Kitosan ve antimikrobiyal aktivitesi
‹stanbul Üniversitesi Veteriner Fakültesi Besin Hijyeni ve Teknolojisi Anabilim Dal›, ‹stanbul
Kamil Bostan, Tuba Aldemir, Ali Ayd›n
ÖZET
Kimyasal koruyucu madde içermeyen g›da maddelerine olan talep yeni do¤al katk› maddelerinin araflt›r›lmas›n› teflvik etmifltir. Bunlardan birisi olan kitosan, çok genifl bir uygulama alan› olmas› nedeniyle son zamanlarda ilgi oda¤› haline gelmifltir. Kitosan, kitinden deasetilasyon yoluyla elde edilir. Bir aminopolisakkarit olan kitin ise kabuklu deniz ürünlerinin kabuklar›nda bulunur. Kitosan sindirim yoluyla al›nd›¤›nda bitkisel diyetetik lifler gibi ifllev görebilir. G›da endüstrisinde ise baflta g›da maddelerinin kalitesinin ve raf ömrünün art›r›lmas› olmak üzere çeflitli uygulama alanlar›na sahiptir. G›da maddelerinin raf ömrünün uzat›lmas›nda kitosan›n antimikrobiyal etkisinin önemli bir rolü vard›r. Yap›lan çal›flmalarda kitosan›n ço¤u mikroorganizman›n geliflimini inhibe etti¤i ortaya konmufltur. Bu makalede kitosan›n antimikrobiyal etkisi ve çeflitli g›da uygulamalar› özetlenmifltir.
Anahtar kelimeler:Antimikrobiyal aktivite, kabuklu deniz ürünleri, kitosan SUMMARY
The growing consumer demand for foods without chemical preservatives has focused efforts in the discovery of new natural additivies. Chitosan, which is one of these, have been of interest in the past few decades due to their potential broad range of industrial applications. Chitosan is obtained from chitin by a deacetylation process. Chitin is an aminopolysaccharide that comes from the shells of shellfish. Deacetylated chitin, or chitosan, is comprised of chains of D-glucosamine. When ingested, chitosan can be considered a dietary fibre. These biopolymers offer a wide range of unique applications such as enhancing of quality and storability of foodstuffs. The antimicrobial activity of chitosan has an important role in increasing of shelf-life of foods. Various studies showed that chitosan prevents microbial activity, targeting the different groups of microorganisms such as bacteria, fungi and yeasts This review summarizes the antimicrobial activity and food applications of chitosan. Key words :Antimicrobial activity, chitosan, shellfish
G‹R‹fi
G›da katk› maddeleri genel anlamda tek bafl›na g›da olmayan, g›da maddesinin yap›s›nda do¤al olarak bulunmayan ancak g›dalara üretim, iflleme, depolama veya ambalajlama gibi aflamalarda g›-da maddesinin tat, koku, görünüm, yap› ve di¤er niteliklerini düzeltmek, kalitesini uzun süre mu-hafaza etmek, besleyici de¤erini korumak, raf ömrünü art›rmak, güvenli hale getirmek gibi amaçlarla kat›lan madde veya madde kar›fl›mlar›-d›r. G›da üreticileri bu ve benzeri amaçlarla izin verilen, baz› hallerde izin verilmeyen oranlarda ve çeflitlilikte katk› maddesi kullanmaktad›rlar. Gerçekten de katk› maddesi kullan›lmas› duru-munda ürünün istenen özelliklerinde önemli
dü-zeyde iyileflme sa¤lanmakta, raf ömründe belirgin bir art›fl elde edilmektedir. Bu sayede ürünün pi-yasadaki rekabet flans› artmakta ve bozulmalardan dolay› ekonomik kay›plar azalmaktad›r. Di¤er ta-raftan katk› maddesi kullan›larak düflük kaliteli hammaddelerden ürün üretmek söz konusu oldu-¤undan tüketicinin aldat›lmas›na; daha da önem-lisi izin verilen limitlerin üzerinde veya izinsiz kullan›mlarda tüketicini sa¤l›¤›n›n bozulmas›na yol aç›labilmektedir. Özellikle yapay nitelik tafl›-yan katk› maddelerinin baz›lar›n›n sonradan tafl›-yan etkileri belirlendi¤inden izin verilen kullan›m miktarlar› azalt›lm›fl veya kullan›m› yasaklanm›fl-t›r. Bu nedenlerle son y›llarda g›da üretiminde yapay yerine toksik olmad›¤› bilinen do¤al
kay-Chitosan and its antimicrobial activity
‹letiflim / Correspondence: Kamil Bostan Adres / Address: ‹stanbul Üniversitesi Veteriner Fakültesi, Besin Hijyeni ve Teknolojisi Anabilim Dal›, 34320, Avc›lar, ‹stanbul Tel: 0212 473 70 70/17185 Fax: 0212 473 72 41 E-mail: bostank@istanbul.edu.tr
naklardan elde edilmifl katk› maddeleri tercih edilmekte ve her geçen bunlara yenileri eklen-mektedir. G›da katk› maddeleri aras›nda antimik-robiyal etkili olanlar ayr› bir öneme sahiptir. Do-¤al antimikrobiyal maddelerle ilgili ilk çal›flmalar sar›msak, k›rm›z› biber, kekik, tarç›n, karanfil vb belli bitki ekstraktlar› ile gerçeklefltirilmifltir. Bun-lar›n ço¤uyla ilgili laboratuvar koflulBun-lar›nda bafla-r›l› sonuçlar al›nm›flt›r. Ancak bunlar›n kat›ld›k-lar› g›da maddelerinde laboratuar flartkat›ld›k-lar›ndaki ka-dar etkili olmamalar›, fazla miktarlarda kat›ld›k-lar›nda ise g›da maddelerinde istenmeyen lezzet ve aroma oluflumlar›na sebep olmalar› gibi çeflit-li olumsuzluklar› tespit edildi¤inden kullan›mlar› s›n›rl› kalm›flt›r. Yeni nesil katk› maddeleri ara-s›nda yer alan kitosan, günümüzde üzerinde arafl-t›rmalar yap›lan önemli bir katk› maddesi olmufl-tur. Bakteri, mantar ve maya gibi farkl› mikro-organizma gruplar›na karfl› antimikrobiyal etkiye sahip olmas› ve di¤er birçok fonksiyonel özellik-leri nedeniyle dikkat çekmifl ve g›da endüstrisin-de kullan›lmaya bafllanm›flt›r (1).
Kitosan›n tan›m›, özellikleri ve kullan›m alanlar› Kitosan, yengeç ve karides gibi kabuklu deniz ürünlerinin d›fl iskeletlerinde, kelebeklerin kanat-lar›nda, mantarlar›n hücre duvarlar›nda vb bulu-nan do¤al bir polisakkarit olan kitin'den k›smi deasetilasyon yoluyla elde edilen, reaktif fonksi-yonel amino gruplar›na sahip; kimyasal yap› ola-rak seluloza benzeyen ve do¤ada selulozdan son-ra en s›k son-rastlanan biyopolimerdir (2, 3). Kitosan üretiminde kullan›lacak su ürünlerinin kabuklar› öncelikle kum ve di¤er yabanc› mad-delerinden iyice y›kanmak suretiyle ar›nd›r›l›r. Daha sonra kabuk üzerinde kalm›fl doku kal›nt›-lar›n›n uzaklaflt›r›lmas› için deproteinizasyon iflle-mi uygulan›r. Bu amaçla kabuklar % 3 NaOH ile 30 dakika kadar kaynat›l›r; süre sonunda so-¤utulur ve hiçbir alkali kal›nt›s› kalmayacak fle-kilde su ile iyice durulan›r. Bir sonraki ifllem de-minerilizasyon olup kabuklar›n 30 dakika sürey-le % 3 HCl isürey-le muamesürey-le edilmesinden ibarettir. Bu ifllemi takiben kabuklar iyice y›kan›r ve
ar-d›ndan su oran› % 6'›n alt›na düflecek flekilde preslenir. Bu flekilde kitin elde edilmifl olur. Ki-tin, as›l ifllem olan deasetilasyon amac›yla kostik soda içinde 90-95°C' de 1.5 saat kadar ›s›t›l›r; süzdürülür ve sonradan alkali kalmayacak flekil-de iyice y›kan›r. Fazla su preslenerek uzaklaflt›-r›l›r. Bu aflamada kitosan›n yafl formu elde edil-mifl olur. Yafl kitosan nem oran› % 5'in alt›nda olacak flekilde güneflte kurutulur veya bir kuru-tucu içinde bekletilir. ‹nce tabakalar halinde elde edilen kitosan toz haline getirilir ve paketlenir. Kuru ortamda 3 ay kadar saklan›r. 1000 gram kuru kabuktan yaklafl›k 140 gram kitin (% 14), 100 gram kitosan (% 10) elde edilebilmektedir. Ticari olarak pazarlanan kitosanlar›n asetilasyon derecesi % 70' in üzerinde olup molekül a¤›rl›k-lar› 100 000 ile 1.2 million Da aras›nda de¤ifl-mektedir (3, 4).
Bir polisakkarit olan kitin kimyasal olarak 2-aset-amido-2-deoksi-ß-D-glukoz (N-asetil glukoza-min)'dan oluflmaktad›r. Kitinin düflük derecede deasetilasyonu yoluyla elde edilen kitosan ise (1→4)-2-amino-2-deoksi-D-glukoz (glukozamin) olarak bilinmektedir. Kitosan, 3 çeflit reaktif fonksiyonel gruba sahiptir. C-2, C-3 ve C-6 po-zisyonlar›nda birinci ve ikinci hidroksil gruplar›n-da birer amino grubu bulunmaktad›r (3). Beyaz renkte, kokusuz ve tats›z, yar› fleffaf par-tikül veya toz halinde bir madde olan kitosan sindirim enzimlerine dayan›kl›d›r. Buna karfl›n baz› bakteriler taraf›ndan parçalan›r. Suda çözün-mez. Sadece asidik çözücülerde (<6.0 pH) çözü-nür. Çözündürmek için asetik, formik, laktik gi-bi organik asitler kullan›l›r. ‹norganik asitlerde çözünme s›n›rl›d›r (% 1 hidroklorik asitte çözü-nür; sülfirik ve fosforik asitte asitte çözünmez). Kitosan solüsyonlar›n›n pH 7.0 ve üzerinde sta-bilitesi bozulur. Ayn› flekilde oda s›cakl›¤›nda uzun süre muhafaza kitosan solüsyonlar›n›n sta-bilitesini olumsuz etkilemektedir (5).
Kitosan, çöktürme, nem tutma, film oluflturma, antimikrobiyal etki, enzim immobilizasyonu gibi çok çeflitli fonksiyonlar› nedeniyle ilaç, kozmetik,
t›p, tar›m gibi çeflitli endüstrilerde s›n›rs›z kulla-n›m alanlar›na sahiptir. Kitosan›n bu fonksiyon-lar›nda pozitif iyonik tabiata sahip olmas›n›n önemli bir rolü vard›r. Benzer fonksiyonlar› ne-deniyle g›da endüstrisinde de kitosandan yararla-n›lmaktad›r. Kitosan son y›llarda ad›ndan s›kça bahsedilen diyetetik yard›mc› maddeler aras›nda yer almaktad›r. Sindirim enzimleri taraf›ndan hid-rolize edilememesi, yüksek viskozitesi, jel olufl-turma ve yüksek su ba¤lama yetene¤i vb neden-lerle bitkisel diyetetik liflere benzerlik göstermek-tedir ve canl› organizmada benzer etkiler olufltur-maktad›r. Ba¤›rsak hareketlerinin ve sindirim fa-aliyetlerinin düzenlenmesi, ba¤›rsak mikrofloras›-n›n (bifidobakterilerin) desteklenmesi, kan koles-terol seviyesinin düzenlenmesi (LDL kolestrolün düflürülmesi, HDL kolestrolün art›r›lmas›), kan bas›nc›n›n düflürülmesi, karaci¤er fonksiyonlar›n›n düzenlenmesi gibi fonksiyonel etkilerinin yan› s›-ra sindirim yoluyla al›nd›¤›nda ya¤ emilimini azaltarak (pozitif yüklü bir bileflik olmas›ndan dolay› negatif yüklü olan ya¤ asitlerine ba¤lana-rak) kilo kayb›n› desteklemesi oldukça ilgi çek-mifltir (6-10).
Japonya'da ve Avrupa'da ticari olarak üretilen ki-tosan uzun y›llard›r bu amaçla pazara sunulmak-tad›r. Tafl›d›klar› güçlü pozitif yüklerden dolay› kitosan›n uzun zincirli moleküllerinin s›v›lardaki kat› partikülleri sararak çöktürmesi özelli¤i nede-niyle flarap, meyve suyu, bira gibi içeceklerde bulan›kl›¤› gidermek için etkili bir ajan olarak görev yapabilmektedir (11, 12).
Ayn› özelli¤i nedeniyle at›k sular›n ar›t›lmas›nda polikatyonik bir çöktürücü olarak da ifllev gör-mektedir. Özellikle g›da iflletmelerindeki at›k su-lardan proteinlerin, ya¤lar›n ve metal iyonlar›n›n ar›t›lmas›nda oldukça etkili olabilmek edir (13). Ancak kitosan›n g›da teknolojisindeki en önemli kullan›m flekli film halinde bilhassa sebze ve meyvelerin kalitelerinin korunmas› ve depolama süresinin art›r›lmas› olmufltur. Yar› geçirgen özel-likteki kitosan filminin sert, dayan›kl›, esnek ve kolayca y›rt›lmayan bir materyal olmas› önemli
avantajlar› olarak de¤erlendirilmektedir ve bu özellikleri ço¤u ticari polimerle karfl›laflt›r›labilir niteliktedir. G›dalar›n kitosan filmi ile kaplanma-s› ambalaj içindeki k›smi oksijen bakaplanma-s›nc›n›n azalt-makta, g›da ile çevresi aras›ndaki nem transferi ile s›cakl›¤› kontrol alt›nda tutmakta; su kayb›n› azaltmakta, meyvelerde enzimatik kahverengilefl-meyi geciktirmekte, solunumu kontrol etmekte; meyvelerde olgunlaflmay› geciktirmekte vb etkiler göstermekte ir (14-16).
Bunlara ilave olarak do¤al aroman›n artt›r›lmas›, tekstürün ayarlanmas›, emülsifiye edici etkinin ar-t›r›lmas›, rengin stabilizasyonu, deasidifikasyon gi-bi konularda da kitosandan yararlan›lmaktad›r (1). Kitosan›n antimikrobiyal aktivitesi
G›da maddelerinin muhafazas› ve raf ömrünün art›r›lmas›nda da bir alternatif olarak kitosandan yararlan›labilece¤i çeflitli kaynaklarda yer alm›fl-t›r. Burada en önemli etki kitosan›n antimikrobi-yal aktivite göstermesinden ileri gelmektedir. Bu etkinin mekanizmas› tam olarak bilinmemekle birlikte pozitif yüklü kitosan moleküllerinin nega-tif yüklü hücre membran›na ba¤lanarak fonksiyo-nunu bozmas›; intrasellüler içeri¤in d›flar› s›zma-s›n› teflvik etmesi ve ayn› zamanda besin ele-mentlerinin hücreye transportunun inhibe edilme-si; flelat yap›c› bir ajan olarak rol oynayarak iz elementlere ba¤lanmas› ve bu suretle mikrobiyel geliflme ile toksin üretiminin inhibe edilmesi; su-yu ba¤layarak enzimleri inhibe etmesi; DNA ile ba¤lanmas› ve mRNA sentezini engelleyerek üre-menin durdurulmas› gibi çeflitli teoriler ileri sü-rülmüfltür (1, 4, 17-20). Muzzarelli ve ark. (21) kitosana (N-Carboxybutyl) maruz b›rak›lan mik-roorganizmalarda belirgin morfolojik de¤iflimlerin gözlendi¤ini bildirmifllerdir. Helander ve ark. (19) da elektron mikroskobu ile yapt›¤› incelemede ki-tosan›n hücrenin d›fl membran›n› a¤ gibi sard›¤›-n› ve hücrenin d›fl yüzeyinde hasarlar oluflturdu-¤unu gözlemlemifllerdir. Kitosan›n antimikrobiyal etkinli¤i molekül a¤›rl›¤›, asetilasyon derecesi, s›-cakl›k, pH gibi faktörlerden az veya çok etkilen-mektedir (4, 19, 20, 22-30).
Kitosan›n patojen mikroorganizmalar üzerine et-kisi çeflitli araflt›r›c›lar taraf›ndan ele al›nm›flt›r. Wang (30), yapt›klar› in vitro çal›flmada kitosa-n›n %1-1,5 gibi yüksek konsantrasyonlarda Staphylococcus aureus, % 0,5-1 konsantrasyon-larda Escherichia coli üzerinde tam inhibisyon oluflturdu¤unu bildirmifltir. Zheng ve Zhu (31) kullan›lan kitosan›n molekül a¤›rl›¤› artt›kça Gram pozitif bir bakteri olan S. aureus üzerinde antimikrobiyal etkisinin artt›¤›n›; bunun sebebinin de yüksek molekül a¤›rl›¤›na sahip kitosan›n film tabakas› oluflturarak bakterinin besin almas›n› en-gellemesi oldu¤unu ileri sürmüfllerdir. Ayn› arafl-t›r›c›lar tam tersine molekül a¤›rl›¤› azald›kça Gram negatif bir bakteri olan E. coli için anti-mikrobiyal etkisinin artt›¤›n› ve bunun da düflük molekül a¤›rl›¤›na sahip kitosan›n hücre duvar›n-dan daha kolay geçerek hücre metabolizmas›n› bozmas›ndan ileri geldi¤ini iddia etmifllerdir. Ay-r›ca kitosan konsantrasyonu artt›kça antimikrobi-yal etkinin kuvvetlendi¤ini; % 1.0 konsantrasyo-nunda hem E. coli hem de S. aureus için % 100 inhibisyon oluflturdu¤unu rapor etmifllerdir. Buna karfl›n Darmadji ve Izumimoto (32) E. coli'nin üremesini durdurmak için daha yüksek konsan-trasyonlara gerek duyuldu¤unu rapor etmifltir. Ju-maa ve ark. (24) iki farkl› tip kitosan›n (Tip I: molekül a¤›rl›k 8.7x104 g/mol, deasetilasyon de-recesi % 92 ve viskozite 14 mPa; Tip II: mole-kül a¤›rl›k 5.32x105 g/mol, deasetilasyon derece-si % 73 ve viskozite 461 mPa) antimikrobiyal aktivitesini karfl›laflt›rm›fl ve düflük molekül a¤›r-l›kl›, düflük viskoziteli ve yüksek deasetilasyon derecesine sahip olan›n daha etkili oldu¤unu tes-pit etmifllerdir. Jeon ve ark. (23) da kitosan›n molekül a¤›rl›¤›n›n bakterilerin inhibisyonunda önemli bir faktör oldu¤unu, etkili bir inhibisyon için molekül a¤›rl›¤›n›n 10.000 Da ve üzerinde olmas› gerekti¤ini ileri sürmüfllerdir. Tsa-i ve ark. (29) da pH de¤erTsa-i 6.0 olan bTsa-ir ortam-da yapt›klar› çal›flmaortam-da kitosan›n deasetilasyon derecesi artt›kça antimikrobiyal aktivitenin de art-t›¤›n› bildirmifllerdir. Gerasimenko ve ark. (22), düflük molekül a¤›rl›¤›na sahip % 85
deasetilas-yon dereceli, düflük molekül a¤›rl›kl› kitosanlar›n S. aureus ve E. coli gibi hem Gram pozitif hem de Gram negatif bakterilerin üremelerini bask›la-d›klar›n› saptam›fllard›r. Devlieghere ve ark. (33) ise 43 kDa molekül a¤›rl›kl› ve % 94 deaseti-lasyon dereceli kitosana karfl› çal›flt›klar› bakteri-ler aras›nda Gram negatif olanlar›n daha duyarl› oldu¤unu, Gram pozitif olan bakterilerin de¤iflen derecelerde duyarl›l›k gösterdiklerini gözlemlemifl-lerdir. Omura ve ark. (34) ise Gram pozitif olan-lar için minimum inhibe edici kitosan konsantras-yonunun Gram negatif olanlardan daha düflük ol-du¤unu bildirmifllerdir. Benzer flekilde Jeon ve ark. (23) taraf›ndan Gram negatif ile karfl›laflt›r›l-d›¤›nda kitosan›n Gram pozitif olanlara karfl› da-ha etkili inhibisyon oluflturdu¤u bildirilmifl; E. co-li, E. coli O 157, Salmonella typhi, S. aureus, Ba-cillus sublitis gibi ço¤u bakteriler için Minimum ‹nhibitör Konsantrasyon (M‹K) de¤erleri % 0.1'in alt›nda bulunmufl, ayn› de¤er Pseudomanas aeru-ginosa için % 0.25 olarak belirlenmifltir. No ve ark. (26) farkl› molekül a¤›rl›kl› kitosanlar›n an-timikrobiyal etkinli¤ini dört Gram negatif bakte-ri (Eschebakte-richia coli, Pseudomonas fluorescens, S. typhimurium ve Vibrio parahaemolyticus) ve yedi Gram pozitif bakteri için (Listeria monocytogenes, Bacillus megaterium, B. cereus, S. aureus, Lactoba-cillus plantarum, L. brevis ve L. bulgaricus) araflt›r-m›fllard›r. Bu çal›flmada kitosan›n test edilen bak-terilerin ço¤unun üremesini engelledi¤i, % 0.1 konsantrasyonunda Gram pozitif olanlara karfl› Gram negatif olanlar›n daha güçlü bakterisidal et-ki gösterdi¤i rapor edilmifltir. Choi ve ark. (35) a¤›z patojenleri üzerinde yapt›klar› çal›flmada % 0.1'lik kitosan konsantrasyonunun Actinobacillus actinomycetemcomitans say›s›nda 120 dakikada 4.5 log kob/ml; Streptococcus mutans say›s›nda 0.5 log kob/ml düzeyinde azalmaya neden oldu-¤unu saptam›fllard›r. No ve ark. (26) çözücü ola-rak asetik asit (% 1) kullan›ld›¤›nda laktik asit bakterileri hariç test edilen bakterilerin ço¤unun üremesinin inhibe edildi¤ini, laktik asit bakterile-rinin çözücü olarak laktik asit veya formik asit kullan›ld›¤›nda bask›land›¤›n› bildirmifllerdir.
Ay-n› araflt›r›c›lar kitosaAy-n›n etkinli¤ini pH 4.5-5.9 aras›nda da test etmifller ve daha düflük pH de-¤erinde daha yüksek aktivite saptam›fllard›r. Ju-maa ve ark. (24) da kitosan›n antimikrobiyal ak-tivitesinin P. aeruginosa için pH 5.0-5.1'de S. au-reus için pH 5.3'de optimum oldu¤unu bildirmifl-lerdir. Azalan pH ile kitosan›n antimikrobiyal ak-tivetisinin artmas›n›n pH 6.0 ve alt›nda alt›nda kitosan›n amino gruplar›n›n iyonize olmas› ve po-zitif yük tafl›mas›yla iliflkisi vard›r (25). Pranoto ve ark. (36) ise de¤iflik koruyucu made-lerle kombine ederek haz›rlad›klar› kitosan film-lerinin antimikrobiyal etkinli¤ini E. coli, S. aureus, S. typhimurium, L. monocytogenes ve B. cereus üzerinde araflt›rm›fllar ve 100 mg/g seviyesinde sar›msak ya¤›, 100 mg/g seviyesinde potasyum sorbat ve 51,000 IU/g seviyesinde nisin ile ka-r›flt›r›larak haz›rlanan kitosan filmlerinin antimik-robiyal etkinli¤inin filmlerin fiziksel özelli¤inde bir de¤iflik olmaks›z›n artt›¤›n› bildirmifllerdir. Benzer bir çal›flmada, Lee ve ark. (37) antimik-robiyal ajan içeren ambalaj materyalinin süt ve portakal suyunun mikrobiyolojik kalitesi üzerine etkisini incelemifllerdir. Bu amaçla karton amba-laj malzemesi antimikrobiyal ajan olarak nisin ve/veya kitosan içeren vinyl acetate ethylene cop-lomier ile kaplanm›flt›r. Daha sonra taze s›k›lm›fl portakal suyu ile pastörize süt örnekleri karton ambalaj materyali ile temas edecek flekilde cam kaplar içine al›nm›fl ve farkl› s›cakl›klarda muha-faza edilmifltir. Muhamuha-faza periyodu s›ras›nda ya-p›lan analizler sonucunda düflük s›cakl›klarda (3ºC ve 10ºC) saklanan ürünlerde mikrobiyal üremenin önemli derecede bask›land›¤›n›; buna karfl›n 20ºC'de saklanan ürünlerde önemli bir fark olmad›¤›n› gözlemlemifllerdir. Araflt›r›c›lar nisin ile kitosan›n birlikte kullan›lmas› durumunda ise mikrobiyel inhibisyon aç›s›ndan daha iyi netice al›nd›¤›n› rapor etmifllerdir.
Bakteriler kadar küf ve mayalar da kitosandan et-kilenmektedir. Ço¤u küf türlerinin % 1.0'›n alt›n-daki kitosana hassas olduklar›, buna karfl›l›k As-pergillus flavus gibi türlerin ise %1'in üstünde
konsantrasyonlarda bile kitosana karfl› dirençli ol-duklar› rapor edilmifltir (4). Fang ve ark. (38) ise ortama (pH 5.4) 0.1-5 mg/ml. kitosan ilavesinin Aspergillus niger'in üremesini durdurdu¤u; fakat 2 mg/ml'den daha düflük konsantrasyonlarda A. fla-vus'un üremesini ve aflatoksin üretimini inhibe etmede etkisiz oldu¤u sonucuna varm›fllard›r. Cuero ve ark. (18) da kitosan›n (N-carboxy-methyl) A. flavus ve A. parasiticus üremesini ya-r› yaya-r›ya; bu küflerin toksin üretimini ise % 90'›n üzerinde bir oranda azaltt›¤›n› rapor etmifllerdir. Park ve ark. (39) da kitosan›n küfler (Cladospo-rium sp. ve Rhizopus sp.) üzerine etkisini hem çileklerde hem de in vitro olarak araflt›rm›fllard›r. Yap›lan çal›flmada kitosan (% 2) ile kaplaman›n küf üremesini kontrol alt›nda tuttu¤unu ve bu ne-denle meyvelerin raf ömrünü art›rmak için kulla-n›labilece¤ini; kitosan ile potasyum sorbat (% 0.3) beraber kullan›ld›¤›nda in vitro testlerde kombine bir inhibisyon aktivitesi görülmesine ra¤men taze çileklerde böyle bir etkinin görülme-di¤ini; kitosan uygulamas›n›n sadece küf üremesini de¤il depolama s›ras›nda aerop mezo-fil toplam bakteri ve koliform say›s›n› da azalt-t›¤›n› bildirmifllerdir. Tsai ve ark. (29) kitosan›n mantarlar üzerine etkisinin bakterilerden daha dü-flük oldu¤unu; yüksek deasetilasyon dereceli ki-tosan›n minimal letal konsantrasyonunun B. cere-us, E. coli, Listeria monocytogenes, P. aeruginosa, Shigella dysenteriae, S. aureus, Vibrio cholerae, ve V. parahaemolyticus gibi bakteriler için 50-200 ppm iken Candida albicans ve Fusarium oxyspo-rum için s›ras›yla 200 ppm. ve 500 ppm olarak belirlendi¤ini, buna karfl›n 2000 ppm konsantras-yonunda bile Aspergillus fumigatus ve A. parasi-ticus'a karfl› antifungal aktivitenin görülmedi¤ini rapor etmifllerdir. Roller ve Covill (40) kitosan›n g›da bozulmalar›ndan sorumlu 7 küf türüne kar-fl› antimikrobiyal özelli¤ini besi ortam›nda arafl-t›rm›fllard›r. Yap›lan bu çal›flmada 1 g/l konsan-trasyonundaki kitosan›n Mucor racemosus üremesini yavafllatt›¤›; 5 g/l'lik konsantrasyonun Byssochlamys üremesini tamamen engelledi¤i, bu-na karfl›n baz› flementöz küf türlerinin 10 g/l
konsantrasyonunda bile kitosana karfl› dayan›kl› oldu¤u tespit edilmifltir. Ayn› çal›flmada kitosan›n elma suyundaki mayalara karfl› etkisi de incelen-mifltir. Elma suyundaki kitosan (0.1-5 g/l) varl›-¤›n›n 25°C'de incelenen bozulma yap›c› maya türlerinin hepsinin üremesini inhibe etti¤i; incele-nen mayalar aras›nda en duyarl›s›n›n Zygosacc-haromyces bailii en dayan›kl›s›n›n Saccharomyco-des ludwigii oldu¤u rapor edilmifltir. Buna karfl›n Sagoo ve ark. (41) kitosan›n mayalar üzerine et-kisini araflt›rd›klar› çal›flmalar›nda % 0.05 konsan-trasyonunda Saccharomycodes ludwigii say›s›nda önemli redüksiyon sa¤lad›¤›n›; Torulaspora del-brueckii'nin ise test edilen en yüksek konsantras-yona (% 0.5) dayan›kl› oldu¤unu bildirmifllerdir. Ayna araflt›r›c›lar›n benzer bir çal›flmas›nda (42) kitosan›n Saccharomyces exiguus, Saccharomyco-des ludwigii ve Torulaspora delbrueckii gibi ma-yalara karfl› sodyum benzoattan daha etkili oldu-¤unu; birlikte kullan›ld›klar›nda ise etkinin daha da artt›¤›n› rapor etmifllerdir. Savard ve ark. (43) Saccharomyces unisporus'un üremesini inhibe et-mek için 1 g/l konsantrasyonunda kitosan yeter-li olurken Saccharomyces bayanus için 5 g/l kon-santrasyonunda kitosan gerekti¤ini bildirmifllerdir. Jung ve ark. (44), 5.75 pH'da yüksek deasetilas-yon derecesine sahip kitosan›n, Candida albicans üzerine antimikrobiyal etkisinin yüksek oldu¤unu belirtmifller; buna sebep olarak da mantar ve graft kopolimerleri aras›ndaki özel etkileflimi gös-termifllerdir. Gerasimenko ve ark. (22), Candida albicans'›n kitosana karfl› oldukça duyarl› olmas›-na karfl›n Candida kruisei'nin dirençli oldu¤unu; bunun da kitosan›n mantarlar üzerine olan anti-mikrobiyal etkisinin türe özel olmas›ndan kaynak-land›¤›n› ileri sürmüfllerdir. Devlieghere ve ark. (33), kitosan›n antimikrobiyal aktivitesine g›da bi-leflenlerinin (niflasta, peynir alt› suyu, NaCl ve ya¤) etkisini Candida lambica ile inoküle edilmifl ortamda incelemifller; ya¤ hariç di¤erlerinin akti-viteyi olumsuz etkiledi¤i sonucuna varm›fllard›r. Kenawy ve ark. (45), amino gruplar›na vanillin, p-hydroxybenzaldehyde, p-chlorobenzaldehyde, anisaldehyde, methyl 4-hydroxybenzoate, methyl
2,4-dihydroxybenzoate, propyl 3,4,5-trihydroxy-benzoate ve 2-hydroxymethyl3,4,5-trihydroxy-benzoate gibi biyo-lojik aktif maddeler ba¤layarak elde etti¤i modi-fiye kitosanlar›n Candida albicans SC5314, A. fla-vus ve Fusarium oxysporium fluslar›na karfl› test edilen bakterilerden (B. subtilis, E. coli ve S. aure-us) daha aktif oldu¤unu bildirmifllerdir.
Kitosan›n g›da uygulamalar›ndaki antimikrobiyal etkinli¤i
Kitosan›n antimikrobiyal etkinli¤i bizzat g›da maddelerinde de denenmifltir. Et ve et ürünleri bu kapsamda en çok çal›fl›lan grubu oluflturmufl-tur ve bunlarda kitosan›n mikrobiyal üremenin engellenmesi veya mikroorganizmalar›n neden ol-du¤u bozulmalar›n geciktirilmesi ile ilgili etkinli-¤i birçok araflt›r›c› taraf›ndan incelenmifltir. Sago-o ve ark. (41) % 0.3-0.6 kSago-onsantrasySago-onlar›nda domuz eti k›ymas›na kat›lan kitosan›n 4ºC'de ya-p›lan muhafazan›n ilk günü içinde toplam aerop mezofil mikroorganizma, küf-maya ve laktik asit bakteri say›s›nda 3 log kob/g azalmaya yol açt›-¤›n›; mikroorganizma say›s›n›n 18 günlük muha-faza periyodu boyunca kitosan içermeyen kontrol grubunda di¤erlerinden daima daha yüksek oldu-¤unu rapor etmifllerdir. Benzer bulgular % 1.0 konsantrasyonundaki kitosan solüsyonlar›na dald›-r›lm›fl domuz sosislerinde de görülmüfl ve mikro-organizma say›lar›nda 7ºC'de 18 gün yap›lan mu-hafaza sonunda 1-3 log kob/g azalma kaydedil-mifltir. Youn ve ark. (46) ise baharat kat›lm›fl et-lerle yapt›klar› çal›flmada % 0.1'den yüksek kon-santrasyonlarda kitosan›n raf ömrünü artt›rd›¤› ve oksidasyonda belirgin bir azalmaya neden oldu¤u sonucuna varm›fllard›r. Darmadji ve Izumimuto (32), kitosan›n % 0.5-1.0'lik konsantrasyonlar›n›n köftelerde B. subtilis, Pseudomonas gibi bozulma yap›c› bakterilerin say›s›n› 1-2 log azaltt›¤›n› ve kokuflmay› yavafllatt›¤›n› bildirmifllerdir. Bu çal›fl-ma % 0.1'in üzerindeki konsantrasyonlarda ise Lactobacillus plantarum, Pediococcus pentosaceus ve Micrococcus varians gibi fermente et ürünle-rinde önemli kültür bakterilerinin de üremelerinin engelledi¤ine iflaret edilmifltir. Roller ve ark. (47) kitosan›n domuz sosislerinin mikrobiyolojik
kali-tesi üzerine etkilerini araflt›rd›klar› çal›flmalar›nda, % 1.0 konsantrasyonunda kitosan ilave edilmifl sosislerde 7ºC'de 18 günlük muhafaza periyodu sonunda toplam bakteri, küf-maya ve laktik asit bakterileri say›s›nda 1-3 log kob/g azalma görül-dü¤ünü, daha düflük konsantrasyonda (% 0.5) ise etkinin olmad›¤›n› rapor etmifllerdir. Zivanovic ve ark. (48) kitosan filmlerini hem tek bafl›na hem de kekik ya¤› ile birlikte L. monocytogenes ile kontamine edilmifl bologna ad› verilen et ürünün-de ürünün-denemifllerdir. Filmle kaplanan ürünler 10°C' da 5 gün muhafaza edilmifltir. Muhafazan›n so-nunda yap›lan mikrobiyolojik analizlerde kitosan filminin L. monocytogenes say›s›n› 2 log kadar; % 1 ve % 2 kekik esansiyel ya¤› içeren kitosan filmlerinin ise 3.6 ve 4 log kadar azaltt›¤› sap-tanm›flt›r. Tsai ve ark. (29) kitosan›n etkisini ba-l›k etleri üzerinde araflt›rm›fllard›r. Yap›lan çal›fl-mada bal›k fletolar›n›n % 1 kitosan (yüksek de-asetilasyon derecesine sahip) ile muamelesinin uçucu bazik nitrojen içeri¤indeki art›fl› geciktirdi-¤i; mezofil, psikrotrof, koliform, Aeromonas ve Vibrio üremesini yavafllatt›¤›; raf ömrünü 5 gün-den 9 güne uzatt›¤› sonucuna varm›fllard›r. Taha ve Swailam (28) kitosan ile (% 0.04) Aeromo-nas hydrophila'n›n üremesinin ve hemolizin üreti-minin bask›lad›¤›n›; bask›lay›c› etkinin artan s›-cakl›k ve azalan pH ile artt›¤›n› saptam›fllard›r. Kitosan›n depolama s›ras›ndaki koruyucu etkisi meyve ve sebzelerde de çal›fl›lm›flt›r. El Ghaouth ve ark. (49) çilekler üzerinde yapt›¤› çal›flmada kitosan ile kaplaman›n (15 mg/mL) küf üremesinin ve bunlardan ileri gelen çürümenin önemli derecede geciktirildi¤ini rapor etmifllerdir. Chien ve ark. (50) ise dilimlenmifl mangonun ka-litesi ve raf ömrü üzerine yenilebilir kitosan ile kaplaman›n etkisini araflt›rm›fllard›r. Farkl› kon-santrasyonlarda kitosan solüsyonlar› ile (% 0, 0.5, 1.0 ve 2.0) muamele edilen dilimlenmifl meyve-ler PVCD ile kapland›ktan sonra 25ºC'de muha-faza edilmifltir. Yap›lan analizler sonucunda kito-san›n su kayb›n› geciktirmesi ve duyusal kalite-yi korumas›n›n yan› s›ra mikroorganizma gelifli-mini inhibe etti¤i saptanm›flt›r. Savage ve
Sava-ge (51) kitosan ile kaplanm›fl elmalarda 12 hafta-l›k depolama periyodunda küflenme oran›n› azalt-t›¤›n› bildirmifllerdir. Cheah ve Page (52) % 2-4 kitosan ile kaplanan havuçlarda çürüme oran›n›n önemli derecede azald›¤›n› (% 88'den % 28'e) saptam›fllard›r. Du ve ark. (53) fleftali, armut, ki-vi gibi meyvelerin saklanmas› s›ras›nda kitosan ile kaplaman›n benzer yararlar›n› gözlemlemifllerdir. Oh ve ark. (54) kitosan›n antimikrobiyal etkisini deneysel olarak kontamine edilmifl mayonezlerde araflt›rm›fllar; 25ºC'de Lactobacillus fructivorans ve Zygosaccharomyces bailii say›s›n› önemli de-rece azaltt›¤›n› saptam›fllar ve bu nedenle mayo-nezde bozulma yap›c› mikroorganizmalar›n üremesini inhibe etmek için bir koruyucu olarak kullan›labilece¤ini önermifllerdir. Mayonezle ilgili bir baflka çal›flma Roller ve Covill (27) taraf›n-dan gerçeklefltirilmifltir. Asetik asit (% 0.16) ve-ya limon suyu (% 1.2 ve % 2.6) ile kombinas-yon halinde kitosan (3 g/l) ilave edilerek haz›r-lanan mayonezlere deneysel olarak S. enteritidis, Z. bailii ve Lactobacillus fructivorans inoküle edilmifltir. ‹ki farkl› s›cakl›kta (5 ve 25°C) 8 gün süreyle yap›lan depolama s›ras›nda asetik asit ve kitosan içeren mayonezlerde L. fructivorans ve Z. bailii üremesinin bask›land›¤›; S. enteritidis sa-y›lar›nda ise önemli bir de¤iflim olmad›¤› saptan-m›flt›r. Limon suyu ve kitosan içeren örneklerde ise önemli farkl›l›klar gözlenmemifltir. Ayn› ça-l›flmada 5°C' de depolanan ve kitosan ile kaplan-m›fl (9 mg/g) karideslerde bozulma yap›c› mikro-organizma say›s›n›n önemli derecede azald›¤›; an-cak 25°C' de muhafaza edilen örneklerde ise ki-tosan›n bir koruyucu madde olarak etkili olmad›-¤› da bildirilmifltir. Araflt›r›c›lar kitosan›n asetik asit ve so¤uk depolama ile kombine edildi¤inde bir koruyucu olarak kullan›labilece¤i sonucuna varm›fllard›r.
Kitosan›n denendi¤i bir baflka ürün pizza olmufl-tur. Rodriguez ve ark. (55) pizzalarda kitosan›n hem yenilebilir film olarak hem de bir hamur ig-redienti olarak kullan›ld›¤›nda antifungal kapasi-tesini araflt›rm›fllard›r. Yenilebilir film fleklinde
kitosan kullan›m›n›n (0.079 g/100 g pizza) Alter-naria, Penicilliu ve Cladosporium üremesini ya-vafllatt›¤›n›, Aspergillus üzerine ayn› derecede et-ki göstermedi¤ini ve et-kitosan›n hamur içine ilave edildi¤inde ise hiçbir etkisinin olmad›¤›n› bildir-mifllerdir.
Bira üretiminde laktik asit bakterilerin geliflimi bozulmalara neden oldu¤undan arzu edilmemek-tedir. Gil ve ark (56) bira üretimi s›ras›nda izo-le ettikizo-leri dört laktik asit bakterisinin geliflimi-nin inhibisyonu için 0.1 g/L kitosan›n yeterli ol-du¤unu; bira üretiminde kullan›lan yedi farkl› maya türü için 1.0 g/L kitosan gerekti¤ini sapta-m›fllard›r. Araflt›r›c›lar kitosan› bira üretiminde de denemifller, 0.1 g konsantrasyonunda kullan›ld›-¤›nda mayalar›n canl›l›¤›n› ve fermantasyonu et-kilemeksizin bakteriyel üremeyi inhibe etti¤ini bildirmifllerdir.
G›da maddelerinin uzun süre bozulmadan muha-faza edilmesi ve bu esnada kalitelerini koruma-lar› günümüzde hala katk› maddesi kullan›m› ile baflar›labilmektedir. Ancak kullan›lan katk› mad-delerinden birço¤unun tüketici sa¤l›¤›na olumsuz etkilerinin oldu¤u ileri sürülmektedir. Buna alter-natif olarak da zararl› etkisinin olmad›¤› bilinen bitkisel veya hayvansal kaynaklardan elde do¤al koruyucu maddeler önerilmifl, hatta bunlardan ba-z›lar› ticari olarak üretilip piyasaya sürülmüfltür. Ancak yap›lan çal›flmalarda bunlardan baz›lar›n›n iddia edildi¤i gibi beklenen performans› göster-medi¤i sonradan anlafl›lm›flt›r. Makale içinde de ifade edildi¤i gibi çok yönlü kullan›m alan›na sa-hip olan kitosan›n çok çeflitli mikroorganizmala-ra karfl› etkili oldu¤u ve g›da maddelerin mikroorganizmala-raf öm-rünü art›rd›¤› çeflitli bilimsel çal›flmalarda ifade edilmifltir. Bununla birlikte konunun daha çok araflt›r›lmas›nda fayda vard›r. Özellikle et ve et ürünlerinin mikrobiyolojik kalitesi üzerine kitosa-n›n etkisi yap›lacak çal›flmalarla bu anlamdaki a盤› kapatacakt›r. ‹ddia edildi¤i gibi bu üründe istenen etkiyi gösterirse et teknolojisinde koruyu-cu katk› maddesi kullan›m› ile ilgili sorunun çö-zülmesine önemli katk› sa¤layacakt›r.
KAYNAKLAR
1. Shahidi F, Arachchi JKV, Jeon YJ. Food applications of chitin and chitosans. Trends Food Sci Tech 1999; 10: 37-51. 2. Shepherd R, Reader S, Falshaw A. Chitosan functional properties. Glycoconjugate Journal 1997; 14: 535-542. 3. Terbojevich M, Muzarelli RA A. Chitosan. Cambridge: Woodhead Publishing Ltd. Press., 2000.
4. Roller S. Chitosan: New food preservative or laboratory curiosity. Cambridge: Woodhead Publishing Ltd. Press., 2003. 5. No HK, Kim SH, Lee SH, Park NY, Lee SH, Prinyawi-watku W. Stability and antibacterial activity of chitosan so-lutions affected by storage temperature and time. Carbonhy Polym 2006; 65: 174-178.
6. Han LK, Kimura Y, Okuda H. Reduction in fat storage during chitin-chitosan treatment in mice fed a high-fat diet. Int J Obes Relat Metab Disord, 1999; 23: 174-179. 7. Lee JK, Kim SU, Kim JH. Modification of chitosan to improve its hypocholesterolemic capacity. Biosci Biotechnol Biochem 1999; 63: 833-839.
8. Pittler MH, Abbot NC, Harkness EF, Ernst E. Randomi-zed, double-blind trial of chitosan for body weight reducti-on. Eur J Clin Nutr 1999; 53: 379-381.
9. Razdan A, Pettersson D. Effect of chitin and chitosan on nutrient digestibility and plasma lipid concentrations in broi-ler chickens. Br J Nutr 1994; 72: 277-288.
10. Wuolijoki E, Hirvela T, Ylitalo P. Decrease in LDL-cho-lesterol with microcrystalline chitosan. Methods Find Exp Clin Pharmacol 1999; 21: 357-361.
11. Chen Y, Li C. Studies on the application of chitosan to clarification of grapefruit Juice. Food Sci Taiwan 1996; 23: 617-628.
12. Soto-Perlata NV, Muller H, Knorr D. Effect of chitosan treatments on the clarity and color of apple juice. J Food Sci 1989; 54: 495-496.
13. Volesky B. Biosorbents for metal recovery. Trends Bio-tech 1987; 5: 96-99.
14. Butler BL, Vergano PJ, Testin RF, Bunn JN, Wiles JL. Mechanical and barrier properties of edible chitosan films as affected by composition and storage. J Food Sci 1996; 61: 953-955, 961.
15. El Ghaouth A, Arul J, Ponnampalam R, Boulet M. Chi-tosan coating effect on storability and quality of fresh straw-berries. J. Food Sci., 1991b; 56: 1618-1620.
16. Kittur FS, Kumar KR, Tharanathan RN. Functional pac-kaging properties of chitosan films. Z Lesbensm Unters Forsch A 1998; 206: 44-47.
17. Chen C, Liau W, Tsai G. Antibacterial effects of N-Sulfonated and N-Sulfobenzoyl chitosan and application to oyster preservation. J Food Protect 1998; 61: 1124-1128. 18. Cuero RG, Osuji G, Washington A. N-Carboxymethyl
chitosan inhibition of aflatoxin production: Role of zinc. Bio-technol Letters 1991; 13: 441-444.
19. Helander IM, Nurmiaho-Lassila E-L, Ahvenainen R, Rhoades J, Roller S. Chitosan disrupts the barrier properties of the outer membrane of Gram-negative bacteria. Int J Fo-od Microbiol 2001; 71: 235-244.
20. Sudharshan NR, Hoover DG, Knorr D. Antibacterial ac-tion of chitosan. Food Biotech 1992; 6: 257-272. 21. Muzzarelli R, Tarsi R, Filippini O, Giovanetti E, Biagini G, Varaldo PE. Antimicrobial properties of N-carboxybutyl chi-tosan. Antimicrob Agents Chemother 1990; 34: 2019-2023. 22. Gerasimenko DV, Avdienko ID, Bannikova GE, Zueva OYu, Varlamov VP. Antibacterial effects of water-soluble low-molecular-weight chitosans on different microorganisms. Appl Biochem Microb 2004; 40: 253-257.
23. Jeon Y-J, Park P-J, Kim S-K. Antimicrobial effect of chitooligosaccharides produced by bioreactor. Carbohydr. Polym 2001; 44:11, 71-76.
24. Jumaa M, Furkert FH, Müller BW. A new lipid emul-sion formulation with high antimicrobial efficacy using chi-tosan, European J Pharmaceutics and Biopharmaceutics 2002; 53: 115-123.
25. Liu XF, Guan YL, Yang DZ, Li Z, Yao KD. Antibac-terial action of chitosan and carboxymethylated chitosan. J Appl Polym Sci 2001; 79: 1324-1335.
26. No HK, Park NY, Lee SH, Meyers SP. Antibacterial ac-tivity of chitosans and chitosan oligomers with different mo-lecular weights, Int J Food Microbiol 2002; 74: 65-72. 27. Roller S, Covill N. The antimicrobial properties of chi-tosan in mayonnaise and mayonnaise-based shrimp salads. J Food Protect 2000; 63: 202-209.
28. Taha SMA, Swailam HMH. Antibacterial activity of chito-san against Aeromonas hydrophila. Nahrung 2002; 46: 337-340. 29. Tsai GJ, Su WH, Chen HC, Pan CL. Antimicrobial ac-tivity of shrimp chitin and chitosan from different treatments and applications of fish preservation. Fisheries Sci 2002; 68: 170-177.
30. Wang GH. Inhibition and inactivation of five species of foodborne pathogens by chitosan. J Food Protect 1992; 55: 916-919.
31. Zheng LY, Zhu JF. Study on antimicrobial activity of chitosan with different molecular weights. Carbonhy Polym 2003; 54: 527-530.
32. Darmadji P, Izumimoto M. Effect of chitosan in meat preservation. Meat Sci 1994; 38: 243-254.
33. Devlieghere F, Vermeulen A, Debevere J. Chitosan: An-timicrobial activity, interactions with food components and applicability as a coating on fruit and vegetables. Food Mic-robiol 2004; 21: 703-714.
34. Omura Y, Shigemoto M, Akiyama T, Saimoto H, Shi-gemasa Y, Nakamura I, Tsuchido T. Antimicrobial activity
of chitosan with different degrees of acetylation and molecu-lar weights. Biocont Sci 2003; 8: 25-30.
35. Choi BK, Kim KY, Yoo YJ, Oh SJ, Cho-i JH, KCho-im CY. In vCho-itro antCho-imCho-icrobCho-ial actCho-ivCho-ity of a chCho-itoolCho-i- chitooli-gosaccharide mixture against Actinobacillus actinomycetemco-mitans and Streptococcus mutans. Int J Antimic Agents 2001; 18: 553-557.
36. Pranoto Y, Rakshit SK, Salokhe VM. Enhancing anti-microbial activity of chitosan films by incorporating garlic oil, potassium sorbate and nisin. LWT- Food Sci Technol 2005; 38: 859-865.
37. Lee CH, Park HJ, Lee DS. Influence of antimicrobial packaging on kinetics of spoilage microbial growth in milk and orange juice. J Food Eng 2004; 65: 527-531. 38. Fang SW, Li CF, Shih DYC. Antifungal activity of chi-tosan and its preservative effect on low sugar candied kum-quat. J Food Prot 1994; 56: 136-140.
39. Park SLA, Stan SDB, Daeschel MAA, Zhao YA. Anti-fungal coatings on fresh strawberries (Fragaria x ananassa) to control mold growth during cold storage. J Food Sci 2005; 70: 197-201.
40. Roller S, Covill N. The antifungal properties of chito-san in laboratory media and apple juice. Int J Food Micro-biol 1999; 47: 67-77.
41. Sagoo S, Board R, Roller S. Chitosan inhibits growth of spoilage microorganisms in chilled pork products. J Food Mic 2002a; 19: 175-182.
42. Sagoo S, Board R, Roller S. Chitosan potentiates the an-timicrobial action of sodium benzoate on spoilage yeasts. Let-ters Appl Microbiol 2002b; 34/3: 168.
43. Savard T, Beaulieu C, Boucher I, Champagne CP. An-timicrobial action of hydrolyzed chitosan against spoilage ye-asts and lactic acid bacteria of fermented vegetables. J Fo-od Prot 2002; 65: 828-833.
44. Jung BO, Kim CH, Choi KS, Lee YM, Kim J. Prepa-ration of amphiphilic chitosan and their antimicrobial activi-ties. J Applied Polymer Sci 1999; 72: 1713-1719.
45. Kenawy E-R, Abdel-Hay FI, El-Magd AA, Mahmoud Y. Biologically active polymers: Modification and anti-microbial activity of chitosan derivatives. J Bioact Compat Polym 2005; 20: 95-111.
46. Youn SK, Her JH, Kim YJ, Choqi JS, Park SM, Ahn DH. Studies on the improvement of shelf-life in spicy beef meat using chitosan. J Korean Soc Food Nutr 2004; 33: 207-211. 47. Roller S, Sagoo S, Board R, O'Mahony T, Caplice E, Fitzgerald G, Fogden M, Owen M, Fletcher H. Novel com-binations of chitosan, carnocin and sulphite for the preserva-tion of chilled pork sausages. Meat Sci 2002; 62: 165-177. 48. Zivanovic S, Chi S, Draughon AF. Antimicrobial activity of chitosan films enriched with essential oils. J Food Sci 2005; 70: 45-51.
Anti-fungal activity of chitosan on two post-harvest pathogens of strawberry fruits. Phytopathology 1992; 82: 398-402. 50. Chien PJ, Sheu F, Yang FH. Effects of edible chitosan coating on quality and shelf-life of sliced mango fruit. J Fo-od Eng 2007; 78: 225-229.
51. Savage PJ, Savage GP. The effect of coating apples on the quality of stored apples. Proceedings of the Nutrition So-ciety of New Zealand 1994; 19: 129-133.
52. Cheah LH, Page BBC. Chitosan coating for inhibition of sclerotinia rot of carrots. New Zealand J Crop Hort Sci 1997; 25: 89-92.
53. Du J, Gemma H, Iwahori S. Effect of chitosan coating
on the storage of peach, japanese pear, and kiwifruit. J Japan Soc Hort Sci 1997; 66: 15-22.
54. Oh HI, Kim YJ, Chang EJ, Kim JY. Antimicrobial cha-racteristics of chitosans against food spoilage microorganisms in liquid media and mayonnaise. Biosci Biotechnol Biochem 2001; 65: 2378-2383.
55. Rodriguez MS, Ramos V, Agullo E. Antimicrobial acti-on of chitosan against spoilage organisms in precooked Piz-za. J Food Sci 2003; 68: 271-274.
56. Gil G, Del Mónaco S, Cerrutti P, Galvagno M. Selecti-ve antimicrobial activity of chitosan on beer spoilage bacte-ria and brewing yeasts. Biotechnol Letters, 2004; 26: 569-574.
