Tokat çevresinde geneleksel tedavi amacıyla kullanılan bazı bitki karışımlarının optimum antioksidan kapasitelerinin belirlenmesi

T.C.

GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ

Sonuç Raporu

Proje No:2009/41 Projenin Başlığı

Tokat Çevresinde Geleneksel Tedavi Amacıyla Kullanılan Bazı Bitki KarıĢımlarının Optimum Antioksidan Kapasitelerinin Belirlenmesi

Proje Yöneticisi Doç.Dr.Ramazan ERENLER

Birimi

Fen Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü Araştırmacılar ve Birimleri

Osman Atıf ÖZMEN Fen Edebiyat Fakültesi

Kimya Bölümü (Ağustos /2010)

ÖZET Yüksek Lisans Tezi

TOKAT ÇEVRESİNDE GELENEKSEL TEDAVİ AMACIYLA KULLANILAN BAZI BİTKİ KARIŞIMLARININ OPTİMUM ANTİOKSİDAN

KAPASİTELERİNİN BELİRLENMESİ (*) Osman Atıf ÖZMEN

Gaziosmanpaşa Üniversitesi

Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilimdalı Danışman: Doç. Dr. Ramazan ERENLER

Günümüzde antioksidanların gıda sanayinde kullanımı oldukça yaygın olup hemen hemen tükettiğimiz her ürüne antioksidan maddeler ilave edilmektedir. Bunlar gıdaları bozulmaya karĢı koruyarak daha uzun süreli saklanmasını sağlarlar. Bu antioksadanlardan bazıları, bütillenmiĢ hidroksi toluen (BHT), bütillenmiĢ hidroksi anisol (BHA) gibi bileĢiklerdir. Bu maddelerin toksik etkileri olduğundan Ģüphelenildiği için, son yıllarda, daha güvenli ve ucuz antioksidan maddelerin bulunabilmesi için doğal ürünler üzerinde yoğun çalıĢmalar yapılmaktadır. Bu çalıĢmada, Tokat bölgesinde geleneksel tedavide sıklıkla kullanılan 5 adet bitkinin (Achillea biebersteinii Afan., Urtica dioica L., Melissa officinalis L., Malva neglecta Wallr., Viscum album L.) ayrı ayrı ve karıĢımlar halindeki antioksidan aktivitelerinin araĢtırılması amaçlanmıĢtır. Kurutulup öğütülmüĢ bitkilerin ve karıĢımlarının metil alkol ekstrelerinin serbest radikal giderme aktiviteleri, indirgenme gücü aktiviteleri, süperoksit anyon radikali giderme aktiviteleri belirlenmiĢ ve total fenolik bileĢik tayinleri yapılmıĢtır. Seçilen bitkilerin değiĢik kombinasyonlar halindeki karıĢımlarının antioksidan aktivitesinin, tek baĢlarına gösterdikleri antioksidan aktiviteden yüksek olduğu anlaĢıldı. Bitkilerin ve karıĢımlarının total fenolik bileĢik miktarları ile antioksidan aktiviteleri arasında doğrusal bir iliĢki olduğu tespit edilmiĢtir.

Anahtar kelimeler: Antiosidan, Achillea biebersteinii, Urtica dioica, Melissa fficinalis, Malva neglecta, Viscum album.

(*) Bu çalıĢma GaziosmanpaĢa Üniversitesi Bilimsel AraĢtırma Projeleri Komisyon BaĢkanlığı tarafından 2009/41 No’lu proje olarak desteklenmiĢtir.

ABSTRACT Master Thesis

DETERMİNATION OF OPTIMUM ANTIOXIDANT CAPACITY OF SOME PLANT MIXTURE USED AS A FOLK MEDICINE IN TOKAT PROVINCE

Osman Atıf ÖZMEN Gaziosmanpaşa Universtity

Graduate School of Natural and Applied Scienses Department of Chemistry

Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Ramazan ERENLER

Nowadays, antioxidant usage is quite common in food industry and antioxidant substances are supplemented to almost all of the nutriment that we consumed. These substances which are butylated hydroxytoluene (BHT) and butylated hydroxyanisole (BHA) protect the food against the deterioration and contribute the food storage for long time. It is suspected that, these substances used for preservative have some toxic effects. Therefore many researches have been carried out to find new, cheap and safer antioxidant substances lately. Herein it was investigated the antioxidant activity of five different plants (Achillea biebersteinii Afan., Urtica dioica L., Melissa officinalis L., Malva neglecta Wallr., Viscum album L.) used as a traditional medicine grown in Tokat vicinity. Free radical scavenging activity, reducing power activity, superoxide anion radical scavenging activity have been carried out and total phenolic compounds have been determined. The combinations of some mixture plants display higher activity than that of the individual one.

Keywords: Antioxidant, Achillea biebersteinii, Urtica dioica, Melissa officinalis, Malva neglecta, Viscum album.

TEŞEKKÜR

Yüksek lisans tez çalıĢmam boyunca, bilgi, fikir ve literatür temini konusunda her türlü desteğini gördüğüm, her zaman benim için yol gösterici olan ve tez yazımımda yardımlarını esirgemeyen hocam Doç. Dr. Ramazan ERENLER’e ve ikinci danıĢmanım, değerli hocam Doç. Dr. Mahfuz ELMASTAġ’a;

Bu çalıĢmayı destekleyen, deneylerimde ve çalıĢmalarımda kıymetli tecrübelerinden faydalandığım hocalarım, Doç. Dr. Ġbrahim DEMĠRTAġ, Doç. Dr. Ġsa GÖKÇE, Doç. Dr. Ahmet KARADAĞ’a;

Laboratuar çalıĢmalarım esnasındaki yardımlarından dolayı Nusret GENÇ’e;

Bölümümüzün her türlü imkanından faydalanmamı sağlayan GaziosmanpaĢa Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü yöneticilerine;

ÇalıĢmalarım boyunca bilgi ve tecrübelerinden istifade ettiğim, hayatımın her alanında olduğu gibi yüksek lisans çalıĢmalarımda da desteğini benden esirgemeyen, meslektaĢım, sevgili eĢim Ecz. Hatice ÖZMEN’e;

Anneme ve babama;

TeĢekkürü borç bilirim.

İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET……….i ABSTRACT……….ii TEŞEKKÜR………iii İÇİNDEKİLER………...iv KISALTMALAR DİZİNİ………..vi ŞEKİLLER DİZİNİ……… vii 1. GİRİŞ………1 2. LİTERATÜR ÖZETLERİ………..5 2.1. Oksidatif Etki………..5

2.1.1 Reaktif oksijen türevleri ve oluĢum mekanizmaları ………8

2.1.1.1. Süperoksit Radikali (O2ֹ‾)………8

2.1.1.2. Hidrojen Peroksit (H2O2)………10

2.1.1.3. Hidroksil Radikali (OHֹ)………11

2.2. Antioksidan Etki………...………..12

2.3. Kullanılan Bitkiler ve Özellikleri……….……13

2.3.1. Achillea biebersteinii Afan………13

2.3.2. Urtica dioica L………..14

2.3.3. Melissa officinalis L………..14

2.3.4. Viscum album L……….15

2.3.5. Malva neglectga Wallr………..16

3. MATERYAL ve METOD………...……..17

3.1. Materyal ……….……..17

3.1.2 Kullanılacak Kimyasal Madde ve Malzemeler ……….18

3.1.3 Kullanılacak Cihazlar……….18

3.2. Metot……….………19

3.2.1 Süperoksit Anyon Radikali Giderme Aktivitesi……….19

3.2.2. Serbest Radikal (DPPH) Giderme Aktivitesi ………...20

3.2.3. Ġndirgenme Gücü Aktivitesi ……….20

3.2.4. Total Fenolik BileĢik Tayini………..20

4. BULGULAR ve TARTIŞMA………...22

4.1. Süperoksit Anyon Radikali Giderme Aktivitesi Bulguları………...22

4.2. Serbest Radikal (DPPH) Giderme Aktivitesi Bulguları………...25

4.4. Total Fenolik BileĢik Tayini……….35

5. SONUÇ ve ÖNERİLER………36 6. KAYNAKLAR………...41

KISALTMALAR DİZİNİ

Kısaltmalar Açıklama

WHO Dünya Sağlık Örgütü

BHT BütillenmiĢ Hidroksi Toluen BHA BütüllenmiĢ Hidroksi Anisol PG Propil Gallat

DPPH 1,1-Difenil 2-pikril hidrazil H2O2 Hidrojen Peroksit Radikali O2ֹ‾ Süperoksit Radikali OH· Hidroksil Radikali

R· Karbon Merkezli Organik Radikaller RS· Tiyil Radikalleri

ŞEKİLLER ve ÇİZELGELER DİZİNİ

Şekil 4.1.1. Bitki Numunelerinin Süperoksit Anyon Giderme Aktiviteleri (%)……….22 Şekil 4.1.2 Ġkili KarıĢımların Süperoksit Anyon Giderme Aktiviteleri (%)…………...23 Şekil 4.1.3. Üçlü KarıĢımların Süperoksit Anyon Giderme Aktiviteleri (%)………….23 Şekil 4.1.4. Dörtlü KarıĢımların ve 5 Bitkinin KarıĢımından OluĢan Numunenin

Süperoksit Anyon Giderme Aktiviteleri (%)………...24 Şekil 4.2.1. Bitki Numunelerinin Farklı Konsantrasyonlardaki Serbest Radikal

(DPPH ּ) Giderme Aktiviteleri

(%)………..25

Şekil 4.2.2. Ġkili KarıĢımların Farklı Konsantrasyonlardaki Serbest Radikal (DPPH ּ) Giderme Aktiviteleri

(%)………..26

Şekil 4.2.3. Üçlü KarıĢımların Farklı Konsantrasyonlardaki Serbest Radikal (DPPH ּ) Giderme Aktiviteleri

(%)………..27 Şekil 4.2.4. Dörtlü KarıĢımların ve 5 Bitkinin KarıĢımın Farklı

Konsantrasyonlardaki Serbest Radikal (DPPH ּ) Giderme Aktiviteleri (%)…………..29

Şekil 4.3.1. Bitki Numunelerinin Ġndirgenme Gücü Aktiviteleri………31 Şekil 4.3.2. Ġkili KarıĢımların Ġndirgenme Gücü Aktiviteleri……….32 Şekil 4.3.3. Üçlü KarıĢımların Ġndirgenme Gücü Aktiviteleri………33 Şekil 4.3.4. Dörtlü KarıĢımların ve 5 Bitkinin KarıĢımından OluĢan Numunenin

Ġndirgenme Gücü Aktiviteleri ……….34 Şekil 4.4.1. Fenolik bileĢiklerin tayininde gallik asit kullanılarak elde edilen

kalibrasyon grafiği………...35 Çizelge 4.4.1. Numunelerin fenolik bileĢik miktarlarının gösterildiği

1. GİRİŞ

Bitkilerin ilaç, yiyecek ve kozmetik amaçlı kullanımı, insanlık tarihinin ilk dönemlerinden itibaren baĢlamıĢ, günümüze kadar süregelmiĢtir. Hastalıkların tedavi edilmesi amacıyla, bu geçen zaman içerisinde, bitkilerin kullanımı ve kullanılan bitkilerin her birine ait spesifik özellikler insanlar tarafından keĢfedilmiĢ, pozitif ya da negatif denemelerle de geliĢtirilmiĢtir. Tedavi amacıyla kullanılan bitkilerin miktarı devamlı bir artıĢ göstermektedir. Mezopotamya Uygarlığı döneminde kullanılan bitkisel drog miktarı 250 civarında iken, XIX. asrın baĢlarında bilinen tıbbi bitki miktarı 13.000 sayısına ulaĢmıĢtır. 1979 yılında Dünya Sağlık Örgütü (WHO) tarafından yapılan bir araĢtırmanın sonuçlarına göre, farmakopelerde kayıtlı olan beĢ ülkeden fazla ülkede kullanılan ve ticarette bulunabilen bitkisel drogların miktarı 1.900 olarak saptanmıĢtır. Aynı kurumun 91 ülkenin farmakopelerine ve tıbbi bitkileri üzerinde yapılmıĢ olan bazı yayınlara dayanarak hazırladığı bir baĢka araĢtırmaya göre de tedavi amacıyla kullanılan tıbbi bitkilerin toplam miktarı 20.000 civarındadır (Baytop, 2009). Hastalıklara karĢı ilaç veya etken madde keĢfi için tıbbi bitkilere ve bu bitkilerden çeĢitli maddelerin izole edilerek insanlığın hizmetine sunulma çalıĢmaları da son derece önem kazanmıĢtır. Günümüzde bitkisel kaynaklara dayanan doğal ürünlerin üretim teknolojisinin geliĢtirilmesi ve üretilen ürünlerin sanayinin çeĢitli alanlarında kullanımı, insan sağlığı ve çevrenin koruması açısından en önemli teknoloji araĢtırmalarının merkezinde yer almaktadır (Amakura, Umino, Tsuji, Ito, Hatano, Yoshida and Tonogia, 2002; Baytop, 1999).

Son yıllarda özellikle Avrupa’da, çevre kirliliğinin önlenmesi ve insan sağlının korunması açısından, endüstriyel üretimin çeĢitli sahalarında doğal bitkisel katkı maddelerinin kullanımı fevkalade önem kazanmıĢ durumdadır (Baytop, 1999). Mesela

gıdaların depolanması ve pazarlanması sırasında, ortamda bulunan reaktif oksijen molekülleri, gıda bileĢenleri ile reaksiyona girerek istenmeyen uçucu bileĢikler ve kanserojen maddelerin üremesine neden olmakta, esansiyel besin içeriklerine zarar vermekte, protein, yağ ve karbonhidratların yararlılığını azaltmakta ve sonuçta ürünün kimyasal ve fiziksel özelliklerini değiĢtirmektedir (Choe & Min, 2006). Gıdaları bu gibi bozulmalara karĢı korumak ve raf ömürlerini uzatmak amacıyla çeĢitli antioksidan maddeler kullanılmaktadır.

BütillenmiĢ hidroksianisol (BHA), bütillenmiĢ hifroksitoluen (BHT), Propil gallat ( PG) gibi maddeler, gıdalar için sıklıkla kullanılan bazı sentetik antioksidanlardır. Bu sentetik antioksidan maddelerin güvenirlilikleri üzerindeki Ģüpheler sebebiyle doğal antioksidan kaynakları bulabilmek amacıyla yapılan çalıĢmalar hız kazanmıĢtır. Yüksek düzeyde antioksidan özellik gösteren bileĢikleri içermesi bakımından tıbbi ve aromatik bitkiler konusunda araĢtırmalar yapılmaya baĢlanmıĢtır. Bu alanda pek çok bitki üzerinde yapılan çalıĢmalar, içeriklerinde, gerek antioksidan aktivite gerekse çeĢitli hastalıklara karĢı tedavi edici etki açısından etkinlikleri tespit edilmiĢ kimyasal bileĢiklerin yüksek konsantrasyonda bulunduğunu ortaya koymuĢtur (Rojas ve diğ., 2003; Chen ve Diğ., 2005).

Günümüzde hızlı iĢ temposu, ağırlaĢan hayat koĢulları, zaman darlığı ve stres gibi nedenlerde, kiĢiden kiĢiye değiĢmekle birlikte, insanlar normal seyrinden daha önce ve sağlıksız bir Ģekilde yaĢlanmaya baĢlamıĢlardır. Belirtilerin erken yaĢlarda ortaya çıkmasında kalıtımın rolü olduğu kadar yaĢam biçiminin de rolü olduğu bilinmektedir. YaĢlanma, kısaca organizmadaki hücresel aktivitelerin azalmasına bağlı olarak organ fonksiyonlarının da azalması ve gerilemesi sonucu ortaya çıkan bir durumdur.

Ġnsanoğlu yıllardır, yaĢlanmayı durdurmak için uğraĢmasına rağmen, bu durumu önleyecek veya durduracak bir çözüm bulunmuĢ değildir. Son yıllarda popüler hale gelen “antiaging” kavramı da, yaĢlanmayı durdurmayı değil, bir bütün halinde bedensel ve zihinsel olarak sağlıklı bir yaĢlanma sürecinin oluĢumunu amaçlamaktadır. Oldukça geniĢ bir kavram olan antiaging, tıp ve eczacılık dallarından, kozmetik ve spora kadar pek çok disiplin ve uygulamayı kapsamaktadır. Aktüel olarak özellikle “doğala dönüĢ”

veya “yeĢil akım” ifadeleriyle karĢılık bulan bitkisel ilaçların önemi, bu anlamda her geçen gün artmaktadır.

YaĢlanma sürecinde kalıtım dıĢındaki çevresel faktörlerin kontrol edilmesi çoğu zaman mümkündür. Aslında vücudumuzdaki hücreler (beyin ve sinir hücreleri hariç) kendilerini yenileyebilme yeteneğine sahiptir. Ancak uzun yıllar sonunda azalan hücre fonksiyonları organizmayı yaĢlanma sürecine sokar. YaĢlanmanın en önemli sebeplerinden biri de çeĢitli Ģekillerde vücutta oluĢan serbest radikallerin yol açtığı oksidasyondur. Besinlerin oksijen mevcudiyetinde enerjiye dönüĢmeleri esnasında ortaya çıkan reaktif oksijen moleküleri olarak tanımlanabilen serbest radikaller, hücrenin temelini oluĢturan DNA’da hasara yol açabilmekte, hatta oksidatif stresle bağlantılı olarak kanser, kardiyovasküler hastalıklar, diyabet ve demans gibi pek çok hastalığın da oluĢumunda rol oynayabilmektedirler (Orhan, 2008).

Özellikle vücutta bulunan serbest radikallerin inaktive edilmesi için, insan beslenmesinin bu tip bileĢikleri yüksek oranda içeren bitkilerce zenginleĢtirilmesi tavsiye edilmektedir. Serbest radikallere karĢı hücre savunma sistemine katılan önemli öğeler arasında fenolik bileĢikler, askorbik asit ve karotenoidler bulunmaktadır (Capecka ve diğ., 2005). Bitkisel kaynaklardan izole edilen ve antioksidan aktivite gösteren diğer bir madde de tokoferollerdir (Clark ve diğ., 1990).

Bu çalıĢmada antioksidan kapasiteleri araĢtırılmak üzere seçilmiĢ olan bitkiler, Tokat çevresinde geleneksel tedavi amacıyla sıkça kullanılmakta olan bitkilerdir. Bu bitkilerden bazıları gıda olarak da tüketilmekte, gerek pazar yerlerinde taze olarak, gerekse aktarlarda kurutulup paketlenmiĢ biçimde satılmaktadır. Ġnsanlar çeĢitli hastalıklarla ilgili olan yakınmaları için aktarlara gittiklerinde, bu bitkilere veya bu bitkilerin çeĢitli kısımlarını içeren karıĢımlara ulaĢabilmektedirler. Toplanma, depolanma biçimleri, toplanma zamanları açısından belirli standartları karĢılamayan bu ürünlerin, içerikleri de analiz edilmiĢ değildir. Hangi bileĢeni ne oranda ihtiva ettiği bilinmeyen ürünlerin birbirleriyle karıĢtırılmasıyla oluĢturulmuĢ tedavi paketleri, üzerlerindeki kısa bilgilendirme yazılarında çeĢitli hastalıklardan korunma ve kimi hastalıkların tedavisi için önerilmektedirler. GeliĢigüzel hazırlanmıĢ bu paketlerin

kullanılmasının sağlık açısından çeĢitli sakıncalar doğurabileceği ihtimali göz önünde bulundurulduğunda, bu hususta yapılacak bilimsel çalıĢmaların önemi her geçen gün artmaktadır. Bölgemizde geleneksel tedavi amacıyla sıklıkla kullanılan bu 5 bitkinin ve karıĢımlarının antioksidan aktivite açısından bilimsel bir incelemeye konu olması, bitkilerle tedavi konusunda rasyonel yaklaĢımlar geliĢtirilebilmesi adına faydalı bir adım olacaktır.

Bu çalıĢmamızda, 5 bitkinin (Achillea biebersteinii Afan., Urtica dioica L., Melissa officinalis L., Malva neglecta Wallr., Viscum album L.) ve karıĢımlar ( ikili, üçlü, dörtlü ve beĢli kombinasyonlar) halindeki numunelerinin süperoksit anyon radikali giderme aktiviteleri, serbest radikal (DPPH ּ) giderme aktiviteleri, indirgenme gücü aktiviteleri belirlenemiĢ ve total fenolik bileĢik tayinleri yapılmıĢtır.

2. LİTERATÜR ÖZETLERİ

Yapılan literatür çalıĢmalarında, bu çalıĢmada kullanılan bitkiler ile, oksidatif etki ve antioksidatif aktiviteyle ilgili olarak çeĢitli bilgiler edinilmiĢtir. Bunlar aĢağıda özetlenmiĢtir.

2.1. Oksidatif Etki

Serbest radikaller olarak da adlandırılan reaktif oksijen türevleri, gıdalarda oksidasyon reaksiyonlarını baĢlatarak, renk ve koku kaybı ile bozulmalara yol açmakta, insanlarda da bazı hastalıklara neden olmaktadır (Choe ve Min, 2006).

Oksijen ve diğer oksijen türevleri reaktivitesi yüksek moleküllerdir ve proteinler, lipidler ve nükleik asitler ile reaksiyona girerek fonksiyon azalmasına ya da yok olmasına sebep olmaktadırlar. Bu etkileri yüzünden reaktif oksijen türleri ( ROS) olarak isimlendirilirler (Hallivell, 1996).

Reaktif oksijen türleri, kimyasal olarak en dıĢ elektron yörüngesinde bir elektron kaybetmiĢ olan yani eĢleĢmemiĢ elektron içeren atom, atom grubu veya moleküller olarak tanımlanmaktadırlar. Serbest radikallerin çeĢitli zararlı etkilere yol açmaları, elektron açıklarını kapatabilmek için baĢka atomların elektronlarını paylaĢmaya çalıĢmalarından kaynaklanmaktadır (Frankel, 1999).

Moleküler oksijen, paralel spin durumlu iki eĢlenmemiĢ elektrona sahiptir. Serbest radikal tanımına göre moleküler oksijen bir diradikal olarak değerlendirilmektedir. Moleküler oksijen, diradikal doğasının bir sonucu olarak yüksek derecede reaktif oksijen türleri (ROS) oluĢturma eğilimindedir. Ayrıca, radikal olmayan maddelerle

yavaĢ yavaĢ reaksiyona girdiği halde diğer serbest radikallerle kolayca reaksiyona girmektedir (AltınıĢık, 2000).

Bu reaktif özelliğinden ötürü moleküler oksijen, anaeroplar için öldürücü ya da geliĢimi durdurucu etkiye sahiptir. Bazı anaeroplar düĢük oksijen konsantrasyonların da (mesela Bacteroides fragilis veya Clostridium novyi Tip A) yaĢayabilirken bazıları da (Treponema denticola ve bazı Clostridia türleri) ancak oksijenin hiç olmadığı ortamlarda yaĢayabilmektedirler. Anaeroplar geliĢebilmek için indirgeyici bileĢiklere ihtiyaç duyarlar. Moleküler oksijen hücre bileĢenlerini oksitleyerek anaeropların biyosentetik reaksiyonları için gerekli olan bu indirgeyici maddeleri ortadan kaldırır. O2’nin indirgenmesi ayrıca reaktif oksijen türlerinin de oluĢmasına sebep olur. Bunlara hücreye zarar vererek, yeni reaktif türlerin oluĢumuna ve hücrenin ölümüne dene olurlar. Anaeroplardaki bazı enzimler doğrudan O2 tarafından da inhibe edilebilirler. Oksijenin bu yükseltgeyici özelliğinden anaeroplar gibi nispeten aeroplar da zarar görmektedir. Davies (2000)’in araĢtırmasına göre, E. Coli ve diğer aerobik bakterilerin büyümesinin 1 atm basınçtaki saf oksijen ile önemli oranda yavaĢladığı gözlenmiĢtir. Ökaryotik hücrelerin %2-4’lük oksijeni iyi bir Ģekilde tolore edebildikleri düĢünülmektedir. Daha yüksek konsantrasyonda (%20 gibi), bu artıĢa karĢılık adaptasyon için antioksidan sistemlerinin aktivitelerinde artıĢ olmaktadır.

Oksijenin oksidasyon yeteneği az olmasına rağmen onun reaktif türlerinin (süperoksit ve hidrojen peroksit gibi) oksidasyon gücü nispeten daha yüksek olmakta ve özellikle doymamıĢ yağ asitlerini oksidasyona uğratmaktadır. Dolayısıyla yüksek lipid içeriğine sahip olan sinir dokusu, yüksek oksijen konsantrasyonunda kolayca hasara uğrayabilmektedir (Ünal, 2006).

Reaktif oksijen türlerine karĢı özellikle aeroplar çeĢitli savunma sistemlerine sahiptirler. Bu sistemler genel olarak “Antioksidan Sistem” baĢlığı altında toplanmaktadır. Organizmada sürekli oksidanlar üretilmekte, buna karĢılık antioksidan sistem tarafından bu oksidanlar ve bunların olumsuz etkileri bertaraf edilmektedir. Bu durum bir denge halinde süreklilik arzeder. Bu dengenin oksidanlar lehine bozulması durumu ise

“Oksidatif Stres” olarak anılabilir (Ünal, 2006). Oksidatif stres durumunda reaktif türlerin miktarında artıĢ olur ve bu türler baĢta lipidler, proteinler ve nükleik asitler olmak üzere vücudumuzun bir çok sistemine zarar verirler (Lambeth 2004). Olumsuz etkilenen sistemler, iliĢkili oldukları diğer sistemleri etkiler ve bu durum zincirleme olarak devam eder. Bu zincirleme reaksiyonlar antioksidan sabunma sistamleri tarafından sonlandırılır. Antioksidan savunmanın yetersiz olması durumunda bu reaktif türler hücrenin doğrudan veya dolaylı olarak ölümüne sebep olurlar (Moldovan & Moldovan, 2004).

Reaktif türler birçok hastalığın geliĢiminde önemli rol oynarlar (Evans et al. 2004; Robinson et al. 2004). Örneğin, ülser ve kanser oluĢumunda oksidatif stresin önemli rolü olduğu bilinmektedir.

Reaktif türlerin zararlı etkilerinin sebebi radikal olmaları, radikal oluĢumuna sebep olabilmeleri ve yükseltgeme potansiyellerinin nispeten yüksek olmasıdır. Radikaller orbitallerinde eĢleĢmemiĢ elektron içeren atom ya da moleküllerdir. Hidroksil, süperoksit, peroksil, alkoksil radikalleri gibi. Bunlar eĢleĢmemiĢ elektronları eĢleĢtirme eğiliminde oldukları için kararsızdırlar ve bu kararsızlıkları onların kimyasal olarak aktif olmalarının sebebidir. Oksidatif stres sürecinde üretilen reaktif oksijen türleri nükleik asitleri, proteinleri ve lipidleri oksitleyebilir (Standtman, 2002). Özellikle radikal olan reaktif oksijen türleri ile biyomoleküller arasındaki reaksiyon, radikalik zincir reaksiyonu Ģeklinde yürüdüğü için, oksidatif hasar ilerleme eğilimindedir. Bu zincirleme reaksiyon, yeni reaktif türler oluĢturmakta ve bunlar da baĢka biyomoleküllere zarar verebilmektedir. Bu durum organizmanın yaĢı ilerledikçe daha belirgin hale gelmektedir. Oksidatif stres süresince üretilen reaktif türlerin yaĢlanmaya sebep olduğu yönünde görüĢler de mevcuttur. Çünkü yaĢlanmayla beraber reaktif oksijen türlerinin biyomoleküller üzerindeki oksidatif hasarında bir artıĢ söz konusudur (Standtman, 2002).

Reaktif oksijen tülerine en hassas molekülün, hücre membranının ana bileĢeni olan lipidler olduğu düĢünülmektedir (Ünal, 2006). Organizmada, yeterince reaktif bir atom ya da molekül lipid peroksidasyonunu baĢlatabilir. Oksijen ya da baĢka bir radikal, yağ

asidinin karbonuna bağlı hidrojenlerden birini elektronuyla birlikte kopararak radikal oluĢumuna sebep olabilir. OluĢan bu radikal, komĢu yağ asidinden bir hidrojen koparır yeni bir radikalin oluĢumuna sebep olur (Ünal, 2006). Bu arada oluĢan radikal, oksijenle reaksiyona girebilir ve peroksil radikali oluĢabilir. Zamanla bu zincirleme reaksiyonlar sonucunda radikal konsantrasyonu artar. Sonuçta lipid peroksidasyonu gerçekleĢir. Vücut içi antioksidan sistemlerin haricinde dıĢ kaynaklı alınan antioksidanlar da mevcuttur. C vitamini, E vitamini, meyve ve sebzelerdeki fenolik maddeler, A vitamini, β- karatoen gibi (Ünal, 2006).

2.1.1 Reaktif oksijen türevleri ve oluşum mekanizmaları

Reaktif oksijen türleri, normal oksijen metabolizması sırasında az miktarda oluĢan süperoksit radikali, hidrojen peroksit, hidroksil radikalidir

O2 O .-2 e- e 2 H + -, H₂O₂ e-, H+ H₂O + OH. e -, H+ H₂O moleküler oksijen süperoksit radikali hidroksil radikali

Reaktif oksijen türleri, çeĢitli serbest radikallerin oluĢtuğu serbest radikal zincir reaksiyonlarını baĢlatabilirler ve hücrede karbon merkezli organik radikaller, peroksit radikalleri, alkoksi radikalleri, tiyil radikalleri, sulfenil radikalleri, tiyil peroksit radikalleri gibi çeĢitli radikallerin oluĢumuna neden olurlar (Dawn, Allan ve Colleen, 1996; AkkuĢ, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999).

2.1.1.1. Süperoksit Radikali (O2ֹ‾)

Süperoksit radikali hemen hemen tüm aerobik hücrelerde moleküler oksijenin bir elektron alarak indirgenmesi sonucu oluĢur. ĠndirgenmiĢ geçiz metallerinin otooksidasyonu süperoksit radikali meydana getirebilr.

Fe2+ + O₂ Fe 3+ + O₂ . -. O₂ O2 Cu+ + Cu 2 + +

Süperoksit radikali kendisi direkt olarak zarar vermez. Bu radikal anyonun asıl önemi, hidrojen peroksit kaynağı olması ve geçiĢ metalleri iyonlarının indirgeyicisi olmasıdır. Süperoksit radikali düĢük pH değerlerinde daha etkilidir. Oksidan perhidroksi radikali, oluĢturmak üzere protanlanır.

. + -. O2 H+ HO2

Süperoksit radikali ile perhidroksi radikali birbiriyle reaksiyona girince biri okside olur diğeri indirgenir. Bu dismutasyon reaksiyonunda moleküler oksijen ve hidrojen peroksit meydana gelir. + O₂ + . -O₂ + HO₂ H + H₂O₂

Süperoksit radikali hem oksitleyici hem indirgeyici özelliğe sahiptir. Örneğin ferrisitokrom c ya da nitroblue tetrazolium ile reaksiyonunda indirgeyici olarak davranarak bir elektron kaybeder ve moleküler oksijene okside olur.

+ + Fe 3+ O2 -. O₂ sit c ( ) sit c ( Fe 2 )

Süperoksit radikali epinefrinin oksidasyonunda oksidan olarak davranarak bir elektron alır ve hidrojen perokside (H2O2) indirgenir. Süperoksit radikalinin fizyolojik bir serbest radikal olan nitrik oksit (NOֹ) ile birleĢmesi sonucu bir reaktif oksijen türü olan

peroksinitrit (ONOO ּ) meydana gelir. Peroksinitrit, nitrit (NO2‾) ve nitrat (NO3‾) oluĢturmak üzere metabolize edilir. Peroksinitrit, azot dioksit (NO2ֹ), hidroksil radikali (OH ּ ּ), nitronyum iyonu (NO2+) gibi toksik ürünlere dönüĢebilir ki nitrik oksitin (NOֹ) zararlı etkilerinden peroksinitrit sorumludur (Dawn, Allan ve Colleen, 1996; AkkuĢ, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999)

2.1.1.2. Hidrojen Peroksit (H2O2)

Hidrojen peroksit, süperoksidin çevresindeki moleküllerden bir elektron alması veya moleküler oksijenin çevresindeki moleküllerden iki elektron alması sonucu oluĢan peroksidin iki proton ile birleĢmesi sonucu meydana gelir.

+ + O₂ -. O₂ + -H + e ₂ H2O2 + 2 e 2 H+ H2O2

Biyolojik sistemlerde hidrojen peroksidin asıl üretimi, süperoksidin (O2˙ ּ)dismutasyonu ile olur. Ġki süperoksit molekülü, süperoksidin dismutasyonu reaksiyonunda iki proton alarak hidrojen peroksit ve moleküler oksijeni oluĢtururlar.

+ O₂

-.

O₂ + 2 H + H2O2

2

Bu reaksiyon, radikal olmayan ürünler meydana geldiğinden dismutasyon reaksiyonu olarak bilinir, ya spontan gerçekleĢir ya da süperoksit dismutaz (SOD) enzimi tarafından katalizlenir. Spontan dismutasyon pH 4.8’de en hızlıdır, enzimatik dismutasyon ise spontan dismutasyonun nispeten yavaĢ olduğu nötral pH’da daha belirgindir.

Hidrojen peroksit bir serbest radikal olmadığı halde reaktif oksijen türleri (ROS) kapsamına girer ve serbest radikal biyokimyasında önemli rol oynar. Çünkü veya

diğer geçiĢ metallerinin varlığında Fenton reaksiyonu sonucu, süperoksit radikalinin (O2˙ ּ) varlığında Haber-Weiss reaksiyonu sonucu en reaktif ve zarar verici serbest oksijen radikali olan hidroksil radikali (OH ּ ּ) oluĢturur.

Fe+2 + H₂O₂ Fe +3 + OH . + OH -Fenton Reaksiyonu F e + O₂ . -. O₂ + + + H H₂O₂ . OH H₂O

Haber - weiss reaksiyonu

Süperoksit radikalinin yağda çözünürlüğü sınırlı olduğu halde hidrojen peroksit yağda çözünür. Bu nedenle hidrojen peroksit kendisinin oluĢtuğu yerden uzakta olan fakat

içeren membranlarda hasar oluĢturabilir (Dawn, Allan ve Colleen, 1996; AkkuĢ, Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999).

2.1.1.3. Hidroksil Radikali (OHֹ)

Hidroksil radikali, Fenton reaksiyonu ve Haber-Weiss reaksiyonu sonucu hidrojen peroksitten oluĢmaktadır. Ayrıca suyun yüksek enerjili iyonize edici radyasyona maruz kalması sonucu oluĢur.

Hidroksil radikali son derece reaktif bir oksidan radikal olup yarılanma ömrü çok kısadır ve reaktif oksijen türlerinin en güçlüsüdür. OluĢtuğu yerde tiyoller ve yağ asitleri gibi çeĢitli moleküllerden bir proton kopartarak tiyil radikalleri (RS˙), karbon merkezli organik radikaller (R˙) organik peroksitler (RCOO˙), gibi yeni radikallerin oluĢmasına ve sonuçta büyük hasara neden olmaktadır (Dawn, Allan ve Colleen, 1996; AkkuĢ, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999).

+ - . + . +OH H₂O R-SH + OH + -CH ₂ RS + H₂O 2 -CH -2.2. Antioksidan Etki

Antioksidanlar, serbest radikalleri iki temel mekanizma ile inaktive etmektedirler. Bunlardan biri “hidrojen atomu transfer reaksiyonu,” diğeri ise “tek elektron transferi reaksiyonu mekanizmasıdır (Arslan, 2008). Reaksiyon sonuçları her iki mekanizma için aynı olsa da, reaksiyon kinetik ve potansiyelleri birbirinden farklılık göstermektedir. Tek elektron transferi ve hidrojen atomu transferi reaksiyonları, antioksidan yapısının ve pH’nın sağladığı dengeyle tüm sistemlerde bir arada gerçekleĢmektedir. Bu durumda, verilen sistemdeki hakim mekanizma, antioksidanın yapı ve özellikleri, çözünürlük ve bölünme katsayısı ile istem solventinin özelliklerine göre belirlenmektedir. Reaksiyon mekanizmasını ve antioksidanların etkinliğini belirleyen diğer iki temel faktör ise, bağ kırılma enerjisi ile iyonizasyon potansiyeli değerleridir ( Prior ve diğ. 2005).

Antioksidanlar farklı radikallere veya oksidan kaynaklara farklı tepkiler göstermektedirler. Örneğin, karatonoidler fenolik bileĢiklere ve diğer antioksidanlara nazaran, peroksil radikallerine karĢı fazla etkili olmamalarına rağmen singlet oksijene karĢı çok güçlü bir etkiye sahiptirler ( Prior ve diğ., 2005).

Hidrojen atomu transfer reaksiyon mekanizması, antioksidanların sahip oldukları hidrojen atomunu vermek suretiyle serbest radikalleri yok etmeleri esasına dayanır. Bu reaksiyonlar çözücüye ve pH’ya bağlı değildir ve oldukça hızlı gerçekleĢirler. Ortamdaki indirgenme ajanlarının varlığı, hidrojen atomu transfer reaksiyonunu kullanan metotlarla yapılan analizlerde olduğundan daha yüksek reaktivite göstermesine yol açarak hatalı sonuçların elde edilmesine neden olmaktadır (Prior ve diğ., 2005).

Tek elektron transfer reaksiyonu ise, antioksidanların metaller, karboniller ya da radikaller gibi bileĢiklere tek bir elektron vermek suretiyle bu bileĢikleri indirgenmesi esasına dayanır. X + AH X + AH . -.₊ AH .+ A. + H ₃O+ X + H ₃O+ _XH + H₂O M (III) + AH AH ++ M (II)

Bu reaksiyonlar pH’a bağlıdır ve genellikle oldukça yavaĢ gerçekleĢmektedirler. Tek elektron transferine dayalı metotlar askorbik asit ve ürik asite karĢı oldukça hassas olup metal gibi kontaminantların varlığında analiz sonuçları olumsuz yönde etkilenmekte, yüksek değiĢkenliklere ve tutarsızlıklara rastlanmaktadır (Prior ve diğ., 2005).

2.3. Kullanılan Bitkiler Ve Özellikleri

2.3.1. Achillea biebersteinii Afan. (Syn: A. Mictantha Willd.) (pire otu, sarı civanperçemi)

100 cm yükseklikte, çok tüylü, sarı çiçekli, çok yıllık ve otsu bir bitkidir. Batı Anadolu hariç, Anadolu’nun diğer bölgelerinde yaygındır.

Çiçek durumlarında % 0.45 uçucu yağ bulunmaktadır. Bu uçucu yağda % 49 sineol bulunduğu saptanmıĢtır. Uçucu yağın bileĢim ve miktarı bitkinin varyetesine ve elde ediliĢ zamanına ve yöresine göre çok değiĢmektedir

Etki ve kullanılışı: idrar artırıcı, iĢtah açıcı, gaz söktürücü, adet söktürücü ve yara iyi edici etkilere sahiptir.

Kullanılış şekli: Dahilen infusyon (%5) günde 2-3 bardak içilir. Yara iyi edici ve basur ağrılarını dindirici olarak, taze yaprağın sıkılması ile elde edilen usare, bir tülbent ile yaranın veya basur memelerinin üzerine konur ve pansuman günde 2-3 defa dtekrarlanır. Etkili ve zararsız bir ilaçtır (Baytop, 1999)

2.3.2. Urtica dioica L. (Büyük ısırgan otu)

Çok yıllık, dioik ve otsu bir bitkidir. Boyu bazen bir metreyi geçer. Yapraklar koyu yeĢil renkli, saplı, diĢli kenarlı ve yakıcı tüylüdür. Yaygın bir türdür.

BileĢiminde, potasyum tuzları, organik asitler (formik asit), histamin, asetilkolin, vitgamin C taĢımaktadır.

Etki ve kullanılışı: Yaprak ve kök dahilen kan temizleyici, idrar artırıcı ve iĢtah açıcı olarak kullanılır. Taze bitki, romatizma ağrılarını gidermek için, ağrıyan yerlere sürülerek tahriĢ yapılır ve kan toplanması sağlanır. Bitkiden elde edilen bazı fraksiyonların antikoagülan bir etkiye sahip olduğu gösterilmiĢtir (Akcasu, A. ve ark., 1983).

Isırganın deride meydana getirdiği yakıcı etkinin eskiden tüylerde bulunan serbest formik asitten kaynaklandığı sanılırdı. Halen bu etkinin tüylerde bulunan histamin ve asetilkolin nedeniyle oluĢtuğu anlaĢılmıĢtır.

Kullanılış şekli: Yapraktan hazırlanan infusyon (% 2-5) veya kök dekoksiyonu (%3-4) yemek aralarında olmak üzere, günde 2-3 bardak içilir.

20 – 150 cm yükseklikte, tüylü, çok yıllık ve otsu bir bitkidir. Yapraklar basit, saplı ve diĢli kenarlıdır. Çiçekler iki dudaklı beyaz sarımsı veya kırmızımtırak renklidir. Anadolunun dıĢ kısımlarında ve Akdeniz bölgesinde bol olarak bulunmaktadır.

BileĢiminde tanen ve uçucu yağ taĢımaktadır. Uçucu yağ içinde bizzat sitral, sitronellal, sitronelellol, ve linalol bulunmaktadır. Anadolu kökenli olanlarda % 0.1-0.0015 uçucu yağ bulunduğu saptanmıĢtır.

Etki ve kullanılış: YatıĢtırıcı, midevi, gaz söktürücü, terletici ve antiseptik etkilere sahiptir.

Kullanılış şekli: Ġnfusyon (%2-5), yemeklerden önce veya sonra bir fincan içilir.

2.3.4. Viscum album L. (ökse otu, çekem).

Ağaçlar üzerinde parazit olarak yaĢar. KıĢın yapraklarını dökmez. Taze meyveler bezelye büyüklüğünde ve parlak beyaz renklidir. YapıĢkan bir madde taĢır. Bu madde çubuklar üzerine sürülür. Bu Ģekilde küçük kuĢları yakalamak için “ökse” yapılır. Bu nedenle bitkiye “ökseotu” ismi verilir. (Baytop, 1999)

Kuru meyveler sarımtırak renkli, üzeri buruĢuk, kokusuz ve tatsız taneler halindedir. Tedavide kurutulmuĢ meyveler veya yapraklı dallar kullanılmaktadır.

Bitki rezin, saponinler, organik asitler ve alkolikler taĢımaktadır (Baytop, 1999).

Etki ve kullanılış: Meyve veya yapraklı dallar (herba visci albi)’ın kabız, idrar artırıcı, kusturucu, kuvvet verici ve tansiyon düĢürücü etkileri vardır.

Kullanılış şekli: Bilhassa infusyon (%1-2, günde 2-4 bardak) halinde kullanılır. Tansiyon düĢürücü olarak kullanılan bir çok müstahzarın içeriğinde bulunmaktadır.

Meyvaların yakı sakızı ile ezilmesi sonucu elde edilen karıĢım, güneydoğu Anadolu bölgeinde (Gazi Antep, Urfa, Van) yakı halinde romatizma ağrılarının giderilmesinde kullanılmaktadır. Etkili ve zararsız bir ilaçtır.

EzilmiĢ meyveler çıban üzerine koyularak çıbanın açılması ve cerahatın dıĢarı çıkması sağlanır (Baytop, 1999).

2.3.5. Malva neglectga Wallr. (Ebegümeci).

Çok yıllık otsu ve mor çiçekli bir bitkidir. YeĢil renkli, tüylü ve uzun saplı yapraklardır. Yaprak lobları küttür. Hafif kokulu ve yavan lezzetlidir.

BileĢiminde, müsilaj (%15-20), glikoz ve pektin taĢımaktadır (Baytop, 1999).

Etki ve kullanılış: Ġçerdiği müsilaj nedeniyle, koruyucu ve yumuĢatıcı bir etkiye sahiptir. Solunum ve sindirim sistemi tahriĢleri ve iltihaplarında koruyucu olarak çok kullanılır. Taze yapraklarından hazırlanan lapa, cilt üzerindeki çıban ve yaraların ağrılarını dindirmek için, tülbent arasında, deri üzerine korur. Genç bitkileri sebze olarak kullanılır.

Memleketimizin kırsal bölgelerinde, taze ebegümeci dalı çocuk düĢürücü olarak kullanılmaktadır. Yaprakları alınmıĢ taze dal rahim içine sokulur. Ebegümeci dalı yumuĢak lifli olduğundan rahmi delmez. Meydana gelen mekanik etki ve oluĢan enfeksiyon nedeniyle gebelik önlenebilir. Özel bir etkisi bulunmamaktadır.

Ebegümeci dalının rahme konması ile meydan gelen infeksiyon bazen kullanan Ģahsın hayatını tehlikeye sokacak bir nitelik kazanır. Bu nedenle ebegümeci dalı ile çocuk düĢürmeye teĢebbüs edilmemesi tavsiye edilir (Baytop, 1999).

Kullanılış şekli: Ġnfusyon veya dekoksiyon. Dahilen kullanmak için %1-3, haricen gargara halinde kullanmak için ise %5 oranında hazırlanır. Lapa taze yapraklardan yapılmalıdır (Baytop, 1999).

3. MATERYAL VE METOD

3.1. Materyal

Bu çalıĢmada kullanılan bitkilerin tür teĢhisleri GOP. Üniv. Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Bölümü’nde yapılmıĢtır. Bitkilerin isimleri ve bu bitkilerin toplandıkları yerler aĢağıda belirtilmiĢtir:

Achillea biebersteinii Afan.: Tokat ili Almus ilçesi yakınlarında, 15 Mayıs 2009 tarihinde toplanmıĢtır.

Urtica dioica L.: Turhal ilçesi, Kızkayası Köyü yakınlarında, 20 Nisan 2009 tarihinde toplanmıĢtır.

Melissa officinalis L.: Niksar yaylasında, 17 Mayıs 2009 tarihinde toplanmıĢtır.

Malva neglecta Wallr.: Pazar ilçesi Kat beldesi çevresinde, 20 Mayıs 2009 toplanmıĢtır. Viscum album L.: Tokat ili Topçam yaylasında, 10 Haziran 2009 tarihinde toplanmıĢtır.

Her bir bitki için aĢağıdaki Ģekilde numaralandırma yapılmıĢtır: Achillea biebersteinii Afan: 1

Viscum album L. : 2 Melissa officinalis L. : 3 Urtica dioica L. : 4 Malva neglecta Wallr. : 5

Yapılan bu numaralandırmaya göre, her bitki numunesinden 5’er gr alınarak, 2’li, 3’lü, 4’lü ve 5’li karıĢımlar -toplam 31 adet numune- halinde hazırlanmıĢ olup, aĢağıdaki Ģekilde isimlendirilmiĢlerdir.

Ġkili karıĢımlar (10 adet): 12 23 34 45 13 24 35 14 25 15 Üçlü karıĢımlar (10 adet): 123 234 314 415 124 235 315 125 245 345 Dörtlü karıĢımlar (5 adet) 1234 1235 1245 1345 2345 BeĢli karıĢım: 12345

Bu numunelerin her biri 70 ml metanol-metilen klorit (1:1) çözeltisiyle ekstraksiyona tabi tutulmuĢtur. Her bir ekstraktın 1mg/ml konsantrasyonundaki 20 ml stok çözeltileri hazırlanmıĢtır.

3.1.2 Kullanılacak Kimyasal Madde ve Malzemeler

Etanol, Eter, DPPH ּ, Metanol, FeCl3, FeCl2, Etil asetat, Potasyum dihidrojen fosfat, dipotasyum hidrojen fosfat, beher, balon, vezin kapları, deney tüpleri, santrifüj tüpleri v.b laboratuar malzemeleri.

Evaporatör, pH metre, Mikro pipet, Manyetik karıĢtırıcı, Santrifüj, UV spektrofotometre.

3.2. Metot

Toplanan bitkiler gölgede kurutulduktan sonra, iyice öğütülerek ekstraksiyon iĢlemleri için hazır hale getirilmiĢtir. Ekstraksiyon iĢleminde 1:1 oranında metanol ve metilen klorit karıĢımı kullanılmıĢtır. Elde edilen ekstraktın, Süperoksit anyon radikali giderme aktivitesi ( Beauchamp & Fridovich, 1971), Serbest radikal (DPPH·)giderme aktivitesi (Blois, 1958), Ġndirgenme gücü aktivitesi (ElmastaĢ ve ark., 2006) in vitro olarak ölçülmüĢ ve total fenolik bileĢik tayini (Slinkard & Singleton, 1977) spektroskopik olarak yapılmıĢtır. Bu aktivitelerin her biri α- tokoferol (vitamin E), bütillenmiĢ hidroksi toluen (BHT), bütillenmiĢ hidroksi anisol (BHA) gibi antioksidan maddelerin antioksidan aktiviteleri ile karĢılaĢtırılmıĢtır.

3.2.1 Süperoksit Anyon Radikali Giderme Aktivitesi

Süperoksit giderme aktiviteleri Riboflavin-Metiyonin-IĢık-NBT metoduna göre yapılmıĢtır (Beauchamp & Fridovich, 1971). Süperoksit radikalleri, riboflavin/metiyonin/ıĢık/NBT sisteminde oluĢturulmuĢtur. OluĢan süperoksit radikallerinin NBT’yi NBT+2’ye yükseltgemesi esasına dayanan bu yöntemde oluĢan formazan (NBT+2) 560 nm’de maksimum absorbans göstermektedir.

0.005 M pH 7,8 fosfat tamponu hazırlandı. Çözücü olarak bu tampon çözelti kullanılarak, 100 ml’de 3.8 mg olacak Ģekilde riboflavin, 100 ml’de 497mg olacak Ģekilde metiyonin ve 100 ml’de 27 mg olacak Ģekilde NBT çözeltileri hazırlandı. Bitki ekstraktlarının 1mg/ml konsantrasyonda hazırlanan stok çözeltilerinden her tüpe 200’er mikrolitre ilave edildi. Her bir tüpe, 1,5 ml metiyonin çözeltisi, 1,5 ml riboflavin

çözeltisi, 1.5 ml NBT ilave edilip tüpler vortekslendikten sonra, 25 dakika boyunca ıĢıkta bekletildi. 560 nm’de absorbansları ölçüldü.

Kör, tampon çözeltinin karanlıkta bekletilmiĢ halidir. Kontrol, içerisinde numune haricinde diğer maddeleri içeren, aynı iĢlemlere tabi tutulmuĢ çözeltidir.

3.2.2. Serbest Radikal (DPPH ּ) Giderme Aktivitesi

Bitki örneklerinin serbest radikal (DPPH·: 1,1-Difenil 2-pikril hidrazil) giderme aktivitelerinin tespiti Blois (1958) metoduna göre yapıldı.

Her tüpe 0.1 mM DPPH ּ çözeltisinden 1 ml alınarak üzerine stok çözeltiden 40, 160, 320, 500, 800 mikrolitre ilave edildi. Toplam hacmi 4ml olacak Ģekilde etil alkol ilave edildi. IĢık görmeyen yerde 30 dakika inkübe edildikten sonra 517 nm’de absorbans okundu. Kör çözelti etil alkol, kontrol çözeltisi numunesiz çözeltidir.

3.2.3. İndirgenme Gücü Aktivitesi

Her bir ekstre 50, 100, 250, 500 mikrolitre alındı ve toplam hacim 2,5 ml olacak Ģekilde tampon çözelti ile ( ph 6.6, fosfat tamponu) tamamlandı. Üzerine 2,5 ml K3Fe(CN)6 eklendi ve 50°C de 20 dk bekletildi. Daha sonra çıkarılarak oda sıcaklığına getirildi. 2,5 ml TCA eklenerek 3000 rpm’de 10 dk santrifüj edildi..

Süpernatant kısmından 2,5 ml alınarak üzerine 2,5 ml deiyonize su eklendi. 0,5 ml FeCl3 eklendi ve 700 nm’de ölçüm yapıldı. Kontrol, ekstre dıĢında kalan kısımdır. tokoferol (vitamin E), bütillenmiĢ hidroksi toluen (BHT), bütillenmiĢ hidroksi anisol (BHA) standartlarına da aynı iĢlemler yapıldı. Kör: FeCL3 + su + TCA/ FeCl3 +su (ElmastaĢ ve ark., 2006)

Her ekstre için 100 mikrolitre (0,1 ml) alındı (50 ml lik balon jojeye), 45 ml deiyonize su ilave edildi. Daha sonra folin ciocalteu reaktifi eklendi ve 3 dk beklenildi. Son olarak 3 ml % 2 lik Na2CO3 ilave edildi ve karıĢım 2 saat bekletildi. 760 nm’de absorbanslar okundu.

Kör: 45 ml su + 1ml folin ciocalteu + 3 ml Na2CO3 ile 50 ml’ye su ile seyreltildi. Standart (gallik asit): 0,05 mg/ml; 0,1 mg/ml; 0.25 mg/ml; 0,5 mg/ml, 1 mg/ml’lik çözeltiden hazırlandı. Fenolik bileĢik tayininde gallik asitle hazırlanan standartlar tıpkı ekstreler gibi inkübe edildi (100 mikro litre alınarak ekstreler gibi çalıĢıldı) (Slinkard, Singleton, 1977).

4. BULGULAR ve TARTIŞMA

4.1. Süperoksit Anyon Radikali Giderme Aktivitesi Bulguları

Bitki numunelerinden ve standartlardan 40 µg/ml konsantrasyonunda uygulama yapılmıĢtır.

Şekil 4.1.1: Achillea biebersteinii Afan. (1), Viscum album L. (2), Melissa officinalis L (3) Urtica dioica L. (4), Malva neglecta Wallr. (5)

ġekil 4.1.1’deki sonuçlara göre standartların süperoksit anyon radikali giderme aktiviteleri BHA>BHT>α-tokoferol sıralamasıyla tespit edilmiĢtir. Numunelerin aktiviteleri BütillenmiĢ hidroksi anisol aktivitesine yakın çıkmıĢtır. Numunelerin

aktivite değerlerinin birbirlerine yakın olduğu tespit edilmekle beraber, numunelerin standartlara göre ve kendi aralarındaki aktivite sıralamalarının büyükten küçüğe doğru Ģu Ģekilde olduğu anlaĢılmıĢtır:

BHA > 2 (%50) > 5 (%49) > 1 (%46) > 3 (%43) = 4 (%43) > BHT > α-Tokoferol

Şekil 4.1.2: Bitki numunelerinin 2’li karıĢımlarının Süperoksit anyon giderme aktiviteleri. Örneğin, 1 ve 2 numaralı numunelerin eĢit miktardaki karıĢımları 12 olarak isimlendirilmiĢtir.

ġekil 4.1.2’deki sonuçlara göre bitki numunelerinin 2’li karıĢımlarının ve standartların süperoksit anyon giderme aktiviteleri birbirlerine yakın olup, aktivite sıralamalarının büyükten küçüğe doğru Ģu Ģekilde olduğu tespit edilmiĢtir:

Şekil 4.1.3: Bitki numunelerinin 3’lü karıĢımlarının süperoksit anyon radikali giderme aktiviteleri. Örneğin, 1, 2 ve 3 numaralı numunelerin eĢit miktardaki karıĢımları “123” Ģeklinde isimlendirilmiĢtir.

ġekil 4.1.3’teki sonuçlara göre, bitki numunelerinin 3’lü karıĢımlarının ve standartların süperoksit anyon radikali giderme aktiviteleri büyükten küçüğe doğru Ģu Ģekilde sıralanmıĢtır:

BHA > 123 > 125 > 315 > 314 > 245 > 345 > 235 > 234 > 415 > 124 > BHT > α-Tokoferol

Bu sıralamaya göre, 123 numunesinin aktivite olarak BHA’nın aktivitesine çok yakın olduğu görülmektedir. 123 ve 125 numunelerinin aktiviteleri diğer numunelere göre daha yüksek çıkmıĢtır.

Şekil 4.1.4: Bitki numunelerinin 4’lü karıĢımlarının ve bütün numunelerin bir arada bulunduğu 5’li karıĢımın süperoksit anyon radikali giderme aktiviteleri. Örneğin, 1, 2, 3 ve 4 numaralı numunelerin eĢit miktardaki karıĢımları “1234” Ģeklinde isimlendirilmiĢtir.

ġekil 4.1.4’teki sonuçlara göre, numunelerin ve standartların Süperoksit anyon giderme aktiviteleri büyükten küçüğe doğru Ģu Ģekilde sıralanmıĢtır:

BHA > 2345 > 12345 > 1234 > 1235 > 1345 > 1245 > BHT > α-Tokoferol

4.2. Serbest Radikal (DPPH ּ) Giderme Aktivitesi Bulguları

Bitki numunelerinden ve standartlardan 10 µg/ml, 40 µg/ml, 80 µg/ml, 125 µg/ml ve 200 µg/ml konsantrasyonlarında alınarak bu konsantrasyonlardaki aktiviteleri tayin

edilmiĢtir.

Serbest Radikal (DPPH ּ) Giderme Aktivitesi

0 20 40 60 80 100 120 10 40 80 125 200 Konsantrasyon (µg/mL) S e rb e s t R a d ik a l ( D P P H ּ) G id e rm e A k ti v it e s i ( % ) 1 2 3 4 5 α-Tokoferol BHT

Şekil 4.2.1: : Achillea biebersteinii Afan. (1), Viscum album L. (2), Melissa officinalis L (3), Urtica dioica L. (4), Malva neglecta Wallr. (5).

ġekil 4.2.1’deki bulgulara göre, düĢük konstrasyonda (10 µg/ml ) numunelerin serbest radikal (DPPH ּ) giderme aktiviteleri standartlara (α-Tokoferol, BHT) göre oldukça düĢük çıkmıĢtır. Konsantrasyon arttıkça aktivitelerde bariz bir artıĢ gözlenmiĢtir.

Bitki numunelerinin ve standartların değiĢik konsantrasyonlardaki serbest radikal giderme aktiviteleri büyükten küçüğe doğru Ģu Ģekilde sıralanmıĢtır:

10 µg/ml konsantrasyonda α-Tokoferol > BHT > 1 > 3 > 2 > 4 > 5 40 µg/ml konsantrasyonda α-Tokoferol > BHT > 3 > 1 > 2 > 5 > 4 80 µg/ml konsantrasyonda α-Tokoferol > BHT > 1 > 3 > 2 > 5 > 4

125 µg/ml konsantrasyonda

BHT > α-Tokoferol > 1 > 3 > 2 > 4 > 5 200 µg/ml konsantrasyonda

BHT > α-Tokoferol > 1 > 3 > 2 > 4 > 5

Serbest Radikal (DPPH ּ) Gİderme AKtivitesi

0 20 40 60 80 100 120 10 40 80 125 200 Konsantrasyon (µg/ml) S er be st R adi ka l (D P P H ּ) G ide rm e A kt iv it es i (% ) 12 13 14 15 23 24 34 35 45 25 α-Tokoferol BHA BHT

Şekil 4.2.2: Bitki numunelerinden 2’li karıĢımlarının 10 µg/ml, 40 µg/ml, 80 µg/ml, 125 µg/ml ve 200 µg/ml konsantrasyonlarında serbest radikal giderme aktiviteleri (%).

ġekil 4.2.2’deki bulgulara göre, düĢük konstrasyonda (10 µg/ml ) numunelerin serbest radikal (DPPH ּ) giderme aktiviteleri standartlara (α-Tokoferol, BHT ve BHA) göre oldukça düĢük çıkmıĢtır. Konsantrasyon arttıkça aktivitelerde bariz bir artıĢ gözlenmiĢtir.

Bitki numunelerinin 2’li karıĢımlarının ve standartların değiĢik konsantrasyonlardaki serbest radikal giderme aktiviteleri büyükten küçüğe doğru Ģu Ģekilde sıralanmıĢtır: 10 µg/ml konsantrasyonda

BHA > α-Tokoferol > BHT > 15 > 12 > 23 > 24 > 34 > 13 > 14 > 25 > 35 > 45 40 µg/ml konsantrasyonda BHA> α-Tokoferol > BHT > 13 > 12 > 15 > 34 > 14 > 25 > 23 > 24 > 35 > 45 80 µg/ml konsantrasyonda BHA > α-Tokoferol > BHT > 13 > 12 > 23 > 14 > 15 > 35 > 34 > 24 > 25 > 45 125 µg/ml konsantrasyonda BHA > BHT > α-Tokoferol > 13 > 12 > 23 > 14 > 15 > 35 > 34 > 24 > 25 > 45 200 µg/ml konsantrasyonda BHT > BHA > α-Tokoferol > 12 > 13 > 14 > 23 > 15 > 45 > 35 > 34 > 25 > 24

Serbest Radikal (DPPH ּ) Gİderme Aktivitesi

0 20 40 60 80 100 120 10 40 80 125 200 Konsantrasyon (µg/ml) S er be st R adi ka l (D P P H ּ) G ide rm e A kt iv it es i (% ) 123 124 125 234 235 245 315 345 415 α-Tokoferol BHA BHT

Şekil 4.2.3: Bitki numunelerinden 3’lü karıĢımlarının 10 µg/ml, 40 µg/ml, 80 µg/ml, 125 µg/ml ve 200 µg/ml konsantrasyonlarında serbest radikal giderme aktiviteleri (%).

ġekil 4.2.3.’teki bulgulara göre, düĢük konstrasyonda (10 µg/ml ) numunelerin serbest radikal (DPPH ּ) giderme aktiviteleri standartlara (α-Tokoferol, BHT, BHA) göre oldukça düĢük çıkmıĢtır. Konsantrasyon arttıkça aktivitelerde bariz bir artıĢ gözlenmiĢtir.

Bitki numunelerinin 3’lü karıĢımlarının ve standartların değiĢik konsantrasyonlardaki serbest radikal giderme aktiviteleri büyükten küçüğe doğru Ģu Ģekilde sıralanmıĢtır: 10 µg/ml konsantrasyonda BHA > α-Tokoferol > BHT > 124 > 315 > 314 > 234 > 235> 124 > 415 > 345 > 245 40 µg/ml konsantrasyonda BHA > α-Tokoferol > BHT > 315 > 123 > 124 > 314 > 234 > 415 > 345 > 235 > 245 > 125 80 µg/ml konsantrasyonda, BHA > α-Tokoferol > BHT > 123 > 315 > 124 > 234 > 415 > 314 > 235 > 245 > 125 > 345 125 µg/ml konsantrasyonda BHA > α-Tokoferol > BHT > 123 > 314 > 315 > 234 > 124 > 125 > 415 > 235 > 245 > 345 200 µg/ml konsantrasyonda BHT > BHA > α-Tokoferol > 314 > 123 > 234 > 315 > 415 > 235 > 245 > 124 > 125 > 345

Serbest Radikal (DPPH ּ) Giderme Aktivitesi 0 20 40 60 80 100 120 10 40 80 125 200 Konsantrasyon (µg/ml) S e rbe s t R a di k a l (D P P H ּ) G ide rm e A k ti v it e s i (% ) 1234 1235 1245 1345 2345 12345 α-Tokoferol BHA BHT

Şekil 4.2.4: Bitki numunelerinden 4’lü karıĢımlarının ve bütün bitkilerin bir arada bulunduğu 5’li karıĢımın 10 µg/ml, 40 µg/ml, 80 µg/ml, 125 µg/ml ve 200 µg/ml konsantrasyonlarında serbest radikal giderme aktiviteleri (%).

ġekil 4.2.4’teki bulgulara göre, düĢük konstrasyonda (10 µg/ml ) numunelerin serbest radikal (DPPH ּ) giderme aktiviteleri standartlara (α-Tokoferol, BHT, BHA) göre oldukça düĢük çıkmıĢtır. Konsantrasyon arttıkça aktivitelerde bariz bir artıĢ gözlenmiĢtir.

Bitki numunelerinin 4’lü karıĢımları, bütün bitkilerin bir arada bulunduğu 5’li karıĢımın ve standartların değiĢik konsantrasyonlardaki serbest radikal giderme aktiviteleri büyükten küçüğe doğru Ģu Ģekilde sıralanmıĢtır:

10 µg/ml konsantrasyonda

BHA > α-Tokoferol > BHT > 1235 > 1234 > 12345 > 2345 > 1245 > 1345 40 µg/ml konsantrasyonda

BHA > α-Tokoferol > BHT > 1234 > 1235 > 2345 >1245 > 1345 > 12345 80 µg/ml konsantrasyonda, BHA > α-Tokoferol > BHT > 1234 > 1235 > 1245 > 1345 > 12345 > 2345 125 µg/ml konsantrasyonda BHT > BHA > α-Tokoferol > 1234 > 1235 > 12345 > 1245 > 1345 > 2345 200 µg/ml konsantrasyonda BHT > BHA > α-Tokoferol > 1234 > 12345 > 1345 > 1245 > 12345 > 2345

4.3. İndirgenme Gücü Aktivitesi Bulguları

Bitki numunelerinden ve standartlardan 10 µg/ml, 20 µg/ml, 50 µg/ml ve 100 µg/ml alınarak bu konsantrasyonlarındaki absorbans değerleri kaydedilmiĢtir.

İndirgenme Gücü Aktivitesi

Şekil 4.3.1: : Achillea biebersteinii Afan. (1), Viscum album L. (2), Melissa officinalis L (3), Urtica dioica L. (4), Malva neglecta Wallr. (5).

ġekil 4.3.1’deki bulgulara göre, numunelerin ve standartların indirgenme gücü aktiviteleri büyükten küçüğe doğru Ģu Ģekilde sıralanmıĢtır

İndirgenme Gücü Aktivitesi

Şekil 4.3.2: Bitki numunelerinden 2’li karıĢımlarının ve standartların 10 µg/ml, 20 µg/ml, 50 µg/ml ve 100 µg/ml konsantrasyonlarında indirgenme gücü aktiviteleri.

ġekil 4.3.2’deki bulgulara göre, numunelerin ve standartların indirgenme gücü aktiviteleri büyükten küçüğe doğru Ģu Ģekilde sıralanmıĢtır:

İndirgenme Gücü Aktivitesi

Şekil 4.3.3: Bitki numunelerinden 3’lü karıĢımlarının ve standartların 10 µg/ml, 20 µg/ml, 50 µg/ml ve 100 µg/ml konsantrasyonlarında indirgenme gücü aktiviteleri.

ġekil 4.3.3’teki bulgulara göre, numunelerin ve standartların indirgenme gücü aktiviteleri büyükten küçüğe doğru Ģu Ģekilde sıralanmıĢtır:

İndirgenme Gücü Aktivitesi -0,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 0 20 40 60 80 100 120 Konsantrasyon (µg/ml) A b s o rb a n s ( 7 0 0 n m ) 1234 1235 1245 1345 2345 12345 α-Tokoferol BHT BHA

Şekil 4.3.4: Bitki numunelerinden 4’lü karıĢımlarının ve bütün bitkilerin bir arada bulunduğu 5’li karıĢımın 10 µg/ml, 20 µg/ml, 50 µg/ml ve 100 µg/ml konsantrasyonlarında indirgenme gücü aktiviteleri.

ġekil 4.3.5’teki bulgulara göre, numunelerin ve standartların indirgenme gücü aktiviteleri büyükten küçüğe doğru Ģu Ģekilde sıralanmıĢtır:

4.4. Total Fenolik Bileşik Tayini

Fenolik bileĢiklerin tayininde gallik asit kullanılarak elde edilen kalibrasyon grafiği kullanılmıĢtır (ġekil 4.4.1). Fenolik bileĢik miktar tayini gallik asit’e eĢdeğer gram (GAE) olarak hesaplanmıĢtır.

y = 1,2972x - 0,0284 R2 _{= 0,9648} 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0 0,05 0,1 0,15 0,2 Konsantarsyon (mg/mL) A bs orba ns (7 60 nm )

Şekil 4.4.1. Gallik asit kullanılarak elde edilen kalibrasyon grafiği.

Bitkilerin ve karıĢımlarının fenolik bileĢiklerinin miktarları gallik aside eĢdeğer (GAE) olarak hesaplanmıĢtır. Fenolik bileĢik miktarları çizelge 4.4.1’de gösterilmiĢtir.

Çizelge 4.4.1.

Numune Fenolik Bileşik Miktarı (g GAE/kg bitki)

Numune Fenolik Bileşik Miktarı (g GAE/kg bitki) 315 19,12044 34 6,887632 125 15,72763 345 6,346731 314 15,01255 45 6,104523 123 14,02408 245 6,078634 124 11,60574 5 5,964847 1 9,909806 15 5,634521 2 9,553099 25 5,475643 1234 8,772433 235 5,353191 14 8,675469 2345 5,214356 35 7,865783 24 5,145372 12 7,676324 1245 4,845243 12345 7,564572 3 4,3716 13 7,465476 1345 4,152846 415 7,142342 1235 3,254673 23 7,015637 4 2,011471 234 7,002346

5. SONUÇ ve ÖNERİLER

Yapılan testlerden elde edilen sonuçlara göre bitkilerden ve bu bitkilerin değiĢik kombinasyonlardaki karıĢımlarından hazırlanan ham ekstrelerinin antioksidan kapasiteye sahip olduğu görülmüĢtür. KarıĢımların antioksidan aktivitelerinin bitkilerin tek baĢlarına gösterdikleri antioksidan aktiviteden yüksek olduğu tespit edilmiĢtir. Süperoksit anyon radikali giderme aktiviteleri incelendiğinde, numunelerin ve standartların aktivitelerinin yüksekten düĢüğe doğru sıralamasının aĢağıdaki Ģekilde olduğu görülmüĢtür.

123, BHA, 125, 35, 25, 2345, 2, 34, 5, 315, 12345, 314, 1234, 245, 12, 235, 345, 15, 23, 234, 13, 24, 1235, 1, 14, 1345, 415, 124, 1245, 45, 3, 4, BHT, α-Tokoferol.

Yukarıdaki sıralamaya göre, numunelerin süperoksit anyon radikali giderme aktivitelerinin BHT ve α-Tokoferol’den yüksek olduğu görülmektedir. 123 karıĢımının (civan perçemi, ökseotu, oğulotu) aktivitesi, BHA’dan da yüksek çıkmıĢtır. Antioksidan aktivitesi yüksek bitkiler içerisinde bulundukları karıĢımların antioksidan aktivitelerini olumlu yönde etkilemiĢtir. DüĢük aktivite gösteren bitkilerin bir arada bulunduğu karıĢımların aktiviteleri ise bitkilerin tek baĢlarına gösterdikleri aktiviteden yüksek çıkmıĢtır. AĢağıdaki diğer testlerde de açıkça görülebileceği gibi numunelerin konsantrasyonları arttıkça antioksidan aktiviteleri artmaktadır. Buna göre, bitkilerin tek baĢlarına gösterdikleri aktiviteler düĢük olsa bile karıĢımlarının aktivitelerinin yüksek olması bitkilerin yapılarındaki antioksidan aktivite gösteren sekonder metabolitlerin karıĢım halindeyken toplamsal özellik göstermelerinden kaynaklanıyor olabilir. Bu duruma örnek olarak, 3 (oğulotu) ve 4 (ısırgan otu) bitkileri tek baĢlarına iken diğer numunelerden daha düĢük aktivite göstermiĢlerdir. Ancak bu iki bitkinin eĢit miktarlardaki karıĢımlarından oluĢan 34 numunesinin antioksidan aktivitesi yüksek çıkmıĢtır.

Numunelerin serbest radikal (DPPH ּ) giderme aktiviteleri değiĢik konsantrasyonlarda (10 µg/ml, 40 µg/ml, 80 µg/ml, 125 µg/ml, 200 µg/ml) incelendiğinde aktiviteleri yüksekten düĢüğe doğru aĢağıdaki sıralamayla tespit edilmiĢtir.

10 µg/ml konsantrasyonda,

BHA, α-Tokoferol, BHT, 15, 1235, 124, 1234, 1, 12345, 3, 12, 2345, 314, 315, 234, 23, 24, 34, 235, 13, 123, 14, 25, 35, 2, 1245, 4, 1345, 345, 415, 5, 245, 45, 125

DüĢük konsantrasyonda numunelerin serbest radikal giderme aktiviteleri standartların gösterdikleri aktivitelere göre oldukça düĢük çıkmıĢtır (bkz. ġekil 5, ġekil 6, ġekil 7, ġekil 8).

40 µg/ml konsantrasyonda

BHA, α-Tokoferol, BHT, 3, 1, 1234, 315, 13, 123, 124, 12, 15, 314, 34, 1235, 14, 25, 234, 2, 23, 24, 2345, 415, 345, 35, 5, 235, 1245, 1345, 245, 45, 125, 4, 12345.

40 µg/ml konsantrasyonda, 3 (oğulotu) ve 1 (civanperçemi) bitkilerin aktiviteleri diğer bitkilere göre yüksek çıkmıĢtır. Bu bitkileri içeren karıĢımların aktiviteleri de diğer karıĢımlara göre yüksektir. Yukarıdaki sıralama incelendiğinde, aktivitesi düĢük olan bitkilerin, içerisinde bulundukları karıĢımların aktivitelerini olumsuz yönde etkiledikleri görülmektedir. Bunun bariz bir örneği olarak, 1234 numunesinin aktivesinin 12345 numunesinin aktivitesine göre hayli yüksek çıkması gösterilebilir. 5 (ebegümeci) bitkisi 1234 karıĢımına eklendiğinde, karıĢımın (12345) aktivitesini düĢürmüĢtür. Bu bitki, aktivitesi yüksek olan 34 karıĢımına ilave edildiğinde de, karıĢımının (345) aktivitesini düĢürmüĢtür. 5 numunesi, 3, 1, 12, 14, 24, 34, 124, 134, 123 numunelerine aktivite açısından aynı olumsuz etkiyi yaparken, 13, 2, 4 numunelerine olumlu etkide bulunmuĢtur. Bu durumun sebeplerinin anlaĢılabilmesi için, bitkilerin içerisindeki antioksidan bileĢiklerin saflaĢtırılması ve karakterizasyonu yapılmalı ve bu bileĢiklerin karıĢımlardaki diğer bitkilerin içerisindeki bileĢiklerle ne gibi etkileĢimlere girdikleri incelenmelidir. AĢağıda farklı konsantrasyonlardaki aktivite sıralamaları bu bulguları destekleyen sonuçlar ortaya koymaktadır.

80 µg/ml konsantrasyonda BHA, α-Tokoferol, BHT, 13, 12, 1, 3, 1234, 123, 23, 315, 124, 1235, 234, 14, 15, 35, 1245, 2, 415, 314, 34, 1345, 24, 25, 12345, 235, 245, 125, 45, 345, 2345, 5, 4. 125 µg/ml konsantrasyonda BHA, 13, 12, BHT, α-Tokoferol, 1, 123, 3, 1234, 14, 314, 315, 1235, 34, 23, 12345, 234, 124, 35, 2, 15, 415, 125, 1245, 1345, 235, 24, 245, 2345, 4, 25, 45, 5, 345. 200 µg/ml konsantrasyonda BHA, 12, 13, 14, BHT, 23, α-Tokoferol, 314, 45, 1, 15, 123, 35, 34, 3, 1234, 234, 12345, 315, 1345, 415, 1235, 2, 235, 245, 4, 124, 125, 2345, 25, 24, 345, 5.

Numunelerin indirgenme gücü aktiviteleri değiĢik konsantrasyonlarda (10 µg/ml, 20 µg/ml, 50 µg/ml, 100 µg/ml) incelendiğinde aktiviteleri yüksekten düĢüğe doğru aĢağıdaki sıralamayla tespit edilmiĢtir.

10 µg/ml konsantrasyonda

BHA, α-Tokoferol, 315, 23, BHT, 13, 125, 45, 35, 1, 3, 14, 24, 25, 15, 314, 234, 34, 123, 1234, 1345, 12345, 12, 415, 1245, 124, 245, 2345, 4, 235, 1235, 345, 2, 5.

Numunelerin indirgenme gücü aktiviteleri bu konsantrasyonda, standartlardan düĢük çıkmıĢtır. 315 (oğulotu, civanperçemi, ebegümeci) ve 23 (ökse otu, oğulotu) numunelerinin aktiviteleri BHT’den yüksektir. KarıĢımların aktiviteleri bitkilerin tek baĢlarına gösterdikleri aktiviteden genellikle yüksek çıkmıĢtır. Aktivitesi yüksek bitkiler içersinde bulundukları karıĢımların aktivitelerini olumlu yönde etkilemiĢlerdir. Aktivitesi düĢük bitkilerin karıĢım aktivitesine olumsuz yönde etkide bulunduğu gözlemlenmiĢtir. AĢağıda diğer konsantrasyonlardaki aktivite sıralamaları da bu bulguları destekleyen sonuçlar ortaya koymuĢtur.

20 µg/ml konsantrasyonda

BHA, 315, α-Tokoferol, BHT, 234, 13, 125, 314, 1, 23, 15, 3, 35, 14, 45, 1234, 12345, 25, 24, 123, 34, 415, 2345, 1345, 345, 1245, 124, 12, 245, 4, 1235, 2, 5, 235

50 µg/ml konsantrasyonda BHA, BHT, 315, α-Tokoferol, 1234, 125, 12345, 3, 34, 1, 12, 13, 14, 314, 234, 15, 35, 2345, 4, 13, 123, 1345, 1235, 45, 1245, 123, 24, 25, 2, 415, 345, 245, 235, 5. 100 µg/ml konsantrasyonda BHA, BHT, α-Tokoferol, 315, 3, 1234, 12345, 14, 1, 2345, 123, 12, 35, 314, 13, 125, 23, 124, 34, 1245, 1345, 15, 415, 1235, 234, 45, 25, 2, 4, 24, 345, 5, 245, 35

Yapılan aktivite testlerinin (süperoksit anyon radikali giderme aktivitesi, serbest radikal giderme aktivitesi, indirgenme gücü aktivitesi) ortaya koyduğu sonuçlara göre, bitkiler arasında 1 (civanperçemi) ve 3 (oğulotu) bitkilerinin antioksidan aktivitelerinin diğerlerine göre daha yüksek olduğu tespit edilmiĢtir. 2 (ökseotu) bitkisinin aktivitesinin de genel olarak 4 (ısırgan otu) ve 5 (ebegümeci) bitkilerinin aktivitelerine göre yüksek olduğu gözlemlenmiĢtir.

Aktivitesi yüksek olan bitkiler içerisinde bulundukları karıĢımların aktivitelerini de olumlu yönde etkilemiĢlerdir. Aktivitesi düĢük olan bitkiler ise içerisinde bulundukları karıĢımların aktivitelerini olumsuz yönde etkilemiĢ görünmektedirler.

Bitki karıĢımları arasında, ikili karıĢımlar arasında 13 (civan perçemi, oğulotu), 12 (civan perçemi, ökse otu), 14 (civan perçemi, ısırgan otu) karıĢımları yüksek aktivite göstermiĢlerdir. Üçlü karıĢımlar içinde, 315 (oğulotu, civan perçemi, ebegümeci), 314 (oğulotu, civan perçemi, ısırgan otu), 125 (civan perçemi, ökse otu, ebegümeci) karıĢımları daha yüksek antioksidan etkiye sahiptirler. Dörtlü karıĢımlar arasında, 1234 (civan perçemi, ökseotu, oğulotu, ısırgan otu) karıĢımı antioksidan aktivite açısından ideal bir karıĢım olarak tespit edilmiĢtir. Bütün bitkilerin bir arada bulunduğu 12345 karıĢımı da antioksidan aktivitesi yüksek karıĢımlar arasında yer almaktadır.

Bitkilerin ve bu bitkilerin değiĢik kombinasyonlar halindeki karıĢımlarının total fenolik bileĢikleri tayin edilmiĢtir. Çizelge 4.4.1’deki sonuçlara göre, numunelerin antioksidan aktiviteleri ile içeriklerindeki fenolik bileĢiklerin miktarları arasında genel olarak doğru orantılı bir iliĢki olduğu tespit edilmiĢtir. Numunelerin içeriklerindeki fenolik bileĢik miktarı arttığında antioksidan aktivitelerinde de artıĢ gözlemlenmiĢtir. Buna göre

numunelerin gösterdikleri antioksidan aktivitelerin içeriklerindeki fenolik bileĢikler ile alakası olduğu söylenilebilir.

Bu çalıĢmanın açığa çıkardığı sonuçların değerlendirilmesiyle antioksidan aktiviteleri tespit edilmiĢ bulunan bitkiler (Achillea biebersteinii Afan. (1), Viscum album L. (2), Melissa officinalis L (3), Urtica dioica L. (4), Malva neglecta Wallr. (5)) ve bu bitkilerin karıĢımları ile ilgili Ģu çalıĢmaların yapılması önerilir;

1. Bitkilerin içerisindeki doğal antioksidan bileĢiklerin saflaĢtırılması ve karakterizasyonu.

2. Tokat ili ve çevresinde geleneksel tedavi amacıyla sıklıkla kullanıldıkları için, bu bitkiler üzerinde baĢka biyolojik aktivite (antikanser, antimikrobiyal, toksisite vb.) testleri yapılması.

3. Bu bitkilerin fonksiyonel bileĢikleri belirlenerek, bunların biyolojik testlerinin yapılması.