1* 1 2 Mustafa TÜRE , Oðuzhan EROÐLU , Ercüment AKSAKAL
1
Su Ürünleri Merkez Araþtýrma Enstitüsü, Vali Adil Yazar Cad. No:14 Kaþüstü Beldesi Yomra/Trabzon. 2
Atatürk Üniversitesi, Ziraat Fakültesi Tarýmsal Biyoteknoloji Bölümü, Erzurum
Giriþ
Molecular Genetic Markers for Fish Diseases and Their Usage
Molecular techniques developed in recent years relatively faster and more sensitive than traditional methods that are used to research fish pathogens. Regard to detection and spread of fish pathogens can be obteined quick and reliable information thanks to techniques such as polymerase chain reaction (PCR), restriction fragment length polymorphism (RFLP), Pulse-field gel electroforesis (PFGE), and multiplex PCR. Thus can be prevented outbreak diseases, reduced so that creation of antibiotic resistant bacteria and cost of treatment in aquaculture. In this paper, common molecular techniques are reviewed for detection and epidemiology of fish pathogens and their application are described.
Ýdeal bir çevrede herhangi bir klinik belirti oldukça önemlidir (Plumb, 1999). Geniþ bir göstermeyen canlýlar üzerlerinde taþýdýklarý balýk popülasyonunda normal görünen taþýyýcý patojenler ile popülasyonda ciddi hastalýk riski balýklardan patojen tespiti oldukça zor, yüksek oluþtururlar. Yoðun üretim ve çevresel þartlarýn maliyetli ve spesifik sistem gerektirir(Altýnok ve aniden bozulmasý gibi stres yaratacak Kurt, 2003).
durumlarda hastalýklar ortaya çýkabilir. Bu Geleneksel olarak bakteriyel balýk nedenle taþýyýcý canlýlardan hastalýk etkenlerinin patojenlerin tespiti; etkenin agar üzerinde tespiti hastalýklarýn kontrol edilmesi açýsýndan üretilmesini takiben fenotipik ve serolojik özel-Balýk patojenleri ile yapýlan araþtýrmalarda, son yýllarda geliþtirilen moleküler teknikler, geleneksel metotlara göre nispeten daha duyarlý, güvenilir ve hýzlýdýrlar. Polimerize zincir reaksiyonu (PZR), restriksiyon parça uzunluðu polimorfizmi (RFLP), itilmiþ alan jel elektroforesizi (PFGE) ve çoklu PZR (multiplex PCR) gibi teknikler sayesinde, balýk patojenlerinin tespiti ve yayýlýmý hakkýnda hýzlý ve güvenilir bilgi alýnabilmektedir. Böylelikle akuakültürdeki salgýn hastalýklarýn önüne geçerek, hem antibiyotik dirençli bakteri geliþimi engellenmekte hem de tedavi harcamalarý azaltýlabilmektedir. Bu derlemede, balýk patojenlerinin tespitinde ve epidemiyolojik araþtýrmalarýnda yaygýn olarak kullanýlan moleküler teknikler irdelenmiþ ve kullaným alanlarýndan söz edilmiþtir
Keywords: Aquaculture, fish pathogens, molecular methods.
Anahtar Kelimeler: Akuakültür, balýk patojenleri ve moleküler metotlar.
© Su Ürünleri Merkez Arastýrma Enstitüsü Müdürlügü, Trabzon
Özet
Balýk Hastalýklarýnda Moleküler Genetik Belirteçler ve Kullanýmlarý
* Sorumlu yazar: Tel: +904623411053, Faks: +904623411152, e-mail: mture@sumae.gov.tr, mustafa61ture@gmail.com
liklerinin belirlenmesi þeklinde gerçekleþtirilir gerçekleþtirilebilmiþtir (Altýnok ve Kurt, 2003). (Bernardet vd., 1990). Fakat yapýlan çalýþmalar Geliþen moleküler teknikler bakteriyel, ayný genus içerisinde olan bazý bakteriyel viral ve paraziter balýk hastalýklarýnýn erken patojenlerin bu klasik testler sonucu farklýlýk teþhisinde önemli avantajlar saðlarlar. Genel göstermediklerini ortaya koymuþtur (Eldar vd., olarak, genetik materyalin (DNA ya da RNA) 1996). Ayrýca bu klasik metotlar, yeterince hassas ilgili örnekten ekstrakt (elde) edilmesi ile iþlem olmamalarý, etkenin önce izole edilmiþ olma baþlatýlýr. Sonrasýnda, çoðunlukla DNA spesifik gerekliliði ve düþük düzeyde patojenle sonuç primerler kullanýlarak PZR iþlemi yardýmý ile verememesi gibi dezavantajlara sahiptirler amplifiye edilir. Balýk üretimindeki deðiþik
(Altýnok ve Kurt, 2003). problemleri çözmek üzere Polimerize Zincir
Son yirmi yýlý aþkýn sürede balýk Reaksiyonu (PZR), Enterobacterial Repatitive patojenlerinin tespiti üzerine moleküler Intragenic Consensus Element (ERIC-PZR), biyolojinin kullanýmý oldukça yaygýnlaþmýþtýr. Restriksiyon Parça Uzunluðu Polimorfizmi Moleküler biyoloji alanýnda balýk patojenlerinin (PZR-RFLP), Çoðaltýlmýþ Parça Uzunluk rutin tespiti ve kontrolü, bakteriyel ve viral Polimorfizmi (AFLP), Rastgele Çoðaltýlmýþ etkenlerin epidemiyolojilerinin araþtýrýlmasý rutin Polimorfik DNA (RAPD), Multipleks (Çoklu) çalýþmalar haline gelmiþtir. Bu sayede birçok PZR, gibi PZR bazlý moleküler araçlar etkenin sadece tespiti deðil ayný zamanda kullanýlmaktadýr (Prichard, 1997). PZR tabanlý yayýlýmý ve korunma önlemleri konusunda olmayan uygulamalar olarak ise Restriksiyon önemli ilerlemeler kaydedilmiþtir (Vela vd., Parça Uzunluðu Polimorfizmi (RFLP) Pulsed-2000; Çaðýrgan, 2004; Türe vd., 2012). Field Jel Elektroforesiz (PFGE), In Sütü
Özellikle etkenlerin epidemiyolojisi Hibridizasyon gibi teknikleri sayabiliriz (Yaðcý, alanýnda son yýllarda moleküler tiplendirme 2006).
konusunda devrim niteliðinde geliþmeler Bu derlemenin amacý; balýk üretiminde gerçekleþmiþtir. Antimikrobiyal duyarlýlýk sýklýkla kullanýlan moleküler tekniklerin bir testleri, serotiplendirme ve geleneksel deðerlendirmesini yapmak ve bu tekniklerin nasýl biyokimyasal testlerin sonuçlarýna göre ayný kullanýldýðý, avantaj ve dezavantajlarý hakkýnda görünen izolatlar moleküler epidemiyoloji güncel bilgi sunmaktýr.
teknikleri sayesinde farklý olduklarý ortaya konulmuþtur. Yeni teknikler geliþtirilirken bir
yandan da eski teknikler modifiye edilerek daha Pulsed-Field Gel Elektroforesiz (PFGE) az zaman ve çaba ile yüksek kalitede sonuçlar Metodu
elde edilmiþtir. (Mc Ellistrem vd., 2000). Pulsed-field gel elektroforesiz ilk kez Moleküler teknikler patojenlerin erkenden Schwartz ve Cantor tarafýndan tanýmlanmýþtýr tespit edilmesinde geleneksel teþhis tekniklerine (Schwartz vd., 1994). Bu metot, genomik göre daha hýzlý ve duyarlýdýrlar. Asemptomatik DNA'nýn kesici restriksiyon endonükleaz enzim-balýklardan patojenlerin erken tespiti hastalýk leri kullanarak PFGE tarafýndan fragmentlerin salgýnlarýnýn önlenmesine ve antibiyotik ayrýlmasý ve bant örneklerinin karþýlaþtýrýlýp kullanýmýnýn azaltýlmasýna yardýmcý olur. yorumlanmasý esasýna dayanýr. Geleneksel jel Böylece antibiyotik dirençli bakterilerin elektroforesiz 50 kilobaz çift (kb) kadar olan oluþturacaðý çevre zararýnýn önüne geçilmiþ olur. DNA fragmentlerini ayrýþtýrabilirken, PFGE Hatta, nükleik asitlerin tespiti sayesinde kültür 10 megabaz çifti (Mb) aþan büyüklükteki edilemeyen ya da ölü mikroorganizmalarýn tespiti bakteri, maya, virüs ve memelilerde dahil birçok
birçok türe ait kromozomal DNA'yý ayrýþtýrma izolasyonu yapýlmaktadýr. Bu aþamada bakteri kabiliyetine sahiptir (Schwartz ve Cantor, 1984; türüne göre deðiþmekle beraber lizozim,
Gardiner, 1991). proteinaz K ve mutonolizin gibi farklý litik
PFGE enfeksiyon etkeni suþlarýn karþýlaþ- enzimler kullanýlýr. Liziz iþlemini takiben agaroz týrýlmalarýnda kullanýlan bir metot olup bakteri bloklarý yýkanarak kontaminantlar uzaklaþtýrýlýr. suþlarýnýn tanýmlanmasýnda nadiren kullanýlýr. Agaroz içindeki genomik DNA, nispeten az Son yýllarda izolatlar arasý benzerlik ya da sayýda ve büyük parçalar oluþturabilen bir farklýlýklarýn tespitinde mevcut en tartýþmasýz restriksiyon enzimi ile kesilir. ApaI, SpeI, Xba, ayýrýcý metottur (Olive ve Bean, 1999). PFGE'nin SmaI gibi restriksiyon endonükleazlar sýklýkla temel özelliði, jel üzerinde bir homojen elektrik tercih edilirler (Vela vd., 2000; Kawanishi vd., alanýnýn çoklu elektrot ve farklý voltajlar 2005; Türe vd., 2012). Daha sonra kesime kullanarak üretilmesidir (Chu vd., 1986). Bakteri uðratýlan DNA bloklarý sertifikalý PFGE agaroz yoðunluðu ve yaþý, DNA nýn kalite ve içerisine yerleþtirilir ve belirli aralýklarla yönü konsantrasyonu, agaroz konsantrasyonu, yýkama deðiþtirilen elektrik akýmýna tabi tutulur. Bu iþlemi, kesici enzimin miktarý ve özelliði, bafýrýn elektrik akýmý ortalama 1 ila 800 kilobazlýk DNA sertliði, voltaj, pulse zamaný, ve sýcaklýk gibi bir segmentlerinin ayýrt edilmesini saðlar. Elekro-çok faktör PFGE deki görüntü kalitesini etkiler forez iþlemi bitince jel etidiyum bromür ile (Anonim 1). PFGE'de; katý veya sývý besi yerinde boyanarak her bir izolata ait bant profilleri üretilen bakteriler yoðunluklarý ayarlandýktan görünür hale gelir (Turabelidze vd., 2000). Bu sonra düþük erime ýsýlý agaroza katýlýp küçük profiller, iyi gözlemlenerek, software yada bir kalýplar içerisine dökülmektedir. Kalýplardan istatistik programý ile yorumlanabilir. Þekil 1'de bloklar halinde alýnan bakteri hücreleri, deterjan PFGE metodunun pratik adýmlarý þematize ve enzim yardýmýyla parçalanarak DNA edilmeye çalýþýlmýþtýr.
Blastula evresinin sonuna doðru, gastrulas- vd., 2009).
yonun baþlamasýndan önce, blastodiskin tüm Mikroorganizmalarýn ayrýmýnýn yapýlma-çevresinde, hýzlý hücre artýþý ile kalýnlaþma sýnda PFGE son yýllarda en güvenilir metot olarak oluþmaktadýr. Bu kalýnlaþmýþ blastodisk bilinmesine raðmen RFLP en sýk kullanýlan çevresinin bir bölümü, geri kalan çevre metotlardan biridir. Her iki teknikte geniþ kalitede bölümünden daha fazla kalýnlaþmýþtýr. Bundan DNA, fazla zaman ve uðraþ gerektirmektedir. sonra gastrulasyon gerçekleþmektedir (Þekil 1). ERIC-PZR son yýllarda elde edilen sonuçlara Geniþ kullanýmý, yüksek ayýrt etme gücü ve bakýldýðýnda birçok moleküler karakterizasyon çok iyi epidemiyolojik uygulamalarýndan dolayý tekniðinin yerini almýþtýr. Bu metot ile daha az PFGE son 20 yýldýr bakteriyel patojenlerin alt zaman ve masrafla doðru sonuçlara ulaþýla-tiplemelerinde altýn standart olarak kullanýl- bilmektedir (Silveria vd., 2002).
maktadýr. Özellikle PFGE ayný türe ait ERIC-PZR dizi tekrarýna dayalý DNA bakterilerin tiplenmesinde PZR ve klasik amplifikasyonudur. Tüm organizmalar genom-elektroforezde yapýlan RFLP'ye göre daha yüksek larýnda tekrarlayan (repetitive) sekanslar ayýrt edici güce sahiptir (Olive ve Bean, 1999). bulundurur. Ökaryotik genomlarda DNA sekans PFGE tekniði kullanýlarak akuakültürde ciddi organizasyonu tek kopya sekanslardan oluþmuþ ekonomik kayýplara yol açan birçok balýk çok sayýda tekrarýn aralýklý olarak daðýlmasýyla patojeninin epidemiyolojisi araþtýrýlmýþtýr gerçekleþir. Prokaryotik genomlarda ise çeþitli (Turabelidze vd., 2000; Vela, 2000; Kawanishi düþük kopya sayýlý tekrar sekansý bulunur. vd., 2005) Türkiye'nin farklý bölgelerinden Baþlangýçta sadece Enterobacteriaceae ve alabalýklardan izole edilen Lactococcus garvieae Vibrinoceae türlerinde olduklarý düþünülen ERIC s u þ l a r ý n ý n P F G E m e t o d u k u l l a n ý l a r a k ve REP sekanslarýnýn birçok türde olduðu epidemiyolojisi çalýþýlmýþ ve özellikle gökkuþaðý belirlenmiþtir. Bu sekanslara yönelik primerler alabalýklarý için çok önemli olan bu patojenin kullanýlarak bakteri genomlarýnýn parmak izleri genetik çeþitliliði ve yayýlýmý belirlenmiþtir (Türe ilk olarak 1991'de belirlenmiþtir (Versalovic vd., vd., 2012). Yine, Avustralya'da yapýlan bir 1991).
çalýþmada balýk ve insanlar için patojen olan ERIC bir örnekteki nükleik asidin Streptococcus iniae suþlarý PFGE metodu amplifikasyonu yapýlarak kýsa zamanda ve yardýmýyla iliþkilendirilmiþ ve bu zoonoz için yüksek güvenilirlikte gerçekleþebilen genotip-koruyucu önerilerde bulunulmuþtur (Nawawi vd., lendirmede kullanýlan PCR bazlý metottur. PCR
2008). ürünü DNA'nýn agaroz jel elektroforezine tabi
tutulmasý ve sonra etidiyum bromür ile boyanan 2. Enterobacterial Repatitive Intragenic jelde oluþan DNA bantlarýn yeri ve sayýsý Consensus Element (ERIC-PZR) kýyaslanarak elde edilen çeþitliliktir. Bu metot Tarih boyunca türlerin (ökaryot, prokaryot) bakteriyel kromozomal ve ekstra kromozomal genetik yakýnlýklarýnýn araþtýrýlmasý amacý ile DNA'nýn veya viral genomun (RNA ve DNA) birçok metot denenmiþtir. Bunlardan PZR bazlý restriksiyon profillerinin belirlenmesinde kulla-olanlarý geniþ yayýlým göstermiþtir. PZR nýlmaktadýr. Dört temel adýmda gerçekleþtirilir: reaksiyonlarý diðerlerine oranla kolay, güveni- DNA nýn izolasyonu (RNA viruslar için önce lirlikleri yüksek ve nispeten ekonomiktir (Duan RNA izole edilip RT-PZR ile cDNA elde edilir),
tek bir primer ile PZR yapýlmasý, amplifiye olan DNA nýn jelde elektroforezi ve en son aþama ise jeldeki DNA'nýn görüntülenmesidir (Yaðcý, 2006).
ERIC-PCR Enterobakterilerin genotip-lendirilmesinde baþarýyla kullanýlmýþtýr. Son yýllarda bu metot Vibrio parahaemolyticus, Campylobacter, Escherichia coli, Salmonella enterica ve Aeromonas sp. gibi balýk patojenlerinin epidemiyolojik araþtýrmalarýnda kullanýlmýþtýr (Yingwang vd., 2008).
Türkiye'de Gökkuþaðý Alabalýklarý'ndan izole edilen kýrk adet Lactococcus garvieae suþunun fenotipik ve genetik çeþitliliði ERIC-PZR metodu kullanýlarak belirlenmeye çalýþýlmýþtýr (Türe, 2011). Þekil 2'de gram(+) bir bakteriden elde edilen ERIC-PZR modeli (profili) görünmektedir.
koþullarýnda en az bir milyon kez çoðaltýlmasý ve ürünün jel elekroforez aracýlýðý ile tespit edilmesi esasýna dayanýr. Çoðaltýlan bölge 150-3000 baz çifti uzunluðundadýr (McPhearson vd., 1991). PZR bir baþka deyiþle in-vivo DNA replikas-yonunun in-vitro gerçekleþtirilmesidir. Reak-siyon için denatüre edilmiþ DNA, oligonük-leotitler (primer), desoksinükleotid trifosfat (dNTP) ve DNA polimeraz enzimi gibi komponentler gereklidir. Üç basamaklý siklusun tekrarý þeklinde olur.
Ýlk aþamada DNA denatüre olur.
Daha sonra oligonükleotitlerin DNA'nýn belirli bir bölgesini tanýyýp o bölge ile reaksiyona girerler.
Polimeraz enzimi aracýlýðýyla ile yeni DNA zincirlerinin üretimi.
Söz konusu PCR basamaklarý ortalama olarak 25-35 kez tekrarlanmak suretiyle iþlem tamamlanmýþ olur (Ün vd., 2000). Þekil 3'de PZR iþlemi þematize edilmiþtir.
Tersine PZR denen RT-PZR; RNA viruslarý ile çalýþýldýðý durumlarda, spesifik mRNA'nýn tespiti ve gen expresyon düzeylerinin belirlenmesinde kullanýlýr (Koo ve Jaykus, 2000). Hücreden RNA'nýn kantititesinin tespitinde duyarlý bir tekniktir. Son yýllarda real-time PZR'nin yaygýnlaþmasý ile beraber gen expresyon düzeyindeki deðiþimlerin tespiti bu metotla yapýlmaya baþlamýþ ve birçok alanda klasik PZR'nin yerini almýþtýr (Altýnok ve Kurt, 2003).
Ökaryot ve prokaryotlarda rRNA gen bölgeleri korunmuþ sekanslar içerir. Bu korunmuþ bölgelerin amplifiye edilmesi ile canlýda bulunan hatta kültür edilemeyen bakteri ve viruslarýn isimlendirimesi gerçekleþtirilir (Barry vd., 1990). Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR)
rRNA gen bölgelerinin çoðaltýlmasý ile Polimeraz Zincir Reaksiyonu DNA'nýn
gerçekleþtirilen PZR metodu, birçok balýk spesifik bir bölgesinin bir çift primer ve ýsýya
patojeninin isimlendirilmesi ve epidemiyolojisi dayanýklý Taq polimeraz (thermostable DNA
alanýnda çok sýk baþvurulan temel metot halini polymerase) enzimi yardýmý ile laboratuar
almýþtýr.
Þekil 2. ERIC-PZR modeli. M: markýr (100bp), 1-9:
Çoðaltýlmýþ Parça Uzunluk Polimorfizmi yapýþkan uçlarýna baðlanmak üzere tasarlanmýþ 2
(AFLP) adaptör (EcoRI ve MseI) üretilen parçalara
Hýzlý bir PZR tabanlý teknik olan AFLP, hem baðlanýr. Bu ligasyon iþlemi PZR çoðaltýmýna prokaryot hem de ökaryotlarýn tiplendi-rilmesinde olanak saðlar. Her iki restriksiyon enzimi 500 000 kullanýlabilir. RFLP ve RAPD gibi metotlarýn EcoRI-MseI parça üretimi gerçekleþtirir. Primer-güçlü yanlarýný toplayan, daha kullanýþlý, multi- lerdeki spesifik bazlarýn sayýsý deðiþtirilerek lokuslu bir DNA parmak izi tekniðidir. Ana hedef, çoðaltýlan parça sayýsý kontrol edilebilir. Bu türler arasý genetik varyasyonun belirlenmesidir. amaçla PZR primerlerinin 3' ucuna rastgele bir Bu metot tüm genomun restriksiyon enzimi ile veya iki ekstra baz ilavesi yapýlarak restriksiyon parçalara ayrýlmýþ DNA parçalarýnýn seçici parçalarýnýn alt dizilerinin selektif olarak çoðaltýlmasý esasýna dayanýr (Vos vd., 1995). çoðaltýlmasý saðlanýr. Son olarak PZR ürünleri jel Markýrlarýn PZR'de çoðaltýlýp selekte edilmesi elektroforezde görüntülenip yorumlanýr (Ajmone-yöntemini kolay ve hýzlý yapar. Bu metot; tarým, Marsan vd., 1997). Bir adaptör ve bir enzim ilavesi botanik, mikrobiyoloji ve hayvan araþtýrmalarýnda ile alternatif AFLP tipleri üretilmiþ ve jel tür ve alt türlerin isimlendirilmelerinde hýzlý, kolay elektroforez ile analiz edilmiþtir (Gibson vd., ve güvenilir bir araçtýr (Valsangiacomo vd., 1995). 1998).
AFLP analizi için küçük bir miktar pürifiye edilmiþ genomik DNA gereklidir. Teknik herhangi bir organizmadan elde edilen DNA'nýn önce bir çift restriksiyon enzimi (6 baz EcoRI, 4 baz MseI) ile kesimiyle baþlar. Parçalarýn birer uçlarý yapýþkan özelliktedir. Daha sonra 4 baz ve 6 baz
(Congiu vd., 2002), mersin balýklarýnýn tür içi ayrýmlarýnda AFLP'den yararlanmýþlardýr. Bir baþka çalýþmada morfolojik olarak üç farklý renkteki kayabalýklarý arasýndaki genetik farklýlýk bu teknikten yararlanýlarak çalýþýlmýþtýr (Kai vd., 2002).
Þekil 3. PZR iþlemi (Anonim, 2)
KALIP DNA
DENATÜRASYON
PRÝMER BAÐLANMASI
Restriksiyon Parça Uzunluðu Polimorfizmi etmek gerekir (Yaðcý, 2006; Eroðlu vd., 2011). (RFLP)
Organizmadan alýnan doku örneklerinin toplam DNA'larýnýn izole edilip bu ürünün nükleik asit sýralanýþýný tanýyan restriksiyon enzimleri ile kesilmesi ve oluþan DNA parçacýklarýnýn elektroforezde ayrýldýktan sonra yorumlanmasý esasýna dayanýr (Þekil 4). PZR metoduna göre daha fazla örneðin kýsa zamanda analiz edildiði bir metottur (Altýnok vd., 2003). PZR bazlý olup olmamasýna göre iki þekilde yapýlýr. Kromozomal DNA'nýn direkt restriksiyon enzimi ile kesimi ancak temiz ve fazla miktarda DNA varlýðýnda iyi sonuç verir. Yöntemin güvenilirliðini artýrmak amacýyla eklenen yeni metotlarda zamaný ve maliyeti arttýrmaktadýr. Bu nedenle PZR bazlý RFLP çoðunlukla tercih edilmektedir (Yaðcý, 2006). RE enzimi olarak,
Ülkemizde, alabalýklarda PZR-RFLP EcoRI, HindIII, HinfI sýklýkla tercih edilirler.
analizi ile tür ve orijin belirlenmesi üzerine PZR-RFLP moleküler biyolojide en çok
yapýlan bir araþtýrmada, ülkemiz gen kaynak-kullanýlan metotlardan birisidir. DNA sekansýna
larýndan olan doðal alabalýða ait detaylý bir doku gerek kalmadan populasyon ve türler arasýndaki
ve DNA bankasýnýn oluþturulmasý ve farklý birçok genetik çalýþma gerçekleþtirilebilir.
metotlarla elde edilecek genetik verileri de Mevcut gen kaynaklarýn tespiti, soyaðacý
kapsayan ulaþýlabilir bir veri tabaný oluþturul-oluþturmak sureti ile genetiksel açýdan
benzer-masýnýn önemi üzerinde durulmuþtur (Eroðlu vd., liklerin hesaplanmasý, her yaþ ve boydaki ayýrýmý
2011). yapýlamayan su canlýlarýnýn ayýrýmýný yaparak
taksonomik açýdan yaþanan sýkýntýlarýn aþýlmasý,
Multipleks (Çoklu) PZR mutasyon ve seleksiyon taramalarý ve et
Bu metot daha az zaman ve düþük maliyetle satýþýndaki sahteciliklerin önüne geçilmesi
bir kaç patojenin ayný anda tespitine olanak bunlardan bazýlarýdýr (Aksakal ve Erdoðan,
saðlayan bir tekniktir (Williams vd., 1999). 2007).
Klasik PZR'ye benzer ancak birden fazla PZR RFLP metodu ayrýca ökaryot ve prokaryot
amplifikasyonu, birden fazla primer çifti hücre genomik DNA analizinde, bakteriyel ve
tarafýndan ayný reaksiyon içerisinde birden fazla viral suþlardaki mutasyonlarý tanýmlamada,
hedefin sekansý þeklinde gerçekleþir. Teknik epidemiyolojik çalýþmalarda, su ürünlerinde tür
iþgücü, maliyet ve efor bakýmýndan önemli ve orijin tespitinde, genetik kaynaklarýn kontrol
avantajlar saðlar. altýnda tutulmasý ve korunmasý ve daha pek çok
Ayný reaksiyon içerisinde birden fazla genetik hastalýklarýn tanýsýnda kullanýlmýþtýr.
hedefin amplifikasyonu saðlanacaðý için; RFLP yöntemi uygulamasý kolay fazla zaman
primerlerin seçimine dikkat edilmesi, baðlanma gerektirmeyen bir yöntemdir. Dezavantajý çok
sýcaklýklarýnýn birbirine uygun olmasý, farklý sayýdaki sýk bantlarýn seçimi bazen mümkün
primer çiftlerinin bir arada çalýþmalarý için en uy-olmayabilir. Bu nedenle enzim seçimine dikkat
DNA'nýn Ýzolasyonu
PZR (Spesifik bölgelerin çoðaltýlmasý)
Ürünün RE ile kesimi
Elektroforez
Görüntüleme
gun konsantrasyonlarýnýn belirlenmesi gibi olmasý, kýsa primerin DNA'nýn karþý iplikçiðine konulara önem gösterilmelidir (Chamberlain vd., 3'ucu birbirine karþý gelecek þekilde baðlanmasý 1988; Altýnok, 2011). Ýnfeksiyöz balýk hastalýklarý ve iki baðlanma noktasýnýn yeterince yakýn olmasý alanýnda, bakteri, virus, mantar ve parazit gibi gibi kriterler gereklidir. Tüm bunlarýn sonucunda hastalýk etkenlerinin teþhisine kýsa sürede olanak DNA'nýn rastgele seçilen bölgelerinin PZR ile saðlayan çok kullanýþlý metotlardan biridir çoðaltýlmasý sonucu DNA'daki polimorf (Altýnok ve Kurt, 2003). alanlarýnýn belirlenmesi gerçekleþtirilir. Bu teknik Beþ farklý balýk patojeninin (Aeromonas tür ayrýmý ve taksonomi, filogenetik iliþkiler, h y d ro p h i l a , A e ro m o n a s s a l m o n i c i d a , hibridizasyon, genom haritalama ve stok ayrýmý Flavobacterium columnare, Renibacterium gibi konularda kullanýlabilir. Birçok çalýþmada, salmoninarum ve Yersinia ruckeri) tespiti ticari olarak önemli balýk ve omurgasýzlarýn amacýyla dizayn edilen çoklu PZR iþleminde genomik DNA segmentlerinin amplikasyonu baþarýlý görüntüler elde edilmiþ ve bu metodun amacýyla, farklý balýklar arasýndaki polimor-balýklarda hastalýklara sebep olan farklý fizmin belirlenmesinde ve farklý coðrafik alandan bakterilerin eþ zamanlý olarak tespitinde duyarlý izole edilen bazý önemli balýk patojenlerinin ve kullanýþlý bir metot olduðu ispatlanmýþtýr genetik olarak iliþkilendirilmeleri amacýyla
(Altýnok vd., 2008). kullanýlmýþtýr (Ravelo vd., 2003; Okumuþ, 2006).
Japonya'da yapýlan bir çalýþmada, farklý Rastgele Çoðaltýlmýþ Polimorfik DNA (RAPD) coðrafik alanlardan ve çoðunluðu Gökkuþaðý RAPD ilk kez 1990'lü yýllarda tarýmsal bitki Alabalýklarý'ndan elde edilen 57 L. garvieae varyetelerinin belirlenmesi amacý ile kullanýl- suþunun parmak izi tespiti amacýyla RAPD mýþtýr. Nokta mutasyonlarý ile ekleme veya tekniði kullanýlmýþtýr. Bu çalýþmada farklý çýkarmalarýn (delasyon, insersiyon) neden olduðu alanlardan elde edilen izolatlar, benzerliklerine polimorfizmleri belirler. Bu metot balýk göre baþarýlý bir biçimde gruplandýrýlmýþ ve çiftliklerinde problemlere sebep olan farklý bazý tekniðin balýk patojenleri ile yapýlan epidemi-bakteri ve mantar izolatlarýnýn incelenmesinde ve yolojik çalýþmalarda uygun bir araç olduðu epidemiyolojik olarak incelemeler de kullanýl- ispatlanmýþtýr (Ravelo vd., 2003).
mýþtýr. Kýsa oligonükleotit primerlerin genom
üzerlerinde baðlantý noktalarýnýn farklýlýklarýna Sonuç ve Öneriler
ve birbirlerine olan uzaklýklarýna baðlý olarak Son yýllarda moleküler biyolojide türler arasý genetik çeþitlilik ortaya konur (Lilley kullanýlan tekniklerin ilerlemesi, sürekli bunlara
vd., 1997). yenilerinin eklenmesiyle birlikte su ürünlerinde
Basit, kolay ve hýzlý bir teknik olarak bilinir. bu tekniklerinin kullanýmý çok yaygýn bir hal Kontaminasyon riskinden dolayý uygun bir metot almýþtýr. Ülkemizde, biyolojik çeþitlilik ve gen olmamakla beraber spesifik primer yada kaynaklarýnýn varlýðý açýsýndan sahip olduðumuz problarýn geliþtirilmesi ile beraber bakteriyel doðal zenginliklerin varlýðý fark edilmiþ ve çalýþmalarda çabuk sonuç veren uygun bir teknik bunlarýn korunmasýna iliþkin genetik sahada haline gelmiþtir (Altinok ve Kurt, 2003). Bu yapýlan çalýþmalar hýz kazanmýþtýr. Bu alanda teknikte mükemmele yakýn baðlanma yerleri söz yapýlacak çalýþmalara daha da aðýrlýk verilerek konusu olduðunda tek bir rastgele seçilmiþ kýsa mevcut gen kaynaklarýnýn koruma altýna alýnmasý primer ile DNA'nýn çoðaltýlmasýna imkan gereklidir.
Barry, T., Powell, R. ve Gannon, F. 1990. A general method to
Balýk yetiþtiriciliðinin ve ihracatýnýn her
generate DNA probes for microorganisms.
geçen gün arttýðý ülkemizde, daha saðlýklý ürün
Bio/Tech., 8: 233236.
yetiþtirmek ve üretim giderlerini azaltmak için Bernardet, J.F., Campbell, A.C. ve Buswell, J.A. 1990. moleküler biyoloji alanýndaki geliþmeleri iyi Flexibacter maritimus is the agent of 'black patch necrosis' in Dover sole in Scotland. Dis. Aquat. Org.,
takip etmek ve bu metotlardan sonuna kadar
8: 233-237.
yararlanmak zorunlu hale gelmiþtir. Moleküler
Chamberlain, J.S., Gibbs, R.A., Ranier, J.E., Nguyen, P.N. ve
araçlar balýk patojenlerinin teþhisi ve kontrol Caskey, C.T. 1988. Deletion screening of the altýna alýnmasý çalýþmalarýnda önemli avantajlar Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification. Nucleic Acids Res., 16:
11141-saðlamýþlardýr. Nükleik asitlerdeki polimorflarýn
11156.
analizi hýzlý teþhisin yaný sýra türler arasýndaki
Chu, G., Vollrath, D. ve Davis, R.W. 1986. Separation of
fenotipik ve genetik iliþkiyi de ortaya koymuþtur.
Large DNA molecules by contour clamped
Bu çalýþmanýn amacý, akuakültürde, ülkemizde homogeneous electric field. Science, 234: 1582-yaygýn olarak kullanýlan genetik markýrlarýn 1587.
Congiu, L., Fontana, F., Patarnello, T., Rossi, R. ve Zane, L.
çalýþma prensipleri, kullaným alanlarý, avantaj ve
2002. The Use of AFLP in Sturgeon Identification.
dezavantajlarý hakkýnda genel bilgi vermektir.
Journal of Applied Ich., 18: 286-289.
Sonuç olarak, akuakültürde kullanýlan Çaðýrgan, H. 2004. Biotyping of Lactococcus garvieae genetik markýrlar, infeksiyöz balýk hastalýklarýnýn isolated from Turkey E.Ü. Su Ürünleri Dergisi, 21,
3-4: 267-269.
teþhis ve epidemiyolojisinde, tür içi ya da türler
Duan, H., Chai, T., Liu, J., Zhang, X., Qi, C., Gao, J., Wang,
arasý yapýlacak taksanomik çalýþmalarda, gen
Y., Cai, Y., Miao, Z., Yao, M. ve Schlenker, G. 2009.
kaynaklarýn tespiti ve korunmasý gibi daha birçok Source Identification of Airborne Escherichia coli konuda yapýlacak araþtýrmalar için rutin bir araç of Swine House Surroundings Using ERIC-PCR
and REP-PCR. Environmental Research, 109:
olmuþlardýr.
511517.
Eldar, A., Ghittino, C., Asanta, L., Bvozzettz, E. ve Goria, M.
Kaynaklar
1996. Enterococcus seriolicida is a Junior Synonym of L. garvieae, a causative agent of septicemia and Ajmone-Marsan, P., Valentini, A., Cassandro, M.G.,
meningoencephalitis in fish. Curr. Microbiol., 32: Vecchiotti, A., Bertoni, G. ve Kuiper, M. 1997.
8588. AFLP markers for DNA fingerprinting in cattle.
Eroðlu, O., Firidin, Þ. ve Çiftçi, Y. 2011. A study on Anim. Genet., 28: 418-426.
determination of origin and species by using Aksakal, E. ve Erdoðan, O. 2007. PCR-RFLP
sequense and PCR-RFLP analisis in salmonids. uygulamalarýnýn su ürünlerinde kullaným alanlarý.
Bibad Bilolojical Sciences, 4(1): 77-83. Türk Sucul Yaþam Dergisi, Yýl: 3-5: 5-8.
Gardiner, K. 1991. Pulsed-Field Gel Electrophoresis. Altýnok, Ý. ve Kurt, I. 2003. Molecular diagnosis of fish
Analytical Chemistry, 63: 658-665. diseases: a Review Turkish Journal of Fisheries and
Gibson, J.R., Slater, E., Xerry, J., Tompkins, D.S. ve Owen, Aquatic Sciences, 3: 131-138.
R.J. 1998. Use of an amplified-fragment length Altýnok, Ý., Çapkýn, E. ve Kayýþ, ?. 2008. Development of
polymorphism technique to fingerprint and Multiplex PCR Assay for Simultaneous Detection
differentiate isolates of Helicobacter pylori. J. Clin. of Five Bacterial Fish Pathojens. Veterinary
Microbiol., 36: 2580-2585. Microbiology, 131: 332-338.
Kai, Y., Nakayama, K. ve Nakabo, T. 2002. Genetic Altinok, Ý. 2011. Multiplex PCR Assay for detection of four
Differences among three Colours Morphotypes of Major bacterial pathogens cusing rainbow trout.
the Black Rockfish, Sebastes inermis, Ýnferred from Disease. Dis. Aquat. Org., 93: 199206.
mtDNA and AFLP Analyses. Molecular Ecology, Anonim (1) www.pulsenetinternational.org. Kara Cooper.
11(12): 2591-2598. PFGE: General Overview and Troubleshooting
Kawanishi, A., Kojima, A., Ishihara, K., Esaki, H., Kijima, Tips. Eriþim tarihi: 25.03.2011.
M. ve Takahashi, T. 2005. Drug Resistance and Anonim (2) www. genotyping.wordpress.com. Eriþim tarihi:
Pulsed-Field Gel Electrophoresis Patterns of 24.04.2012.
Lactococcus garvieae Isolates from Cultured Seriola Microbiology, 89: 323328.
(Yellowtail, Amberjack and Kingfish) in Japan. Turabelidze, D., Kotetishvili, M., Kreger, A., J. Morris, J.G. Lett. Appl. Microbiol., 40: 322328. ve Sulakvelidze, A. 2000. Improved Pulse-Field Koo, K. ve Jaykus, L.A. 2000. Selective amplification of Gel Elektroforesis for Typing
Vancomycin-bacterial RNA: use of a DNA primer containing Resistant Enterococci. Journal of Clin. Microbiol., mismatched bases near its 3' terminus to reduce 4242-4245.
falsepositive signals. Lettters App. Microbiol., 31: Türe, M. 2011. Lactococcus garvieae'nin fenotipik ve
187-192. genetik çeþitliliðinin belirlenmesi. Yüksek lisans
Lilley, J.H., Cerenius, L. ve Soderhall, K. 1997. RAPD tezi. Karadeniz Teknik Üniversitesi.
evidence for the origin of crayfish plague outbreaks Türe. M., Altýnok, Ý., Iþýdan, H., Savaþ, H. ve Kutlu, Ý. 2012. in Britain. Aquaculture, 157: 181-185. PFGE Metodu Kullanýlarak Lactococcus Mc Ellistrem, M.E. Stout, J. ve H. Harison, L. 2000. garvieae'nin Genetik Çeþitliliðinin ve Yayýlýmýnýn
Simplifield Protocol for Pulsed-Field Gel Belirlenmesi. TAGEM/HS/10/09/02/179. 61 s. Electrophoresis Analysis of Streptococcus Ün, C., Wimmer, K. ve Ponsuksili, S. 2000. Mikrosatellitler
pneumoniae. Journal of Clinical Microbiology, ve Kullaným Alanlarý. Hayvansal Üretim, 41: 9-14. 351-353. Valsangiacomo, C., Baggi, F., Gaia, V., Balmelli, T., McPhearson, R.M., DePaola, A., Zywno, S.R., Motes, M.L. Peduzzi, R. ve Piffaretti, J. 1995. Use of amplified ve Guarino, A.M. 1991. Antibiotic resistance in fragment length polymorphism in molecular Gram-negative bacteria from cultured catfish and typing of Legionella pneumophila and application aquaculture ponds. Aquaculture, 99: 203-211. to epidemiological studies. J. Clin. Microbiol., 33: Nawawi, R.A., Baiano, J. ve Barnes, A.C. 2008. Genetic 1716-1719.
variability amongst Streptococcus iniae isolates Vela, A.I., Vazquez, J., Gibello, A., Blanco, M.M., Moreno, from Australia. Journal of Fish Diseases, 31: M.A. ve Liebana, P. 2000. Phenotypic and Genetic
305309. Characterization of Lactococcus garvieae Isolated
Okumuþ, Ý. 2006. Rastgele Çoðaltýlmýþ Polimorfik DNA in Spain from Lactococcosis Outbreaks in (RAPD PCR). Rize Üniversitesi. (Yayýn- Comparison with Isolates of Other Countries and
lanmamýþ). Sources. J. Clin. Microbiol., 38: 37913795.
Olive, BM. ve Bean, P. 1999. Principles and Aplication of Versalovic, J., Koeuth, T. ve Lupski, J.R. 1991. Distribution Methods DNA Based Typing of Microorganism. J. of Repetitive DNA Sequences in Eubacteria and Clin. Microbiol. 37; 1661-1669. Application to Fingerprinting of Bacterial Plumb, J.A. 1999. Health maintenance and principle Genomes. Nucleic Acid Res., 19: 68236831.
microbial diseases of cultured fishes. Iowa State Vos, P., Hogers, R., Bleeker, M., Reijans, M., van de Lee T., University Press. Ames, Iowa: 344 s. Hornes, M., Frijters, A., Pot, J., Peleman, J., Prichard, R. 1997. Application of molecular biology in Kuiper, M. ve Zabeau, M. 1995. AFLP: a new veterinary parasitology. Vet. Parasitol., 71: technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids
155175. Res., 23: 4407-4414.
Ravelo, C., Magarinos, B., Lopez-Romalde, S., Toranzo, Williams, K., Blake, S., Sweeney, A., Singer, J.T. ve A.E. ve Romalde, J.L. 2003. Molecular Nicholson, B.L. 1999. Multiplex reverse Fingerprinting of Fish-Pathogenic Lactococcus transcriptase PCR assay for simultaneous detection
garvieae Strains by Random Amplified of three fish viruses. J. Clin. Microbiol., 37: Polymorphic DNA Analysis. Journal of clinical 41394141.
Microbiology. 41, 2: 751-756. Yaðcý, A. 2006. Restriction Fragment Lenght Schwartz, D.C. ve Cantor, C.R. 1984. Separation of yeast Polymorfhizm ve Polimeraz Zincir Reaksiyon
chromosomesized DNAs by pulsed field gradient Bazlý Tipleme Yöntemleri. Ýnönü Üniversitesi. gel electrophoresis. Cell, 37: 6775. Yingwang, Y., Qingping, W., Yanhong, Z., Xiaohui, D. ve Silveria, W., Ferreira, A., Lancellotti, M., Barbosa, I., Leite, Jumei, Z. 2008. Analysis of Major Band of D., Castro, A. ve Brocchi, M. 2002. Clonal Enterobacter sakazakii by ERIC-PCR and
Relationships Among Avian Escherichia coli Development of A Species-specific PCR for Isolates Determined by Enterobacterial Repetitive Detection of Ent. sakazakii in Dry Food Samples. Intergenic Consensus (ERIC)PCR. Veterinary Journal of Microbiological Methods, 75: 392-397.
