Hastane kökenli Acinetobacter baumannii izolatlarının antibiyotik duyarlılıkları ve imipenem dirençli izolatların genotiplemesi

HASTANE KÖKENLİ ACINETOBACTER BAUMANNII

İZOLATLARININ ANTİBİYOTİK DUYARLILIKLARI

VE İMİPENEM DİRENÇLİ İZOLATLARIN

GENOTİPLEMESİ

Dr. Çiğdem KARAGÖL

T.C.

TRAKYA ÜNİVERSİTESİ

TIP FAKÜLTESİ

MİKROBİYOLOJİ VE KLİNİK

MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI

Tez Yöneticisi

TEŞEKKÜR

Uzmanlık eğitimimde ve tez çalışmamda yardımlarını hiçbir zaman esirgemeyen sayın hocam, Doç. Dr. Müşerref Otkun’a, sayın hocalarım Prof. Dr. Metin Otkun’a, Prof. Dr. Murat Tuğrul’a, Doç. Dr. Nermin Şakru’ya, Doç. Dr. Şaban Gürcan’a, Doç. Dr. Neşe Akış’a; moleküler yöntemin uygulanmasında deneyimlerini paylaşan Prof. Dr. Dilek Çolak’a, Uzm. Dr. Nevgün Özen’e, laboratuvar personeli arkadaşlarımın tümüne ve asistan arkadaşlarıma teşekkür ederim.

İÇİNDEKİLER

GİRİŞ VE AMAÇ ... 1

GENEL BİLGİLER ... 3

GEREÇ VE YÖNTEMLER ... 22

BULGULAR ...

TARTIŞMA ... 49

SONUÇLAR ... 58

ÖZET ...

SUMMARY ...

KAYNAKLAR ... 62

EKLER

SİMGE VE KISALTMALAR

ABD : Amerika Birleşik Devletleri

BHI : Beyin kalp infüzyon

CLSI : Clinical and Laboratory Standards Institute DNA : Deoksiribonükleik asit

DNaz : Deoksiribonükleaz EDP : Energy Dependent Phase EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid EMB : Eosin metilen blue agar

GSBL : Genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz Hİ : Hastane infeksiyonları

MHA : Müller Hinton agar MHB : Müller Hinton buyyon

MİK : Minimal inhibitör konsantrasyon

mRNA : Haberci ribonükleik asit PABA : Para aminobenzoik asit PBP : Penisilin bağlayan protein PFGE : Pulsed Field Gel Electrophoresis PZR : Polimeraz zincir reaksiyonu

TBE : Trisbase boric acid- Ethylenediaminetetraacetic acid

tRNA : Transfer ribonükleik asitler TSB : Triptik soy buyyon

GİRİŞ VE AMAÇ

Son 20 yıldır gelişmiş ülkelerde, çoğul antibiyotik dirençli gram negatif basillerin neden olduğu hastane infeksiyonları (Hİ) önemli bir problem oluşturmaktadır (1). Hİ hasta morbidite ve mortalitesini arttırmakta, hastanede kalış süresini uzatarak tedavi maliyetini yükseltmekte ve önemli ekonomik kayba yol açmaktadır (2). Bu nedenlerle, gram negatif bakterilerle oluşan Hİ günümüzün önemli sağlık sorunlarından biridir.

Trakya Üniversitesi Eğitim Araştırma Uygulama Hastanesi (TÜEAUH)’nde Hİ hızı; 2003 yılı Eylül-Aralık ayları arasında %5,7, 2004 yılında %4,9, 2005 yılında ise %3,7 olarak belirlenmiştir (3).

Acinetobacter cinsi bakteriler Hİ’ye yol açan etkenler içinde önemli bir yer tutmaktadır (1). Acinetobacter infeksiyonu, yoğun bakım ünitelerindeki hastalarda gittikçe artan sıklıkta görülmektedir (4). Bu etkenlerin Hİ’de sık olarak saptanmalarının nedenleri, dış ortam koşullarında kolaylıkla yaşayabilmeleri ve antibiyotiklere karşı çoğul direnç kazanabilmeleridir (1,5). Acinetobacter türleri hastane ortamında uzun süre canlılığını korur ve toprak, su, yiyecek gibi maddelerden izole edilebilir. Sağlıklı kişilerin florasında bulunabildiği gibi hastaneye yatırılarak tedavi edilen hastalarda kolonizasyon da yapabilirler (6–8).

Hastane infeksiyonu salgınlarında en sık izole edilen ve antibiyotiklere en dirençli tür Acinetobacter baumannii’dir (5). TÜEAUH İnfeksiyon Kontrol Komitesi’nin verilerine göre bu hastanede Acinetobacter türleri Hİ etkenlerinin 1995–2000 döneminde %8-17’sini oluşturmakta ve gram negatif bakteriler içinde 2. ya da 3. sırada yer almaktadır (9).

Hastanemizde, Tatman-Otkun ve ark. (10) tarafından yapılan bir çalışmada, Ekim 1994–1997 döneminde Hİ etkeni olarak izole edilen Acinetobacter türlerinde in vitro en etkin antibiyotik imipenem (%100) iken, diğer beta laktam antibiyotiklere direncin %1–52 arasında değiştiği belirlenmiştir. Ancak, imipenem için Minimal İnhibitör Konsantrasyon (MIK) değerlerinin duyarlılık sınırları içinde kalmasına rağmen yıllar içinde gittikçe arttığı gözlenmiştir.

Tatman-Otkun ve ark. (9) tarafından yapılan diğer bir çalışmada ise TÜEAUH’de Ekim 1994-Haziran 2000 döneminde izole edilen 150 A. baumannii kökeni incelemeye alınmıştır. Denenen antibiyotikler içinde imipenem ve bir köken hariç netilmisine direnç yok iken, seftazidime %71, tikarsilin-klavulanik aside %68, ampisilin/sulbaktama %63, sefepime %62, amikasine %45, siprofloksasine %36, tobramisine %23 oranında direnç saptanmıştır (9).

Son zamanlarda hastanemizde izole edilen Hİ etkeni Acinetobacter spp.’lerde imipenem dirençli kökenlerin arttığı gözlendiğinden bu çalışmada, TÜEAUH’de 2004–2006 yılları arasında kandan izole edilen A. baumannii kökenlerinde antibiyotik duyarlılıklarındaki değişimlerin araştırılması ve imipenem dirençli A. baumannii kökenlerinin Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE) ile genotiplemesinin yapılması amaçlandı. PFGE ile A. baumannii’yle oluşan Hİ’nin tek bakteriden köken alıp almadığı ortaya konularak Hİ’nin epidemiyolojisinin anlaşılmasına katkı sağlanılacaktır.

GENEL BİLGİLER

HASTANE İNFEKSİYONLARI

Hastane infeksiyonları (Hİ), hasta hastaneye başvurduğu sırada inkübasyon döneminde olmayıp, hastaneye başvurduktan 48–72 saat sonra oluşan ya da hastanede gelişip hasta taburcu olduktan sonra 10 gün içinde ortaya çıkan infeksiyonlardır (11). Hastane infeksiyonlarında mortalite ve morbidite oranlarını, ayrıca hastanede kalış süresini ve tedavi maliyetini önemli oranda arttırdığı için, önemli bir sağlık problemi olmaya devam etmektedir (2,11). Ülkemizde az sayıda hastanede total sürveyans yapılmış ve Hİ oranları %5 civarında bulunmuştur (12). Otkun ve ark. (13) 1995’te yaptıkları çalışmada TÜEUAH’de tüm hastane için Hİ oranını %2,9 bulmuşlardır. Çalışma yayınlandığı sırada yoğun bakım ünitesi (YBÜ) yanlızca üç aylık verilere sahip olduğundan çalışmaya tüm veriler alınmamış, ancak bu dönem içinde YBÜ’ye 26 hasta yatırıldığı ve bu hastaların 21’inde (%80,8) Hİ geliştiği bildirilmiştir.

Yoğun bakım ünitelerinde yatan hastaların genellikle durumları daha ağırdır. Altta yatan hastalıkları nedeniyle dirençleri zayıftır. Yapılan tıbbi girişimlerin sıklığı fazladır ve antibiyotiklerin en fazla kullanıldığı hastalardır (14).

Özer B. (15) TÜEAUH’de 2005 yılında yaptığı çalışmada dokuz aylık sürede YBÜ’de gelişen Hİ oranını %68 olarak bulmuştur. Bu oran Pamukkale Üniversitesi, Akdeniz Üniversitesi, Atatürk Üniversitesi, Ankara Üniversitesi ve Kocaeli Üniversitesi Hastane’leri YBÜ’de gelişen Hİ oranlarından fazladır.

Hastane infeksiyonlarında sıklıkla izole edilen mikroorganizmalar antibiyotik ve tıbbi uygulamalardaki değişikliklere bağlı olarak zaman içinde farklılıklar göstermektedir. Günümüzde uygunsuz ve geniş spektrumlu antibiyotik kullanımı ile invazif girişimlerin artması sonucu, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter türleri, metisiline dirençli

Staphylococcus aureus, koagulaz negatif stafilokoklar, Enterobacter türleri, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus türleri, enterokoklar ve Candida türlerinde anlamlı artış görülmektedir (16).

Acinetobacter türleri, deri ve mukoza kolonizasyonları sonrasında yüksek morbidite ve mortaliteye neden olarak Hİ içinde ayrı bir önem kazanmaktadır. A. baumannii ile gelişen infeksiyonlarda antibiyotiklere olan direnç önemli sorunlar yaratmaktadır (17,18). A. baumannii hastanedeki hastalarda tek başına salgınlara neden olan, kan dolaşımı sisteminin önemli bir patojenidir (19).

ACINETOBACTER CİNSİ

Acinetobacter türleri, 1939 yılında Debord’un gram negatif kokobasilleri üretral örnekten izole etmesi ile tanımlanmıştır (20).

Morfolojik, Mikrobiyolojik Özellikler

Acinetobacter cinsindeki bakteriler üremenin logaritmik fazında kısa, iri, bazen renksizleştirme problemi yaşanılan, gram negatif, 1,0–1,5 µm uzunluğunda basil, üremenin duraklama fazında kok veya kokobasil şeklinde görülmektedir. Genellikle düzgün, bazen mukoid, renksiz koloniler oluşturur. Zorunlu aerop, DNaz ve oksidaz negatif, katalaz pozitif, nonfermantatif bakterilerdir. Fimbriaları vardır ve hareketsizdirler. Diğer nonfermantatif bakterilerden ayırmada kullanılacak ilk test oksidaz testidir (17).

Acinetobacter türleri arasında en sık ve en önemli klinik tablolara yol açan etken A. baumannii’dir (17). Rutin laboratuvar koşullarında, biyokimyasal reaksiyonlara ve üreme özelliklerine göre Acinetobacter tür ayrımı yapılmaktadır (Tablo 1). Glukozu oksitleyen ve hemoliz yapmayan, 44 °C’de üreyebilen kökenler A. baumannii’dir (18).

Klinik laboratuvarlarda nonfermantatif mikroorganizmaların izolasyonunda genellikle kanlı agar ve eozin metilen blue agar gibi besiyerleri kullanılır. Bromkrezol moru, safra tuzları, laktoz, maltoz şekerleri içeren Herellea agar klinik örneklerden ve vankomisin, sefsulodin, sefradin gibi antibiyotikleri içeren Leeds Acinetobacter Medium ise hem klinik örneklerden hem de çevreden Acinetobacter’lerin izole edilmesinde kullanılabilen seçici ve ayırt edici besiyeridir (17,21).

Tablo 1. Acinetobacter türlerinin tanımlanması için basitleştirilmiş şema (22)

3,6,10,11:İsimlendirilmemiş türler, + : %90-100 pozitif, - : %0-10 pozitif; Değişken (D): %11-89 pozitif.

Patogenez ve Virulans Faktörleri

Acinetobacter cinsi bakteriler genel olarak virulansı düşük patojenlerdir. Konak savunma mekanizmaları normal olan bireylerde infeksiyon oluşturmaları oldukça güçtür. Genellikle hastane kaynaklı fırsatçı infeksiyonlara neden olmaktadırlar (17,23). Malignite, yanık, konağın savunma sistemini baskılayan durumlar ve konağın yaşı infeksiyon gelişimini kolaylaştıran bazı faktörlerdir. Ağır cerrahi girişim, uzun süre yoğun bakım ünitesinde kalma, uzun süre mekanik ventilatöre bağlı kalma, uzun süreli antibiyotik kullanımı, damar içi kateterizasyon, enteral beslenme, idrar sondası, endotrakeal tüp ve trakeostomi varlığı başlıca

TEST

A. calcoaceticus

A. baumannii

3 4- A. haemolyticus 5- A. junii 6 7- A.johnsonii 8- A. lwoffii 10 11

A. radioresistens Üreyebildiği ısı 44 °C’de - + - - - - - - - 41 °C’de - + + - + - - - - - - 37 °C’de + + + + + + - + + + + Glukozdan asit + + + D - D - D + - D Jelatin hidrolizi - - - + - + - - - - - Karbonhidrat kullanımı dl-Laktat + + + - + - + + + + + dl-4-aminobutirat + + + + D - D D + + + Trans-akonitat + + + D - - - - - Sitrat + + + + D + + - + + - Glutarat + + + - - - - - + + + Aspartat + + + D D D D - + D - Azelat + + + - - - - + D D + Β-Alanin + + + - - - - - + + - I-Histidin + + + + + + - - + + - d-malat - + + + + D D D + + - Malonat + + D - - - D - - - + Histidin - - - - - - - - D + - I-Fenilalanin + D D - - - - - + Fenilasetat + D D - - - - + D D +

risk faktörleridir. Son 30 yıldır hastane ortamında yeni, geniş spektrumlu antibiyotiklerin yaygın ve uygunsuz kullanımı, hem Acinetobacter türleri ile gelişen Hİ oranını arttırmış hem de bu bakterilerde birçok antibiyotiğe karşı direnç gelişmesine neden olmuştur. Antibiyotik kullanma alışkanlıkları ve çevresel faktörlerin katkısı ile antibiyotik direnci hastaneler, şehirler ve ülkeler arasında farklılık göstermektedir (17,23).

Acinetobacter cinsi bakteriler genel olarak düşük virulanslı olarak kabul edilmelerine rağmen virulanstan sorumlu faktörler de vardır;

1- Polisakkarit kapsül: L-ramnoz, D-glukoz, D-mannoz ve D-glukronik asitten oluşup, bakteri yüzeyinin hidrofilik olmasını sağlar ve fagositozdan korur. Ek olarak intravenöz kateter, trakeal kanül gibi yüzeylere tutunmayı kolaylaştırır.

2- Fimbria ve/veya kapsüler polisakkarit: İnsan epitel hücrelerine bağlanmayı sağlar. 3- Lipopolisakkarit ve lipid A: Hücre duvarında bulunan lipid A potansiyel toksik etki göstererek patojeniteyi arttırır.

4- Dokulardaki lipidleri yıkan enzimler üretirler.

5- Aerobaktin ve siderofor gibi demir tutucu dış membran reseptör proteinlerinin üretimi ile bakteri üremesi için gerekli demir temin edilmektedir.

Ayrıca son zamanlarda yapılan çalışmalarda antibiyotik direnci sağlayan PER–1 enziminin virülansı arttırdığı ve klinik olarak daha ölümcül infeksiyonlara neden olduğu gösterilmiştir (17,24,25).

Acinetobacter İnfeksiyonları

Acinetobacter spp.’ler doğada yaygın bulunurlar. İnsanda deri florasında yer aldıklarından klinik örneklerden izole edilebilirler. Zaman zaman fırsatçı patojen bakteriler olarak infeksiyon yaparlar. Genitoüriner sistem infeksiyonları (kateter uygulamasına bağlı sistit ve piyelonefrit gibi), intrakraniyel infeksiyonlar (cerrahi girişimlerden sonra görülen menenjit gibi), solunum sistemi infeksiyonları (intübasyon ve trakeostomi sonrası), yumuşak doku infeksiyonları oluşturduğu fırsatçı infeksiyonlardandır (26). Acinetobacter infeksiyonları sıklıkla hastane kaynaklı olmasına rağmen toplum kökenli alt solunum yolu infeksiyonlarından da izole edilmiştir (27).

Acinetobacter türlerinin hastane personelinin %15-33’ünde ellerinde kolonize olduğu, bu kökenleri hastalara ve ekipmanlara aktardıkları gösterilmiştir (23).

ABD’deki birçok tıp merkezinde, A. baumannii önemli bir nozokomiyal patojen olarak kabul edilmektedir. New York’un Brooklyn şehrinde mikrobiyoloji laboratuvarlarında identifiye edilen tüm gram negatif kökenlerin yaklaşık %10’u A. baumannii’dir (28).

Türkiye’de yapılan bir çalışmada A. baumannii, hastane kökenli pnömoni etkenleri arasında %24 oran ile ilk sırada yer almıştır. Bu olguların önemli bir kısmının ventilatörle ilişkili pnömoni olduğu dikkati çekmektedir (29).

Bakteriyemi, Acinetobacter infeksiyonu sırasında sık görülen, mortalitesi yüksek bir durumdur. En sık kaynak, solunum sistemi infeksiyonları ve intravenöz kataterlerdir (23). Taşova ve ark. (23) tarafından yapılan bir çalışmada nozokomiyal Acinetobacter infeksiyonlarının %10’u bakteriyemiye bağlı bulunmuştur.

Acinetobacter’lere bağlı menenjitler nadir görülen ancak mortalitesi %34–54 arasında değişen önemli infeksiyonlardır. Yoğun antibiyotik kullanımı, ventrikülostomi, beş günden fazla tutulan ventriküler kateterler ve beyin omurilik sıvısı fistülleri gibi risk faktörleri menenjit gelişiminde etkilidir (23).

Üriner sistem infeksiyonları; genellikle yaşlı, yoğun bakım ünitesinde kalan, uzun süredir sondalı ve böbrek taşı olan erkek hastalarda görülmektedir. Avrupa’da 228 hastanenin katıldığı bir nokta prevalans çalışmasında, Acinetobacter cinsi bakterilerle gelişen üriner sistem infeksiyonları %1,8 oranında bildirilmiştir (30).

Endoftalmit, protez kalp kapağı endokarditi, periton diyalizi ile ilişkili peritonit, perkütan transhepatik kolanjiografi ve perkütan safra drenajıyla ilişkili kolanjit, pankreas ve karaciğer apseleri, otolog kemik iliği transplantasyonundan sonra gelişen osteomyelit, septik artrit bildirilen diğer nadir olgulardır. Travmatik yaralar, cerrahi insizyon bölgeleri, yanık, venöz kateter uygulaması, bağışıklık sisteminin baskılanması başlıca risk faktörleridir (17,27).

Acinetobacter İnfeksiyonlarında Tedavi

A. baumannii infeksiyonlarının tedavisi, bu mikroorganizmanın birçok antibiyotiğe dirençli olmasından dolayı oldukça güçtür. Karbapenemler, sulbaktam ve kolistin en etkili antibiyotikler olarak görünmektedir (31).

Ciddi Acinetobacter infeksiyonlarında kombinasyon tedavisi önerilmektedir. En sık kullanılan kombinasyon, düşük direnç oranları ve in vitro sinerji göstermesinden dolayı imipenem + amikasindir. Seftazidim + aminoglikozid veya florokinolon kombinasyonu da etkili olabilir. İmipenem + siprofloksasin kombinasyonunun in vitro ve in vivo aktivitesinin

olduğu gösterilmiştir. Sefoperazon + sulbaktam kombinasyonu A. baumannii’ye oldukça etkilidir (31).

İmipenem ve meropeneme orta düzeyde dirençli A. baumannii’nin kullanıldığı in vitro çalışmalarda rifampisin + kolistin kombinasyonu sinerjik etkili bulunmuştur (32).

İmipenem, doksisiklin ve amikasine duyarlı A. baumannii’nin kullanıldığı deneysel fare pnömoni modelinde ise imipenem + amikasin veya doksisiklin + amikasin kombinasyonu imipenem monoterapisinden daha etkili bulunmamıştır. Bu çalışmada doksisiklin + amikasin kombinasyonu in vitro olarak sinerjik etki göstermiştir (33).

Sulbaktama duyarlı A. baumannii’nin kullanıldığı deneysel pnömoni modelinde, sulbaktam imipenem kadar etkili bulunmuş, bir başka çalışmada ise levofloksasinin imipenem veya amikasin ile kombinasyonu, levofloksasin monoterapisinden daha etkili bulunmamıştır (34,35).

Sulbaktam, Acinetobacter türleri üzerine bakterisidal etkilidir. Beta laktam antibiyotikle kombine edilmiş sulbaktam (sefoperazon + sulbaktam, ampisilin + sulbaktam) tedavide iyi bir alternatiftir (36).

Genel olarak klinik çalışmalar incelendiğinde olgu sayısı oldukça az olmakla birlikte hastane kaynaklı pnömonilerde meropenem veya imipenem monoterapisi ile A. baumannii eradikasyonunun oldukça düşük oranlarda olduğu görülmüştür. Trakeobronşitli olgularda sulbaktam ve ampisilin-sulbaktam monoterapisi oldukça etkili bulunmuştur. Piperasilin-tazobaktam + amikasin ve seftazidim + amikasin tedavilerinde de tedavi sırasında direnç geliştiği ayrıca bildirilmiştir (31).

Gülhan ve ark. (37)’nın yaptığı bir çalışmada 2004–2006 yılları arasında infeksiyon etkeni olarak izole edilen A. baumannii kökenlerinin antibiyotik dirençlerinin belirlenmesi için MİK değerleri incelenmiştir. Bakterilerin 2004 ve 2006 yıllarına ait antibiyotik dirençleri sırasıyla; meropenem %7 ve %25, amikasin %59 ve %59, seftazidim %80 ve %88, siprofloksasin %54 ve %82, sefepim %83 ve %87, gentamisin %78 ve %87, ko-trimoksazole %73 ve %78 oranında tespit edilmiştir. Meropenem ve siprofloksasinde 2004’e göre 2006’da direnç artışı anlamlı bulunmuştur. A. baumannii kökenlerine en etkili antibiyotiklerin imipenem ve meropenem olduğu saptanmıştır.

Shokrylanbaran (38)’ın TÜEAUH’de yaptığı çalışmada çoğul dirençli A.baumannii kökenlerinde en yüksek sinerji oranları imipenem-tobramisin, ampisilin/sulbaktam-tobramisin ve seftazidim-amikasin, duyarlı kökenlerde ise imipenem-amikasin, imipenem-tobramisin, tikarsilin/klavulanat-amikasin, tikarsilin/klavulanat-netilmisin, seftazidim-netilmisin ve

seftazidim-siprofloksasin kombinasyonlarında gözlenmiştir. Ancak çoğul dirençli kökenlerde her zaman klinikte erişebilecek konsatrasyonlarda sinerji oluşmadığı saptanmıştır.

Acinetobacter baumannii İnfeksiyonlarında Kullanılan Antibiyotikler ve Direnç Mekanizmaları

Beta laktam antibiyotikler: Bu grup antibiyotikler ortak beta laktam halkası ile

antibakteriyel etkilerini gösterirler. Başlıca beta laktam antibiyotikler: Penisilinler, sefalosporinler, karbapenemler ve monobaktamlardır. Bakteri hücre duvarının sentezini bozarak bakterisidal bir etki oluştururlar. En önemli etkileri bakteri duvarında ayrı ayrı duran peptidoglikan komponentlerin birleşmesini sağlayan transpeptidasyon olayının aktivatör enzimi transpeptidazın aktivitesini bloke etmesidir (39).

1- Anti-psödomonas aktivite ile geniş spektrum gösteren penisilinler: Karboksi ve ureidopenisilin yapısındaki bu antibiyotiklerin gram negatif basiller üzerine etkinliği aminopenisilinlerden daha fazladır. Tikarsilin ile karbenisilinin etkisi benzerdir, fakat tikarsilinin etkin dozu daha düşüktür. Piperasilin ve azlosilin psödomonaslar ile gram negatif anaeroblara karşı yüksek aktivite gösterirler (39).

2- Penisilinlerle beta laktamaz inhibitörleri kombinasyonu: Beta laktamazlara duyarlı beta laktamların hidrolizini engellemek için önerilmektedir. Klavulanik asit ile amoksisilin ve tikarsilin kombinasyonları ile ampisilin/sulbaktam kombinasyonu bulunmaktadır. Sulbaktam yarı sentetik beta laktamaz inhibitörüdür (39).

3- Sefalosporinler: Cephalosporium türü mantarlardan elde edilen üç aktif fermentasyon ürünün biri olan sefalosporin-C türevi ilaçlardır. Birinci kuşak sefalosporinler gram pozitif koklara çok etkilidirler. İkinci kuşak sefalosporinler gram negatif bakterilere, özellikle proteus ve enterobakter üzerine biraz daha fazla etkilidirler. Üçüncü kuşak sefalosporinler enterobakterilere ikinci kuşaktan daha fazla etkilidirler. Organizmaya dağılımları birinci ve ikinci kuşak sefalosporinlerden iyidir (39).

4- Karbapenemler: İmipenem ve meropenem günümüzde kullanımda olan iki karbapenem derivesidir. Karbapenemler kimyasal olarak sentetik ya da yarı sentetik beta laktam türevi antibiyotiklerdir. Penisilinlerden farklı olarak, C1 atomuna bir kükürt atomu buna da bir tiazolidin halkası bağlanmıştır. C2 ve C3 atomlarında doymamış bağlar vardır. 6- transhidroksimetil grubunun varlığı birçok beta laktamaz türüne karşı molekülün direncini sağlar. Karbapenemler, başta PBP2 olmak üzere PBP1A, PBP1B, PBP3, PBP4 ve PBP5’e bağlanarak hücre duvar sentezini engellerler (40).

İmipenem, bir beta laktam halkası içerir, penisilin ve sefalosporinlerden farklı olarak α-halkasındaki sülfür atomunda metilen vardır. Bu yapı bakteri hücresindeki hedef proteinlere bağlanmasını arttırır. Bunun sonucunda etki spektrumu genişler ve antibakteriyel gücü artar. Molekül ağırlığı düşüktür, bakteri hücre membranından girişi kolay olur. Beta laktam halkasında bulunan hidroksimetil yan zinciri beta laktamazlara dayanıklılığı sağlar. Penem halkasında bulunan alkil tiyo yan zinciri ise molekülün P. aeruginosa’ya etkinliğini sağlamaktadır. Meropenem, gram negatif mikroorganizmalara karşı imipenemden daha etkilidir (40).

Karbapenemler tüm antibiyotikler içerisinde en geniş spektrumlu gruptur. Gram negatif çomaklar ve koklar, gram pozitif koklar ve anaeroplar üzerine etkilidirler. Diğer beta laktam antibiyotiklerde post-antibiyotik etki sadece gram pozitif bakteriler de görülürken, imipenemin hem gram pozitif hem de gram negatif bakteriler için post-antibiyotik etkisi saptanmıştır. Bu farkın nedeni, imipenemin PBP2’ye de bağlanarak bakterilerde sferoblast formasyonu oluşturmasıdır (40).

Aminoglikozidler: Aminoglikozidler, Streptomyces ve Micromonospora cinsi

mantarlardan elde edilen doğal ya da yarı sentetik bakterisidal etkili antibiyotiklerdir.

Etkilerini, mRNA’daki kodonların okunuşunu azaltarak ve tRNA antikodonlarındaki bilginin ribozomlarda yanlış okunması ile proteinlerin yanlış kodlanmasına yol açarak gösterirler. Bunun sonucunda bakteri protein sentezi sonlanır. Bu etkinin gerçekleşebilmesi için streptomisin ribozomal 30 S alt birimine bağlanırken diğer aminoglikozidler 30 S ribozom üzerinde birçok bölgeye ve aynı zamanda ribozomun 50 S alt ünitesine de bağlanırlar. Aminoglikozidler, bakterilerin dış membranlarındaki porin kanallarından periplazmik aralığa difüzyonla girer, ancak bakteri sitoplazmik membranını geçebilmeleri enerji ve oksijene bağımlı aktif transport mekanizması ile olmaktadır. Bu işlem Energy-Dependent Phase 1 (EDP 1) ve Energy-Energy-Dependent Phase 2 (EDP 2) olmak üzere iki fazda gerçekleşir. Diğer protein sentezini inhibe eden antibiyotikler bakteriyostatik etki gösterirken, aminoglikozidlerin bakterisidal etki göstermesinin transport esnasında hücre membranında delikler oluşmasına ve sonuçta hücre duvar geçirgenliğinin bozulmasına bağlı olduğu düşünülmektedir (41).

Kinolonlar: Kinolonlar, konsantrasyona bağımlı bakterisidal etkiye sahip

antibiyotiklerdir. Bakterilerde DNA replikasyonu için gerekli olan iki topoizomeraz (DNA giraz ve topoizomeraz IV) ile etkileşime girerek DNA sentezini durdurmaktadırlar. DNA giraz, iki GyrA ve iki GyrB alt birimlerinden oluşan tetramerik bir enzim olup gyrA ve gyrB

genlerinden kodlanır. Topoizomeraz IV de, ParC ve ParE alt birimlerinden oluşmaktadır. Florokinolonların gram pozitif ve gram negatif bakterilerdeki enzim hedefleri farklıdır. Gram negatif bakterilerde birincil hedef DNA giraz, gram pozitif bakterilerde ise topoizomeraz IV’tür (42).

Tetrasiklinler: Tetrasiklinler naftasenkarboksamid türevi bileşiklerdir. Yapılarında dört halka içerdiklerinden tetrasiklin adını almışlardır. Hepsinde karboksamid ortak yapısı vardır. R, R1, R2 ve R3 pozisyonuna farklı kökenlerin gelmesiyle birbirlerinden ayrılırlar. Bakteriyostatik etkili maddelerdir. Bakteriyostatik etkisi bakteri hücresinde ribozomların 30 S alt ünitelerine reverzibl bir şekilde bağlanarak, protein sentezi inhibisyonuyla meydana gelmektedir. Bu bağlanma sonucu, tRNA-aminoasit kompleksinin ribozom-mRNA kompleksiyle birleşmesi engellenir. Böylece protein sentezinde peptid zincirine yeni aminoasitlerin eklenmesi önlenmektedir. Minosiklin vestibüler sistemi bozarak sarhoşluk benzeri bir duygu oluşturabilmektedir. Gebe kadınlarda karaciğer üzerine olumsuz etkisi daha fazla olduğundan kontrendikedir. Doksisiklin nefrotoksisitesinin düşük olması ve dokulara kolay dağılması nedeniyle böbrek yetmezliği olanlarda ve prostatitte kullanılmaktadır. Minosiklin ve doksisiklin yağda çözünür bileşikler olduğundan kan beyin engelini kolayca geçebilirler, fakat yan etkileri nedeniyle menenjit tedavisinde ilk tercih ilaç olarak kullanılamamaktadırlar (39).

Sülfonamidler: Sülfonamidler dihidropteroat enzimini inhibe ederek folik asit,

dolayısıyla folinik asit sentez reaksiyonunu inhibe ederler. Sülfonamidlerin yapısı para aminobenzoik asit (PABA) yapısına benzediğinden, bakterilerin büyümesinde gerekli olan ve dışarıdan sağlanan bu madde ile sülfonamidler yalancı substrat gibi etkileşerek yarışmaya girmektedir. Bakterilerden farklı olarak insan hücrelerinde, besinlerle alınan folik asit hücre içine geçebildiğinden sülfonamidler etkili olamamaktadır (39).

Acinetobacterlerde Direnç Mekanizmaları

Nozokomiyal infeksiyonlarda sıklıkla karşılaşılan çoğul dirençli Acinetobacter’lerin yoğun bakım ünitelerindeki infeksiyonlarının tedavisinde büyük problemler yaşanmaktadır. Aminoglikozidler, üreidopenisilinler, florokinolonlar, üçüncü kuşak sefalosporinler gibi geniş spektrumlu antibiyotiklerin yaygın kullanımı, Acinetobacter türlerini antibiyotiklere dirençli hale getirmiştir (43). A. baumannii ampisilin, amoksisilin, birinci kuşak sefalosporinlere doğal direnç özelliği gösterir (44). A. baumannii diğer türlere göre daha dirençlidir ve YBÜ’deki mortalitenin %19-25’inden sorumludur (9).

Transpozonlar ve plazmidler, Acinetobacter türlerinin biyolojisinde önemli rol oynarlar. Acinetobacter’lerin %80 oranında çeşitli molekül büyüklüklerinde çok sayıda plazmid taşıdıkları bildirilmiştir. Kromozomda lokalize transpozonlar aracılığıyla çoğul antibiyotik direnç geninin taşındığı bildirilmiştir (17).

Acinetobacter’lerde bulunan antibiyotik direnç mekanizmalarının bazıları Tablo 2’de gösterilmiştir.

Tablo 2. Acinetobacter’lerde bulunan antibiyotik direnç mekanizmaları (1) ANTİBİYOTİKLER MEKANİZMA

Beta laktamlar Beta laktamaz (plazmid ve/veya kromozom kökenli) Penetrasyonun azalması

Hedef molekülde değişiklik

Aminoglikozidler Enzim ile modifikasyon İçeri alınmanın azalması

Florokinolonlar Hedef molekülde değişiklik

Penetrasyonun azalması, aktif dışarı atım

Acinetobacter spp.’ler genellikle penisilinleri etkileyen TEM–1, TEM–2 ve CARB–5, sefalosporinleri etkileyen ACE 1–4 gibi beta laktamazlara sahiptirler (31). PBP’lere afinite azalması önemli bir direnç gelişme mekanizmasıdır (40).

Karbapenem direncinin en önemli nedeni beta laktamaz aktivitesidir. Karbapenemazlar kromozom ve plazmid kontrolünde üretilebilirler. Karbapenemler metallo beta laktamazlara duyarlıdırlar ve bu enzimler tarafından hidrolize edilirler (40).

Karbapenemlerin çoğu beta laktamazlar tarafından hidrolize edilmezler. Acinetobacter türlerinde karbapenem ve yeni kuşak sefalosporinleri hidrolize eden metallo beta laktamazlar tanımlanmıştır ( IMP, VIM). Bu enzimler plazmidlerce kodlanan sınıf B beta laktamazlardır (45–47).

İskoçya’da 1985 yılında plazmid kaynaklı, karbapenemleri hidrolize eden ilk beta laktamaz ARI–1 (Acinetobacter rezistant imipenem) olarak tanımlanmıştır. İmipenemi hidrolize etmekte ancak ikinci ve üçüncü kuşak sefalosporinlere etki etmemektedir (48). Bu enzime daha sonra OXA–23 adı verilmiştir.

Yeni çalışmalarla diğer OXA enzimleri (OXA–23, OXA–27, OXA–40, OXA–51, OXA–58) tanımlanmıştır (48,49). Tüm bu enzimler plazmidlerce kodlanan sınıf D karbapenemazlardır.

İmipenem veya meropenemden herhangi birini veya her ikisini de hidrolize edebilen enzimlere karbapenemazlar denir. Çoğunlukla IMP ve VIM türü olan bu enzimler, aktif bölgelerinde taşıdıkları metal iyonları nedeniyle metallo beta laktamazlar olarak da adlandırılırlar. Karbapenemler, Acinetobacter türlerine en etkili antibiyotikler olarak görünmekle birlikte, direnç oranları giderek artmaktadır. Üçüncü kuşak sefalosporinlerin kullanımının karbapenem dirençli suşların ortaya çıkmasıyla anlamlı olarak birlikteliği gösterilmiştir (50).

Karbapenemlere etkili diğer enzimlerin ise ARI–1 ve ARI–2 enzimleri olduğu gösterilmiştir (31).

Diğer türlere göre A. baumannii kökenlerinde beta laktam direnci daha sıktır (17,51,52). Beta laktam antibiyotiklere karşı oluşan direnç üç farklı mekanizma ile gelişebilmektedir:

1- Beta laktamaz enzimleriyle antibiyotiğin parçalanması, 2- Beta laktam antibiyotiğin hücre içine girişinin engellenmesi, 3- Penisilin bağlayan proteinlerde (PBP) değişikliklerin oluşması,

Genellikle bu mekanizmaların bir arada işlemesi sonucu direnç gelişimi gözlenmektedir (52).

1- Beta laktamaz enzimleriyle antibiyotiğin parçalanması: Acinetobacter

kökenlerinde beta laktam direncinin en önemli sebebidir. Plazmid, kromozom veya transpozon kontrolünde sentezlenirler.

Gram negatif bakterilerdeki kromozomal beta laktamazların miktarları, sentez yolu ve direçteki rolleri farklılık göstermektedir (52).

Gram negatif bakterilerin çoğu, tür özelliği olarak, değişik sınıflamalara göre AmpC veya Bush-Jacoby-Mederios Grup 1 olarak adlandırılan kromozomal beta laktamazlar üretir. Normalde düşük düzeyde üretilen bu beta laktamazlar, ortamda bir indükleyici bulunması halinde sentezlerinin uyarılması, indükleyici ajan ortadan kalktığında sentezin tekrar bazal seviyeye inmesi nedeniyle, indüklenebilir beta laktamazlar (İBL) olarak da adlandırılır. İBL’ler, yüksek düzeyde üretildiklerinde, karbapenemler hariç tüm beta laktamları parçalayabilme özelliğindedirler (53).

Acinetobacter türlerinde bulunan kromozomal enzimlerin büyük çoğunluğu Ambler sınıf C içerisinde yer almakta ve sefalosporinaz aktivitesi göstermektedir. Yapılan çalışmalarda A. baumannii kökenlerinin %98’inde sefalosporinaz aktivitesi saptanmıştır (52,54).

Bu enzimler aktif bölgelerinin özellikleri nedeniyle birinci, ikinci, üçüncü kuşak sefalosporinleri, penisilinleri ve monobaktamları hidrolize edebilirler (53).

AmpC beta laktamazların karbapenemler üzerine etkileri son derece az olmasına karşın, bu enzimlerin aşırı üretimi dış membran porin değişiklikleri gibi bir diğer mekanizma ile birleştiklerinde karbapenem direncine yol açabilmektedir (55).

Bu enzimler, aktif bölgelerinin yapısal özellikleri nedeniyle klavulanik asit ve sülfonların beta laktam halkalarına bağlanamaz. Bu nedenle de, bu beta laktamaz inhibitörlerine dirençlidirler (53).

Sınıf C beta laktamazlar imipenem ile bağlandığında, antibiyotiğin 6α pozisyonundaki büyük hidroksietil yan zinciri, açil enzim türevinin elektrofilik açil merkezini hidrolik saldırıdan korunacak şekilde kaydırmaktadır. Bunun sonucunda enzim, açil türevinden ayrılmamakta ve inhibe olmaktadır (53). Yeni tanımlanan sınıf C enzimler günümüzde Acinetobacter kökenli sefalosporinazlar olarak adlandırılırlar (54).

ACE–1, ACE–2, ACE–3, ACE–4 enzimler, Ambler sınıf C’de yer alan sefalosporinazlardır. ACE–1 sefuroksime karşı zayıf etkili, klavulonik aside dirençli en geniş spektrumlu enzimdir (17,52).

İmipeneme dirençli A. baumannii kökenlerinde kromozomal OXA–24 enzimi gösterilmiştir. Bu enzim, Ambler sınıf D’de yer almakta ve karbapenemleri hidrolize etmektedir (56–58).

Plazmidlerce kodlanan enzimler sınıf A, B ve D beta laktamazlar içerisinde yer almaktadırlar (58). Ambler sınıf A’da yer alan TEM–1 ve TEM–2 beta laktamazlarının varlığı, Acinetobacter türlerindeki beta laktam direncinden büyük ölçüde sorumlu tutulmaktadır. Plazmid bağımlı beta laktamazlar beş başlık altında toplanabilir (52):

1) TEM–1, TEM–2 ve SHV–1 enzimleri,

2) Klasik OXA ve PSE enzimleri ve daha nadir dar spektrumlu enzimler, 3) TEM ve SHV türevi GSBL’ler,

4) TEM ve SHV’den kaynaklanmayan GSBL’ler, 5) İnhibitör dirençli TEM mutantları.

Bir çalışmada Acinetobacter kökenlerinin %16’sının TEM–1 beta laktamaz ve tamamına yakınının sefalosporinaz oluşturduğu bildirilmişse de TEM–1 ve sefalosporinazın varlığı geniş spektrumlu sefalosporinlere ve karbapenemlere direnci açıklayamamaktadır (59). Yapılan çalışmalarda TEM–1, TEM–2 ve SHV dışı sınıf A’da yer alan genişlemiş spektrumlu beta laktamazlar (GSBL) tanımlanmıştır. Bu beta laktamazlar, PER–1 ve VEB–1 enzimleridir. PER–1 ve VEB–1 enzimleri alt grup 2d’de yer alırlar. VEB–1 enzimi ilk olarak 2001 yılında Fransa’dan yayınlanmıştır (60–62). Ambler sınıf A’da yer alan GSBL olan PER–1 enzimi ilk kez 1996 yılında Türkiye’de saptanmış ve PER–1 enzimi taşıyan kökenlerle gelişen infeksiyonlarda prognozun daha kötü olduğu bildirilmiştir. Bunlar seftazidim ve gentamisine yüksek dirençli, amikasine orta dirençli, imipenem ve meropeneme duyarlı veya kısmen duyarlıdırlar (25,60).

Dünyada Acinetobacter türleri arasında GSBL’ye bağlı direnç çok az bildirilmektedir. Ülkemizde ise hastane kökenli izolatların %46’sında PER–1 (GSBL) türü direnç bulunmaktadır (60).

Vila ve ark. (63) plazmidlerce kodlanan sınıf D beta laktamaz (oksasilinaz) tanımlamışlar ve OXA–21 olarak adlandırmışlardır. Bu enzim oksasilin, kloksasilin ve metisilini hidrolize etmektedir.

2- Beta laktam antibiyotiğin hücreye girişinin engellenmesi: Enzimlerle beta

laktam antibiyotiklerin inhibisyonu direnç gelişiminde tek neden değildir. Hücre duvar geçirgenliğinde azalma direnç gelişimine önemli bir katkı sağlamaktadır (17,51).

Bakterinin dış membranı, antibiyotikler ve diğer moleküller için yarı geçirgen bir engel oluşturmaktadır. Beta laktam gibi küçük hidrofilik moleküller, bakteri içine dış membran porin proteinleri yolu ile girer. Acinetobacter kökenlerinde dış membran geçirgenliği, Escherichia coli’nin %1-3’ü kadardır. Protein 1 ve 2, A. baumannii’nin dış membran porinlerini oluşturmaktadır (46).

Yapılan çalışmalarda carO tarafından kodlanan 29 kDa’luk dış membran proteininde azalma karbapenem direncinde önemli rol oynamaktadır. Porin protein sayısını değiştiren mutasyonlar sonucu direnç gelişebilir (55,64,65).

3- Penisilin bağlayan proteinlerde (PBP) değişikliklerin oluşması: Bu tip direnç

esas olarak stafilokok ve enterokok gibi gram pozitif türlerde görülmekle beraber Acinetobacter türlerinde de tanımlanmıştır. Burada direnç, PBP sayısında azalma, kromozomal mutasyonlar sonucu PBP’lerin antibiyotiklere afinitelerinin azalması ve beta laktam antibiotiklere düşük afinite gösteren yeni PBP sentezlenmesi şeklinde gelişebilir (52).

Aminoglikozidlere direnç gelişiminde temel olarak enzimatik modifikasyon sorumludur (31). En önemli direnç mekanizması plazmid orjinli enzimlerin (asetiltransferaz, fosfotransferaz, adeniltransferaz) oluşmasıyla aminoglikozidlerin, asetilasyon, fosforilasyon ya da adenilasyon gibi işlemlerle inaktive olmalarıdır (39).

Kinolonlara karşı direnç gelişiminde en önemli mekanizmalar ise gyrA ve parC genlerindeki mutasyonlardır (31). Kinolonlara karşı direnç oluşması plazmidler tarafından taşınmamaktadır (39).

Tetrasiklinleri bakteri dışında elimine eden transmembraner aktif transport debisinde ya da bu görevi yapan indüksiyon sistemindeki bir azalmayla bakterilerde direnç oluşabilmektedir. Bir tetrasikline dirençli olan diğerine de direnç kazanmaktadır. Ancak eski kuşak tetrasiklinlere dirençli olan bazı suşlar minosiklin ve doksisiklin gibi yeni kuşak tetrasiklinlere duyarlıdırlar (39).

Bakteriler, PABA sentezinin artmasıyla ya da dihidropteroat sentetazın yapısında meydana gelen değişiklikle sülfonamidlere karşı direnç kazanabilirler. Direnç plazmidler tarafından da taşınabilmektedir (39).

Epidemiyoloji

Acinetobacter türleri cansız yüzeylerde günlerce canlı kalabilmektedirler. Toprak, gıda, su, eşya, hava gibi çevreden izole edilen Acinetobacter kökenlerinin sağlıklı insanların ağız florasında, üst solunum yollarında, genitoüriner sistem ve alt gastrointestinal sistemlerinde bulunduğu gösterilmiştir (21,27).

Hastane kaynaklı infeksiyonların yanı sıra kolonizasyon nedeniyle de mikroorganizma klinik örneklerden izole edilmektedir (17,20).

Yoğun bakım ünitesinde yatmakta olan hasta dışkılarından çoklu ilaç direnci olan Acinetobacter spp. izole edilmiş ve trakeostomili hastaların %45’inde kolonizasyon saptanmıştır (18,27).

Dirençli mikroorganizmaların taşınması birkaç aşamada oluşur. Dirençli bakterilerin taşınmasında en önemli risk faktörü hastalığın ciddiyetidir. Sağlıklı bireyler sağlam bağışıklık sistemleri ile bu bakterileri uzaklaştırırlar. Sağlıksız bireyler ise boğazlarında, cilt lezyonlarında ve özellikle barsaklarında bu dirençli bakterileri taşırlar. Hastalar hastaneye başvurduğunda dirençli bakterileri taşıyor olabilir ya da YBÜ’de dirençli bakterileri alabilirler. Dirençli mikroorganizmalar en fazla eller ile hastadan hastaya taşınır. Ek olarak kirli ekipmanlar ile de taşınmaktadır (66).

TİPLENDİRME YÖNTEMLERİ Fenotiplendirme Yöntemleri

Bugüne kadar bilinen patojen bakterilerin çoğu tanımlanmış ve bunların identifikasyonunda anahtar olabilecek fenotipik özellikler belirlenmiştir. Fenotipik yöntemler genetik özellikleri yansıtır ve genellikle oldukça spesifiktir. Belirli bir fenotip bir patojen kökende ender olarak bulunuyorsa, bu fenotip tek başına kökenin yayılma yolu hakkında fikir verebilir. Ancak her zaman görülebilen fenotipik özelliklere sahip kökenler söz konusu olduğunda ise, ek olarak alt tiplendirme yapılmalıdır. Alt tiplendirim için sıklıkla kullanılan yöntemler arasında; antimikrobiyal maddelere duyarlılık veya başta ağır metaller olmak üzere çeşitli kimyasal maddelere duyarlılık modellerinin belirlenmesi, biyotiplendirme, faj ve bakteriyosin tiplendirme, serotiplendirme, protein elektroforezleri (tam hücre proteini, immünoblotting, multilokus enzim elektroforezi, zimotiplendirme) sayılabilir (67).

Fenotipik yöntemlerin duyarlılığını azaltan çeşitli nedenler vardır (67). Bunlar; 1-Çevresel seçici baskılardan etkilenme,

2-Antijen yapısının değişken olması,

3-Direnç modellerinin antibiyotik tedavisinden güçlü bir şekilde etkilenmesi, 4-Fenotipik özelliklerin her zaman eksprese olmayan genlerde kodlanabilmesi, 5-Ticari olarak bulunmayan bazı ayıraçların gereksinimi,

6-Bir tür içindeki her bir kökeni ayırdetmeye yeterli farklılıkların bulunmaması.

Fenotipik yöntemlerin yetmediği durumlarda genotipik tiplendirme yöntemlerine başvurulur.

Genotipik Tiplendirme Yöntemleri

Bakteri plazmidlerinin veya kromozomal DNA’ nın genotiplendirmesi, fenotiplendirme yöntemlerindeki olumsuzlukları ortadan kaldırmış ve epidemiyolojik araştırmalarda daha güvenilir veriler sağlamıştır. Alt tiplendirmenin belirlenmesinde kullanılan tüm moleküler yöntemler, DNA dizisindeki farklılıkların saptanmasına dayanır (67).

Yöntem seçiminde ayırıcı güç, üstün bir tekrarlanabilirlik özelliği, uygulama ve sonuçları değerlendirmedeki karmaşıklıkların dikkate alınmasının yanında, maliyet ve laboratuvarın yöntemi uygulayabilme kapasitesi de büyük önem taşır (67).

Acinetobacter cinsi genotipleme ile 19 genotipe ayrılmıştır. Acinetobacter genomik türleri Tablo 3’te gösterilmiştir.

Tablo 3. Acinetobacter genomik türleri (1)

GENOTİPİK TÜR NUMARALANDIRMALARI Tür adı Bouvet ve ark. Tjernberg ve

Ursing Nishimura ve ark. Köken tipi A. calcoaceticus 1 1 1N ATCC 23055 A baumannii 2 2 1N CIP 70.34

İsimlendirilmemiş 3 3 Çalışılmamış ATCC 19004

İsimlendirilmemiş Gruplanmamış 13TU Çalışılmamış ATCC 17903

A.haemolyticus 4 4 4N ATCC 17906

A.junii 5 5 Çalışılmamış ATCC 17908

İsimlendirilmemiş 6 6 4N ATCC 17979

A. johnsonii 7 7 3N ATCC 17909

A. lwoffii 8 8TU 2N ATCC 15309

İsimlendirilmemiş 9 8TU Çalışılmamış ATCC 9957 İsimlendirilmemiş 10 10 Gruplanmamış ATCC 17924 İsimlendirilmemiş 11 11 Gruplanmamış ATCC 11171

A.radioresistens 12 12 5N IAM 13186

İsimlendirilmemiş 13 14TU Çalışılmamış ATCC 17905 İsimlendirilmemiş 14 Çalışılmamış Çalışılmamış Bouvet 382 İsimlendirilmemiş 15 Çalışılmamış Çalışılmamış Bouvet 240 İsimlendirilmemiş 16 Gruplanmamış Çalışılmamış ATCC 17988 İsimlendirilmemiş 17 Çalışılmamış Çalışılmamış Bouvet 942 İsimlendirilmemiş Çalışılmamış 15TU Çalışılmamış Tjernberg 151A

Genotiplendirme yöntemleri fenotiplendirmeye göre; tiplendirebilirlik, tekrarlanabilirlik ve ayırıcı güç yönünden daha üstündür (67).

Farklı genotipik tiplendirme yöntemleri bulunmaktadır. Bunlar;

1- Plazmid profil analizleri: Epidemiyolojik yönden incelenecek kökenlerin

plazmidlerinin ayrılarak, agaroz jel elektroforezi ile analiz edilmesine dayanan bu yöntemler mikroteknik uygulamalar nedeni ile fazla gereç ve yer gerektirmeyen, kolay, ucuz, hızlı ve tekrarlanabilir olma özelliğine sahiptir. Sonuca varmak için gen ekspresyonuna gereksinim olmaması diğer bir avantajlı yönünü oluşturur (67).

Plazmidler, bakteri türleri ve hatta cinsleri arasında başta konjugasyon olmak üzere birçok mekanizma ile nakledilebildiğinden, hastanelerdeki epidemiler bazen tek kökenin yayılması ile değil, bir plazmidin yayılması ile ortaya çıkar. Epidemik kökenin plazmid taşımaması, birçok plazmidin kolayca kaybedilmesi veya kazanabilmesi ve birer ekstrakromozomal element olduklarından doğal olarak bakterinin genotipini yansıtmaması bu yöntemin olumsuz yönlerini oluşturur (67).

Plazmid profil analizleri Acinetobacter kökenlerinin tiplendirilmesi için günümüzde çeşitli çalışmalarda hızlı ve basit metot olarak kullanılır. Acinetobacter kökenlerinde hem boyut hem de sayı olarak çeşitli plazmidler bulunmuştur (1).

2- Ribotiplendirme: Ribozomal operonlar ile ilgili DNA sıralarındaki değişkenlikleri

belirlemek için cins, tür veya gruba özel ribozomal RNA’lar birer prob olarak kullanılır. Ribotiplendirmede kökenlerin DNA’sı izole edilir, restriksiyon enzimleri ile kesilir ve elektroforez ile DNA parçaları ayrıştırıldıktan sonra seçilmiş prob ile hibridize edilir. Ribozomal gen modellerinin bir tür içinde nispeten stabil halde bulunması, epidemiyolojik kökenleri birbirinden ayırmada yöntemin gücünü bir dereceye kadar azaltır (67).

Ribotiplendirme diğer tip metodlarla kombine edilerek kullanıldığında değerli epidemiyolojik bilgiler sağlanabilir (1).

3- Pulsed field gel electrophoresis (PFGE): Yüksek oranda tekrarlanabilirlik

özelliğine sahip olduğundan, bu yöntem birçok araştırmacı tarafından moleküler yöntemler içinde altın standart olarak kabul edilmiştir (67).

Bu yöntemde kökenler eritilmiş agaroz ile karıştırılır, bir deterjan enzim ile lizise uğratılır ve restriksiyon enzimleri ile kesilir. Daha sonra agaroz jelde PFGE uygulanır. Aynı türün farklı alt tiplerindeki genomik farklılıklar, restriksiyon enzimleri ile kesildikleri bölgelerin de farklı olmasına neden olur. İncelenen kökenler, genotipik yönden benzer bulunduğunda, epidemik ve endemik kökenlerin kesin olarak ayırt edilebilmesi için en az iki enzim ile restriksiyon analizi yapılması önerilmektedir (67).

Acinetobacter kökenlerinin DNA’sı izole edildikten sonra ApaI, SmaI ve NheI restriksiyon enzimleri ile parçalanması sonucu oluşan DNA parçalarının uzunluk polimorfizmi gösterilmektedir. Bu yöntem, A.baumannii için salgınlarda veya bir hastanın izole edilen farklı kökenlerin tiplendirilmesinde yararlı bir metottur. Dezavantajı, pahalı ve uzun süreye ihtiyaç duyulmasıdır. PFGE oldukça ayırt edici ve epidemiyolojik çalışmalar için çok yararlı bir metottur (68–70).

4- Southern blotting ve restriksiyon fragman uzunluk polimorfizmi: Gen

belirleme için tam kromozomal DNA bir restriksiyon enzimi ile kesilir ve parçalar agaroz jel içinde elektroforez ile ayrılır. Parçalar, agaroz jelden nitroselüloza veya naylon membrana Southern blotting ile geçirilir. Membrana bağlı nükleik asit daha sonra bir veya daha çok işaretli ve incelenen gen ile homolog olan prob ile hibridize edilir. Restriksiyon fragman uzunluk polimorfizm analizinde sadece problarla hibridize olan DNA parçaları görülür hale geldiği için sonuçların analizi de büyük ölçüde kolaylaşmıştır (67).

5- Polimeraz zincir reaksiyonu: Polimeraz zincir reaksiyonu, 50–2000 baz çiftli

DNA veya RNA’nın tek zincirinin bir yarı otomatik sistem içinde birkaç saatte primerler kullanılarak bir milyondan fazla kat çoğalmasını sağlayan üç basit reaksiyonun (denatürasyon, birleşme, DNA sentezi) bir döngü halinde tekrarlanmasıdır. Duyarlılık ve özgüllüğü yüksek ve hızlı bir yöntem olması, mikroorganizmaların ve ürünlerin direkt olarak tiplendirilmesi yararlı özellikleridir. Buna karşın, kontaminan DNA’nın amplifikasyonuna ya da epidemi ile ilgisi bulunmayan mikroorganizmaların çok benzer nükleik asit sıralarının tanımlanmasına bağlı olarak yanlış pozitif sonuç vermesi, primerlerin sadece hedeflenen nükleik asit sırasını tanımlaması da, epidemiyolojik araştırmalarda polimeraz zincir reaksiyonunun güvenilirliğini azaltan başlıca olumsuz özelliklerdir (67).

A. baumannii kökenlerinin ilişkisini belirlemek için polimeraz zincir reaksiyonunda M13 bakteriyofajının kor bölgesi, ERIC 1 ve ERIC 2 primerleri kullanılabilir (1).

Rastgele çoğaltılmış polimorfik DNA yöntemi: Düşük bağlanma sıcaklıklarında kromozomal DNA sıralarına yeterli afinite ile hibridize olan 9-10 baz sıralı rastgele primerlerin kullanılmasıdır. Bu rastgele primer bölgeleri yerleşim ve sayıları yönünden bir bakteri türünün değişik suşlarında farklılık gösterir. Sonuçta agaroz jelde elektroforez ile her bir farklı köken için karakteristik bantlar ortaya çıkar (67).

Tekrarlayan gen dışı palindromik polimeraz zincir reaksiyonu: Bakteri genonumundaki tekrarlayan DNA elementlerinin, polimeraz zincir reaksiyonu ile amplifikasyonundan elde edilen suşa özgül modellerinin incelenmesi suretiyle bakteri DNA’sının parmak izinin belirlenmesidir (71).

6- DNA dizi analizi: Bunun için DNA hibridizasyonu yapılır. Çift zincirli DNA tek

zincirli hale getirilmek üzere denatüre edilir ve sonra işaretlenmiş komplementer tek zincirli DNA probuna bağlanma oranını belirlemek için ölçüm yapılır. Enterobacteriaceae üyesi suşların alt tiplendirilmesinde sıklıkla kullanılır (67).

DNA dizi analizi maliyeti pahalı ve sonuçların yorumlanması yönünden en zor yöntemdir (67).

GEREÇ VE YÖNTEMLER

Bu çalışma Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik Kurulu onayı alınarak (Ek–1) ve Trakya Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu (TÜBAP) tarafından 802 numaralı proje ile destek sağlanarak Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Laboratuvarı’nda gerçekleştirildi.

Çalışmada TÜEAUH’de yatan hastaların kan kültürlerinden Hİ etkeni olarak 2004– 2006 tarihleri arasında izole edilen A. baumannii kökenleri kullanıldı. İmipenem dirençli A. baumannii kökenlerine PFGE uygulandı. Bu nedenle imipenem direncinin çok görüldüğü servislerden izole edilen kökenler çalışmaya alındı. Bir hastadan tekrar izole edilen kökenler çalışmaya alınmadı.

ÇALIŞMADA KULLANILAN BESİYERİ VE KİMYASALLARIN HAZIRLANMASI

Besiyerleri

1) Beyin kalp infüzyon buyyonu (BHI): Toz BHI (Oxoid, İngiltere)’den 37 gr

alınarak hacim distile su ile 1000 ml’ye tamamlandı. Manyetik karıştırıcıda (Schott Gerate, GMBH, Almanya) eritildikten sonra deney tüplerine 5’er ml dağıtıldı. Otoklavda (OT 4060 Nüve, Türkiye) 121 °C’de 15 dk tutularak sterilizasyon sağlandı.

2) Eosin-metilen blue agar (EMB): Toz EMB (Oxoid, İngiltere)’den 37,5 gr alınarak

hacim distile su ile 1000 ml’ye tamamlandı. Manyetik karıştırıcıda karıştırılarak kaynatıldıktan sonra otoklavda 121 °C’de 15 dk tutularak sterilizasyon sağlandı. Su

banyosunda (ST 402 Nüve, Türkiye) 50 °C’ye soğutulup steril petrilere dökülerek kullanıma hazır hale getirildi.

3) Müller-Hinton agar besiyeri: Toz MHA (Oxoid, İngiltere)’dan 38 gr alınarak

hacim distile su ile 1000 ml’ye tamamlandı. Manyetik karıştırıcıda karıştırılarak kaynatıldıktan sonra otoklavda 121 °C’de 15 dk tutularak sterilizasyon sağlandı. Su banyosunda 50 °C’ye soğutularak steril petrilere döküldü, kullanıma hazır hale getirildi.

4) Müller-Hinton buyyon besiyeri: Toz MHB (Oxoid, İngiltere)’den 21 gr alınarak

hacim distile su ile 1000 ml’ye tamamlandı. Manyetik karıştırıcıda eritildikten sonra deney tüplerine 2’şer ml dağıtıldı. Otoklavda 121 °C’de 15 dk tutularak sterilizasyon sağlandı.

5) Deoksiribonükleaz (DNaz) besiyeri: Toz DNaz agar (Oxoid, İngiltere)’dan 39 gr

alınarak hacim distile su ile 1000 ml’ye tamamlandı. Manyetik karıştırıcıda karıştırılarak kaynatıldıktan sonra otoklavda 121 °C’de 15 dk tutularak sterilizasyon sağlandı. Su banyosunda 50 °C’ye soğutulup steril petrilere dökülerek kullanıma hazır hale getirildi.

6) DNaz miyarı: 97,2 ml distile su ile 2,8 ml %37’lik HCl(Riédel de haën, Almanya) karıştırılarak hazırlandı.

7) Sütlü besiyeri: Süt tozu (Oxoid, İngiltere)’ndan 10 gr alınarak 100 ml distile su ile

karıştırıldı. Manyetik karıştırıcıda eritildikten sonra ependorf tüplerine 1’er ml dağıtıldı. Kapakları kapatılıp, küçük sporlara dizildi. Otoklavda 121 °C’de 15 dk tutularak sterilizasyon sağlandı.

8) Triple sugar iron agar (TSI): Toz TSI (Oxoid, İngiltere)’den 64,6 gr alınarak

hacim distile su ile 1000 ml’ye tamamlandı. Manyetik karıştırıcıda karıştırılarak kaynatıldıktan sonra su banyosunda 50 °C’ye kadar soğutuldu. Deney tüplerine 8–9 ml konuldu. Otoklavda 121 °C’de 15 dk tutularak sterilizasyon sağlandı. Otoklavdan çıkınca tüpler 2,5–3 cm dik kısım ve üstte bir yatık kısım kalacak derecede yatık tutularak katılaştırıldı.

Kimyasallar ve Ayıraçlar

1) Kovacs ayıracı: N, N, N, N-Tetrametil-p-fenilenediamin hidroklorürün (Sigma,

Almanya) distile sudaki %1’lik eriyiği hazırlandı.

2) 0,5 McFarland bulanıklık tüpü: 2007 Klinik ve Laboratuvar Standartları

PFGE İçin Gerekli Solüsyonlar

1) Triptik soy buyyon: Toz TSB (Oxoid, İngiltere)’den 30 gr alınarak hacim distile

su ile 1000 ml’ye tamamlandı. Eritildikten sonra, otoklavda 121°C’de 15 dk tutularak sterilizasyon sağlandı. Steril tüplere 10 ml olacak şekilde dağıtıldı.

2) Tampon solüsyonu (1M Tris–0,5mM EDTA-5M NaCl stok solüsyonu): 10

mM’lık Trizma-baz (Sigma, ABD)’dan 1,211 gr. alınıp 10 ml distile suda karıştırıldı ve 1 M’lık Trizma-baz elde edildi. Bu karışımdan tampon solüsyon için 1 ml alındı. 50 mM’lık EDTA (Sigma, ABD)’dan 18,612 gr alınıp 100 ml’de karıştırılıp 0,5 M’lık EDTA elde edildi. Bundan da tampon solüsyon için 10 ml alındı. 5 M’lık NaCl’den (Sigma, ABD) 400 µl alındı. Tampon solüsyon için alınanlar 88,5 ml distile su ile 100 ml’ye tamamlandı, pH: 8,0’a ayarlandı.

3) Lizozim baz solüsyonu: 1 M’lık Tris (Sigma, ABD) (pH: 7,2)’ten 1 ml, 5 M

NaCl’den 1 ml, %10’luk Na deoksikolattan (Sigma, ABD) 2 ml, %10’luk Na laurilsarkosinden (Sigma, ABD) 5 ml alınarak hacim distile su ile 100 ml’ye tamamlandı. 20 µl lizozim stoğundan solüsyonun içine katıldı.

4) Lizozim stok solüsyonu: 1 ml distile su içine 0,05 gr. lizozim liyofilize (Sigma,

ABD) karıştırıldı.

5) Proteinaz K baz solüsyonu: 0,5 M EDTA (pH: 8,0)’dan 20 ml, %10 Na

deoksikolattan 2 ml, %1 Na laurilsarkosinden 10 ml alınarak hacim distile su ile 100 ml’ye tamamlandı.

6) Proteinaz K stok solüsyonu: Proteinaz K (Sigma, ABD ) 1 ml’de 20 mg olacak

şekilde distile su ile karıştırıldı.

7) Pmsf çözeltisi: 10 ml etanol içinde 0,174 gr pmsf (Sigma, ABD) çözündürüldü. 8) Yıkama tamponu: 1 M Tris (pH: 8,0)’ten 2 ml, 0,5 M EDTA’dan 10 ml alınarak

hacim distile su ile 100 ml’ye tamamlandı, pH: 8,0’a ayarlandı.

9) 1/100 oranında yıkama tamponu + Pmsf: 10 ml Yıkama Tamponu ile 100 µl

Pmsf çözeltisi karıştırıldı.

10) 5 M NaCl solüsyonu: 5 M’lık hazır solüsyondan kullanıldı.

11) 10xTBE stok tampon solüsyonu: Trizma-baz’dan 108 gr, borik asit (Merck,

Almanya)’ten 55 gr, 0,5 M EDTA’dan 40 ml alınarak hacim distile su ile 1000 ml’ye tamamlandı. Manyetik karıştırıcıda eritildikten sonra pH: 8,0’a ayarlandı.

12) 0,5 M EDTA: Cam şişeye 50 mM EDTA’dan 18,612 gr alınıp hacim distile su ile

13) 0,5xTBE: 250 ml 10xTBE’den alıp 4750 ml distile su ile karıştırıldı.

14) Düşük donma dereceli agaroz: 100 ml distile su içine 2 gr düşük donma dereceli

agaroz (Sigma, ABD)’dan alınıp karıştırılarak mikrodalga fırında (Arçelik) eritildi ve kullanılıncaya kadar 55 °C su banyosunda bekletildi.

15) Etidyum bromür: 100 ml distile su içinde 1 gr etidyum bromür (Sigma, ABD)

çözündürüldü. Hazırlanan solüsyon ışıktan korunarak +4 °C’de saklandı.

16) 1xTBE tampon solüsyonu: Stok olarak hazırlanan 10xTBE solüsyonu distile su

ile 1/10 oranında sulandırılarak elde edildi.

17) %1 agaroz jel: Agaroz (Sigma, ABD)’dan 1,5 gr, 0,5xTBE tamponundan 150 ml

alınıp karıştırılarak mikrodalga fırında (Arçelik) eritildi ve kullanılıncaya kadar 55 °C’de su banyosunda bekletildi.

BAKTERİLERİN KÜLTÜRÜ

Kan kültürlerinden geleneksel yöntemlerle A .baumannii olarak tanımlanan kökenlerin Hİ etkeni olarak kabul edilenleri sütlü besiyerinde – 70 °C’de saklandı. Stoklanmış bakteriler çalışma anında iki kez EMB agara pasajlandı ve 36 °C’ye ayarlı etüvde (EN 500, Nüve, Türkiye) 20–24 saat inkübe edildi.

ÇALIŞMA AKIŞI

1) Bakteri kültürü ve geleneksel yöntemlerle bakteri tanımlanması 2) Disk difüzyon metodu ile antibiyotik duyarlılık testi yapılması

3) Sonuçların ‘Clinical and Laboratory Standarts Institute’ (CLSI) kriterlerine göre yorumlanması

4) Kökenlerin genotiplemesi için Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE) uygulanması

BAKTERİLERİN TANIMLANMASI

Daha önceden kanda üreyip Acinetobacter spp. adını almış olan ve -70 °C’de saklanan 95 adet kan kültürü kökenlerinin A. baumannii olduklarını doğrulamak için fenotipik testler yapıldı.

Oksidaz varlığının araştırılması: Hazırlanan Kovacs ayıracı kurutma kağıdına damlatıldı. Koloniden alınıp kağıda sürüldüğünde 10 saniye içinde mor rengin oluşması pozitif olarak, oluşmaması ise negatif olarak değerlendirildi (72).

Triple Sugar Iron Agar besiyerinin ekim yöntemi ve değerlendirilmesi: Petride tek düşen koloniye dokundurulan iğne öze ile alınan bakteriler önce iğne öze besiyerinin dik kısmına batırılarak sonra yatık kısmının yüzeyinde zik zak çizilerek ekim yapıldı. Ekimler 36 °C’de 18–24 saat enkübe edildi, fermantatif veya nonfermantatif olması incelendi (72).

DNaz besiyerinin ekimi ve değerlendirilmesi: DNaz besiyerinin ortasına nokta ekim yapıldı. 35 °C’de bir gece enkübe edildi. Plak yüzeyine tüm yüzeyi kaplayacak şekilde DNaz miyarı döküldü. Koloni çevresinde HCl ve DNA birleşmesi sonucu presipitasyon gözlendiğinde (besiyeri matlaştığında) DNaz negatif olarak yorumlandı (72).

44 °C’de üreme: BHI buyyonunda bir gece 36 °C’de üretilmiş bakteri süspansiyonundan 5 ml aynı besiyerini içeren tüpe bir damla damlatıldıktan sonra tüp 44 °C’lik su banyosuna konuldu, 24 ve 48 saat sonra üremeleri değerlendirildi.

Hareket bakılması: BHI buyyona tek koloniden pasaj yapıldı ve 37 °C’lik etüvde iki saat bekletildi. Çukur lamda hazırlanan asılı damla yöntemi ile hareket araştırıldı (72).

Fenotipik testlerle doğrulama sırasında kandan izole edilen 95 kökenin bir tanesinde pasajlandığında üreme olmamıştır. Üreyen kökenlerin oksidaz varlığı araştırılmış ve negatif bulunmuştur. Bu kökenlere yapılan DNaz testi negatif bulunmuştur. Ayrıca asılı damla yöntemi ile hareket bakılmış ve negatif bulunmuştur. Isı testinde 44 °C’de iki köken üreyememiş bu nedenle çalışma dışı bırakılmıştır. Çalışmaya toplam 92 A. baumannii adını alan köken ile devam edilmiştir.

BAKTERİLERİN ANTİBİYOTİK DUYARLILIKLARININ BELİRLENMESİ

İzole edilen bakterilerin antibiyotik duyarlılıklarının belirlenmesi Müller-Hinton Agar ve standart antibiyotik diskleri (Becton Dickinson and Company, Amerika) kullanılarak CLSI M2-A9 (73)’a göre disk difüzyon test yöntemiyle yapıldı, CLSI M100-S17’e (74) göre yorumlandı.

Kalite kontrol kökeni olarak P. aeruginosa Amerikan Tip Kültür Koleksiyonu (American Type Culture Collection) ATCC 27853 ile Escherichia coli ATCC 25922 ve E. coli ATCC 35218 kullanıldı.

Disk Difüzyon Yöntemi: Disk difüzyon testi seftriakson (30 μg), piperasilin (100 μg), piperasilin/tazobaktam (100/10 μg), seftazidim (30 μg), sefepim (30 μg), imipenem (10 μg), meropenem (10 μg), siprofloksasin (5 μg), amikasin (30 μg), gentamisin (10 μg), tobramisin (10 μg), tetrasiklin (30 μg) doksisiklin (30 μg), trimethoprim/sülfometoksazol (1,25/23,75 μg), tikarsilin (75 μg), sefotaksim (30 μg), tikarsilin/klavulanik asit (85 μg), minosiklin (30

μg), ampisilin/sulbaktam (20 µg), mezlosilin (75 μg) (Becton Dickinson and Company, Amerika) diskleri kullanılarak yapıldı. Çalışmada MHB ve MHA kullanıldı.

A. baumannii kökenlerinin EMB agar besiyerindeki 24 saatlik kolonilerinden 4–5 koloni alınıp MHB besiyerine ekilerek 37 ºC’de 2–3 saat bekletildi. Bakteri süspansiyonlarının bulanıklığı MHB eklenerek 0,5 Mc Farland bulanıklığına ayarlandı ve eküvyon yardımı ile MHA plağına yayıldı. Üzerine duyarlılıkları incelenecek olan antibiyotik diskleri 25 mm arayla yerleştirildi. 36 ºC’de 20–24 saat inkübe edildi. Zon çapları kumpas yardımıyla ölçülerek CLSI kriterlerine göre değerlendirildi (74). Testin değerlendirilmesinde kullanılan sınır değerler Tablo 4’de gösterilmektedir.

Tablo 4. Disk diffüzyon testinin yorumlanmasında kullanılan zon çapları (mm) (74)

Antibiyotik Dirençli Orta Duyarlı Duyarlı

Tikarsilin ≤ 14 15-19 ≥ 20 Piperasilin ≤ 17 18-20 ≥ 21 Mezlosilin ≤ 17 18-20 ≥ 21 İmipenem ≤ 13 14-15 ≥ 16 Meropenem ≤ 13 14-15 ≥ 16 Seftazidim ≤ 14 15-17 ≥ 18 Seftriakson ≤ 13 14-20 ≥ 21 Sefotaksim ≤ 14 15-22 ≥ 23 Sefepim ≤ 14 15-17 ≥ 18 Piperasilin/tazobaktam ≤ 17 18-20 ≥ 21 Tikarsilin/klavulanik asid ≤ 14 15-19 ≥ 20 Ampisilin/sulbaktam ≤ 11 12-14 ≥ 15 Amikasin ≤ 14 15-16 ≥ 17 Gentamisin ≤ 12 13-14 ≥ 15 Tobramisin ≤ 12 13-14 ≥ 15 Doksisiklin ≤ 9 10-12 ≥ 13 Minosiklin ≤ 12 13-15 ≥ 16 Tetrasiklin ≤ 11 12-14 ≥ 15 Siprofloksasin ≤ 15 16-20 ≥ 21 Sülfometoksazol/trimethoprim ≤ 10 11-15 ≥ 16

PFGE ÇALIŞMA YÖNTEMİ

Çalışmada Sigma (ABD) marka kimyasal malzemeler ile Bio-Rad (ABD) firmasının cihazları kullanıldı. Çalışma Akdeniz Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi Merkez Laboratuvarı’nda yapıldı.

2. Ertesi gün 10 ml buyyon içine 2–4 koloni ekim yapılarak tüpler 45° açıyla yatık

olarak etüve yerleştirilip 37 °C’de bir gece inkübasyona bırakıldı.

3. Ertesi gün bu tüplerden yeni 10 ml buyyon içine 2 ml aktarılıp 37 °C’de yatık

olarak yerleştirilip yaklaşık 3–5 saat inkübe edildi.

4. Bu tüplerden; 2 ml’lik dibi yuvarlak ependorf tüplerine 2 ml aktarıldı ve 8000

rpm’de 15 dk santrifüj edildi.

5. Üst sıvı atılıp, 1 ml distile su eklendi ve 8000 rpm’de 12 dk santrifüj edildi.

6. Üst sıvı atılıp, pelletin büyüklüğüne göre 50–100–200 µl Tampon Solüsyonu

eklenerek, iyice pipetlenerek yeniden süspanse edildi.

7. Tüpler +4 °C’ye kaldırıldı.

8. Hazırlanan %2’lik Düşük Donma Dereceli Agaroz 55 °C su banyosunda en az 15

dk bekletildi.

9. Tüpler buzdolabından alındı ve her tüpe kaç µl Tampon Solüsyonu eklenmişse

aynı miktarda %2’lik Düşük Donma Dereceli Agaroz konuldu iyice pipetlenerek, hiç bekletilmeden tıkaç kalıbı kuyularına kuyu ağzına kadar dolacak şekilde, hava kabarcığı oluşturmadan pipetlendi.

10. Tüplerin hepsi tıkaç kalıbına pipetlendikten sonra tıkaç kalıbı buzdolabına

kaldırıldı ve en az 15 dk beklendi.

11. Bu arada lizozim baz solüsyonu içine 1/50 olacak şekilde stok lizozim konup iyice

karıştırıldı. Bu lizozim solüsyonundan 2 ml dibi yuvarlak ependorf tüplere 1 ml konuldu.

12. Tıkaç kalıbının her bir kuyusundaki artık donmuş olan jeller teker teker bu

lizozimli tüplere aktarıldı.

13. Tüpler 37 °C’de en az 30 dk enkübe edildi.

14. Bu arada proteinaz K baz solüsyonu içine 1/20 olacak şekilde stok proteinaz K

eklenerek, kullanım için pK solüsyonu hazırlandı.

15. İnkübasyonun sonunda steril plastik pastör pipeti ile 11. maddede koyduğumuz

sıvı aspire edildi.

16. Hazırlanmış olan pK solüsyonundan her tüpe 500 µl eklendi. 17. 50 °C’lik su banyosunda bir gece inkübasyona bırakıldı. 18. Ertesi gün tüpler su banyosundan alınıp altları silindi.

19. Tüplerin içindeki sıvılar plastik pastör pipeti ile aspire edildi. 20. Her tüpe 500 µl yıkama tamponu koyup tüpler ters yüz edildi.

21. Yıkama tamponu plastik pastör pipeti ile aspire edilerek 1 ml yıkama tamponu +

Pmsf konuldu.

22. Oda ısısında en az 30 dk inkübe edildi.

23. Sıvı aspire edilip 1 ml yıkama tamponu eklendi. 24. Oda ısısında en az 30 dk inkübe edildi.

25. Sıvı aspire edilip 1 ml yıkama tamponu eklendi.

26. Tezgaha bir miktar parafilm konarak tüpün içindeki jel öze ile parafilm üzerine

düşürüldü. Bistüri ile 1/3’ü kesildi. Bistüri ile jelin 2/3’lük kısmı tüpün içine geri konarak buzdolabına kaldırıldı.

27. Kesilen 1/3’lük kısım, içinde 0,1x yıkama tamponu olan dibi konik 1,5 ml’lik

ependorf tüpün içine kondu. Oda ısısında en az 30 dk inkübe edildi. Bu arada restriksiyon enzim tamponu ve Apa1 enzimi hazırlandı.

28. Kullanılacak restriksiyon enziminin kendine özel tamponundan 1 ml+9 ml distile

su olacak şekilde enzim tamponu hazırlandı.

29. Tüplerdeki 0,1x yıkama tamponu aspire edilerek, enzim tamponundan 3 ml

ayırdıktan sonra geri kalanı tüplere 200’er µl konuldu.

30. Tüpler 30–60 dk oda ısısında inkübe edildi.

31. İnkübasyonun sonuna doğru enzim tüp başına 5 Ü hesabı ile hazırlandı. Önceden

ayrılan 3 ml enzim tamponuna hazırlanan enzim konularak iyice pipetlendi ve sıvı aspire edildi.

32. Her tüpe eşit volümde 31. madde de hazırlanan enzim + enzim tamponu dağıtıldı. 33. Enzimin çalışma ısısı olan 36 °C’de etüvde bir gece inkübasyona bırakıldı. 34. Ertesi gün tüplerin içindeki sıvı aspire edildi.

35. Tüplere 1 ml 0,5xTBE konuldu. 36. 30 dk oda ısısında inkübe edildi.

37. Sıvı aspire edilerek yine 1 ml 0,5xTBE konuldu. 38. 30 dk oda ısısında inkübe edildi.

39. İnkübasyon sırasında PFGE jeli hazırlandı. PFGE agarozundan 0,5xTBE ile

%1’lik jel hazırlandı. Mikrodalga fırında şişenin ağzı aralık bırakılarak birkaç defa kaynamasına izin verilerek iyice eritildi ve 55 °C’lik su banyosuna konuldu. Bu arada jel taşıyıcı hazırlandı.

41. Tezgaha bir parça parafilm konup, tüp ters çevrilerek parafilm üzerine vurularak

jel parafilm üzerine düşürüldü.

42. Kağıt havlu ile jelin etrafındaki sıvı uzaklaştırıldı.

43. Yuvarlak uçlu öze yardımıyla jel tarağın bir dişi üzerine, en uç kısma gelecek

şekilde konuldu.

44. Tarağa konulan jelin üstünde hiç sıvı olmaması gerektiğinden jeller tarak üstüne

yerleştirildikten sonra kağıt havlu ile iyice kurulandı.

45. Moleküler Ağırlık Marker tüpünden bir miktar jel alınıp, bakteriler için hazırlanan

jel boyutunda kesildi ve diğer jeller gibi tarak dişi üstüne konuldu. CHEF DNA Size Standards Lambda Ladder (48,5–970 kpd) kullanıldı.

46. Tarak dişleri uç kısımlarındaki minik jellerle birlikte yerine oturtuldu.

47. Su banyosunda beklemekte olan PFGE agarının büyük kısmı tarağın karşı

tarafından yavaşca jel tankına dökülüp, dipte 3–5 ml bırakıldı ve yeniden su banyosuna konuldu. Dökerken hava kabarcığı olmamasına dikkat edildi.

48. Agarın donması beklendi. Donduktan sonra tarak yavaşça çıkarıldı.

49. Tarak dişlerinden kalan boşluklar ayrılan 3–5 ml PFGE jeli ile pipet yardımıyla

dolduruldu.

50. Bunlar da donunca agar altındaki siyah destek ve siyah dikdörtgen çerçeve ile

CHEF II PFGE cihazına yerleştirildi ve 20 saat, 0,5–15 sn şeklinde programlanarak cihaz çalıştırıldı.

51. Etidyum bromür (1 µg/ml) (Sigma) ile boyanan ürünler UV transilluminatörde

incelendi.

52. Oluşan bantlar ‘Gel-doc’ sistemi (Bio-Rad) yardımıyla bilgisayarda görüntülendi.

PFGE’da oluşan bantların yorumu Tenover ve ark. (75)’ının önerilerine göre yapıldı (Tablo 5).

İSTATİSTİKSEL ANALİZ

İstatistiksel analiz için STATISTICA 7.0 programı kullanıldı. Antibiyotiklerin yıllara göre direnç sıklıklarının karşılaştırılmasında uygun ki-kare testleri ( Fisher, Yates, Pearson Ki-kare testleri) kullanıldı ve p<0,05 değerleri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

Tablo 5. Bantların yorumu (75) Kategori Salgın suşuna kıyasla genetik farklılık sayısı Salgın suşundan farklılık gösteren bant sayısı Epidemiyolojik yorum

Aynı 0 0 İzolat salgının bir

parçası Yakın ilişkili 1 2-3 İzolat salgınla yakın ilişkili Olası ilişkili 2 4-6 İzolat salgınla olası ilişkili

Farklı ≥3 ≥7 İzolat salgınla