de¤iflik oranlarda sentezlendi¤i gözlenmifltir. Adenilat siklaz-hemolizin sentezinin sufllar›n›n tamam›nda yük-sek de¤erlerde (9.2-17.8 AC ünitesi) görülmesi ve üremenin erken döneminde bafllamas›, bu komponentin B. bronchiseptica sufllar›n›n farelerde görülen güçlü letal etkisi ile birinci derecede ilgili oldu¤unu göstermifltir. De¤iflik B. bronchiseptica sufl-lar›na ait tam hücre afl›lar› ile ba¤›fl›klanan farelerde yüksek titrede ve çapraz reaksiyon veren aglutinin düzeyi olufltu¤u gö-rülmüfltür. Bununla uyumlu olarak, ba¤›fl›k farelerin peritoniçi patojen bakteri uygulamas›na karfl› iyi düzeyde (%80-100) ko-rundu¤u gözlenmifltir. Bununla beraber, genel olarak B. bronchiseptica sufllar› aras›nda koruyucu ba¤›fl›k yan›t oluflturma yönünden yeterli bir çapraz reaksiyon görülmesine karfl›n, sufllar aras›nda önemli derecede antijenik farkl›l›klar bulundu¤u belirlenmifltir.
Anahtar kelimeler:Bordetella, virulans, immünojenite SUMMARY
Virulence Factors and Immunogenicity of Different Bordetella bronchiseptica Strains
Virulence factors of Bordetella bronchiseptica strains, sythesis level of some of the antigens and immunogenicity of the stra-ins were investigated. filamentous hemagglutinin (FHA), adenylate cyclase hemolysin (AC-Hly), pertactin, fimbria (FimD), 36 kDa protein and fimbriae components that have major roles in pathogenicity were observed to be sythesized in different quantities by B. bronchiseptica strains. Early initiated and high level AC-Hly (9.2-17.8) secretion of the strains showed the first level relationship of AC-Hly synthesis with the strong letality of B. bronchiseptica strains. Besides, high level protection (80-100%) in mice against bacterial challenge was determined in parallel with the high and cross-reacted agglutinin level of the same mice immunized with whole-cell vaccines of the strains. Generally, major antigenic differences among the clinical isolates and strains were observed despite the minimum cross-reaction adequate for protection.
hücre içi siklik AMP (cAMP)’nin artmas›n› sa¤-layan bir proteindir (3, 4). FHA, fimbriya ve pertaktin komponentleri bakterinin solunum yolu epiteline ba¤lanmas›n› ve kolonize olmas›n› sa¤-layan faktörlerdir. Bunlar›n yan›nda 40 kDa mo-lekül a¤›rl›¤›na sahip ve Fim D olarak adland›-r›lan minör fimbriyal alt birim ve virulans ile il-gili d›fl membran proteinlerinin de bulundu¤u gösterilmifltir (5-8).
Bu çal›flmada, de¤iflik orijinli B. bronchiseptica sufllar›nda yukar›da belirtilen virulans faktörleri ve baz› antijenlerin sentezlenme durumlar› ile sufllar›n immünolojik ve antijenik özellikleri arafl-t›r›ld›.
MATERYAL VE YÖNTEM
Bakteri Sufllar›. Bu çal›flmada, B. bronchiseptica F415 köpek suflu Dr. Tony Hurt, Liverpool Üni-versitesi ‹ngiltere'den, B. bronchiseptica 219 kö-pek suflu ve B. bronchiseptica 3036 kobay suflu Goetheborg Üniversitesi Kültür Kolleksiyonu ‹s-veç'ten, 4617 ATCC suflu Refik Saydam H›fz›s-s›hha Merkezi Kültür Kolleksiyonu Laboratuva-r›'ndan, CA, ÜK2, ÜK3, ÜK4, ÜK6, ÜK7, ÜK8, ÜK11, ÜK14, B51 ve B63 izolatlar› Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dal›'ndan temin edilmifltir. Sufllar bi-yokimyasal ve antijenik olarak yeniden tan›mlan-d›ktan sonra (9), modifiye Cohen-Wheeler kat› besiyerinde (10) üretilmifl ve SIV1 besiyeri ile süspanse edilerek, stok kültür olarak % 50 gli-serol içerisinde -80°C'de saklanm›flt›r. B. pertussis Saadet, Nursel ve Tohama sufllar› Refik Saydam H›fz›ss›hha Merkezi, Afl›-Serum Üretim ve Araflt›rma Bölümü'nden temin edilmifl-tir.
Deney Hayvanlar›. Ba¤›fl›klama çal›flmalar›nda kullan›lan Swiss-albino fareler ve kobaylar Refik Saydam H›fz›ss›hha Merkezi, Afl›-Serum Üretim ve Araflt›rma Bölümü, Deney Hayvanlar› Üretim Laboratuvar›'ndan temin edilmifltir.
Kültür. B. bronchiseptica sufllar›na ait kültürler, kat› Bordet-Gengou ve modifiye Cohen-Wheeler
besiyerleri ile S›v› Modifiye Morse-Bray, Stai-ner-Scholte ve CL (betacyc1o-dextrin) besiyerle-rinde 37°C’de yap›lm›flt›r (10-14).
Hemaglutinasyon (HA) aktivitesi tayini. CL be-siyeri s›v› küItürleri 12 000 rpm'de 30 dakika +4°C'de santrifüj edilmifl ve süpernatant örnekle-ri U tabanl› mikropleytde ilk çukura 50 μl ko-nularak PBS ile seri dilusyonlar› yap›lm›flt›r. Üzerine, PBS ile 3 defa y›kanan kanatl› eritro-sitlerinin % 0,5'lik süspansiyonundan 50 μl ila-ve edilmifltir. Oda s›cakl›¤›nda bir saat bekle-tildikten sonra en son hemaglutinasyon görülen çukur HA titresi olarak kaydedilmifltir. Hemag-lutinasyon pozitifli¤i kültürdeki filamentöz Wz hemaglutinin (FHA) varl›¤›n› göstermifltir (15). Hemolitik aktivite (AC-Hly) tayini. Bakteri ade-nilat siklaz-hemolizin (AC-Hly)'e ait hemolitik aktivite, Rogel ve ark.(16) yöntemi ile tayin edilmifltir. Testte koyun eritrositlerinin TBS tam-ponu (0,145 M NaCl, 0,005 M dekstroz, 0,002 M CaCl2 ve 0,01 M Tris, pH:7,4) ile haz›rla-nan % 1'lik çözeltisi kullan›lm›flt›r. Bakteri s›v› kültürü 12 000 rpm'de 30 dakika +4°C'de san-trifüj edilmifl ve 1ml süpernatant üzerine eflit ha-cimde koyun eritrositleri ilave edilerek kar›flt›r›l-m›flt›r. Kar›fl›m, 37°C'de 18 saat bekletildikten sonra 3000 rpm'de 5 dakika santrifüj edilerek eritrositler çöktürülmüfltür. Örnek süpernatant›n 541nm'de absorbans de¤erinin negatif kontrol de-¤erine oran› AC ünitesi olarak kaydedilmifltir. Testte pozitif kontrol olarak distile su, negatif kontrol olarak da CL besiyeri kullan›lm›flt›r. Sufllar›n Elektroforetik Analizi. Çal›flmada kulla-n›lan sufllara ait bakteri lizat proteinleri, sodyum dodesil sülfatpoliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE)'nde Laemmli (17) yöntemi ile incelen-mifltir. Ay›rma jeli % 12,5, dizici jel % 4,5 ola-rak haz›rlanm›flt›r. Bakteri hücre örnekleri, elek-troforez uygulamas›ndan önce, örnek tamponu (500 μl hacmi; 200 μl % 50'lik gliserol, 100 μl 1 M Tris, 100 μl % 10'luk SDS, 50 μl % 0,1'lik bromfenol mavisi ve 50 μl DTT (Ditiyo- trei-tol) içerir) ile 1:1 oran›nda kar›flt›r›lm›flt›r. Ör-nekler jele uygulanmadan önce 2 dakika
kayna-t›lm›flt›r. Güç kayna¤› bafllang›çta 200 V, örnek-ler ay›r›c› jele girdikten sonra ise 250 V olacak flekilde ayarlanm›flt›r. Jel gümüfl nitrat yöntemi ile boyand›. Uygulamada genifl da¤›l›ml› mole-kül a¤›rl›k standartlar› kullan›lm›flt›r.
Jel Filtrasyon Kromatografisi. Sufllara ait ekstrakte proteinler, Irons'›n (18) üre-›s› eks-traksiyon yöntemi modifiye edilerek ekstrakt %30 (w/v) bakteri süspansiyonundan haz›r-lanm›flt›r. 10 mM Tris, 0.145 M NaCI, pH 7.2 (TSA) tamponu ile dengelenen Bio Pi-lot (Pharmacia) Superdex 75 jel filtrasyon kolonuna (26x600 mm) yüksek bas›nçta uy-gulanarak kromatogramlar› belirlenmifltir. Ba¤›fl›kl›k. Her sufla ait bakteri süspansiyo-nu 56ºC'de inaktive edilerek 15 OU/ doz olarak haz›rlanan tam hücre deneysel afl›lar-la fareler 15 gün ara ile iki defa peritoniçi enjeksiyonla ba¤›fl›klanm›flt›r. ‹kinci enjeksi-yondan 15 gün sonra kuyruk venalar›ndan kan al›nan hayvanlar›n bir grubuna bir gün sonra peritoniçi enjeksiyonla LD50 (Letal Doz50 de¤eri = 0.5 OU canl› bakteri
süspan-siyonu olarak belirlenmifltir) ve di¤er grubu-na 4LD50 canl› bakteri uygulanm›flt›r. Bir hafta boyunca fareler gözlenerek ölümler kaydedilmifltir. Ba¤›fl›k hayvanlardan al›nan kan serumlar›nda mikroaglutinasyon yönte-miyle (18) aglutinin titreleri belirlenmifltir. Ayr›ca baflka bir grup fareye 15 gün arayla 3 enjeksiyon yap›larak aglutinin titre yükse-lifli kaydedilmifltir.
BULGULAR
Araflt›rmada kullan›lan tüm sufllar›n benzer morfolojik ve biyokimyasal tür özelliklerine sahip oldu¤u ve ayn› zamanda standart sufl Bordetella bronchiseptica F415 antiserumu ve Bordetella pertussis Saadet antiserumu ile po-zitif lam aglutinasyonu verdi¤i tespit edilmifl-tir.
Hemaglutinasyon (HA) Aktivitesi. HA akti-vitesinin, CL besiyerinde üremenin 24 ve 42'nci saatlerinde bafllayarak, 72-90'nc› saat-lere kadar görülebildi¤i belirlenmifltir (Tablo 1). Araflt›r›lan 15 suflun 12'sinde (%80) (F415, ÜK2, ÜK3, ÜK4, ÜK6, ÜK7, ÜK8, F415 219 CA ÜK2 ÜK3 ÜK4 ÜK6 ÜK7 ÜK8 ÜK11 ÜK14 B51 B63 4617 3036 A630 0,123 0,279 0,131 0,182 0,100 0,122 0,130 0,130 0,115 0,178 0,151 0,204 0,526 0,149 0,308 HA (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) A630 0,514 0,694 0,555 0,424 0,274 0,366 0,391 0,401 0,358 0,368 0,408 0,464 0,945 0,789 0,658 HA (-) (-) (-) 1/2 (-) (-) (-) 1/2 1/2 (-) (-) (-) (-) (-) (-) A630 1,804 1,647 1,645 1,482 1,361 1,299 1,385 1,248 1,392 1,630 1,278 1,719 1,805 1,556 1,512 HA 1/2 (-) (-) 1/8 1/4 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/4 (-) 1/2 1/2 A630 1,906 1,753 1,747 1,680 1,449 1,473 1,458 1,252 1,477 1,739 1,432 1,795 1,940 1,694 1,715 HA 1/2 (-) (-) 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 (-) 1/2 1/8 A630 2,344 2,086 2,057 2,135 1,871 1,863 2,150 1,720 1,632 2,027 2,061 2,210 2,218 1,748 1,834 HA 1/4 (-) (-) 1/2 1/2 1/4 1/2 1/4 1/4 1/2 1/2 1/2 (-) 1/2 1/4 A630 2,491 2,390 2,307 2,407 2,130 2,115 2,369 2,078 2,008 2,276 2,297 2,407 2,355 2,329 2,108 HA 1/4 (-) (-) 1/2 1/2 1/2 1/2 1/4 1/4 1/2 1/4 1/2 (-) 1/4 1/2 A630 2,748 2,539 2,481 2,653 2,430 2,508 2,650 2,367 2,176 2,443 2,515 2,665 2,516 2,448 2,363 HA 1/8 (-) (-) 1/2 1/2 1/2 1/2 1/8 1/8 1/8 1/8 1/2 (-) 1/2 (-)
Sufllar 18. saat 24. saat 42. saat 48. saat 66. saat 72. saat 90. saat
ÜK11, ÜK14, B51, 4617, 3036) FHA sen-tezinin 1:2-1:8 gibi düflük titrelerde oldu¤u gözlenmifltir. 219, CA ve B63 sufllar›nda ise
herhangi bir aktivite görülememifltir (Tablo 1).
Hemolitik Aktivite (adenilat siklaz-hemoli-zin; AC-Hly). Çal›flmada kullan›lan sufllar›n tamam›nda AC-Hly aktivitesinin yüksek ol-du¤u ve aktivitenin genel olarak kültürlerin 42 ve 48'nci saatlerinde en üst düzeye ulafl-t›¤› gözlenmifltir. F415, CA, ÜK4, ÜK6, ÜK7, ÜK8, B51 ve B63 sufllar›n›n di¤erle-rine göre daha yüksek aktivite gösterdikleri belirlenmifltir (Tablo 2).
Sufllar›n Elektroforetik Analizi. Bakteri lizat›n›n SDS-PAGE profil analizinde sufllar›n ço¤unda bakteriye ait belirgin bafll›ca flu protein bandlar› gözlenmifltir: 200 kDa civar›nda FHA ve AC-Hly proteinleri; 83 kDa civannda iki protein band›; 68 kDa'da pertaktin protein band›; 51,8 kDa civar›nda benzer bandlar ve 36 kDa prote-in (d›fl membran porprote-in proteprote-in) band›
görülmüfl-tür. 21, 22 ve 24 kDa civar›nda yer alan Fim 1, 2, 3 proteinlerinin sufllara göre de¤ifliklik gös-terdi¤i gözlenmifltir (fiekil 1).
Jel Filtrasyon Kromatografisi. Sufllara ait üre-›s› ekstrakte proteinlerin Süperdex 200 jel filtrasyon kromatografilerinde bafll›ca üç protein piki görül-müfltür. Kromatogramlar birbirine benzer olmak-
AC-Hemolitik aktivite (U)
18. saat 24. saat 42. saat 48. saat 66. saat AC-Hemolitik aktivite (U) AC-Hemolitik aktivite (U) AC-Hemolitik aktivite (U) AC-Hemolitik aktivite (U) Sufllar F415 219 CA ÜK2 ÜK3 ÜK4 ÜK6 ÜK7 ÜK8 ÜK11 ÜK14 B51 B63 4617 3036 8,7 5,3 2,4 7,8 8,8 6,8 5,8 7,9 6,1 5,3 7,3 3,4 10 2,6 4,8 14,9 9,6 11,2 4,2 4,3 7,2 8,5 11,5 6,9 5,6 9 11,5 9,6 3,7 6,84 15,7 12,4 16,4 11,1 10,2 10,3 12,7 12,9 11,4 11,0 10,1 14,2 7,7 7,2 7,4 17,4 10,4 11,5 9,9 11,9 14,2 14,6 17,8 17,7 11,6 11,6 12,8 17,2 14 9,2 10,2 7,7 8,4 7,1 11,5 10,9 13,1 13,8 8,1 10,2 10,2 12,3 16,3 13,2 8,54
Tablo 2. B. bronchiseptica sufllar›n›n CL besiyerinde adenilat siklaz sentez miktarlar›.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 212 kDa 122 83 51.8 35 28.4 20 7.2
fiekil 1. B. bronchiseptica sufllar› hücre lizatlar›n›n %10 SDS-PAGE analizi.
Tablo 3. Tam hücre B. bronchiseptica sufllar› ile ba¤›fl›klanan farelerde peritoniçi F415 uygulamas›na karfl› korunma.
Uygulama Doz (LD50) Canl›/Toplam % Canl›/Toplam % Korunma Uygulama Doz (4LD50) Korunma Sufllar 5/5 5/5 5/5 4/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 4/5 5/5 5/5 2/5 100 100 100 80 100 100 100 100 100 100 100 100 80 100 100 40 5/5 2/5 5/5 4/5 5/5 4/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 4/5 4/5 5/5 0/5 100 40 100 80 100 80 100 100 100 100 100 100 80 80 100 0 F415 4617 CA 219 3036 ÜK2 ÜK3 ÜK4 ÜK6 ÜK7 ÜK8 ÜK11 ÜK14 B51 B63 Kontrol
la beraber, protein piklerinde sufllar aras›nda oransal farkl›l›klar bulundu¤u belirlenmifltir (fie-kil 2).
Ba¤›fl›kl›k. Her sufltan haz›rlanan tam hücre afl›-lar› ile ba¤›fl›klanan farelerin, F415 suflu LD50 ve 4 LD50 uygulamas›na karfl› genel olarak iyi düzeyde korundu¤u görülmüfltür (Tablo 3). F415, CA, 3036, ÜK3, ÜK4, ÜK6, ÜK7, ÜK8, ÜK11 ve B63 sufllar› ile ba¤›fl›klanan farelerin 4LD50 uygulamaya karfl› da %100 korunduklar›, 219, ÜK2, ÜK14 ve B51 sufllar› ile ba¤›fl›klanan fa-relerin ise %80 oran›nda korundu¤u gözlenmifl-tir. 4617 suflunun fareleri LD50 uygulamaya kar-fl› %100 korumas›na ra¤men, 4LD50'ye karfl› an-cak % 40 gibi düflük bir oranda korudu¤u be-lirlenmifltir.
Ba¤›fl›k farelerden canl› bakteri uygulamas› ön-cesi al›nan serum örneklerinde, F415, 4617, ÜK2, ÜK3, ÜK4, ÜK6, ÜK7, ÜK8, ÜK11, B51 ve 3036 sufllar›na ait serumlar›n kendi antijenle-riyle yüksek titrede mikroaglutinasyon verdi¤i (1/2048-1/32768), bununla birlikte ÜK14 ve B63
sufllar›na ait serumlann kendi antijenleriyle düflük titrede (1/64-1/128) aglutinasyon oluflturdu¤u be-lirlenmifltir. Ayn› zamanda anti-B. bronchiseptica serumlar›n›n B. pertussis antijenleri ile de
önem-Tablo 4. B. bronchiseptica sufllar›na ait ba¤›fl›k serumlar›n kendi antijenleri ve B. pertussis Saadet ve Tohama antijenleri ile mikroaglutinasyon titreleri (x10-1).
Tablo 5. B. bronchiseptica sufllar›n›n anti-F415 serumu ile mikroaglutinasyon titreleri (x10-1).
Tablo 6. B. bronchiseptica F415 antijeni ile di¤er sufllara ait ba¤›-fl›k (iki enjeksiyon) ve hiperimmun (üç enjeksiyon) serumlar›n mikroaglutinasyon titreleri (x10-1). Anti-F415 Anti-4617 Anti-219 Anti-CA Anti-ÜK2 Anti-ÜK3 Anti-ÜK4 Anti-ÜK6 Anti-ÜK7 Anti-ÜK8 Anti-ÜK11 Anti-ÜK14 Anti-B51 Anti-B63 Anti-3036 16384 8192 2048 2048 32768 32768 32768 8192 32768 32768 16384 128 32768 64 32768 1024 256 128 256 2048 128 2048 2048 1024 4096 1024 1024 2048 1024 2048 1024 256 32 256 4096 2048 512 512 256 1024 1024 512 1024 512 1024 Ba¤›fl›k Serumlar Antijen B. bronchiseptica (kendi tam hücresi) B. pertussis Saadet (tam hücre) B. pertussis Tohama (tam hücre) Antijen Antijen F415 4617 219 CA ÜK2 ÜK3 ÜK4 ÜK6 ÜK7 ÜK8 ÜK11 ÜK14 B51 B63 3036 16384 512 512 1024 4096 4096 8192 4096 4096 8192 16384 4096 16384 Negatif 16384 Anti-F415 Anti-4617 Anti-219 Anti-CA Anti-ÜK2 Anti-ÜK3 Anti-ÜK4 Anti-ÜK6 Anti-ÜK7 Anti-ÜK8 Anti-ÜK11 Anti-ÜK14 Anti-B51 Anti-B63 Anti-3036 2048 32 Negatif 2048 2048 512 512 512 512 512 512 1024 512 256 2048 16384 256 64 8192 4096 2048 1024 8192 4096 8192 512 4096 2048 1024 8192 Ba¤›fl›k ve hiperimmun serumlar ‹ki enjeksiyon sonras› titre Üç enjeksiyon sonras› titre Tam Hücre Antijenler Anti-F415 serumu ile titre
1400 1200 1000 800 600 400 200 0 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 2527 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59616365 1 35 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61 1 35 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59616365 1 3 57 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 2931 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 1 3 5 79 11 13 15 17 19 21 23 25 27 2931 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 1 3 57 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 2931 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 Protein Konsantrasyonu Tüp say›s› Protein Konsantrasyonu Tüp say›s› Protein Konsantrasyonu Tüp say›s› Protein Konsantrasyonu Tüp say›s› Protein Konsantrasyonu Tüp say›s›
Protein Konsantrasyonu (ug/ml)
Tüp say›s›
Protein Konsantrasyonu (ug/ml)
Tüp say›s›
Protein Konsantrasyonu (ug/ml)
Tüp say›s›
fiekil 2. B. bronchiseptica sufllar›nda jel filtrasyon kromatogram›: a) F415 b) UK7 c) CA d) 219 e) 4617 f) 3036 g) UK6 h) UK8
a
b
g
h
e
f
li titrelerde reaksiyon verdikleri gözlenmekle be-raber, iki tür aras›ndaki farkl›l›k anlaml› görül-müfltür (Tablo 4).
B. bronchiseptica ba¤›fl›klamalar›n›n de¤erlendiril-mesinde patojen canl› bakteri olarak kullan›lan F415 suflu ile di¤er sufllar aras›ndaki immünoje-nik iliflki Tablo 5 ve 6’da görülmektedir. Tüm sufllar›n anti-F 415 serumu ile verdikleri reaksi-yonda farkl›l›klar bulunmakla beraber genel ola-rak yüksek titrede aglutinasyon gösterdikleri göz-lenmifltir (Tablo 5). Tüm sufllara ait iki ve üç enjeksiyon ile ba¤›fl›klanan farelerden elde edilen antiserumlar›n da F415 antijeni ile yüksek titre-de reaksiyon vermekle beraber aralar›nda önemli farklar bulundu¤u gözlenmifltir (Tablo 6). TARTIfiMA
B. bronchiseptica sufllar›n›n üreme özellikleri MMB, SS ve CL s›v› besiyerlerinde incelendi¤i zaman, log faz›na 18'nci saatte ulaflt›¤› ve 42'nci saate kadar bu fazda devam etti¤i görül-müfltür. Çal›flmam›zda 15 sufltan 12'sinin, s›v› kültürde, Bordetella cinsinin patojeniteden so-rumlu en önemli komponentlerinden olan fila-mentöz hemaglutinin (FHA) proteinini sentezle-meye geç log faz›nda bafllad›¤› ve dura¤an dö-nemde devam etti¤i, bununla beraber FHA sentezinin oldukça zay›f oldu¤u saptanm›flt›r (1:2 -1: 8 HA aktivitesi) (Tablo 1). 219, CA ve B63 gibi baz› sufllarda ise aktivitenin hiç tespit edi-lememesi ve FHA'n›n genel olarak düflük mik-tarlarda sentezlenmesi, B. bronchiseptica'y› B. pertussis'den ay›ran önemli özelliklerden biri ola-rak gözlenmifltir. FHA'n›n düflük düzeyde sentez-lenmesine, farkl› B. bronchiseptica sufllar› ile ça-l›flan Jacob-Dubuisson ve ark, (19) taraf›ndan da iflaret edilmifltir. Çal›flmam›zda ayn› zamanda FHA sentezinin besiyeri özelliklerine de ba¤l› ol-du¤u gözlenmifl ve sentetik StainerScholte ve ya-r› sentetik MMB besiyerlerinde iyi üreme görül-mesine karfl›n Stainer-Scholte besiyerinde HA aktivitesi gösterilememifltir. FHA varl›¤›n›n beta-siklodekstrin içeren CL-besiyerinde ise MMB siyerinden daha yüksek düzeyde bulundu¤u
be-lirlenmifltir. Tüm sufllar ve klinik izolatlara ait olan FHA sentezi ile ilgili bulgular, Keil ve Fenwick, 1998 (20) ve Suzuki ve ark., 1985 (13)'n›n çal›flmalar› ile uyumlu görülmüfltür. B. bronchiseptica patojenitesinden sorumlu di¤er önemli komponent olan adenilat siklaz hemolizin (AC-Hly) proteininin ise tüm sufllarda yüksek oranda ve erken log faz›nda sentezlendi¤i göz-lenmifltir. AC-Hly aktivitesinin 42-48'nci saatler-de en yüksek saatler-de¤ere (9,2-17,8 AC ünitesi) ulafl-t›¤› belirlenmifltir. Bu durum, B. bronchiseptica sufllar›n›n farelerde oluflturdu¤u kuvvetli letal et-kinin AC-Hly'in yüksek düzeyde sentezlenmesine ba¤l› oldu¤unu göstermektedir.
B. bronchiseptica sufllar›nda FHA'nin düflük dü-zeyde sentezlenmesi, bakteri kolonizasyonunda d›fl membran proteinleri ile fimbriya proteinleri-nin daha önemli oldu¤unu düflündürmektedir. Bununla beraber, B. bronchiseptica sufllar› ve kli-nik izolatlar›n›n hücre lizat protein profilinin SDS-PAGE incelemesinde (fiekil 1); sufllar›n ço-¤unda ba¤›fl›kl›kta önemli oldu¤u bilinen FHA, AC-Hly, pertaktin, 40 kDa FimD, 38 kDa d›fl membran porin proteini, 36 kDa protein ve fim-briya gibi proteinlerin ana bantlar olarak görül-mesi ise, FHA molekülünün hücre d›fl›nda oldu-¤u gibi hücre yüzeyinde de az miktarda bulun-du¤unu ve adezyona katk› verdi¤ini göstermifltir. Bu durum, Gueirard ve Guiso (21)'nun çal›flma-lar›nda, B. bronchiseptica sufllar›n›n adenilat sik-laz-hemolizin, FHA ve pertaktin (d›fl membran protein) sentezleme yetenekleri ve enfekte fare-lerin serumlar›nda anti-adenilat siklaz-hemolizin ve antiFHA antikorlar›n›n erken dönemde olufl-tu¤unun gösterilmesi ile de uyumlu görüldü. Ba-¤›fl›klama çal›flmalar›m›zda görülen yüksek aglu-tinasyon titrelerinin ise FHA d›fl›ndaki yüzey komponentlerinin ba¤›fl›k yan›tta oldukça önemli oldu¤unu göstermektedir. Tam hücre afl›s› ile ba-¤›fl›klanan farelerde F415 suflu ile LD50 ve 4LD50 challenge'a karfl› genel olarak iyi düzey-de (% 80-100) korunma sa¤lanmas› da sufllar aras›nda çapraz koruma özelliklerinin bafll›ca bu
komponentlerle ilgi olaca¤›n› gösterdi. Bu du-rum, her sufla ait tam hücre antijeninin, anti-F415 serumu ile verdi¤i çapraz aglutinasyon tit-resinde genel olarak yüksek de¤erler görülmesi ile de uyumlu olarak de¤erlendirildi. Bununla be-raber çapraz aglutinin reaksiyonlar›ndaki farkl›-l›klar,antijenik farkl›l›klar› da göstermektedir. Bu antijenik farkl›l›klar›n oluflumunda, B. bronc-hiseptica sufllar› üre-›s› ekstrakte proteinlerinin jel filtrasyon kromatogramlar›ndaki benzer yap›-ya karfl›n sufllar aras›ndaki protein piklerinde gözlenen oransal farkl›l›klar›n da etkili olabilece-¤ini düflündürdü (fiekil 2).
Sonuç olarak, B. bronchiseptica klinik izolatlar-da, toksisiteden büyük oranda sorumlu olan ade-nilat siklaz›n yüksek düzeyde sentezlenmesinin yan›nda, koruyucu ba¤›fl›k yan›t oluflturan kom-ponentler bak›m›ndan yeterli bir homolojinin ge-nel olarak mevcut oldu¤u belirlendi. Çal›flmam›z-da bunu sa¤layan komponentlerin büyük oranÇal›flmam›z-da fimbriya ve di¤er yüzey yap›lar› oldu¤u, bunun-la beraber suflbunun-lar aras›nda antijenik farkl›l›kbunun-lar›n da önemli oldu¤u gözlendi.
KAYNAKLAR
1. Bemis DA, Greisen HA, Appel MJG: Pathogenesis of canine
Bordetellosis. J Infect Dis 135: 753 (1977).
2. Goodnow RA:Biology of Bordetella bronchiseptica. Microbiol
Rev 44: 722 (1980).
3. Sakamoto H, Bellalou J, Sebo P, Ladant D: Bordetella pertussis
adenylate cyclase toxin, structural and functional independence of the catalytic and hemolytic activities. J Bio Chem 267: 13598 (1992).
4. Leusch MS, Paulaitis S, Friedman RL: Adenylate cyclase toxin of Bordetella pertussis: Production, purification, and partial cha-racterization. Infect Immun 58: 3621 (1990).
5. Cotter PA, Yuk MR, Mattoo S, et al: Filamentous hemaglutinin
of Bordetella bronchiseptica is required for efficient establishment of tracheal colonization. Infect Immun 66: 5921 (1998).
6. Mattoo S, Miller JF, Cotter P A: Role of Bordetella
bronchi-septica fimbriae in tracheal colonization and development of a humoral immune response. Infect Immun 68: 2024 (2000). 7. Kobisch M, Novotny N: Identification of a 68-kilodalton outer membrane protein as the major protective antigen of Bordetella bronchiseptica by using specific-pathogen-free piglets. Infect Im-mun 58: 352 (1990).
8. WIllems RJL, Geuijen C, van der Heide HGJ, et al:Isolation of
a putative fimbrial adhesin from Bordetella pertussis and the identification of its gene. Mol Microbiol 9: 623 (1993).
9. Holt JG, Krieg NR, Sneath PHA, et al: Bergey's Manual of
De-terminative Bacteriology. Williams and Wilkins, Ninth Edition (1996).
10. Powell HM: Charcoal agar culture medium for preparing H.
pertussis vaccine. Bul Hlth Rep 66: 346 (1951).
11. WHO: BLG/UNDP/77.3 Rev. 1. Manual for the production
and control of vaccines, pertussis vaccine. (1977).
12. Stainer DW, Scholte MJ: A simple chemically defined
medi-um for the production of phase-I Bordetella pertussis. J. Gen Microbiol 63: 211 (1971).
13. Suzuki Y, Imaizumi A, Ginnaga A et al: Effect of heptakis
(2,6-0-Dimethyl) betacyclodextrin on cell growth and the produc-tion of pertussis toxin and filamentous hemagglutinin in Borde-tella pertussis. Develop. Biol. Standard 61: 89 (1985).
14. Özcengiz E, Günalp A: Bordetella pertussis ekzotoksinlerinden
lenfositozis-promoting faktör (LPF) ve filamentöz hemagglutinin (FHA)'n›n de¤iflik s›v› besiyerlerinde sentez miktar›. Do¤a- Tr J Med Sci 14: 307 (1990).
15. Irons LI, Maclennann AP: Isolation of the lymphocytosis
-promoting factor haemagglutinin of Bordetella pertussis by affi-nity chromatography. Biochim Biophys Acta 580: 175 (1979).
16. Rogel A, Meller R, Hanski E: Adenylate cyclase toxin from
Bordetella pertussis, the relationship between induction of cAMP and hemolysis. J Bio Chem 266: 3154 (1991).
17. Laemmli UK: Cleavage of structural proteins during the
as-sembly of the head of bacteriophage T4. Nature (London). 227: 680 (1970).
18. Irons LI, Ashworth LAE, Robinson A: Release and purification of fimbriae from Bordetella pertussis. De-velop. Biol Standard 61: 153 (1985).
19. Jacob-Dubuisson F, Kehoe B, Willery E: Molecular characterization of Bordetella bronchiseptica filamento-us haemaglutinin and its secretion machinery. Micro-biology 146: 1211 (2000).
20. Keil DJ, Fenwick B: Strain and growth condition-dependent variability in outer membrane protein ex-pression by Bordetella bronchiseptica isolates from dogs. AJVR 60: 1016 (1998).
21. Gueirard P, Guiso N: Virulence of Bordetella bronchiseptica: Role of adenylate cyclase-hemolysin. Infect Immun 61: 4072 (1993).
