T.C.
PAMUKKALE ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
BİYOLOJİ ANABİLİM DALI
CAPPARİS OVATA’DAN İZOLE EDİLEN, YENİ VE DOĞAL BİR BİLEŞİK OLAN 1H-INDOL- 2-HİDROKSİ, 3-KARBOKSİLİK ASİT’İN
ANTİ-KANSER ÖZELLİKLERİNİN ARAŞTIRILMASI
YÜKSEK LİSANS
HATİCE ORUÇ
T.C.
PAMUKKALE ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
BİYOLOJİ ANABİLİM DALI
CAPPARİS OVATA’DAN İZOLE EDİLEN, YENİ VE DOĞAL BİR BİLEŞİK OLAN 1H-INDOL- 2-HİDROKSİ, 3-KARBOKSİLİK ASİT’İN
ANTİ-KANSER ÖZELLİKLERİNİN ARAŞTIRILMASI
YÜKSEK LİSANS
HATİCE ORUÇ
Bu tez çalışması PAÜ-BAP tarafından 2017FEBE051 nolu proje ile desteklenmiştir.
i
ÖZET
CAPPARİS OVATA’DAN İZOLE EDİLEN, YENİ VE DOĞAL BİR BİLEŞİK OLAN 1H-INDOL- 2-HİDROKSİ, 3-KARBOKSİLİK ASİT’İN
ANTİ-KANSER ÖZELLİKLERİNİN ARAŞTIRILMASI HATİCE ORUÇ
PAMUKKALE ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI
BİYOLOJİ
(TEZ DANIŞMANI: PROF. DR. ALAATTİN ŞEN) DENİZLİ, 2019
Kemoterapi ve radyasyon terapisi gibi geleneksel tedavilere ek olarak tamamlayıcı tedaviler de tüm dünyada kanser hastalarında sıklıkla kullanılmaktadır. Bu çalışmanın amacı, moleküler düzeyde yaygın olarak kullanılan geleneksel terapötik tıbbi bitki Capparis ovata 'nın yeni bir fitokimyasal bileşeninin anti karsinojenik ve tümör baskılayıcı etkisini araştırmaktır.
1H-indol-2-Hidroksi, 3-Karboksilik Asit (I2H3K) 'nin Capparis ovata'dan izole edilen yeni ve doğal bir bileşik olarak etkisi LNCaP ve Caco-2 hücre hattı üzerinde araştırıldı. I2H3K'nin, kanser başlangıcının ve gelişimi ile birlikte tümör baskılanması, hücre ölümü ve proliferasyonu ile ilgili seçilmiş genlerin ekspresyonu üzerindeki etkileri araştırıldı. Farklı hücresel yolaklara bağlı 17 genin mRNA ekspresyon seviyelerinde EC25 ve EC50 dozlarında I2H3K'nin etkisi belirlendi. I2H3C tedavisinin, hücrelerdeki üç farklı hücresel yoldaki ekspresyonlarını önemli ölçüde değiştirdiği bulundu. Tümör bastırma için önemli olan nükleer reseptörlerin mRNA seviyeleri, I2H3K ile önemli ölçüde artmıştır. Ek olarak, hücre döngüsünü destekleyen genler, apoptoz ile ilişkili genlerdeki önemli artışlarla birlikte ciddi şekilde azaldı. Kontrol bileşiği olan Taxol anti kanser ilacına göre seçilen dozların daha anlamlı artış ve azalış gösterdiği gözlendi.
Bu bağlamda Capparis ovata bitkisinden izole ettiğimiz İ2H3K bileşiğinin anti kanserojenik ve antiapoptotik etki gösteriyor olması oldukça muhtemeldir. ANAHTAR KELİMELER: LNCaP hücre hattı, Caco-2 hücre hattı, Capparis ovata, Anti kanser
ii
ABSTRACT
INVESTİGATİON OF THE ANTİCANCER PROPERTİES OF 1H-INDOLE-2-HYDROXY, 3-CARBOXYLİC ACİD AS A NOVEL AND
NATURAL COMPOUND ISOLATED FROM CAPPARİS OVATA M.SC. THESIS İN BİOLOGY
HATİCE ORUÇ
PAMUKKALE UNIVERSITY INSTITUTE OF SCIENCE BIOLOGY
(SUPERVISOR: PROF. DR. ALAATTİN ŞEN) DENİZLİ, 2019
In addition to traditional treatments such as chemotherapy and radiation therapy, complementary therapies are often used in cancer patients all over the world. The aim of this study was to investigate the anti-carcinogenic and tumor suppressive effect of a new phytochemical component of the traditional therapeutic medicinal plant Capparis ovata which is widely used at molecular level.
The effect of 1H-Indol-2-hydroxy, 3-carboxylic acid (I2H3C) on the LNCAP and Caco-2 cell line as a new and natural compound isolated from Capparis OVA was investigated. The effects of i2h3k on the expression of selected genes related to tumor suppression, cell death and proliferation together with the development of cancer onset were investigated. The effect of EC25 and EC50 I2H3C on mRNA expression levels of 17 genes related to different cellular pathways were determined. It was found that I2H3C treatment significantly altered the expression of cells in three different cellular pathways. mRNA levels of nuclear receptors, which are important for tumor suppression, have increased significantly with I2H3C. In addition, genes that support the cell cycle have significantly decreased with significant increases in genes associated with apoptosis. According to the control compound Taxol anti-cancer drug, the selected doses showed a significant increase and decrease.
In this context, it is very likely that the I2H3C compound isolated from the Capparis ovata plant has an anti-carcinogenic and antiapoptic effect.
iii
İÇİNDEKİLER
Sayfa ÖZET... i ABSTRACT ... ii İÇİNDEKİLER ... iii ŞEKİL LİSTESİ... vTABLO LİSTESİ ... vii
SEMBOL LİSTESİ ... viii
ÖNSÖZ ... x
1. GİRİŞ ... 1
1.1 Prostat Kanseri... 6
1.1.1 Prostat’ın Anatomik ve Histolojik Yapısı... 8
1.1.2 Prostat Kanseri Oluşumu ve Temel Moleküler Mekanizması ... 8
1.1.3 Prostat Kanseri Epidemiyolojisi ... 10
1.2 Kolon (Kolorektal) Kanseri ... 12
1.2.1 Kolon Kanseri Oluşumu ve Temel Moleküler Mekanizması ... 13
1.2.2 Kolon’un Anatomik ve Histolojik Yapısı ... 16
1.2.3 Kolon Epidemiyolojisi ... 16
1.3 Hücre Döngüsü ... 18
1.3.1 Siklin ve Siklin Bağımlı Kinazlar ... 20
1.3.2 Hücre Döngüsünün Kontrolü ... 20
1.3.3 Hücre Döngüsü İnhibitörleri ... 21
1.4 Programlı Hücre Ölümü: Apoptoz... 21
1.4.1 Kaspazlar ... 23
1.4.2 Kaspazların Aktivasyonu ... 25
1.4.3 Mitokondri/ SitokromC Aracılı Hücre Ölümü (İntrinsik Yolak) . 25 1.4.4 Ölüm Sinyalleri Aracılığı İle Hücre Ölümü (Ekstrinsik Yolak) .. 27
1.5 Capparis ovata (Kapari) ... 28
1.6 Tezin Amacı ... 30
2. MATERYAL VE METHOD ... 33
2.1 Materyal ... 33
2.1.1 Çalışmada Kullanılan Kimyasallar ... 33
2.1.2 Çalışmada Kullanılan Cihazlar ... 33
2.2 Method ... 34
2.2.1 Capparis ovata’ dan Bileşik İzole Edilmesi ... 34
2.3 Hücre Kültürü Çalışmaları ... 34
2.3.1 LNCaP Hücreleri ... 34
2.3.2 Caco-2 Hücreleri ... 35
2.3.3 Besiyeri Hazırlanışı ve Hücrelerin Büyütülmesi... 35
2.3.4 Tripan Mavisi ile Hücre Boyama ... 36
2.3.5 Hücrelerin Pasajı ... 36
2.3.6 Sitotoksisite Çalışmaları ... 36
2.3.7 Hücrelere Bileşiklerin Uygulanması ... 37
iv
2.3.9 Total RNA’nın Agaroz Jel Elektroforez İle Görüntülenmesi ... 38
2.3.10 cDNA Sentezi ... 39
2.3.11 mRNA Düzeyinde Ekspresyonların Tayin Edilmesi: Gerçek Zamanlı PZR ... 40
2.4 İstatistiksel Analiz ... 41
3. BULGULAR ... 42
3.1 İ2H3K Bileşiğinin Hücre Canlılığına Etkisi ... 42
3.2 Taxol Anti-Kanser İlacının Hücre Canlılığına Etkisi ... 43
3.3 İ2H3K Bileşiğinin LNCaP Hücre Hattında Belirlenen Genlerin mRNA Ekspresyon Düzeylerine Olan Etkisi... 45
3.3.1 Apoptoz Yolağı İle İlgili Genler ... 45
3.3.2 Hücre Döngüsünü Düzenleyen Genler ... 49
3.3.3 Onkogenik ve Tümör Baskılayıcı Genler ... 50
3.3.4 Proliferatif Hücre İçi Sinyal Yolaklarıyla İlişkili Genler ... 53
3.4 İ2H3K Bileşiğinin Caco-2 Hücre Hattında Belirlenen Genlerin mRNA Ekspresyon Düzeylerinin Tayin Edilmesi ... 54
3.4.1 Apoptoz Yolağı İle İlgili Genler ... 55
3.4.2 Hücre Döngüsünü Düzenleyen Genler ... 57
3.4.3 Onkogenik ve Tümör Baskılayıcı Genler ... 59
3.4.4 Proliferatif Hücre İçi Sinyal Yolaklarıyla İlişkili Genler ... 62
4. TARTIŞMA ... 63
5. SONUÇ VE ÖNERİLER ... 90
6. KAYNAKLAR ... 91
v
ŞEKİL LİSTESİ
Sayfa
Şekil 1. Kanserin bir organ ya da dokudaki kontrolsüz çoğalması ... 1
Şekil 2. Kanserleşmenin on temel kuralı... 4
Şekil 3. Kanser risk faktörleri ... 5
Şekil 4. Erkeklerde görülen kanser çeşitleri ... 11
Şekil 5. Kolon kanserinde poliplerin zamana bağlı olarak kansere dönüşümü..14
Şekil 6. Sindirim sisteminde kolonun pozisyonu ve kolon kanserinin, sindirim sisteminin alt kısmı olan kalın bağırsakta gözlenmesi .... 16
Şekil 7. Hücre döngüsü kontrol noktaları. ... 19
Şekil 8. Antiapoptotik ve proapoptotik proteinlerde “BCL-2 Homology” ... 26
Şekil 9. Capparis ovata... 29
Şekil 10. 1H-indol- 2-hidroksi, 3-karboksilik asit. ... 31
Şekil 11. İ2H3K Bileşiğinin LNCaP Hücre Canlılığına Etkisi ... 42
Şekil 12. İ2H3K Bileşiğinin Caco-2 Hücre Canlılığına Etkisi ... 43
Şekil 13. Taxol Anti-kanser İlacının LNCaP Hücre Canlılığına Etkisi ... 44
Şekil 14. Taxol Anti-kanser İlacının Caco-2 Hücre Canlılığına Etkisi ... 44
Şekil 15. İ2H3K bileşiğinin LNCaP hücre hattında APAF geninin mRNA seviyesine olan etkisi. ... 46
Şekil 16. İ2H3K bileşiğinin LNCaP hücre hattında CASP3 geninin mRNA seviyesine olan etkisi. ... 46
Şekil 17. İ2H3K bileşiğinin LNCaP hücre hattında CASP8 geninin mRNA seviyesine olan etkisi. ... 47
Şekil 18. İ2H3K bileşiğinin LNCaP hücre hattında CASP9 geninin mRNA seviyesine olan etkisi. ... 47
Şekil 19. İ2H3K bileşiğinin LNCaP hücre hattında FAS geninin mRNA seviyesine olan etkisi. ... 48
Şekil 20. İ2H3K bileşiğinin LNCaP hücre hattında BAX geninin mRNA seviyesine olan etkisi. ... 48
Şekil 21. İ2H3K bileşiğinin LNCaP hücre hattında CYCD2 geninin mRNA seviyesine olan etkisi. ... 49
Şekil 22. İ2H3K bileşiğinin LNCaP hücre hattında CYCD2 geninin mRNA seviyesine olan etkisi. ... 50
Şekil 23. İ2H3K bileşiğinin LNCaP hücre hattında KRAS geninin mRNA seviyesine olan etkisi. ... 51
Şekil 24. İ2H3K bileşiğinin LNCaP hücre hattında PTEN geninin mRNA seviyesine olan etkisi. ... 51
Şekil 25. İ2H3K bileşiğinin LNCaP hücre hattında P53 geninin mRNA seviyesine olan etkisi. ... 52
Şekil 26. İ2H3K bileşiğinin LNCaP hücre hattında RB geninin mRNA seviyesine olan etkisi ... 52
Şekil 27. İ2H3K bileşiğinin LNCaP hücre hattında ERK geninin mRNA seviyesine olan etkisi. ... 53
vi
Şekil 28. İ2H3K bileşiğinin LNCaP hücre hattında JNK geninin mRNA
seviyesine olan etkisi. ... 54 Şekil 29. İ2H3K bileşiğinin Caco-2 hücre hattında CASP3 geninin mRNA
seviyesine olan etkisi. ... 56 Şekil 30. İ2H3K bileşiğinin Caco-2 hücre hattında CASP8 geninin mRNA
seviyesine olan etkisi ... 56 Şekil 31. İ2H3K bileşiğinin Caco-2 hücre hattında CASP9 geninin mRNA
seviyesine olan etkisi. ... 57 Şekil 32. İ2H3K bileşiğinin Caco-2 hücre hattında CYCD2 geninin mRNA
seviyesine olan etkisi ... 58 Şekil 33. İ2H3K bileşiğinin Caco-2 hücre hattında CDK4 geninin mRNA
seviyesine olan etkisi. ... 58 Şekil 34. İ2H3K bileşiğinin Caco-2 hücre hattında KRAS geninin mRNA
seviyesine olan etkisi. ... 59 Şekil 35. İ2H3K bileşiğinin Caco-2 hücre hattında C-MYC geninin mRNA
seviyesine olan etkisi. ... 60 Şekil 36. İ2H3K bileşiğinin Caco-2 hücre hattında PTEN geninin mRNA
seviyesine olan etkisi. ... 60 Şekil 37. İ2H3K bileşiğinin Caco-2 hücre hattında RB geninin mRNA
seviyesine olan etkisi. ... 61 Şekil 38. İ2H3K bileşiğinin Caco-2 hücre hattında P53 geninin mRNA
vii
TABLO LİSTESİ
Sayfa
Tablo 1. İşlenmiş 100 gram Kapari ... 29
Tablo 2. cDNA sentez karışımı. ... 39
Tablo 3. qRT-PZR koşulları. ... 40
Tablo 4. PZR sıcaklık, döngü ve zamanları. ... 40
Tablo 5. Hücre hattı çalışmalarında kullanılan primer dizileri. ... 41
Tablo 6. LNCaP hücre hattında I2H3K bileşiğinin doz uygulama sonuçları. .. 70
Tablo 7. Caco-2 hücre hattında I2H3K bileşiğinin doz uygulama sonuçları. .. 73
Tablo 8. LNCaP hücre hattında Taxol ilacının doz uygulama sonuçları. ... 76
viii
SEMBOL LİSTESİ
ABD : Amerika Birleşik Devletleri AGE : Agaroz Jel Elektroforez AIF : Apoptoz İndükleyen Faktör
APAF-1 : Apoptotik Proteaz Aktive Edici Faktör -1 AR : Androjen Reseptörü
BAD : BCL-2 İlişkili Ölüm Organizatörü BAX : BCL-2 İlişkili X Protein
BCL-2 : B Lenfoma-2 Hücresi BH : BCL-2 Homoloji Bölgeleri BSA :Sığır Serum Albumin
Caco-2 : İnsan Kolon Adenokarsinom CAR : Konstitütif Androstan Reseptörü
CARD : Kaspaz Aktivasyon ve Tanıma Domaini CASP-3 : Kaspaz 3
CASP-8 : Kaspaz 8 CASP-9 : Kaspaz 9
CDK : Siklin Bağımlı Kinaz
CDKNI : Siklin Bağımlı Kinaz İnhibitörü C-MYC : MYC Protoonkogen Proteini DEPC : Dietilpirokarbonat
DIABLO : Direkt Apoptozis İnhibitörü Bağlayıcı Protein DISC : Ölüm İndükleyici Sinyal Kompleksi
DMEM : Dulbecco Modifiye Eagle Medium DMSO : Dimetilsülfoksit
DNA : Deoksiribonükleikasit
EDTA : Etilen Diamin Tetra Asetik Asit
EC25 : %25 Etkin Doz
EC50 : %50 Etkin Doz
ERK : Mitojen Aktive Edici Protein Kinaz 1 EtBr : Etidyum Bromür
FADD : Fas İlişkili Ölüm Domaini
FAS : Tümör Nekroz Faktör Reseptör Ailesi Üyesi 6
FasL : Fas Ligand
FBS : Fetal Sığır Serumu
IAP : Apoptoz İnhibitör Proteini JNK1 : Mitojen Aktive Protein Kinaz 8 LNCaP : İnsan Prostat Kanser Hattı
MAPK : Mitojen Aktive Edici Protein Kinaz NFkB : Nükleer Faktör Kappa B
PARP : Poli ADP Riboz Polimeraz PBS : Fosfat Tamponlu Tuz Çözeltisi
PTEN : Tümör Baskılayıcı Fosfataz ve Tensin Homolog PZR : Polimeraz Zincir Reaksiyonu
P38 : Mitojen Aktive Edici Protein Kinaz P53 : Tümör Baskılayıcı Protein 53
ix
qRT-PZR : Gerçek Zamanlı Kantitatif Polimer Zincir Reaksiyonu RB : Retinablostama
RPMI : Roswell Park Memorial Enstitü RT : Ters Transkriptaz Enzimi SDS : Sodyum Dodesil Sülfat
SMAC : Sekonder Mitekondri Türevli Kaspaz TAE : Tris Asetik Asit EDTA Tamponu TNF : Tümör Nekrozis Faktör
TRAF2 : TNF Reseptör Bağlantılı Faktör 2
TRAIL : TNF ile İlişkili Apoptoz İndükleyici Ligand Reseptör UV : Ultraviyole
x
ÖNSÖZ
“Capparis ovata bitkisinden izole edilen, yeni ve doğal olan 1H-indol- 2-hidroksi, 3-karboksilik asit (İ2H3K) Bileşiğinin Anti Kanser Özelliklerinin Araştırılması ” adlı çalışma 2016-2018 yılları arasında Pamukkale Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalında Biyokimya ve Moleküler Toksikoloji Laboratuarı’nda Yüksek Lisans tezi olarak hazırlanmıştır.
Laboratuarının tüm imkânlarını koşulsuz öğrencileriyle paylaşan, bilgi dağarcığını son zerresine kadar bizlere sunan ve her zaman yardımcı olan, yol gösteren, yüksek lisans eğitimi boyunca bilgilerini esirgemeyen, bilimsel çalışma ve araştırma anlayışını kendime örnek aldığım çok değerli danışman hocam Prof. Dr. Alaattin ŞEN’ e sonsuz teşekkürlerimi sunarım.
Her zaman güler yüzü ile bana mutluluk veren ve her konuda yanımda olduğunu hissettiğim bilimsel deneyim ve bilgilerini benimle paylaşan çok sevdiğim laboratuarın biricik ablası Dr. Özden ÖZGÜN ACAR’ a teşekkür ederim.
Tezimin düzenlenmesi ve değerlendirilmesi aşamasındaki yardımlarından ve katkılarından dolayı değerli jüri üyelerim Prof. Dr. Nazime MERCAN DOĞAN ve Dr. Öğr. Gör. Işıl GAZİOĞLU’na teşekkür ederim.
Laboratuarda birlikte çalıştığım arkadaşlarım Elif KALE, Fatma SANDAL, Şule IRMAK ve Hajarat Abilo ALFA’ ya bu zorlu süreçte bana karşı olan yardımları ve destekleri için teşekkür ederim.
Ayrıca maddi destek sağladığı için Pamukkale Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimine (2017FEBE051) ve TÜBİTAK’a (112S187) teşekkür ederim.
1
1. GİRİŞ
Kanser kelimesinin tarihçesi milattan önce 460-370 yılları arasında yaşayan Hipokrat tarafından ilk defa ‘carcinos’ ve ‘carcinoma’ olarak ülser oluşturan ve ülser oluşturmayan tümörler için kullanılmıştır. Parmak benzeri uzantılara sahip olan kanser hücrelerinin yengeçleri (cancer) andırması sebebiyle verilen ‘carcinos’ ve ‘carcinoma’ isimleri milattan önce 28-50 yılları arasında yaşamış olan Roma’lı hekim Celcus tarafından ‘cancer’ olarak kullanılmaya başlanmıştır (Karataş, 2014).
Kanser, organizmaya ait hücrelerin çeşitli nedenlerden dolayı kontrolsüz şekilde çoğalmaları ile karakterize edilen bir hastalıktır. Bu nedenler, onkogenlerin işlev kazançları, bazı tümör baskılayıcı genlerin işlev kayıpları, apoptoz yolaklarında görev alan genlerin ekspresyon düzeyinde değişiklikler ve DNA hasarı onarım yolaklarındaki genetik değişiklikler olarak sıralanabilir. Bu nedenle, kanser bazı ortak özelliklerde birleşmiş bir dizi heterojen patolojik görünümüne ait karmaşık bir hastalıktır (Kreeger ve Lauffenburger, 2010).
Şekil 1. Kanserin bir organ ya da dokudaki kontrolsüz çoğalması (http-//rise.duke.edu/seek/pages/page.html?0205 web adresinden değiştirilerek alınmıştır.)
2
Kanser günümüzde ölüm oranı yüksek olan sağlık sorunları arasında ön sıralarda yer almaktadır. Teknoloji ve bilimin ilerlemesi ile birlikte tanı olanaklarının ve tedavi yöntemlerinin gelişmesi kanser vakalarının daha erken teşhis edilmesine imkân sağlamaktadır. Kanserde tümör baskılayıcı genlerin inaktivasyonu ve onkogenlerin aktivasyonu rol oynamaktadır. Genetik ve epigenetik değişimler kanser gelişiminde önemlidir (Montenegro ve diğ. 2014).
Kanser hücrenin temel düzenleyici mekanizmalarındaki kusurlardan kaynaklandığı için, özellikle moleküler ve hücresel düzeyde değerlendirilmesi gereken bir hastalıktır. Hücrede; sinyal iletimi, hücre döngüsünün ve programlı hücre ölümünün düzenlenmesi gibi işlemlerde anahtar görev üstlenen proteinlerin birçoğu, ilk kez hücrenin kontrolsüz çoğalmasına yol açan anormal aktiviteleriyle tanımlanabilmiştir (Cooper ve Hausman, 2006).
Kontrollü hücre çoğalmasının gerçekleşmesi için protoonkogenler ve tümör baskılayıcı genler arasında denge olması gerekmektedir. Kanserde mutasyon sonucu gen ifadesi değişmektedir. Hücreler kontrolsüz olarak büyümeye ve bölünmeye başlamaktadır. Bu sebeple hücrelerin normal fonksiyonları engellenmektedir. Hücrelerin sürekli çoğalması ile her organ yenilenme göstermektedir. Ancak bu yenilenme sırasında bazı hücreler anormal bir şekilde üreyerek tümör oluşturmaktadır (Kasap ve diğ. 2010). Kanser kontrolsüz hücre büyümesi ve metastaz özellikleri ile karakterize edilmektedir (Montenegro ve diğ. 2014). Sağlıklı dokularda hücre çoğalması organizmanın ihtiyacına göre belirlenmektedir (Lowitz ve Casciato, 2007). Kanser, bulaşıcı olmayan hastalıklar (BOH) etkenler arasında yer almaktadır (Karataş, 2014). 2010 yılı WHO BOH Global Durum Raporu’na göre dünya genelinde ölümlerin %63’ ünden (36 milyon) sorumlu olan BOH’ lar arasında kanser, ölümlerin %21’ inden sorumludur (Alwan, 2010).
DNA'ya zarar veren ajan bazlı tedavi, anti-kanser tedavisinde en sık kullanılan stratejilerden biridir. DNA hasarı, organizmanın normal işleyişi için gerekli olan ve önemli bir onko-baskılayıcı işlevi temsil eden bir hücre ölüm sürecini apoptozisi tetikler. Bununla birlikte, tek-ajan kemoterapisinin kansere karşı yeterince etkili olmadığını gösteren güçlü belirtiler vardır, çünkü tümör hücreleri genetik olarak heterojendir. Bu nedenle, anti-kanser tedavilerini iyileştirmek için farklı tedavi yaklaşımlarının kombinasyonları yoğun bir şekilde araştırılmaktadır. BCL-2 aile
3
üyeleri de dâhil olmak üzere bir dizi pro ve anti-apoptotik protein, apoptozisin başlatılmasını sıkı bir şekilde düzenler (Elmore, 2007).
Hücrede meydana gelen genetik değişimlerin kanserleşme sürecinde, hücre davranışı üzerindeki etkileri on farklı yol ile gerçekleşir. Bunlar;
1. Büyüme faktörü sinyallerinden bağımsız proliferasyon
2. Büyüme engelleyici sinyallerden kaçış
3. Apoptozdan kaçış
4. Sınırsız çoğalma potansiyeli
5. Anjiyogenez
6. Bağışıklık sisteminden kaçma
7. İnflamasyon
8. Mutasyonlar
9. Genetik kararsızlık
10. İnvazyon ve Metastaz’dır.
Bu etkiler hücre metabolizmasında ve proliferasyonun da işlev gören sinyal yolaklarındaki değişiklikler ile ortaya çıkar. Sağlıklı bir hücrede hücre döngüsü ve DNA hasarı, tamir mekanizmaları tarafından onarılıncaya kadar durdurulur. Eğer tamir edilemeyen bir durum söz konusu ise hücre apoptoza yönlendirilir. Böylece hasarlı hücrenin ortadan kaldırılması sağlanmış olur. Ancak sağlıklı normal bir hücrenin kanserli bir hücreye dönüşmesindeki süreçte DNA hasarı oluştuksan sonra hücre döngüsünün kontrolü veya DNA tamir mekanizmaları aktif olarak görev yapamadığı durumlarda DNA tamiri yapılamayabilir. Bu bağlamda hücre apoptoza yönlendirilmeden hasarlı bir şekilde proliferasyonuna devam edebilir (Bartek ve diğ., 1999).
4
Şekil 2. Kanserleşmenin on temel kuralı (Hanahan ve Weinberg, 2017)
1915 yılında Tokyo Üniversitesinde ki bilim insanlarından Katsusaburo Yamagiwa ve Koichi Ichikawa tavşan derisine kömür katranı sürerek ilk kez laboratuar ortamında hayvan modeli kullanarak kanser oluşturmuştur. Bununla birlikte kanser etiyolojisinin tarihinde önemli bir adım atmışlardır (Henschen F. Yamagiwa's, 1968). Daha sonra ise birçok kanserojen maddenin var olduğunu tespit etmişlerdir.
Kanserojenik risk faktörleri arasında, enfeksiyon ajanları, parazitler, bakteriler, UV veya Radyasyon maruziyeti, obezite, mesleki maruziyeti, diyet kaynaklı etkenler, sigara ve alkol kullanımı kanser oluşumuyla ilişkilendirilmiştir (Clavel J., 2007).
5
Şekil 3. Kanser risk faktörleri. (AACR Cancer Progress Report, 2013)
Laboratuarımızda yapılan çalışmalar doğrultusunda halk arasında bilinen adlarıyla gebere, gebere otu, karga kavunu, deve dikeni, gevil, bubu şebellah olarak bilinen (Capparis ovata) analjezik, diüretik, yara iyileştirici ve hücre yenileyici olarak kullanılan kapari bitkisinin tomurcuk ve yaprakları da ilaç ve kozmetik sanayide kullanılmaktadır. Son yapılan çalışmalarda meyve, sebze ve bitkilerde bulunan ‘fitokimyasallar’ adı verilen doğal bileşikler, tümör oluşumu ve gelişimini engelleme potansiyelleri nedeniyle akademik olarak ilgi çekmektedir. Her ne kadar kanser riskinin modifikasyonu üzerinde tartışmalar olsa da bu fitokimyasalların birçoğu kimyasal önleme stratejilerinde kullanılmaktadır.
Bu tez çalışmasında literatür için yeni ve doğal bir bileşik olan, önceki çalışmalarımızda (TÜBİTAK 112S187 nolu proje) Capparis ovata bitkisinden izole ettiğimiz 1H-indol-2-hidroksi, 3-karboksilik asit (İ2H3K) bileşiğinin anti kanser özellikleri insan prostat kanser hücre hattı (LNCaP) ve insan kolon kanser hattı (Caco-2) üzerinde çalışılmıştır. İ2H3K bileşiğinin belirlenen hücre hatları üzerindeki sitotoksik etkilerine ve farklı yolaklara ait genlerin mRNA ekspresyon düzeyindeki
6
değişimlerine bakılmıştır ve bileşiğin uygulanması sonucunda meydana gelen değişimlerin istatistiksel olarak analizleri yapılarak sonuçlar yorumlanmıştır.
Kansere ait moleküler mekanizmanın temelini ve kansere karşı bağışıklık yanıtlarını düzenleyen sinyal yolaklarını anlamak ilerleyen çalışmalarda yeni tedavi yöntemlerinin gelişmesine yol açarak araştırmacılar için heyecan verici olurken hastalar için ise umut kaynağı olmaktadır.
1.1 Prostat Kanseri
Prostat kanseri özellikle androjen reseptörü hedefleyen ajanlara çeşitli yanıtlar veren heterojen bir hastalıktır (Ecstein-Fraisse ve Su, 2014).
Prostat kanseri, prostat bezi hücrelerinde büyüme ve bölünme kontrolünün kaybı ile organ hacminde meydana gelen büyüme olarak tanımlanmaktadır. Prostat kanseri dünya genelinde en çok tanı konulan ikinci kanser türü olup, erkeklerde kanser nedeniyle ölüm vakalarında altıncı sırada yer almaktadır. Son yapılan çalışmalara göre Amerika Birleşik Devletleri’nde prostat kanseri, deri kanserinden sonra en yaygın görülen kanser türü olmakla beraber erkeklerde ölüme yol açan ikinci kanser türü olarak gösterilmiştir (Verma ve diğ., 2011).
Prostat kanseri genellikle uzun süre belirti göstermeden ilerlemektedir. Belirtiler hastaların ileri yaşlara geldiğinde oraya çıkmaktadır (Szliszka ve Krol, 2013).
Prostat kanserini erken dönemde saptamak için kullanılan en önemli biyobelirteç olan Prostat Spesifik Antijen (PSA)1971 yılında bulunmakla birlikte 1986’da hastalığın takibi için, 1994’te ise prostat kanser tanısında, tedavi ve takibinde kullanılmaktadır. PSA’nın en önemli avantajı duyarlılığının oldukça yüksek olmasıdır (Sreekumar ve diğ., 2009).
Prostat kanserinin nedenleri ve regülasyonu tam olarak aydınlatılmamış olmakla birlikte genetik yatkınlık, yaş, ırk ve yaşam şekli gibi birçok faktörün hastalık sürecinde rol aldığı düşünülmektedir. Epidemiyolojik çalışmalar sonucunda
7
bütün prostat kanserlerinin %5 ile %10’unun ailesel olduğu ve genetik faktörler tarafından belirlendiğini göstermektedir (Coffey ve diğ., 2001).
Androjen reseptörü sinyal yolağının anormal bir fonksiyonu ile birlikte çeşitli belirteç özelliklerinin kazanımı ile prostatik tümörigenezin arkasındaki mekanizmalar, metastatik kastrasyon dirençli hastalığa geçişe neden olur (Mazaris E, Tsiotras, 2013, Karantanos ve diğ.,2013; Katsogiannou ve diğ.,2015). Bu özellik, hayati hücre fizyolojik süreçlerinin düzensizleştirilmesi, tümör baskılama aktivitesinin inaktivasyonu ve prostat bezine spesifik hücresel homeostazın bozulması da dahil olmak üzere çeşitli kritik faktörlerin yoğun bir şekilde düzensizliği ve bozukluğundan kaynaklanmaktadır (Datta ve diğ.,2016). Prostat kanserinde sinyal gönderen onko proteinlerin moleküler karmaşıklığı ve fazlalığı, eşzamanlı birden fazla özgün yolağın inhibisyonu gerektirmektedir ve bu nedenlede tedavisi zor hale gelmektedir (Katsogiannou ve diğ.,2015).
Amerika Birleşik Devletleri’nde (ABD) her yıl yaklaşık olarak 200.000 erkek prostat kanseri tanısı almaktadır. Sağlık Bakanlığı verilerine göre Türkiye’deki prostat kanseri insidansı yüz binde 37,6 olup erkeklerde ikinci en sık görülen kanser olarak belirtilmiştir. ProstaTÜRK çalışmasında Türkiye’de insi dansı yüz binde 35 olarak saptanmıştır (Ekin ve diğ., 2015).
Türkiye’de iller bazında elde edilen veriler doğrultusunda, prostat kanserinin halk sağlığını tehdit eden önemli bir sağlık problemi olduğu ve görülme sıklığının devamlı olarak arttığı belirlenmiştir. Bu amaçla gerçekleştirilen bir çalışmada, yaklaşık bir yıl boyunca (1 Temmuz 2008 – 30 Haziran 2009) yeni 4150 prostat kanseri teşhisi konulduğu gösterilmiş olmakla birlikte ve yaşa bağlı olarak en sık görülen prostat kanseri vakası İstanbul iken, en az ise Edirne’de prostat kanseri vaka sayısı saptanmıştır (Zorlu ve diğ., 2014).
Halen metastatik kastrasyon dirençli prostat kanseri için etkili bir moleküler hedefli tedavi stratejisi yoktur (Datta vd.,2016). Sonuç olarak, yeni potansiyel anti kanser ajanların belirlenmesine gerçek bir ihtiyaç vardır. In vitro ve in vivo çalışmalar, antioksidan aktivitesinin ötesinde, fotokimyasalların ilave özelliklerini ortaya koymuştur. Bu ajanlar aynı zamanda tümörlerin proliferasyonunu, büyümesini ve metastazını engellemektedir (Dorai vd.,2004; Aggarwal ve Shishodia, 2006; Luiz
8
and Hernandez, 2016). Bunlar ve diğer bitki kaynaklı maddeler doğal anti-kanser ilaçlarını temsil edebilir.
Kansere karşı mücadelede, konvansiyonel kemoterapötik ajanların yanı sıra fitokimyasallar gittikçe artan bir şekilde önem kazanmıştır. Fotokimyasallar üzerine yapılan bilimsel çalışmalar, etki mekanizmalarının ve özellikle hücre sinyal yolakları üzerindeki etkilerinin daha detaylı bir şekilde anlaşılmasını sağlamıştır. Fotokimyasallar bitki, sebze, meyveler ve tahıllarda bulunan (besleyici olmayan) biyoaktif maddelerdir. Sağlık üzerindeki birçok olumlu etkileri atfedilmektedir. Çok sayıda fotokimyasal belirlenmiştir, ancak çoğu için potansiyel faydalı etkiler halen bilinmemektedir ve aydınlatılması gerektirmektedir (Weng vd., 2012).
1.1.1 Prostat’ın Anatomik ve Histolojik Yapısı
Mesanenin hemen altında yer alan ve erkek üretrasının proksimal kısmını çevreleyen fibromüsküler ve glandüler bir organdır. Prostat bezi 4cm genişliğinde, 4-6cm kompleks küçük bir salgı bezidir. Prostatın yaklaşık olarak ağırlığı 20 gr (18-40 gr) olup, ters bir piramide benzemektedir. Prostatın ağırlığı testiste sentezlenen androjenik hormonlara bağlıdır (Silverberg ve diğ., 2006). Hafif alkali (pH 7.29) bir sıvı salgılar. Bu salgılanan sıvı spermatozoaların yer aldığı seminal vezikül sıvı hacminin %25-30’luk bir bölümünü oluşturur.
Prostat bezinin zonal anatomisi klinik açıdan oldukça önemlidir. Prostat karsinomlarının genel olarak %15-20’si transizyonel zondan köken almaktadır. Prostatik üretrayı saran periferal zon, karsinomların en sık olarak görüldüğü bölgedir. Karsinomların %70-75’i bu zondan köken almaktadır. Ayrıca kronik inflamasyon ve atrofi de en sık bu zonda görülmektedir (Carter ve diğ., 2004).
1.1.2 Prostat Kanseri Oluşumu ve Temel Moleküler Mekanizması Kanser, tümör baskılayıcı genlerin inaktive, onkogenlerin aktive olduğu bazı genetik değişmeler temelinde oluşan bir hastalıktır. Bu genetik değişimlerden (örneğin mutasyonlar) bazıları kalıtsal bir özellik kazanarak kansere yatkınlık
9
yaratırlar. Kansere karşı ilaçlar geliştirebilmek için şüphesiz kanserleşme sürecindeki değişimler çok iyi bilinmelidir (Porkka, 2004). Prostat, erkeklerde bulunan ve pelvise yerleşmiş küçük bir bezdir. Prostatın temel işlevi semen üretimine yardımcı olmaktır. Fonksiyonları androjenler tarafından kontrol edilip düzenlenmektedir. Prostat kanser hücre hattı (LNCaP), insan prostat kanserinin metastatik lenf nodu lezyonundan türetilen ve androjen reseptörü (AR) pozitif, androjene duyarlı büyüme sergileyen bir hücre dizisidir (Horoszewicz ve diğ., 1989).
Sağlıklı normal bir dokuda hücrelerin bölünme hızı ve ölüm hızı arasında bir denge bulunmaktadır. Herhangi bir nedenden dolayı bölünme hızının ölüm hızından fazla olduğu zaman kanser adını verdiğimiz kontrolsüz hücre çoğalması gerçekleşir. Prostatta da aynı şekilde bölünme hızı ölüm hızından fazla olduğu zaman prostat kanseri ortaya çıkmaktadır.
Prostat kanserinin hala net olarak etyopatojenezi bilinememektedir. Hormonal, genetik, epigenetik ve çevresel faktörlerin tümör oluşumunun patojenezinde rol oynadığı öngörülmektedir. Prostat kanseri yavaş ilerleyen bir hastalıktır (Shen ve Abate-Shen, 2010).
Prostat kanserinin başlaması, gelişmesi ve invazyonunda rol oynayan moleküler yolakların çoğunluğu ara sıra (sporodik) görülmektedir. Bu bağlamda, tümör supresör genler ve onkogenler, Prostat kanserinin gelişimi, ilerlemesi ve androjenden bağımsız fenotiplerin ortaya çıkmasında rol oynamaktadır. Sporodik Prostat kanserinden sorumlu tümör supresör genlerinin başında; P53, PTEN, CDKN1B (p27), MX11, NKX3.1, RB, GSTP1, KLF6, CDKN2A, ATFB1 gelir. Onkogen olanlarda ise c-MYC, c-ErB2 (Her-2 neu), BCL-2, PSCA, ERG, ETV1, AMACR, PIM1, Hepsin, AR, CYP17, SRD5A2, CYP3A4, VDR, STAT5 genleri başı çekmektedir (Konaç ve Sözen, 2014).
Prostat normal büyüme ve gelişmesi için androjenik hormonlara ve düzgün çalışan androjen reseptörü sinyal yolağına ihtiyaç duymaktadır. Metastatik prostat kanserleri büyük oranda kastrasyon veya antiandrojenik ajanlar gibi, tumoru androjen uyarımından mahrum bırakan tedavi yontemleri ile kontrol altına alınmaya çalışılmaktadır. Ancak, bu tedaviye rağmen, hastalarda eninde sonunda hormonal tedaviye dirençli“androjen bağımsız” tümörler gelişmektedir. Bu tumorler dışarıdan
10
androjenik uyarıma ihtiyac duymasalar da, hucre bazında AR ekspresyonu ve AR sinyal yolaklarının korunmuş olduğu gosterilmiştir. Dahası, androjen bağımsız tümör hücrelerinin çoğalmasında AR sinyal yolağının hala kritik oneme sahip olduğu duşunulmektedir. AR ekspresyonu hormonal tedaviye dirençli tumorlerde sıklıkla artmış olarak bulunmaktadır (Gürel, 2013).
Prostat kanserinin patogenezinde androjenlerin seviyesi ve fonksiyonları, sinyal yolaklarıyla etkileşimlerindeki değişiklikler yer almaktadır. Prostat kanserinin patogenezi için güncel ideolojik çerçeveler, prostatik intraepitelyal neoplazi (PIN), proliferatif inflamatuar atrofi (PIA) ve doku hipoksisi gibi prekürsör lezyonların rolünü vurgulamaktadır. Alternatif olarak ortaya atılan teoriler, prostat kök hücrelerinin hastalık rezervuarları olarak işlev gördüğünü öne sürmektedir (Parker, 2004).
Androjenler, prostat hücrelerinin normal proliferasyonunda ve diferansiyasyonunda, prostat kanserinin gelişmesinde ve ilerlemesinde önemli rol oynamaktadırlar. Bu nedenle erken evre prostat kanseri androjen ablasyon tedavisine yanıt vermektedir. Ancak hastalık kısa bir süre sonra androjenlerden bağımsız hale gelmekte ve ilerlemesine devam etmektedir. Prostat kanserinin bu androjen yanıtsız evresinde etkin bir tedavi yöntemi bulunmamaktadır (İrer, 2017).
1.1.3 Prostat Kanseri Epidemiyolojisi
Prostat kanseri ileri yaş erkeklerde gözlenen bir hastalık olmakla birlikte hastalığın tanı koyma yaklaşık olarak ortalama 70’li yaşlardır. Ekonomik olarak gelişmekte olan ve gelişmiş ülkelerde erkeklerde daha sık tanı konulan bir hastalıktır. Gelişmiş ülkelerde yaşayan erkeklerde en yaygın görülen kanser tipi prostattır (Jemal ve diğ., 2008; 2011).
Prostat kanserinin erkeklerde görülen kanser ölümlerinden yüzdelik dilimlere ayrılmış hali Şekil 4’te verilmiştir.
11
Şekil 4. Erkeklerde görülen kanser çeşitleri (Kanser İstatistikleri, 2014)
Prostat kanserinin gelişim evrelerinde özellikle erken evrelerine bakıldığında genellikle genetik yatkınlık, oksidatif hasar ve inflamatuar değişikliklerle ilişkilendirilmektedir. Kromozomal kayıplar ve telomer kısalmaları da prostat kanserinde ilerlemeye neden olabilmektedir (Gonzalgo ve Isaacs, 2003).
Gelişmiş ülkelerde erkeklerde görülen kanser çeşitlerinden prostat kanseri üzere %15‟ini oluşturmaktadır. Yine gelişmekte olan ülkelerde bu oranın %4’e kadar düştüğü görülmektedir (Parkin ve diğ., 2001). Prostat kanseri insidansı ile ilgili Türkiye’de kesin veriler bulunmamaktadır. Ancak 1993-1994 yılları arasında yapılmış olan bir çalışmada prostat kanseri insidansı İzmir için yüz binde 9.1 olarak tespit edilmiştir. Bu oran Doğu Avrupa ülkeleri ile aynı seviyededir. Amerika Birleşik Devletlerinin ise 1/12’sine denk gelmektedir (Fidaner ve diğ., 2001). Prostat kanserinde aile öyküsü, coğrafik konum, hormonal faktörler, diyetsel faktörler, yaş, ırk, alkol ve sigara kullanımı gibi çeşitli faktörler risk artışında önemli yer tutmaktadır.
12 1.2 Kolon (Kolorektal) Kanseri
Kolon kanseri dünya genelinde akciğer ve prostat, kadınlarda ise akciğer ve meme kanserinden sonra üçüncü sırada en çok görülen kanserdir (American Cancer Society, 2011).
Kolon kanseri gelişimi için risk faktörleri hem kalıtsal hem de çevresel faktörleri içermektedir. Kalıtsal faktörler ailesel polipozis, kalıtsal nonpolipozis kolon kanseri, lynch sendromu I ve II ve ülseratif koliti içermektedir. Sanayi bölgesinde yaşam, fiziksel inaktivite, belli kimyasallara maruz kalma, yüksek yağ ve düşük lif tüketimi gibi çevresel faktörler ise, daha büyük öneme sahiptir (Brady ve diğ., 2000).
Hastalığın teşhisi fiziksel muayene ve tanısal testler ile belirlenir. Özellikle ailesel hikayesi, dışkılama alışkanlığındaki değişiklikler, kilo kaybı, rektal kanama gibi belirtiler araştırılmalıdır. Kolon kanserinde belirtiler ve bulgular tümörün yayılım derecesini, lokalizasyonunu, kanama, tıkanma, makroskobik yapısının etkilerinin oluşumuna göre değişmektedir (Corman ve diğ., 1979).
Kolon karsinomların genel olarak görülme sıklığı 50 yaş üzerinde olup giderek artmaktadır. Ayrıca 80 yaş civarında ise en sık görülme seviyesine ulaşır. Kolon kanserinin ortaya çıkmasındaki ortalama yaş erkeklerde 63, kadınlarda ise bu yaş 62’dir. Cinsiyet açısından kolon kanserinde belirgin bir fark yoktur. Sadece erkeklerde biraz daha sık görülmektedir.(Tantoğlu, 2012).
Amerikan Kanser Derneği'nin güncel istatistiklerine göre, 2014 yılında ABD'de yapılan bir araştırma sonucunda 1665540 yeni kanser vakası olmakla birlikte günde 1600 ölüme karşılık gelen 585720 kanser ölümünün olacağını göstermektedir.
Türkiye’de Sağlık Bakanlığının 2000 ve 2006 yılları arasında yaptığı çalışmaya göre yaklaşık olarak 396 bin kanser vakası bulunmaktadır. Kanserden ölüm sayıları her yıl 140 bin kişi olduğu ve bu rakamın önümüzdeki 20 yılda yaklaşık 500 bine çıkacağı tahmin edilmektedir. Ortalama 4 yılda bir 150 bin yeni
13
kanser tanısı konulmaktadır. Önümüzdeki 20 yıl içerisinde ise hasta sayısının 1,5 milyona ulaşacağı tahmin edilmektedir (Eser ve diğ., 2012).
1.2.1 Kolon Kanseri Oluşumu ve Temel Moleküler Mekanizması Kolon kanserlerinin hemen hepsi, kolon ve rektum duvarlarındaki iyi huylu poliplerin zamana bağlı olarak kötü huylu poliplere dönüşümüyle açığa çıkar (Borinstein ve diğ., 2010).
Kolon kanserleri polip olarak adlandırılan yapılar üzerinden gelişirler. Sağlıklı bireylerde her gün milyonlarca kalın bağırsak hücresi görevini tamamlayıp ölür ve dışkı ile dışarı atımı gerçekleşir. Bu ölen hücrelerin yerine yeni hücreler yerleşir. Genetik ve çevresel faktörlerden dolayı bu hücrelerin genetik yapılarında değişiklikler oluşması sonucu hücrelerin normal yaşam döngüsünde bozulma olur. Böylece yeni oluşan, büyüyüp gelişen ve çoğalan hücreler ölmeleri gereken zamanda ölmezler ve anormal şekilli hücreler olarak çoğalmaya devam ederler. Bulundukları kalın bağırsak bölümünde küçük bir polip (hiperplastik ve adenomatöz polipler) olarak yer edinip büyürler. Daha sonra genetik değişiklikten dolayı oluşan kanser yapıcı genler (onkogenler) sayesinde adenomatöz polipler bulundukları organları ele geçirerek kanser oluştururlar ve diğer başka organları da çeşitli yollarla ele geçirirler (Dusak, 2015).
Kolon karsinomların büyük bir çoğunluğunun adenom-karsinom temelinden geliştiği kabul edilmektedir. Kolon karsinogenezinde çok fazla sayıda mutasyonun biriktiği iki farklı yol vardır. Belirtilen mutasyonlar gerçekleştikleri genler ve birikim mekanizmalarından dolayı farklılık gösterirler.
14
Şekil 5. Kolon kanserinde poliplerin zamana bağlı olarak kansere dönüşümü (http://labiotech.eu/swiss-blood-test-for-colorectal-cancer-joins-race-of-liquid-biopsies/).
Kolon adenomu, bez kökenli bir benign bir tümör çeşididir. Adenom kolon, hipofiz, tiroit, pankreas ve adrenal bez gibi birçok organda gelişebilmektedir. Epitel içinde neoplazi gösteren pregmalignant lezyonlardır. Ancak mukoza içinde invazyon olmamıştırlar. Zamana bağlı bu iyi huylu büyüme ilerleyerek malignant olabilmektedir. Bu durumda ise adenokarsinoma olarak adlandırılmaktadır. Adenom-karsinom dönüşümü yavaş yavaş onkogenlerin mutasyonel aktivasyonuyla veya tümör baskılayıcı genlerin inaktivasyonu ile meydana gelmektedir (Vogelstein ve diğ., 1988).
Normal epitel hücrelerin adenom ve karsinoma dönüşümü, DNA’daki metil gruplarının kaybı, P53 geninin mutasyonu ve inaktivasyonu ya da KRAS gibi onkogenlerin aktivasyonu ile birlikte gerçekleşmektedir (Busuttil, 2011).
Kolorektal kanser patogenezinde genomik ve epigenomik instabilite kadar, hücre proliferasyonu, farklılaşması, apoptozis, immortalizasyon, anjiogenezis ve invazyon gibi karsinogenezisde kritik olayları düzenleyen çok özel genlerin mutasyonları ve bunun sonucu değişen sinyal yolakları da önemli yer tutar. Kolorektal kanserler için en iyi çalışılmış yolak Wnt-β Katenin sinyal yolağı, Transforme Edici Büyüme Faktörü-β (TGF)-β sinyali, Epidermal Büyüme Faktörü (EGF), Mitojenler ile Aktive Edilen Protein Kinaz (MAPK) ve Fosfatidil İnozitol 3-Kinaz (PI3K) yolaklarıdır(Dahabreh ve diğ., 2011, Walther ve diğ., 2009).
15
Fearon ve Vogelstein’in (1990) kolorektal kanser tümörogenezinde rol oynayan moleküler mekanizmayı açıklamak amacıyla oluşturdukları model sonraki çalışmalara ışık tutmaktadır. Bu modele göre;
- Kolorektal tümörlerin onkogenlerin mutasyonel aktivasyonu ve tümör supresör genlerin mutasyonel inaktivasyonu sonucunda oluşmaktadırlar.
- Malin tümör oluşumu için en az 4 yada 5 genin mutasyona uğramış olması gerekmektedir. Daha az miktardaki değişimlerin ancak benign tümör oluşumu için yeterli olmaktadır.
- Genetik değişikliklerin birbirini takip etmesiyle ortaya çıktığı düşünülse de tümörün biyolojik özelliklerini belirlemek için bu genetik değişikliklerin birikimi oluş sırasından daha önemlidir. - Mutant tümör supresör genin heterozigot bir ortamda bulunduğu
zaman fenotipik etkisini gösterebilmektedir.
Bu bilgilerden sonra yapılan daha sonraki çalışmaların temelini oluşturmaktadır. Kolorektal kanser gelişimine sebep olan genetik değişimler ise üç grupta incelenebilir. Bunlar;
- Tümör supresör gen aktivitesinin azalması yada kaybolması. - Protoonkogenler de meydana gelen değişiklikler.
- DNA onarımıyla ilgili genlerde meydana gelen değişikliklerdir.
Araştırmalara göre değişik kanser türleri beslenme faktörlerine bağlıdır ve kanser ölümlerinin % 30-35’ inden sorumlu olabileceği öne sürülmektedir. Diyetsel faktörler ve kanser türleri arasındaki ilişki görülmektedir. Diyetin kolorektal kanser üzerine etkisi oldukça yüksektir (Karagöz, 2011). Hayvansal yağ alımı gibi diyet alışkanlıkları ile kolorektal kanser riski arttığı bilinmektedir (Hajiaghaalipour ve diğ., 2015).
16
1.2.2 Kolon’un Anatomik ve Histolojik Yapısı
Kolon, Latince kökenlidir ve sindirim sisteminin bir parçası olan kalın bağırsakların genel adıdır. Kalın bağırsakların ilk 1,5-2 metresine kolon ve son 15-20 cm’ sine ise rektum ve anal kanal denir. Kolonun vücut dışına açılan bölümü sonlanır (Dusak, 2015).
Şekil 6. Sindirim sisteminde kolonun pozisyonu ve kolon kanserinin, sindirim sisteminin alt kısmı olan kalın bağırsakta (kolonda) gözlenmesi (http://www.mayoclinic.org/diseases-conditions/colon-cancer/home/ovc-20188216).
Caco-2 hücreleri kendiliğinden farklılaşabilen, tipik bağırsak villus yapısında, sıkı bağlantılara, bağırsak emilim yeteneğine ve bağırsağa özgü enzim ifadesine sahip kanser hücreleridir (Mitchell Ve Ball, 2004). Ayrıca insan ince bağırsak epitelinin birçok özelliğini taşımaktadır (Hilgendorf ve diğ., 2000).
1.2.3 Kolon Epidemiyolojisi
Sağlık Bakanlığının 1998 ve 1999 verilerine göre kolorektal kanserler erkeklerde en sık izlenen dördüncü, kadınlarda en sık izlenen 2. kanser türüdür ve
17
rektum kanseri her iki cinste de kolorektal kanserlerin yarıya yakınını oluşturmaktadır (Kanser İstatistikleri, 2004).
Epidemiyolojik ve deneysel çalışmalar kolon kanseri insidansının çevresel faktörlerle, özellikle diyetle, etkilendiğini desteklemektedir (Rafter, 2002; Allsopp ve Rowland, 2009).
Kolon kanseri gelişmiş ülkelerin büyük çoğunluğunda ciddi bir sağlık problemi olup, kanser mortalitesinin ana nedenlerinden biridir (Ewaschuk ve diğ., 2006; Kim ve diğ., 2008; Lee ve diğ., 2008). Epidemiyolojik ve deneysel çalışmalar kolon kanseri insidansının çevresel faktörlerle, özellikle diyetle, etkilendiğini desteklemektedir (Rafter, 2002; Allsopp ve Rowland, 2009).
Dünya Sağlık Örgütü’nün 2015 yılı verilerine göre tüm dünyada çeşitli kanser tiplerinden kaynaklanan 8,8 milyon ölüm olmuştur. Ve dünya genelinde kolon kanseri en yüksek dördüncü insidansı, en yüksek üçüncü mortaliteye sahiptir. 2014 Türkiye verilerine göre kolorektal kanserler erkeklerde her 58.400 ölümün %7 sini oluşturarak dördüncü sırada kadınlarda ise her 32.500 ölümün %9,1’ini oluşturarak üçüncü sıradadır. Beslenme geleneklerine, sosyoekonomik durumlara ve diğer çevresel faktörlere bağlı olarak kolon kanseri insidansları ülkeler arasında değişim göstermektedir.
18 1.3 Hücre Döngüsü
Bir hücrenin canlılığının göstergesi olan en anahtar noktalardan biri onun birbirine tıpa tıp benzeyen iki hücreye bölünmesidir. Hücre siklusu, çoğalmak
(prolifere olmak) üzere uyarılmış bir hücrede gerçekleşen ve bir dizi geçici biyokimyasal aktivitelerin ve morfolojik değişikliklerin görüldüğü bir süreçtir. Bir siklusa giren hücre, morfolojik ve genetik olarak birbirine tıpa tıp benzeyen iki hücre oluşumuyla döngüyü tamamlar. Hücre proliferasyonu hücre siklusu içinde yer alan bazı kontrol noktaları (“check-points”) tarafından düzenli olarak kontrol edilir. Hücre siklusu proliferasyon, farklılaşma (diferansiyasyon) ve apoptozis gibi temel hücresel fonksiyonları düzenlediğinden büyüme ve doku “turnover”ıyla yakın ilişki içinde bulunur. Bu düzenleme özelliğinin olması organizmadaki hemen hemen her tür fizyolojik (örneğin doku hemostazisi) ve patolojik durumlarda (örneğin tümör oluşumu) hücre siklusunun ne denli kritik bir öneme sahip olduğunu göstermektedir (Ulukaya, 2001).
Bölünebilme yeteneğine sahip hücreler ekstraselüler sinyaller ve büyüme faktörleri tarafından uyarıldıklarında büyüyebilmekte ve bölünebilmektedirler. Çok hücreli organizmalarda ölü ve hasarlı dokunun yenilenmesinde hücre bölünmesi çok önemlidir. Hücrelerin büyüme ve farklılaşmasının düzenlenmesi gerekmektedir; aksi takdirde, organların ve dokuların bütünlüğü uygun olmayan hücre tipleri ve hücre miktarları tarafından bozulabilmektedir. Hücre çoğalmasında normal düzenleme, hücre döngüsü aşamalarını, hücre ölümlerinin programlanmasını ve aşırı büyüme sinyallerine karşı hücrelerin cevaplarını kontrol eden çok sayıda gen tarafından kontrol edilmektedir. Kanserli hücrelerde bu genler mutasyona uğramıştır ve kontrol edilemeyen hücre çoğalmasına neden olmaktadırlar. Bir hücre bölünmesinden diğer bir bölünmeye kadar büyüme ve bölünme şeklinde meydana gelen hücresel faaliyetlere hücre döngüsü denir. Hücre döngüsünde bir hücrenin oluşmasından hücrenin tekrar bölünmesine kadar geçen süreç, yani mitotik bölünmeler arasındaki süreç interfaz aşamasıdır. İnterfaz evresi genetik materyalin replike edildiği sentez evresi (S), sentez evresinden önceki evre (G1) ve sonraki evre (G2) olmak üzere 3‟e ayrılmaktadır. G1 evresinde yapısal proteinler, RNA ve hücre elemanları (mitokondri, lizozomlar, ribozomlar, vs) sentezlenerek 2 katına çıkar. G1 evresinin sonuna doğru S evresine hazırlık olarak DNA replikasyonu için gerekli olan
19
enzimlerin sentezi yapılır. Bu enzim üretimi de hücreyi sentez evresine girmesi için teşvik eder. G1‟i hücrenin kromozomal DNA‟sının kopyalandığı S fazı izler. Hücre DNA replikasyonunu tamamladıktan sonra G2 evresine girer. G2 evresi hücrenin bölünmeden önce yoğun protein sentezi yaptığı son basamaktır. Bölünmeye hazırlık olarak hücre mikrotübül organizasyon merkezinden iğ ipliklerini oluşturacak mikrofilamentler meydana gelir. Hücre G2 evresinden sonra M evresine girer ve çoğalmış olan kromozomlar yoğunlaştırılır, kardeş kromozomlar zıt kutuplara ayrılır ve hücre ikiye bölünür. M evresi sonunda hücre döngüsü tamamlanmış olur (Klug ve diğ., 2009, Kasap ve diğ., 2010).
Şekil 7. Hücre döngüsü kontrol noktaları. (Klug WS, Cummings MR, Spencer CA. Hücre döngüsünün düzenlenmesi ve kanser. Palme Yayıncılık, 2009)
Genel olarak, hücreler bir bölünme sinyali almadıkları sürece hücre döngüsünün aktif (G1, G2, S ve M) fazlarına girmezler ve dinlenme fazı denilen G0 fazında beklerler. G1 ve G2 kısaltmaları “gap” (ara, boşluk) sözcüğünden dolayı kullanılmaktadır. S fazına da bu fazda DNA sentezi gerçekleştiği için S fazı denilmiştir. M aşamasında mitoz bölünme gerçekleştiği için M aşaması olarak adlandırılmıştır. G0 fazındaki hücreler hücre döngüsü içinde yer almayan hücrelerin bulunduğu fazdır. Hücreler bu fazda bölünme uyarısı aldıklarında G1 fazına girer ve döngünün ilk fazına girmiş olurlar (Cooper ve Hausman, 2006).
20 1.3.1 Siklin ve Siklin Bağımlı Kinazlar
Siklinler hücre döngüsünün çeşitli fazlarını aktive eden spesifik proteinler olarak bilinmektedir. Siklinler hücre döngüsü sırasında uygun olan fazda sentezlenir ve görevini tamamladığında yıkılmaktadırlar. Siklin bağımlı kinazlar sadece siklinlere bağlı oldukları durumda aktive olan hücre döngüsünün düzenlenmesinde önemli rollere sahip proteinlerdir (Esposito ve diğ., 2004). Siklinler spesifik siklin bağımlı kinaz olan tirozin kinazlarla kompleks oluşturmakta, onları aktifleştirmekte ve etkilerini düzenlemektedirler (Lowitz ve Casciato, 2007).
Siklin bağımlı kinazların (CDKler) aktivitesi düzenleyici bir alt sikline bağlı olan serin / treonin kinazlardır. Kinaz domeninin sekansına dayanarak, CDK'lar, CMGC grubuna (bazı üyelerin baş harfleri için adlandırılır), mitojenle aktive edilmiş protein kinazlar (MAPK'ler), glikojen sintaz kinaz-3 beta (Gsk3A), çift özgüllük tirozinle düzenlenmiş kinaz (DYRK) ailesi ve CDK benzeri kinazlar (Manning ve diğ., 2002) MAPK'ler gibi ilgili kinazlarda, substrat spesifitesi, katalitik bölgeden ayrılan yerleştirme yerleri ile sağlanırken, CDK'lar, enzimatik aktivite için gerekli ek dizileri sağlayan ayrı protein alt birimlerine bağımlılık ile karakterize edilir. CDK'ların isimlendirilmesine ve analizine yardımcı olmak için, bu aileye ait proteinler CDK1'den CDK20'ye kadar yeniden adlandırılmıştır (Malumbers ve diğ., 2009).
1.3.2 Hücre Döngüsünün Kontrolü
Hücrelerin bölünmek için döngüye girmeleri çevreden gelen dış sinyallere ve iç sinyallere bağlıdır. Büyüme faktörleri ile uyarılan hücrede döngünün değişik evreleri arasında bir ilişki gereklidir. Bu ilişkinin sağlanması için kontrol noktalarına gereksinim vardır. Hücre döngüsünde evreler arasındaki ilişkiyi sağlayan önemli kontrol noktaları vardır. Önceki olaylarda hata varsa bu noktalarda dur işareti verilir ve döngü sonlandırılır. Bu şekilde hasarlı kromozomların replike olması ve yavru hücrelere geçmesi engellenmiş olur (Kasap ve diğ., 2010).
21 1.3.3 Hücre Döngüsü İnhibitörleri
CDK inhibitörleri hücre döngüsünün negatif düzenleyicileridir ve 1993-1995 yıllarında tanımlanmışlardır. Hücre döngüsünün negatif kontrolünden sorumludurlar ve CDK’ arın hücre döngüsündeki işlevlerini düzenlemektedirler (Tsihlias ve diğ., 1999, Zieske, 2000). CDK inhibitörleri DNA hasarı, hücre-hücre teması, sitokin salınımı, hipoksi gibi çeşitli sinyallere cevap olarak birikmektedirler. Memeli hücrelerinde iki CDK inhibitör ailesi, farklı CDK/Siklin komplekslerinin düzenlenmesinde rol oynayan INK4/ARF ve Cip/ Kip aileleridir (Cooper ve Hausman, 2006).
1.4 Programlı Hücre Ölümü: Apoptoz
Apoptoz 1972 yılında Kerr ve arkadaşları tarafından ilk defa tanımlanmıştır. Eski bir yunan terimi olan apoptoz, kelime anlamı olarak yaprakların ağaçtan, petallerin çiçekten doğal olarak düşmesi anlamına gelmektedir. Bugün de bu terimin kullanımı uygundur ve fizyolojik nedenlerden kaynaklanan hücre ölümünü anlatır. Endonükleazların yol açtığı DNA kırıklarının jel elektroforezinde gösterilmesi ile apoptotik hücre ölümünün ilk biyokimyasal kanıtı elde edilmiştir (Richard ve diğ. 1983).
Apoptoz çok basamaklı programlanmış hücre ölüm yolağıdır. Bu yol reseptörler aracılığı ile ekstrinsik, mitokondrial yol ile intrensek olarak başlatılabilir. Hücre içi pro-apoptotik ve anti-apoptotik protein oranı apoptoz temelini oluşturur. Hücre ölümlerinin iki şekli vardır. Bunlar nekrozis ve apoptozisdir. Her ikisi de hücre ölümüne öncülük ederken, hücre morfolojik ve biyokimyasal olarak sıralı bazı reaksiyonların içine girer.
Nekrozis, hücre plazmasının yarılması ve hücre membranının parçalanması ile karakterizedir ve bu, akut inflamatuar cevaba neden olur. Nekroz, eş zamanlı gerçekleşen iki olaydan kaynaklanır (Cotran ve diğ. 2002). Bunlar hücrenin enzimatik sindirimi ve protein denatürasyonudur. Hücrenin enzimatik sindirimini iki şekilde gerçekleştirir. Birincisi hücrenin kendi enzimleri tarafından sindirimi (otoliz) ile ikincisi ise hücrenin lökositler tarafından sindirimi (heteroliz) ile gerçekleştirir.
22
Bunun tersine, apoptozis veya programlı hücre ölümü, hücre ölümlerinin fizyolojik formudur (Kosaval ve diğ. 2011).
Apoptozisin oluşmasının iki nedeni vardır. Birincisi apoptozis gelişim için gereklidir; örneğin mensturasyon başlangıcında endometriumun atılması, kastrasyon sonucu prostat atrofisi, beyinde nöronlar arası haberleşme için fazlalık hücrelerin ortadan kaldırılması apoptozisle olur. İkincisi ise apoptozis organizmayı tehdit eden yabancı etkenleri bulunduran hücrelerin yok edilmesi için gereklidir; örneğin virüsle enfekte hücreler, otoimmün hastalıklara yol açan immün sistem hücreleri, DNA’sı hasar görmüş hücreler ve kanser hücreleri apoptozisle ortadan kaldırılır (Kısmalı 2009; Yehhiely ve diğ. 2000).
Apoptozun çok hücreli organizmaların gelişiminde, fizyolojik ve patolojik koşullarda dokulardaki hücre popülasyonlarının düzenlenmesinde, ihtiyaç duyulmayan ya da hasar görmüş hücrelerin yok edilmesinde fonksiyonel olduğu bildirilmiştir (Saunders ve diğ. 1998; Fischer ve diğ. 2005). Bunun yanında düzenlenmesinde oluşan hatalar nedeni ile dokularda çok fazla apoptoz görülmesi ile felç, nörodejeneratif hastalıklar, bağışıklık sistemi bozuklukları gibi hastalıklar ve apoptozun sekteye uğraması ile de kanser görülmektedir.
Apoptotik süreçte kromatin kondenzasyonu, desmozomal bağlantı yıkımı, hücre yüzeyi spesifik yapı taşları kaybı ve diğer hücrelerle bağlantı özelliğinin kaybı önemli rol oynamaktadır (Igney ve diğ., 2002, McKnight ve diğ., 2005). DNA fragmantasyonu, mitokondrial porların açılması ve litik sürecin başlayarak ortamdaki fagositlerin içinde lizozomal yol ile hızlıca yıkılır. Bu süreçte hücre içeriği hücre dışı ortama salınmaz. Prostat kanserinde özellikle metastatik kanser hücrelerinin apoptoza dirençli olması progresif hastalığın temel bileşenlerinden birini oluşturur. Çalışmaların birçoğu kanser dokusunda apoptozun indüklenmesine yöneliktir. Buna paralel tedavi stratejilerinin geliştirilmesi tasarlanmaktadır.
Apoptoz normal veya benign hücrelerde hücre döngüsü ve büyümesinin fizyolojik bir parçasıdır. Tüm kanserlerde olduğu gibi prostat kanserinde de hücresel döngü düzenleyicilerinin oldukça önemlidir. Kanserlerde apoptozun düzenlenmesinde pro-apoptotik ve anti-apoptotik moleküller kilit rol oynar. Pro-apoptotik moleküllerden en önemlisi P53 proteinidir. P53 geni 17p13’de lokalizedir.
23
P53 DNA hasarında G1 fazı için gerekli olan genlerin transkripsiyonunu düzenler. P53 DNA hasarında hücre döngüsünü durdurur ve apoptoza gitmesini sağlar. Lokalize olmuş prostat kanserinde P53 mutasyonu %10 oranında görülürken, metastatik hastalıkta bu oran %50 dir. Apoptoz mekanizmasında bir diğer önemli molekül olarak bilinen proonkogen BCL-2 (B-hücreli lenfomada apoptozu inhibe eden proonkogen)dir. BCL-2 özellikle metastatik prostat kanserinde immuno-reaktivitesinin ve aşırı ekspresyonunda tümörlerde radyoterapiye olan direncin arttığı gösterilmiştir (Rosser CJ ve diğ., 2003).
Omurgalılarda apoptotik yolakta etkili olan proteinler kaspazlar olarak adlandırılmakta ve katalitik bölgelerinde sistein (c) rezidüsü taşıdıkları, hedef proteinleri C-uçlarında bulunan aspartat’dan (asp) kestikleri ve enzim (ase) görevi yaptıkları için kaspaz (caspase) olarak adlandırılmışlardır (Güneş, 2014).
1.4.1 Kaspazlar
İnsanlarda 15 farklı kaspaz belirlenmiştir (Güneş, 2010). Bu proteinler normal koşullarda hücrenin sitoplazmasında inaktif proenzim formunda bulunmaktadırlar. Bu inaktif proenzim formunda kaspazlara prokaspaz denilmektedir. Hücreye ölüm uyarısı geldiğinde proteolitik bir işlem ile prokaspazlar aktif kaspazlara dönüşmektedir. Aktif kaspaz formu oluştuktan yaklaşık bir saat içinde apoptoz gerçekleşmektedir (Shibue ve Taniguchi, 2006).
Apoptozun uyarılmasıyla, genomik DNA’nın 50-200 kb parçalar halinde kırılması, proteinlerin parçalanması, fosfotidilserinin hücre zarı iç yüzeyinden dış yüzeyine çıkması gibi değişiklikler proteolitik sistem tarafından gerçekleştirilir. Bu sistem içinde proteaz ailesi olarak bilinen kaspazlar, aktif merkezlerinde sistein aminoasiti içeren öncül enzim formunda bulunurlar (Chang ve diğ. 2000; Alnemri ve diğ. 1996). ). İçerdikleri sistein aminoasiti sayesinde substratlarına nükleofilik saldırılar yaparak, her aspartik asit kalıtından sonraki peptit bağlarının parçalanmasına neden olurlar (Alnemri ve diğ. 1996).
Öncül yapıdaki kaspazlar 3 bölgeye sahiptir ve tek zincirli bir polipeptid olarak sentezlenir. 17-22 kDa ağırlığında internal bölge (p20), 10-13 kDa ağırlığında
24
küçük katalitik alt ünite olarak isimlendirilen C terminal bölge (p10), merkezinde katalitik aktif bölge ve 3-24 kDa ağırlığında DD olarak adlandırılan NH2 terminal bölgelerini içermektedirler (Chowdhury ve diğ., 2008).
Kaspazlar 3 spesifik gruba ayrılmaktadır. Grup 1 kaspazlar (Kaspaz-1, 4, 5, 13) sitokinlerin maturasyonuna aracılık etmektedirler. Grup 2 kaspazlarda (Kaspaz-2, 3, 7) apoptozun asal efektörleri olarak bilinmektedirler. Grup 3 kaspazlar (Kaspaz-6, 8, 9, 10) grup 2 kaspazların aktivasyonunda görev almaktadır. Granzim-B de kaspazlara ek olarak başka bir proteazdır ve kaspaz aktivasyonunda görev alarak yada kaspazların yerine fonksiyon göstererek apoptotik sürece katkıda bulunmaktadır (Bok ve Small, 2002).
Başlatıcı Kaspazlar; bu gruba 2., 8., 9. ve 10. kaspazlar dahildir ve bu kaspazlar pro-apoptotik sinyali alarak, sinyalin alt kısmında kalan diğer kaspaz üyelerinin aktive olmasını sağlarlar. Her biri 100 aminoasitten oluşan başlatıcı kaspazlar, transmembran reseptörleri veya sitotoksik etkiye sahip maddeler ile etkileşerek aktif hale geçerler (Krauss, 2001). Bu kaspazlar, adaptör ve düzenleyici proteinlerin farklı kombinasyonları ile etkileşime girerek apoptotik mekanizmanın hücre içerisinde farklı yönlerde devam etmesine neden olurlar. Kaspaz 2’nin aktivasyonu için ölüm bölgesi içeren PIDD (ölüm bölgesi içeren P53 uyarıcı protein) ve adaptör protein olarak da RAIDD’ (ölüm bölgesi içeren RIP-ile ilgili protein) nın gerekli olduğu yakın zamanlarda tespit edilmiştir (Zheng ve diğ. 2000).
Effektör Kaspazlar; bu gruba 3., 6. ve 7. kaspazlar dahildir ve bu kaspazlar çeşitli hücre içi proteinleri enzimatik reaksiyonlarla parçalarlar ve apoptotik hücre morfolojisinin meydana gelmesine neden olurlar. Bazı effektör kaspazların bulunuş sebebi tam olarak anlaşılamamıştır (Zheng ve diğ. 2000).
Sitokinleri Aktive Eden Kaspazlar; hücre sinyal iletiminde önemli role sahip sitokinlerin aktivasyonları için gereklidir. Bu gruba dahil olan kaspaz-1, interlökin-1 dönüştürücü enzim (ICE) olarak bilinmekte ve öncül interlökin-1’in aktif hale geçmesine neden olmaktadır (Thornberry ve diğ. 1992).
25 1.4.2 Kaspazların Aktivasyonu
Öncül kaspazın yapısında bulunan öncül-bölge yapıdan ayrılır ve heterodimer bir yapı geride kalır. Bu şekilde oluşan iki heterodimer yapı birleşip iki aktif bölgeyi bulunduran tetramer aktif kaspazı oluşturur. Prokaspaz-3, 6 ve 7’ nin aktivasyonlarında oluştuğu gibi bütün kaspazlar kaspaz kaskatı oluşturulmasıyla aktif hale gelir. Prokaspazın aktif kaspaz formuna dönüşebilmesi için düzenleyici bir alt ünitenin aktifleştirmesiyle gerçekleşir. Örneğin; prokaspaz-9’un aktif hale gelebilmesi için Apaf-1’in sitokrom c ile birleşmesi ve sonra prokaspaz-9’un bu birleşmeyle etkileşerek aktif yapıya geçebilmektedir (Elmore, 2007; Krauss, 2011).
1.4.3 Mitokondri/ SitokromC Aracılı Hücre Ölümü (İntrinsik Yolak)
İntrinsik yolakta, mitokondriler merkezi rol oynarlar. Mitokondri, apoptozis için gerekli olan enerjiyi üretir ve sitokrom-c, endonükleaz G ve AIF (Apoptozis Inducing Factor) gibi proapoptotik proteinlerin salınmasını sağlar. Sitorkom-c’nin mitokondriden salınımı, Apaf-1 (Apoptotic protease activating factor-1) aracılığıyla kaspaz-9’ un aktifleşmesine neden olur(Zou ve diğ., 1999). İntrinsik yolak, BCL-2 protein ailesi üyeleri tarafından kontrol edilir. Bu protein ailesi, BH (BCL-2 homology) domeinleri diye bilinen 4 korunmuş bölgeyi paylaşan proapoptotik ve antiapoptotik proteinlerden oluşur(Adams ve Cory, 1998).
26
Şekil 8. Antiapoptotik ve proapoptotik proteinlerde “BCL-2 Homology” (https://www.researchgate.net/figure/Bcl-2-family-members-Another-representation-of-the-three-different-subfamilies-of-Bcl-2_fig3_30002134).
BCL-2 ve BCL-XL gibi antiapoptotik üyeler bu 4 BH domeinini de içerir ve proapoptotik BCL-2 ailesi proteinlerinin fonksiyonlarını inhibe ederek hücrenin yaşamını sürdürmesini sağlarlar, hücreyi çok çeşitli apoptotik uyarılara karşı korurlar(Motoyama ve diğ., 1995; Nakayama ve diğ., 1993; Opferman ve diğ., 2003; Veis ve diğ., 1993). Şaşırtıcı olarak, bazı durumlarda, BCL-2 ve BCL-XL kaspazların hedefi olur ve bu proteinlerin yıkımı, mitokondriden sitokrom-c salınımını indükleyerek proapoptotik moleküllere dönüşmelerine neden olur(Cheng ve diğ., 1997; Clem ve diğ., 1998).
Bu hücre ölüm yolağı dışarıdan gelen uyartılara (FAS, TNF) duyarlı değildir. DNA hasarı ve oksidatif stres gibi hücre içinden gelen uyartı, apoptozun intrinsik yolağını mitokondrinin dış membranına etki eden BCL-2 ailesi proteinleri aracılığıyla indüklemektedir (Schultz ve Harrington, 2003).
BCL-2 transmembran bir bölgeye sahiptir ve mitokondri dış zarı, nükleus zarı ve endoplazmik retikulum zarında yer almaktadır. BCL-2 her ne kadar apoptozu baskılıyor ise de bu protein ile ilişkili bazı diğer proteinler apoptozu
27
desteklemektedir. Bu proteinlerden biri de BAX’ tır. Sağlıklı hücrelerde mitokondrinin zarlar arasında yer alan sitokrom c’nin sitozole geçmesi apoptozu başlatmaktadır. Anti-apoptotik olan BCL-2 sitokrom c’nin sitozole geçişini engellerken pro-apoptotik olan BAX, sitokrom c’nin sitozole geçişine katkıda bulunmaktadır. Sitokrom c, APAF-1 (Apoptotik proteaz aktive edici faktör 1)‟a bağlanır (Güneş, 2014). Sitokrom c, APAF-1 ve prokaspaz-9 apoptozomu oluşturur. Prokaspaz-9 apoptozom içinde aktif formuna dönüşür ve kaspaz-9, bu yolağın başlangıç kaspazıdır. Kaspaz-9, kaspaz-3, kaspaz-6, kaspaz-7 olmak üzere diğer 3 kaspazı aktive ederek apoptotik süreci tetikler (Igney ve diğ., 2002; McKnight ve diğ., 2005).
1.4.4 Ölüm Sinyalleri Aracılığı İle Hücre Ölümü (Ekstrinsik Yolak) Ekstrensek yolağa, ölüm reseptörleri aracılık eder. Bu reseptörler apoptozisde çok önemli rol oynarlar ve ligandlar ile saniyeler içinde bağlanarak kaspaz kaskadının aktifleşmesini sağlarlar. Bu nedenle apoptozisin bu yolağı çok hızlı gerçekleşmektedir (Dipal, 2012).
Hücre ölümü, yaşam sinyalleri yokluğunda ortaya çıkıyorsa da, ölüm sinyalleri varlığında da ortaya çıkmaktadır. FAS ligand gibi bir ölüm faktörü ve ya tümör nekroz faktörü (TNF) sırası ile FAS reseptörü ve TNF reseptörü gibi transmembran ölüm reseptörü tarafından kabul edilir. FAS ligandı komşu hücrelerin plazma membranına bağlıdır. Ligand ölüm reseptörlerine bağlandığı zaman yapısal bir değişiklik meydana gelir ve birkaç reseptör bir araya gelir, oligomerizasyon gerçekleşir. Böylelikle hücre dışından gelen moleküllerin bağlanmasıyla kaspaz-8‟i aktive eden sinyaller yayılır (Khosravi-Far ve Esposti, 2004). Başlatıcı kaspaz olarak görev alan kaspaz-8 diğer kaspazları (kaspaz-3, 6, 7) aktive eder ve apoptoz gerçekleşir.
Hücre zarının dış yüzeyinde yerleşmiş bulunan reseptörlere hücre dışından gelen ölüm uyarısı bağlanır. Reseptörlerin sitoplazmada kalan kısımları bir araya gelir ve hücre ölümü için aracı proteinlere bağlanırlar. Pro-kaspazların proteolitik fonksiyonlarını kısıtlayan bölgeleri kesilerek aktif kaspazlara dönüşürler. Hücre yüzeyinde yerleşik bulunan reseptörler TNF (tümör nekroz faktörleri ) süper gen
