Gerilim Kapılı Potasyum ve Sodyum Kanallarının Tek-Kanal Özellikleri
Single-Channel Properties of Voltage-Gated Potassium and Sodium Channels
Esen Öztürk, Mahmut Özer
Elektrik ve Elektronik Mühendisliği Bölümü, Zonguldak Karaelmas Üniversitesi, 67100 Zonguldak
esenozt@yahoo.com, mahmutozer2002@yahoo.comÖzetçe
Nöron membranında bulunan gerilim-kapılı iyon kanalları farklı konformasyonal durumlar arasında rasgele dalgalanmalar göstermektedir. Bu dalgalanmalar kanal gürültü akımına neden olmaktadır. Bu kanal gürültü akımı, gerilim kapılı iyon kanallarının tek-kanal özelliklerini belirlemede büyük öneme sahiptir. Bu çalışmada Wang-Buzsaki nöron modelinde potasyum ve sodyum iyon kanallarının tek kanal akımları incelenmekte, ve tek kanal iletkenlikleri ve membrandaki toplam sodyum ve potasyum kanal sayıları zamanda değişen gürültü analizi kullanılarak hesaplanmaktadır.
Abstract
Voltage-gated ion channels in neuronal membrane show random fluctuations between different conformational states. These fluctuations give rise to channel noise current. This channel noise current is of great importance in the determination single-channel properties of voltage-gated ion channels. In this study, single-channel currents of potassium and sodium channels in Wang-Buzsaki neuronal model are examined, and their single-channel conductances and total sodium and potassium channel numbers in the membrane are computed by using non-stationary noise analysis.
1. Giriş
Uyarılabilir hücrelerde elektriksel sinyalin oluşmasında hücre membranında bulunan iyon kanalları büyük rol oynamaktadır. İyon kanallarının rasgele açık yada kapalı olması iyon kanal gürültüsüne neden olmaktadır. İyon kanallarından akan akımların makroskobik modeli Hodgkin-Huxley tarafından geliştirilmiştir [1]. Ancak bu modelde iyon kanallarının stokastik açılma ve kapanma özelliği gözönüne alınmamıştır. Patch-clamp tekniği ile sadece bir iyon kanalı üzerinden geçen akımın ölçülmesi mümkün olmuş ve bu deneysel teknik ile elde edilen sonuçlardan iyon kanalının temelde rasgele açılıp kapanan stokastik bir eleman olduğu anlaşılmıştır. İletken ve iletken olmayan durumlar arasında oluşan bu dalgalanma membran gürültü akımına neden olmaktadır.Bu durumda iyon kanalları, hücre içine enjekte edilen makroskopik gürültü kaynağı gibi davranış göstermektedirler [2].
Kanal gürültüsü analizi, gerilim kenetleme çalışmaları yapılarak elde edilen bir çok akım kayıtlarının incelenmesinde kullanılmaktadır. Tek-kanal kayıtları, kanal iletkenliği, kanal açık olma olasılığı ve kanalın açık ve kapalı durumlarda kalma sürelerinin dağılımı ile ilgili bilgileri içermektedir [3]. Bu bilgiler, çok sayıda iyon kanal topluluğunun katkısını gösteren makroskopik akımda da içerilmektedir. Tek-kanal kayıtlarının elde edilme zorluğundan dolayı makroskopik
iyonik akım dalgalanmalarının analizi, iyon kanallarının tek kanal iletkenliklerini ve kanal kinetiklerini belirlemek için kullanılmıştır [4],[5]. Sigworth, zamanla değişen (non-stationary) gürültü analizini ilk defa, Ranvier düğümünde bulunan sodyum kanallarının stokastik özelliklerinden
kaynaklanan
rasgele akım dalgalanmalarına uygulamıştır [6]. Bu çalışmada Wang-Buzsaki nöron modelindeki sodyum ve potasyum iyon kanallarının tek kanal özellikleri incelenmekte, farklı gerilimlerdeki tek kanal akımları ,toplam kanal sayıları ve tek kanal iletkenlikleri zamanda değişmeyen gürültü analizi kullanılarak hesaplanmaktadır.2. İyon Kanal Modeli
Gerilim-kapılı iyon kanal iletkenliği aşağıdaki gibi tanımlanmaktadır [1]: q p i m i(V ,t) m h g =γ (1) Burada γi açık durumdaki bir iyon kanalının iletkenliğini, p ve
q sırasıyla kanalın aktivasyon ve inaktivasyon kapı sayısını göstermektedir. m ve h ise sırası ile aktivasyon ve inaktivasyon kapısının açık olma olasılığını veren kapı değişkenleridir. Aktivasyon ve inaktivasyon kapısının açık olma olasılıklarının zamana bağlı kinetikleri aşağıdaki gibi tanımlanmaktadır: m m) m V ( m dt dm τ − = ∞ (2) ) V ( h ) V ( h dt dh m h m τ − = ∞ (3)
Burada m∞(Vm) ve h∞(Vm) sırası ile sürekli-hal aktivasyon ve
inaktivasyonu , ve τm(Vm) ve τh(Vm) ise sırası ile aktivasyon
ve inaktivasyon zaman sabitlerini göstermektedir. m∞(Vm),
h∞(Vm), τm(Vm) ve τh(Vm) hız fonksiyonlarına göre aşağıdaki
gibi tanımlanmaktadır: h h h m m m ; h m β + α α = β + α α = ∞ ∞ (4) h h h m m m =α 1+β ;τ =α 1+β τ (5) Burada α(Vm) ve β(Vm) iyon kapısının bir durumdan diğer bir
duruma geçişini belirleyen gerilime bağlı hız fonksiyonlarıdır.
0-7803-9238-8/05/$20.00 ©2005 IEEE
Wang-Buzsaki modelinde Na+ kanalı için p=3 ve q=1’dir [7].
Bu modelde K+ kanalının aktivasyonu n değişkeni ile
gösterilmekte olup p=4’dür. Potasyum kanalı inaktivasyon içermemektedir. Potasyum maksimum iletkenliği (GKmax) 9
mS/cm2, sodyum maksimum iletkenliği (G
Namax)35 mS/cm2
olup potasyum ve sodyum denge gerilimleri sırası ile –90 mV ve +55 mV’dur. Wang-Buzsaki modelinde kullanılan hız sabitleri ise )) 60 V ( 1 . 0 exp( 4 ; )) 35 V ( 1 . 0 exp( 1 ) 35 V ( 1 . 0 m m + − = β + − − + = α
))
28
V
(
1
.
0
exp(
1
/
5
));
58
V
(
05
.
0
exp(
35
.
0
h h+
−
+
=
β
+
−
=
α
(6))
80
/
)
44
V
(
exp(
625
.
0
))
34
V
(
1
.
0
exp(
1
)
34
V
(
05
.
0
n n+
−
=
β
+
−
−
+
=
α
olarak tanımlanmaktadır [7].3. Stokastik
Model
Özdeş dört kapıdan oluşan bir potasyum kanalının kinetik modeli aşağıda verilmiştir [8]:
Burada n0,n1,n2 ve n3 kanalın kapalı olduğu durumu n4 ise
kanalın açık olduğu durumu göstermektedir. n4’ün istatistiksel
özellikleri, membran gerilimi sabit bir gerilime kenetlenerek bulunmaktadır. Bir n kapısının sürekli halde açık olma olasılığı (n∞) denklem (4) ile verilmiştir. Özdeş dört kapının açık olma olasılığı ise n4∞ile ifade edilmektedir. Böylece n4’ün ortalaması
4 4 n n 〉= ∞
〈 (7) olarak elde edilmektedir.
Toplam N potasyum kanalı içeren bir membranda potasyum kanalının ortak değişinti fonksiyonu aşağıda tanımlanmıştır: N / ] n ] n e ) n 1 ( n [[ ) 't ( n ) t ( n ( )t t 2 4 8 4 4 ' ∞ ∞ − β + α − ∞ ∞ − + − = 〉 ∆ ∆ 〈 (8) Burada∆n4(V,t)=n4(V,t)−〈n4(V,t)〉olarak
tanımlanmaktadır. Değişinti ise ) n 1 ( n n24〉= 4∞ − 4∞ ∆ 〈 (9) olarak elde edilmektedir. Böylece potasyum kanalının açık olma olasılığını gösteren stokastik değişken
) t ( n n ) t ( n4 =〈 4〉+δ 4 olarak tanımlanabilmektedir.
δ
n
4ortalaması sıfır, değişintisi denklem (9) ile verilen beyaz Gauss gürültüsünü göstermektedir.
Potasyum kanalı herhangi bir gerilime kenetlendiğinde n kapısının zamana bağlı değişimi aşağıda verilmiştir [1]:
n / t 0 n )e n ( n ) t ( n = ∞ + − ∞ − τ (10) Burada n0 kapının açılma olasılığının ilk değerini,
n
∞ise sondeğerini göstermektedir. Potasyum kanallarından akan akım ise aşağıda tanımlanmıştır:
[
n(t) n (t)]
) V V ( g IK = maxK − K 4+δ 4 (11)Özdeş üç aktivasyon kapısı ve bir inaktivasyon kapısından oluşan bir sodyum kanalının kinetik modeli aşağıda verilmiştir [8]:
Burada m3h1 değişkeni sodyum kanalının açık olduğu durumu
göstermektedir. Stokastik m3h1 değişkeni
) t ( h m h m ) t ( h
m3 1 =〈 3 1〉+δ 3 1 olarak ifade edilmektedir. Burada m3h1’in ortalaması〈m3h1〉=m3∞h∞ olup δm3h1 ortalaması sıfır değişintisi m3h (1 m3h ) ∞ ∞ ∞ ∞ − olan beyaz Gauss gürültüsüdür.
Sodyum kanalı herhangi bir gerilime kenetlendiğimde m ve h kapılarının zamana bağlı değişimleri aşağıda veriliştir [1]: h m / t 0 / t 0 e ) h h ( h ) t ( h e ) m m ( m ) t ( m τ − ∞ ∞ τ − ∞ ∞ − + = − + = (12)
Burada m0 ve h0 sırası ile aktivasyon ve inaktivasyon
kapılarının açılma olasılığının ilk değerlerini,n∞ve h∞ise son değerlerini göstermektedir. Sodyum kanallarından akan akım ise aşağıda tanımlanmıştır:
[
m(t) h(t) m h (t)]
) V V ( g I 3 3 1 Na max Na Na = − +δ (13)4. Zamanla
Değişen Gürültü Analizi
Tek kanal iletkenliğinin membran geriliminden bağımsız olduğu varsayımı altında gerilim kenetleme sonucu ölçülen makroskopik kanal akım ifadesi aşağıdaki gibi tanımlanmaktadır: ) E V )( t , V ( P N ) t ( I = γ 0 − (14)
Burada I(t), zamana bağlı makraskopik akımdır. N, membran alanında bulunan kanal sayısını, V membran gerilimini,γ tek kanal iletkenliğini, P0(V,t) zamana ve membran gerilimine bağlı olarak kanalın açık olma olasılığını,
E
ise denge gerilimini göstermektedir. Zamanla değişen gürültü analizi ile makraskopik akım kayıtlarından N,γ
veP0(V,t) değerlerini belirlenebilmektedir [6].Membranda bir kanalın açık olma olasılığı P1(t) ve kapalı
olma olasılığı P2(t) ile gösterilirse N tane kanal içeren
membrandan akan ortalama akım ve akım dalgalanmalarının değişintisi sırası ile denklem (15) ve (16) ile verilmektedir:
) t ( NiP I〉= 1 〈 (15) ) t ( P ) t ( P Ni2 1 2 2 I = σ (16) Denklem (15) denklem (16)’da yerine konulursa değişinti, tek kanal akımı (i), membrandaki toplam kanal sayısı ve ortalama akıma bağlı olarak aşağıdaki gibi ifade edilmektedir:
N I I i 2 2 I 〉 〈 − 〉 〈 = σ (17)
Ölçülen makroskopik akım kayıtlarından elde edilen ortalama akım ve değişinti verilerine denklem (17) eğrisi uydurularak N ve i değerleri elde edilmektedir. Tek kanal iletkenliği ise tek kanal akımının (V−E) değerine bölünmesi ile hesaplanmaktadır: E V i − = γ
(18)
5. Sonuçlar
İlk adımda Wang-Buzsaki nöron modelinde gerilim kenetleme tekniği uygulanarak potasyum ve sodyum kanallarından akan makroskopik akımlar elde edilmiştir. Gerilim kenetleme süresi 5 ms ve zaman artırımı 1µs olarak alınmıştır. Wang-Buzsaki modelinde potasyum kanalları –100 mV’dan 50 mV gerilim seviyesine kenetlendiğinde akan gürültülü potasyum akımı elde edilmiş ve bu işlem 150 kez tekrarlanmıştır. Aynı koşullarda elde edilen 150 gürültülü akımın ortalaması ve değişintisi hesaplanmıştır. Kanallardan akan akımın bir örneği Şekil 1.a’da gösterilmiştir. 150 akım örneğinden alınan potasyum kanal akımların ortalaması ve değişintisi ise sırası ile Şekil 1.b ve 1.c’de gösterilmiştir. Değişintinin maksimum olduğu an, denklem(16)’ya göre kanalların yaklaşık yarısının açık olduğu zamanı göstermektedir. Buna göre 0.5 ms sonra kanalların açılma olasılığı yaklaşık 0.5’dir.
İkinci adımda, elde edilen değişinti verilerinin ortalama akıma karşı değişimi elde edilmiş ve Şekil 2’de gösterilmiştir. Kanalların açık olma olasılığının 0.5 den küçük olduğu aralıkta ortalama akım arttığında değişintinin arttığı, kanalların açılma olasılığının 0.5 olduğu ortalama akım değerinde değişintinin maksimum olduğu (denklem 17), kanalların açık olma olasılığının 0.5 den büyük olduğu aralıkta ise ortalama akım arttığında değişintinin azaldığı Şekil 2’den görülmektedir.
(a)
(b)
(c)
Şekil 1. Potasyum kanalları –100 mV’dan +50 mV gerilim seviyesine kenetlendiğinde (a) potasyum kanal akımı, (b) potasyum ortalama kanal akımı, (c) potasyum kanal akım
değişintisi.
Üçüncü adımda tek kanal akımı ve toplam kanal sayısını kestirmek için aynı koşullarda her biri 150 adet makroskopik gürültülü akımdan oluşan 10 veri seti üretilmiş ve her bir setin ortalama akım ve değişintileri hesaplanmıştır. Her bir setin ortalama akım-değişinti verilerine denklem(17) eğrisi uydurulmuş ve i ve N değerleri sırası ile 2.798± 0.02 pA ve 100 ± 1 kanal olarak hesaplanmıştır.
Şekil2 .Ortalama akım-değişinti ilişkisi
Dördüncü adımda, farklı gerilim kenetleme seviyeleri kullanılarak tek kanal potasyum akımları hesaplanmıştır. Bu amaçla her bir gerilim kenetleme seviyesi için 150 adet gürültülü akım üretilmiş ve üçüncü adımda belirtilen yöntem ile tek kanal akımı hesaplanmıştır. Elde edilen sonuçlar Şekil 3’de gösterilmiştir. Şekil 3’deki eğrinin eğimi potasyum tek kanal iletkenliği olup yaklaşık 20 pS olarak hesaplanmıştır.
Şeki3.Farklı gerilim kenetleme seviyeleri için potasyum tek-kanal akım değişimi
Son olarak, sodyum kanalları 20 mV’a kenetlendiğinde üretilen 150 adet makroskopik gürültülü sodyum akım seti kullanılarak ortalama akım-değişinti ilişkisi elde edilmiş ve Şekil 4’de gösterilmiştir. Sodyum tek kanal akımı ve toplam kanal sayısını kestirmek için aynı koşullarda her biri 150 adet makroskopik gürültülü akımdan oluşan 10 veri seti üretilmiş ve her bir setin ortalama akım ve değişintileri hesaplanmıştır. Her bir setin ortalama akım-değişinti verilerine denklem(17) eğrisi uydurulmuş ve i ve N değerleri sırası ile 0.700± 0.06 pA ve 101 ± 12 kanal olarak bulunmuştur. Daha sonra farklı gerilim kenetleme seviyeleri kullanılarak tek kanal sodyum akımları hesaplanmıştır. Bu amaçla her bir gerilim kenetleme seviyesi için 150 adet gürültülü akım üretilmiş ve üçüncü adımda belirtilen yöntem ile tek kanal akımı hesaplanmıştır. Elde edilen sonuçlar Şekil 5’de gösterilmiştir. Şekil 5’deki eğrinin eğimi sodyum tek kanal iletkenliği olup yaklaşık 20 pS olarak hesaplanmıştır.
Şekil4. Sodyum kanalları 20 mV’a kenetlendiğinde elde edilen ortalama akım-değişinti ilişkisi
Şekil5 . Farklı gerilim kenetleme seviyeleri için sodyum tek-kanal akım değişimi
6. Kaynakça
[1] Hodgkin A. L. and Huxley A. F., ''A Quantative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve'', J. Physiol., 16,6402-6413, 1952.
[2] DeFelice,L.J., Introduction to Membran Noise,Plenum Press,New York ,1981.
[3] Alvarez, O., Gozalez, C. and Latorre R., "Counting channels: Guide on ion channel fluctuation analysis", Advances in Physiol. Education, 26, 327-341, 2002. [4] Neher, E. and Sakmann B., "Noise analysis of drug
induced voltage clamp currents in denervated frog Muscle Fibres", J.Physiol.,258 ,705-729, 1976.
[5] Neher, E. and Stevens, C.F., " Conductance fluctuations and ionic pores in mebranes", Annu. Rev. Biophys Bioeng.,6, 345-381, 1977.
[6] Sigworth, F.J., " The variance of sodium current fluctuations at the node Ranvier", J. Physiol, 307, 97-129, 1980.
[7]
Wang, X. J.and Buzsaki, G., "Gamma oscillations by synaptic inhibition in a hippocompal interneuronal network model", J.Neuroscience, 16, 6402-6413, 1997. [8] Strassberg, A.F. and DeFelice, L. J. "Limitations of theHodgkin-Huxley formalism: Effect of single channel kinetics on transmembrane voltage dynamics", Neural Comput., 5, 843–855, 1993
