Türk Mikrobiyol Cem Derg (2003) 33: 39-41
39
Antibiyotikle ‹liflkili ‹shal Olgular›nda Clostridium
diffici-le Toksin A+B Araflt›r›lmas›
Gökhan AYGÜN(*) , Mustafa ASLAN(*), Hatice YAfiAR(*), Kemal ALTAfi(*)
ÖZET
Antibiyotikle iliflkili ishal ve nozokomiyal ishal olgular›nda en s›k etken Clostridium difficile olarak belirlenmektedir. Bu et-keni araflt›racak çeflitli yöntemler belirlenmifltir ve EL‹SA ile toksin A+B saptanmas› s›kl›kla kullan›lan bir yöntemdir. Bu ça-l›flmada antibiyotikle iliflkili ishal tan›s› alm›fl, hastanede yatmayan olgularda C. difficile toksin A+B varl›¤› EL‹SA yöntemiy-le araflt›r›lm›fl ve 70 olgunun üç (%4.3) tanesinde pozitif bulunmufltur. Bu oran bekyöntemiy-lenen oranlardan düflük bulunmufl, bu du-rumun olas› nedenleri tart›fl›lm›flt›r.
Anahtar Kelimeler: Clostridium difficile , antibiyotikle iliflkili ishal, EL‹SA SUMMARY
Investigation of Clostridium difficile Toxin A+B in Patients with Antibiotic - Associated Diarrhoea.
Clostridium difficile is the most frequent cause in antibiotic-associated diarrhoea and nosocomial diarrhoea. Various methods to detect this agent have been defined and the detection of toxin A+B using ELISA is a frequently used method. In this study we investigated the presence of Clostridium difficile toxin A+B in outpatients diagnosed with antibiotic associated diarrhoe-a using ELISA. The number of positive cdiarrhoe-ases wdiarrhoe-as 3 out of 70 sdiarrhoe-amples (4.3%). This rdiarrhoe-ate wdiarrhoe-as found to be less thdiarrhoe-an expected and the possible reasons are discussed.
Key words: Clostridium difficile, Antibiotic-associated diarrhoea, ELISA
G‹R‹fi
Klinik olarak asemptomatik tafl›y›c›l›ktan ölümle sonlanabilen psödomembranöz enterokolit tablo-la-r›na kadar çok genifl bir yelpazesi olan Clostridium difficile , antibiyotikle iliflkili ishallerde(A‹‹) ve no-zokomiyal ishallerde(N‹) en s›k rastlanan etken ola-rak karfl›m›za ç›kmaktad›r (1-3). C. difficile infeksi-yonu tan›s›nda toksinlerin sitotoksin test-leriyle ta-n›mlanmas›, EL‹SA, lateks testleriyle toksin Ave B ‘nin saptanmas›, kültürde bakteriyi üretmek, endos-kopik inceleme ve biopsi gibi çeflitli tan› yöntemleri tan›mlanm›flt›r (3-5). Antibiyoti¤e ba¤l› ishal olgula-r›nda C. difficile d›fl›nda baflka etkenlerin de buluna-bilece¤i fakat en s›k etkenin C. difficile oldu¤u belir-tilmektedir(6). Bu çal›flmada ünitemizde antibiyoti¤e ba¤l› ishal tan›s›yla baflvuran olgularda , d›flk› örnek-lerinde EL‹SA yöntemi kullanarak C. difficile toksin A+B varl›¤› araflt›r›lm›flt›r.
(*)‹stanbul Üniversitesi , Cerrahpafla T›p Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dal›, ‹stanbul
GEREÇ ve YÖNTEM
Cerrahpafla T›p Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji laboratuvarlar›na 2000 y›l› içinde , hastanede yatmayan, son üç ay içinde antibiyotik kullan›m› hikayesi olan ve antibiyoti¤e ba¤l› ishal düflünülerek gönderilen ve d›flk› örne¤i incele-me-sinde yumuflak k›vaml› ya da sulu mukuslu örne¤i olan olgular çal›flmaya al›nm›flt›r(3). Klinik yak›n-mas› olsa bile forme d›flk› örne¤i olanlar çal›flmaya dahil edilmemifllerdir. Laboratuvara ulaflan d›flk› ör-nekleri makroskopik ve mikroskopik yönden incele-nerek –20 °C ‘de çal›fl›lana kadar bekletilmifller ,bu d›flk› örneklerinde en geç bir hafta içinde EL‹SA yöntemiyle( Ridascreen C difficile toksin A+B (r-bi-opharm , Germany) ) C. difficile toksin A+B varl›¤› araflt›r›lm›flt›r. Tüm örneklerde kültür yap›larak Sal-monella, Shigella, Aeromonas, Plesiomonas varl›¤› araflt›r›lm›flt›r. Direkt inceleme ve lugol ile
haz›rla-Türk Mikrobiyol Cem Derg 33: 39-41
40
nan preparatlarda parazit yönünden de¤erlendirilmifl, ayr›ca direkt incelemede yo¤un maya hücreleri var-l›¤› ve/veya psödohif oluflumu da incelenmifl fakat kantitatif kültür uygulanmam›flt›r(7).
BULGULAR
Olgulara ait bilgiler Tablo 1 ‘de gösterilmifltir. Ta-n›mlanan özelliklere sahip 70 olgu çal›flmaya dahil edilmifltir. Olgular›n üçünde (%4.3) (Biri Gastroen-teroloji, biri Klinik Mikrobiyoloji ve ‹nfeksiyon Hastal›klar› ve biri di¤er poliklinik-lerden) C. diffi-cile toksin A+B pozitif bulunmufltur. Örneklerin 23 tanesinde (% 32.8) lökosit varl›¤› saptanm›flt›r. Bak-teriyel kültürlerden hiçbirinde anlaml› üreme belir-lenmemifltir. Olgular›n 30’unda (%43) artm›fl oranda maya hücreleri ve /veya psödohif varl›¤› belirlenmifl fakat kantitatif kültür yap›lmad›¤› için anlaml› olarak de¤erlen-dirilmemifltir. Parazitolojik inceleme s›ra-s›nda üç olguda nadir alanlarda Blastocystis hominis varl›¤› belirlenmifl fakat anlaml› olarak kabul edil-memifl ve bildiriledil-memifltir.
TARTIfiMA
Clostridium difficile N‹ ve A‹‹ olgular›nda en önem-li etkendir ve bu olgularda yap›lacak ilk test bu etke-ne yöetke-nelik araflt›rma olmal›d›r (1-4,8). Bu olgularda di¤er etkenlere yönelik kültür ve d›flk›da parazit tet-kiki incelemelerinin faydas›z oldu¤u düflünülmekte-dir (2,910).
A‹‹ olgular›n›n yaklafl›k %10-30’undan, psödo-membranöz kolit olgular›n›n hemen tümünden ve N‹ olgular›n›n yaklafl›k %20’sinden C. difficile sorumlu
tutulmufltur (1,11-13). Merkezimizde daha önceki y›llarda yap›lan bir çal›flmada antimikrobik madde kullanan olgularda % 34 ve sa¤l›kl› kontrol grubun-da % 4.3 oran›ngrubun-da d›flk›grubun-da toksin –A pozitifli¤i belir-lenmifltir (14). Çal›flmam›zda A‹‹ olgular›nda öngö-rülenden daha düflük oranlarda C difficile toksin A+B pozitifli¤i belirlenmifltir. Bu çal›flmadaki düflük de¤erler kullan›lan kitlerin farkl›l›¤›ndan ve art›k C. difficile infeksiyonunun daha erken tan›n›p ampirik tedavi edilmesinden kaynaklan›yor olabilir. Balaban ve ark (15) çal›flmalar›nda A‹‹ olgular›nda beklenen-den daha düflük bir oranda (%9) C. difficile sapta-d›klar›n› bildirmifller ve bu konuya dikkat çekmifller-dir.
Tan› amac›yla kullan›lan EL‹SA yönteminin duyarl›-l›¤›n›n %70-95 aras›nda de¤iflen oranlarda bulundu-¤u ve özgüllü¤ünün daha yüksek oldubulundu-¤u bildirilmifl-tir (1,3,4 ). Hafif ve erken olgularda tok-sin saptan-mayabilir (1). Klinikte kullan›labilecek sigmoidos-kopi ve biopsi d›fl›nda laboratuvar testleri aras›nda alt›n standart test sitotoksinin hücre kültürlerinde gösterilmesidir ve EL‹SA d›fl›nda, lateks aglütinas-yon, moleküler teknikler, kroma-tografik teknikler , kültür yöntemleri de gelifltiril-mifltir (1-6,16). Günü-müzde EL‹SA yöntemi k›s›tl› imkanlar› olan, hücre kültürü yapamayan laboratuvarlar için uygun bir al-ternatif olarak ele al›nabilir(3,5,15,16). EL‹SA yön-teminin duyarl›l›-¤›n›n k›s›tl› olmas› nedeniyle tek tan› metodu olarak kullan›lmas›n› önermeyenler de bulunmaktad›r(17). ‹ncelenen d›flk› örne¤i say›s› art-t›¤›nda C. difficile tan›s›n›n konulabilme ihtimalinin artt›¤› ve en az iki örnek incelenerek karar verilmesi gerekti¤i de önerilmifltir(4,6).
C. difficile ile ilgili laboratuvar tan›s›nda örne¤in al›-n›p laboratuvara ulaflt›r›lmas› sonras›nda ilk 24 saat-te +4 °C’de, daha uzun kalacaksa – 20 °C de saklan-mas› önerilmektedir. Fakat örne¤in al›nma-s›ndan la-boratuvara ulaflana kadar geçen süre konusunda fark-l› bilgiler vard›r(18,19). Bu sürenin 1 saati aflmama-s›n› önerenler (18) , 2 saat oda ›s›s›nda bekleyebile-ce¤ini söyleyenler(19) bulunmaktad›r. Baz› ticari kitler ise örneklerin +4 °C’de transport-unu öner-mektedirler. D›flk›da bulunan proteazlar›n toksini parçalayarak miktar›n› azaltabilece¤i düflünülmekte-dir(20). Örneklerin al›nmas› ve transportu s›ras›nda geçen süre testlerin sonuçlar›n› olumsuz etkilemifl
ÖZELL‹KLER Ortanca Yafl Cinsiyet (Kad›n/Erkek) Geldi¤i klnik Gastroenteroloji Klinik Mikrobiyoloji ve ‹nfeksiyon Hastal›klar› Di¤er Poliklinikler D›flk›lar›n makroskopisi Yumuflak Sulu Kanl›-mukuslu
Toksin A+B POZ‹T‹F bulunanlar
31 (5-70) (33/37) 17 10 43 42 25 3 3 (%4.3)
Tablo1. Çal›flmaya al›nan hastalar›n kimlik ve d›flk› inceleme sonuçlar›
41 G. Aygün ve ark., Antibiyotikle ‹liflkili ‹shal Olgular›nda Clostridium difficile Toksin A+B Araflt›r›lmas›
olabilir. Gerçi kullan›lan kit içeri¤inde örneklerin so¤ukta transportu önerilmemiflse de bu durumun bir sorun yaratabilece¤i düflünülebilir.
Antibiyoti¤e ba¤l› ishal olgular›nda C. difficile ya-n›nda Clostridium perfringens, Staphylococcus aure-us, Salmonella , Candida cinsi mantarlar›n ve anti-biyotiklerin direkt etkilerinin de ishal oluflumundan sorumlu olabilecekleri belirtilmifltir(6). Bu etkenler aras›nda Candida cinsi mantarlar›n de¤erlendirilme-si ve etken olarak tan›mlanmalar› konusunda çeflitli görüfller bulunmaktad›r ve en çok önerilen yöntem kantitatif kültür yapmakt›r(6,7,21).
Sonuç olarak A‹‹ olgular›nda C. difficile tan›s›nda daha farkl› yöntemleri de kullanarak yeni yaklafl›m modelleri oluflturmak, di¤er etkenlerin (örne¤in Can-dida) bu olgulardaki rolünü belirlemek, ampirik met-ronidazol kullan›m›ndan kaç›nmak uygun olacakt›r.
KAYNAKLAR
1 .Fekety R:Antibiotic-associated colitis. “GL Mandell, JE Bennett ,R Dolin (eds): Principles and Practice of Infec-tious Diseases” p978, 4th ed, Chuchill-Livingstone Inc. New York (1995).
2 . Guerrant RL, van Gilder T, Steiner TS, et al: Practi-ce guidelines for the management of infectious diarrhea. Clin Infect Dis 32 : 331 (2001).
3 . Fekety R:Guidelines for the diagnosis and manage-ment of Clostridium difficile-associated diarrhea and coli-tis. Am J Gastroenterol 92: 739 (1997).
4 .Manabe YC, Vinetz JM, Moore RD, Merz C, Cha-rache P, Barlett JG:Clostridium difficile colitis: an effi-cient clinical approach to diagnosis. Ann Intern Med 123: 835 (1995).
5.Do¤anc› L:Antibiyoti¤e ba¤l› diyare ve psödomembra-nöz kolit.”H Eraksoy, Ofi Yenen ed ‹nfeksiyon Hastal›kla-r› ve Klinik Mikrobiyoloji 2000” s183 , KL‹M‹K Derne¤i yay›n› No:19 ‹stanbul (2000).
6.Högenauer C, Hammer HF, Krejs GJ, Reisinger EC: Mechanisms and management of antibiotic-associated di-arrhea . Clin Infect Dis 27: 702 (1998).
7.Öztürk R:‹shal tan›m›. “ R Öztürk ed . ‹shal “ s. 70 ‹s-tanbul Bulafl›c› Hastal›klarla Savafl Derne¤i Yay›nlar› No:13, ‹stanbul (1998).
8.Gerding DN, Brazier JS:Optimal methods for identifi-ying Clostridium difficile infections. Clin Infect Dis 16 (Suppl 4): 439 (1993).
9. Rao GG, Ozerek AE, Jeanes A: Rational protocols for testing faeces in the investigation of sporadic hospital-ac-quired diarrhoea. J Hosp Infect 47: 79 (2001).
10.Seigal DL, Edelstein PH, Nachamkim I: Inapporop-riate testing for diarrheal diseases in the hospital. JAMA 263: 979 (1990).
11.Kelly CP, Pothoulakis C, LaMont JT: Clostridium difficile colitis. N Engl J Med 330: 257 (1994).
12.Bartlett JG:Antibiotic-associated diarrhoea . Clin In-fect Dis 15: 573 (1992).
13.Öztürk R : Antibiyotikle iliflkili ishal . “R Öztürk ed.‹shal” s. 176, ‹stanbul Bulafl›c› Hastal›klarla Savafl Der-ne¤i Yay›nlar› No:13, ‹stanbul , (1998).
14.Öztürk R, Midilli K, Ergin S, Ero¤lu C, Aygün G, Okyay K: ‹shalli olgularda EL‹SA yöntemiyle Clostridi-um difficile toksin A aranmas›. 5. Ulusal ‹nfeksiyon Has-tal›klar› Kongresi, Kongre kitab›, s:101(1995).
15.Balaban N, Karahan ZC, Koca Y, Güvener E: Clos-tridium difficileye ba¤l› infeksiyonlar›n tan›s›nda kullan›-lan çeflitli yöntemlerin karfl›laflt›r›lmas›. Mikrobiyol Bült 35 : 211(2001).
16.Staneck JL, WeckbachLS, Allen SD et al.: Multicen-ter evaluation of four methods for Clostridium difficile de-tection: ‹mmunocard C. difficile, cytotoxin assay, culture, and latex aglutination. J Clin Microbiol 34: 2718 (1996). 17.Barbut F, Kajzer C, Planas N, Petit JC: Comparison of three enzyme immunoassays, a cytotoxicity assay and toxigenic culture for diagnosis of Clostridium difficile –as-sociated darrheae. J Clin Microbiol 31: 963 (1993). 18.Miller JM, Holmes HT: Specimen collection, trans-port, and storage. “PR Murray,EJ Baron, MA Pfaller, FC Tenover, RH Yolkin eds Manuel of Clinical Microbiology “ p.19 6th ed. ASM Press , Washington D.C. (1995). 19.Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schreckenber-ger PC, Winn Jr.WC:Color Atlas and Textbookof Diag-nostic Microbiology , p596 , 4th ed. JB Lippincott Com-pany, Philadelphia (1992).
20. Merz CS, Kramer C, Forman M et al:Comparison of four commercialy available rapid enzymeimmunoas-says with cytotoxin assay for detection of Clostridium dif-ficile toxin(s) from stool specimens. J Clin Microbiol 32 : 1142 (1994).
21.Levine J, Dykoski RD, Janoff EN: Candida –associa-ted diarrhea: a syndrome in search of credibility. Clin In-fect Dis 21: 881 (1995).
