Larinks Kanserli Hastalarda Glutatyon Peroksidaz Aktivitesi ve Lipit Peroksidasyon
Düzeylerindeki Değişiklikler
An Alteration in Glutathione Peroxidase Activity and Lipid Peroxidation Levels in Patients with Laryngeal
Carcinoma
Ercan İ. CANBAY
*, Kenan ÇELİK **, Tanfer KUNT***, Murat ERTEMUR****, Emel CANBAY*****
* Doç. Dr., C. Ü Tıp Fakültesi KBB Anabilim Dalı , Sivas
** Yrd. Doç. Dr., C. Ü Tıp Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı , Sivas
*** Prof. Dr., C. Ü Tıp Fakültesi KBB Anabilim Dalı , Sivas
**** Arş. Teknisyeni, C. Ü Tıp Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı , Sivas ***** Arş. Gör. Dr., C. Ü Tıp Fakültesi Genel Cerrahi Anabilim Dalı , Sivas
ÖZET
Larinks kanserli hastalarda eritrosit glutatyon peroksidaz (GSH-Px) aktivitesi ve lipit peroksidasyon düzeylerini araştırdık.
GSH-Px aktivitesi ve lipit peroksidasyonunun son ürünü olan malondialdehit (MDA) düzeyleri , 37 larinks kanserli hasta ve 50 sağlıklı kontrolun eritrositlerinde çalışıldı. Eritrosit lipid peroksidasyonu tiyobarbütirik asit reaktif substansı ile tayin edildi ve eritrosit GSH-Px aktivitesi ölçüldü.
Larinks kanserli hastalarda kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, eritrosit MDA seviyeleri yüksek olmasına rağmen eritrosit GSH-Px aktivitileri azalmış olarak bulundu. Buna ilaveten, larinks kanserli hastalarda eritrosit GSH-Px aktivitesi ile lipit peroksidasyon düzeyleri arasında istatistiki olarak anlamlı negatif bir korelasyon saptandı.
Bu sonuçlar, larinks kanserli hastalarda eritrosit lipit peroksidasyonunun artarken antioksidan enzim sistemlerinin bir üyesi olan GSH-Px aktivitesinin anlamlı bir şekilde hasar gördüğünü desteklemektedir.
Anahtar kelimeler: larinks kanseri; glutatyon
peroksidaz; lipit peroksidasyon; malondialdehit; eritrosit; antioksidan enzimler
SUMMARY
We investigated the activity of erythrocyte glutathione peroxidase (GSH-Px) and lipid peroxidation levels in patients with laryngeal carcinoma.
Activity of GSH-Px and the levels of end product of lipid peroxidation, which is malondialdehyde (MDA), were studied in erythrocytes of 37 patients with laryngeal carcinoma and 50 healthy controls. Erythrocyte lipid peroxidation was assesed by thiobarbuturic acid reactive substances and activity of erythrocyte GSH-Px was measured.
Erythrocyte GSH-Px activities were found to be lower whereas erythrocyte MDA levels were higher in patients with laryngeal carcinoma compared with those of controls. In addition to this, a statistically significant negative correlation was detected between erythrocyte GSH-Px activity and the levels of lipid peroxidation in patients with laryngeal carcinoma.
These results suggest that GSH-Px which is a member of antioxidant enzyme systems was significantly impaired while erythrocyte lipid peroxidation was increased in patients with laryngeal carcinoma.
Key words: laryngeal carcinoma; glutathione
peroxidase; lipid peroxidation; malondialdehyde; erythrocyte; antioxidant enzymes
C. Ü. Tıp Fakültesi Dergisi 24 (4):175 – 178, 2002 GİRİŞ
Prooksidan - antioksidan dengesinin prooksidan lehine değişimi oksidatif stres olarak bilinmektedir (1). Oksidan karsinojenler, çevrede fazla miktarda ve dokularda da dönüşüm yoluyla oluşmaları nedeniyle insan karsinojenezisinde özel bir yer alırlar (2). Oksidanlar kanserin başlamasında, ilerlemesinde ve gelişiminde rol oynamaktadırlar (3). Bu serbest radikallerin neden olduğu aşırı hücresel zarar antioksidan savunma mekanizmalari ile düzenlenebilir.
Lipit peroksidasyonu, hücre membranın fonksiyonları ve yapısal organizasyonunda önemli değişikliklere neden olur(4). Eritrosit membranı yüksek demir içeriği ve doymamış yağ asitleri kadar yüksek oksijen basıncın sürekli maruziyete bağlı oluşan oksidatif hasara özellikle duyarlıdır (5). Lipit peroksidasyon ürünleri DNA hasarına neden olduğundan aerobik organizmalarda lipit peroksidasyonunun önlenmesi önemli bir işlemdir (6).
Larinks kanserlerinde glutatyon peroksidaz (GSH-Px) aktivesi ve lipit peroksidasyonu ile ilgili çalışmalar vardır, ancak bulgular çelişkili olarak bildirilmiştir (7,8). Bu çalışmada larinks kanserli hastalarda eritrosit glutatyon peroksidaz aktivitesi ve lipit peroksidasyon düzeylerinin araştırılması amaçlanmıştır.
GEREÇ ve YÖNTEM Hastalar ve Kontrol Grubu
Pre ya da postoperatif dönemde Ocak 2001- Kasım 2002 tarihleri arasında C.Ü.T.F. KBB polikliniğine başvuran 35’i erkek 2’si kadın toplam 37 T3 veT4 larinks
kanserli hasta çalışmaya dahil edilmiştir. Hastaların ortalama yaşı 62 ± 11.7 ‘dir (47-77yaş arası). Hastaların herbiri çalışmaya katılmayı kabul etmiştir ve yazılı onay formunu imzalamıştır. Sağlıklı 50 kişi (25 erkek, 25 kadın) kontrol grubu olarak alınmıştır. Tüm kontrol hastaları kanser olmayan ve ciddi bir hastalığı olmayanlardan seçilmiştir.
Toplanan Örnekler
Hastalardan ve kontrol grubundaki kişilerden venöz kan örnekleri heparinize plastik tüplere alındı ve oradan ependorf tüplere aktarıldı. Örnekler +4OC’de
2500 xg’de 10 dakika santrifüj edildi. Plazma kısmı aspire edilerek atıldı ve eritrositler bol serum fizyolojik içinde yıkandı. Hücreler 1:5 oranında distile su ilave edilerek hemolize edildi ve -20°C‘deki derin dondurucu içine konuldu. Hemolizat santrifüj edilerek (22,000 Xg, 60 dakika) süpernatant GSH-Px aktivitesi ve MDA tayini için kullanıldı.
Tiyobarbütürik Asid - Reaktif Substans (TBARS) Tayini
Lipit peroksidasyonun son ürünü olan MDA Buege ve Aust metodlarının modifikasyonuna göre TBARS ile belirlendi (9). Bir hacim eritrosit süspansiyonu ile 2 hacim %15 w/v trikloroasetik asid, % 0.375w/v tiyobarbutürik asit ve 0.25 mol/l hidroklorik asit‘den oluşan stok çözelti ile karıştırıldı. Karışım kaynar su banyosu içinde 30 dakika tutularak kaynatıldı. Soğuduktan sonra çökelek 1000 xg’de 10 dakika santrifüj edildi. Örneklerin absorbansı 535 nm’de spektrofotometrik yöntemle belirlendi. Girişimlerden kaçınmak için demir içermeyen tüpler ve deiyonize su kullanıldı.
GSH-Px Aktivitesinin Tayini
Eritrositlerdeki GSH-Px aktivitesi Prohaska(10) and Kraus (11) tarafından modifiye edilen Paglia and Valentine(12) metodu ile ölçüldü. Enzim aktivitesi ölçümünde, H2O2 substrat olarak kullanıldı ve
NADPH’nın oksidasyonu 340nm dalga boyunda spektrofotometrik olarak saptandı. Sonuçlar U/g Hb olarak verildi. Total Hb miktarı cyanmethemoglobin tayini ile g/dl cinsinden saptandı
Etik
Cumhuriyet Üniversitesi Yerel Kurulundan karar alındı. Aynı zamanda her hastanın izni alındı.
İstatistik
Sonuçlar, ortalama ± SD olarak verildi. Hasta ve kontrol grubu arasında GSH-Px aktivitesi ve MDA düzeyleri arasındaki farklılığın istatistiksel anlamlılığı Student’s t-testi ile hesaplandı. GSH-Px ve MDA düzeyleri arasındaki korelasyon Linear regresyon analizi ile değerlendirildi. Yaş, sigara kullanımı, enzim aktiviteleri ve MDA düzeyleri arasındaki ilişki Mann-Whitney U testi ile hesaplandı. Tüm testler SPSS programı kullanılarak (9.0 versiyon, SAS Institute, Carry,NC) hesaplandı.
BULGULAR
T3 veT4 larinks kanserli 37 hasta ve 50 sağlıklı
kontrol çalışmaya alındı. Hasta ve kontrollerin karakteristik özellikleri Tablo 1’de gösterilmiştir. Hasta ve kontrol grubunun eritrosit GSH-Px aktivitelerinin ortalamaları ile MDA düzeyleri Tablo 2’de belirtilmiştir. Larinks kanserli hastalarda, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında eritrosit GSH-Px düzeylerinde istatistiksel olarak anlamlı bir azalma (T =8.44, P<0.01), MDA düzeylerinde istatistiksel olarak anlamlı bir yükselme (T=11.52, P<0.01) saptandı.
Tablo 1- Larinks kanseri ve kontrol olgularının yaş, cinsiyet ve
risk faktörleri dağılımı
Hastalar Kontrol grubu
(sayı) (%) (sayı) ( %) Yaş (yıl) < 40 40-65 27 10 72.97 27.03 25 25 50 50 Cinsiyet Erkek Kadın 35 2 94.59 5.41 23 27 46 54 Sigara içme Evet Hayır 31 6 83.79 16.21 17 33 34 66
Alkol kullanımı Evet Hayır 29 8 78.38 21.62 1 49 2 98
Tablo 2. Larinks kanserli hastalar ve kontrol grubunda
eritrosit GSH-Px aktivitesi ve MDA düzeyleri
Parametreler Larinks Kanserli olgular Kontrol grubu
Glutatyon peroksidaz (U g-1Hb) 190.58 ±12.60* 956±90 MDA (nmol ml-1) 1.34±0.10* 0.26±0.07
Sonuçlar, 37 larinks kanserli hasta ve 50 kontrolun ortalama ±SD değerleri olarak verilmiştir. * p<0.01
Larinks kanserli hastaların çalışılan parametreleri ve yaş, sigara kullanımı ile eritrosit GSH-Px aktivitesi arasındaki korelasyonu Tablo 3’de gösterilmiştir. Yaş, sigara kullanım durumu ile eritrosit GSH-Px aktivitesi arasında negatif bir korelasyon tespit edilirken (P=0.000, P <0.01; P= 0.003, P<0.01, sırasıyla ), bu parametreler ile MDA düzeyleri arasında bir ilişki bulunamadı (P=0.924, P>0.05 P=0.350,P>0.05, sırasıyla). İstatistiksel analizler, cinsiyet ve alkol alımı gibi alt gruplarda yetersiz veri nedeniyle uygulanmadı.
Larinks kanserli hastalarda eritrosit GSH-Px aktivitesi ile MDA düzeyleri arasında istatistiksel olarak anlamlı negatif korelasyon saptandı (R = -0.192, P=0.098, P<0.01).
Tablo 3. Larinks kanserli hastaların yaş, sigara içme durumu
ve GSH-Px aktiviteleri, MDA düzeyleri arasındaki korelasyon durumu * istatistiki anlamlılık
Glutatyon Peroksidaz Aktivitesi
(U g-1Hb) MDA düzeyi (nmol ml-1) Yaş < 40 40-65 242.61±18.11 162.39±18.11* p=0.001 r= - 0.293 1.24±0.11 1.52±0.14 p=0.171 p>0.05 Sigara içimi Evet Hayır 121.00± 64.00* 154.55±12.75 p=0.002 r= -0.178 1.92±0.13 1.30±0.09 p=0.350 p>0.05 Sonuçlar, larinks kanserli hastaların ortalama ±SD değerleri olarak verilmiştir.* p<0.01
TARTIŞMA ve SONUÇ
Metobolizma esnasında oluşan oksidanlar, metobolik reaksiyonları ve belirli işlemleri etkileyerek klinik belirtilere neden olurlar(13). Oksidanların direkt
etkileri, hücre membranında ve DNA (14) gibi diğer hücresel komponentlerde oluşturduğu peroksidatif değişikliklerdir. Ayrıca oksidanların kanser patojenezi üzerine direkt etkilerinden de söz edilmektedir (15). Canlı sistemlerdeki hücreler, oksidanların toksik etkilerine karşı enzimatik ve non-enzimatik savunma sistemleri içerirler. Enzimatik savunma sistemleri esas olarak süperoksit dismutaz, GSH-Px ve katalaz enzimlerinden oluşur.
Literatürde farklı kanser tiplerinde çalışılan antioksidan enzim düzeylerinde çelişkili sonuçlar bildirilmiştir (17). Bu çalışmaların sonuç olarak ortak bir görüş sağlayamamıştır. Örneğin meme, barsak(16), ve akciğer kanserli hastalarda azalmış eritrosit GSH-Px aktivitesi bildirilmiştir. Buna karşın birkaç neoplastik dokuda artan GSH-Px aktivitesi tespit edilmiştir (18).
Larinks kanserleri ele alındığında da son yıllara kadar çok fazla bir çalışmanın yapılmadığı dikkati çekmektedir. Seven ve ark.ları larinks kanserli hastalarda kontrole göre eritrosit GSH-Px aktivitesinin değişmediğini saptadılar(7). Buna ilaveten, Mulder ve ark.ları larinks kanserli hastaların laringeal dokularında yaptığı bir çalışmada GSH-Px aktivitesinde azalma bildirdiler (8). Bizim çalışmamızda, larinks kanserli hastalarda azalmış eritrosit GSH-Px aktivitesi saptanmıştır. Bu azalmış GSH-Px aktivitesi, kansere bağlı artan oksidan miktarına bağlı olabilir.
Kanserde lipit peroksidasyonu, kontrol edilemeyen serbest radikal oluşumu nedeniyle kanser hücresinde bazı değişikliklere yol açar(19). Kanser gelişimi ve peroksidasyon işlemleri arasındaki ilişkiyi açıklamayı amaçlayan çalışmalar farklı sonuçlar vermiştir. Bazı araştırmacılar, kanserli hastaların plazmalarında (20) ve kanser dokularında(21-23) artan lipit peroksidasyon düzeylerini tespit etmişlerdir. Bizim çalışmamızda, larinks kanserli hastalarda kontrol ile kıyaslandığında artan eritrosit MDA düzeyleri tespit edilmiştir. Bu bulgulara ilaveten, larinks kanserli hastalarda kontrol ile karşılaştırıldığında eritrosit MDA düzeyleri ve GSH-Px düzeyleri arasında negatif korelasyon saptanmıştır. Lipit peroksidasyonunda saptanan bu artış, eritrosit tarafından üretilen peroksit miktarı ile peroksitleri-temizleyen enzim sistemleri arasındaki yetersizliğe bağlı olabilir. Bu durum, hidrojen peroksit ve onun aktif ürünü hidroksil radikallerinin neoplastik değişikliklere neden olabileceğini destekler. Larinks kanserli hastaların eritrosit GSH-Px aktivitelerinde saptanan azalma, lipit peroksitlerinin temizlenmesinde olan artışa bağlı olabilir (24). Bu çalışmada ayrıca, larinks kanserli hastalarda yaş ve sigara kullanımı ile eritrosit GSH-Px aktivitesi arasında negatif korelasyon saptanmıştır.
Sonuç olarak, bizim bulgularımız larinks kanserli hastalarda enzimatik serbest radikal savunma
artma olduğunu desteklemektedir. Larinks kanserli hastaların eritrosit GSH-Px aktivitelerinde saptanılan azalma lipit peroksidasyonunda olan artmaya bağlı olarak gelişebilir. Bu sonuçlar, kanserde saptanılan antioksidan aktivitedeki yetersizliğin oksidanlarin neden olduğu DNA hasarını indükleyebileceği ve kanser gelişiminde rol alabileceğini düşündürmekle birlikte kansere bağlı gelişen antioksidan aktivite azalmasını da destekler. Karsinojenezisisin basamaklarının, antioksidan aktivite açısından teker teker incelendiği ayrıntılı planlanan çalışmalar bu keotik durumun gerçek yanıtını verecektir.
Teşekkür
Biyoistatistik bölümünden Yrd. Doç. Dr. Ziynet Çınar’a her zaman olan eşsiz yardımını bu çalışmada da verdiği için teşekkürü bir borç biliriz.
KAYNAKLAR
1. Halliwell B, Gutteridge JM, Cross CE. Free radicals, antioxidants, and human disease: where are we now? J Lab Clin Med 1992 ;119: 598-620.
2. Cerutti PA. Oksidanstress and carcinogenesis. Eur J Clin Invest 1991; 21: 1-5.
3. Guyton KZ and Kensler TW. Oxidative mechanisms in carcinogenesis. Br Med Bul.1993 ; 49: 523-44.
4. Borochov H, Abbott RE, Schachter D, Shinitzky M. Modulation of erythrocyte membrane proteins by membrane cholesterol and lipid fluidity.Biochemistry 1979; 18: 251-5.
5. Scott MD, Lubin BH, Zuo L, Kuypers FA. Erythrocyte defense against hydrogen peroxide: preeminent importance of catalase. J Lab Clin Med 1991;118: 7-16. 6. Esterbauer H, Gebicki J, Puhl H, Jurgens G. The role of
lipid peroxidation and antioxidants in oxidative modification of LDL. Free Radic Biol Med 1992;13: 341-90.
7. Seven A, Civelek S, Inci E, Inci F, Korkut N, Burcak G. Evaluation of oxidative stress parameters in blood of patients with laryngeal carcinoma. Clin Biochem 1999; 32: 369-73.
8. Mulder TP, Manni JJ, Roelofs HM, Peters WH, Wiersma A. Glutathione peroxidases in human head and neck cancer. Acta Otolaryngol 1995 ; 115: 331-3.
9. Buege JA, Aust SD. Microsomal lipid peroxidation. Methods Enzymol 1978; 52: 302-10.
10. Prohaska JR, Oh SH, Hoekstra WG, Ganther HE.
Glutathione peroxidase: inhibition by cyanide and release of selenium. Biochem Biophys Res Commun 1977 ; 74: 64-71.
11. Kraus RJ, Ganther HE. Reaction of cyanide with glutathione peroxidase. Biochem Biophys Res Commun 1980; 96: 1116-22.
12. Paglia DE, Valentine WN. Studies on the quantitative and qualitative characterization of erythrocyte glutathione peroxidase. J Lab Clin Med 1967; 70: 158-69.
13. Tsai KJ, Hung IJ, Chow CK, Stern A, Chao SS, Chiu DT. Impaired production of nitric oxide, superoxide, and hydrogen peroxide in glucose 6-phosphate-dehydrogenase-deficient granulocytes. FEBS Lett 1998; 436: 411-4.
14. Ramotar D, Belanger E, Brodeur I, Masson JY, Drobetsky EA. A yeast homologue of the human phosphotyrosyl phosphatase activator PTPA is implicated in protection against oxidative DNA damage induced by the model carcinogen 4-nitroquinoline 1-oxide. J Biol Chem 1998; 273: 21489-96.
15. Oesch F. Metabolism of carcinogens, possibilities for modulation. Acta Pharmacol Toxicol (Copenh) 1984;55: 15-33
16. Pawlowicz Z, Zachara BA, Trafikowska U, Maciag A, Marchaluk E, Nowicki A. Blood selenium concentrations and glutathione peroxidase activities in patients with breast cancer and with advanced gastrointestinal cancer. J Trace Elem Electrolytes Health Dis 1991; 5: 275-7. 17. Zachara BA, Marchaluk-Wisniewska E, Maciag A, Peplinski
J, Skokowski J, Lambrecht W. Decreased selenium concentration and glutathione peroxidase activity in blood and increase of these parameters in malignant tissue of lung cancer patients. Lung 1997; 175: 321-32.
18. Howie AF, Forrester LM, Glancey MJ, Schlager JJ, Powis G, Beckett GJ, et al.Glutathione S-transferase and glutathione peroxidase expression in normal and tumour human tissues. Carcinogenesis 1990 ; 11: 451-8.
19. Eriksson LC, Andersson GN. Membrane biochemistry and chemical hepatocarcinogenesis. Crit Rev Biochem Mol Biol 1992; 27: 1-55.
20. Gerber M, Segala C. Aging and cancer: plasma antioxidants and lipid peroxidation in young and aged breast cancer patients. EXS 1992; 62: 235-46.
21. Levy RD, Oosthuizen MM, Degiannis E, Lambrechts H. Elevated reversible and irreversible lipid peroxidation in human oesophageal cancer. Anticancer Res 1998;18: 1325-8.
22. Hietanen E, Punnonen K, Punnonen R, Auvinen O. Fatty acid composition of phospholipids and neutral lipids and lipid peroxidation in human breast cancer and lipoma tissue. Carcinogenesis 1986; 7: 1965-9.
23. Otamiri T, Sjodahl R. Increased lipid peroxidation in malignant tissues of patients with colorectal cancer. Cancer 1989; 64: 422-5.
24. Sunde RA, Hoekstra WG. Structure, synthesis and function of glutathione peroxidase. Nutr Rev 1980; 38: 265-73.
Yazışma Adresi :
Dr.Emel CANBAY Cumhuriyet Üniversitesi
