i
ÖZET
YAŞA BAĞLI MAKULA DEJENERASYONU VE RETİNAL VEN OKLÜZYONU OLAN HASTALARDA MMP-2, MMP-9, MMP-2, TIMP-2 GEN POLİMORFİZMLERİNİN ARAŞTIRILMASI(*)
Matriks metalloproteinazlar (MMPs) kanser, ateroskleroz, anjiogenezis ve vasküler bozukluklar gibi pek çok hastalığın oluşumunda rol oynayan bir grup çinko bağımlı proteazlardır. Dahası vitrektomi örneklerinde metalloproteinaz ve inhibitörlerinin aktivitesinin bulunması, yaş tip yaşa bağlı makula dejeneransı, proliferatif diabetik retinopati ve santral retinal ven oklüzyonu gibi neovaskülarizasyonla ilişkili pekçok hastalıkla ilişkilendirilmiştir. Bu çalışmada biz, matriks metalloproteinaz 2-1306C/T (rs 243865) ve matriks metalloproteinaz doku inhibitörü 2 G-418C (rs 8179090) ile RVT için bir risk faktörü olup olmadığını araştırdık. MMP2-1306C/T ve TIMP2G-418C polimorfizmlerinin genotiplemesi real-time polimeraz zincir reaksiyonu ile yapıldı. MMP2-1306 T allel taşıyıcıları (CT + TT), CC homozigotlarla karşılaştırıldığı zaman RVT için önemli bir riske sahipti. (p < 0.001, odds ratio = 4.78; 95% CI = 2.85-8.09) fakat, TIMP2G-418C gen varyantları RVT gelişimi için bir risk faktörü değildi.
Biz aynı zamanda matriks metalloproteinaz 2-1306C/T (rs 243865) ve matriks metalloproteinaz doku inhibitörü 2 G-418C (rs 8179090) ile yaşa bağlı makula dejenerasyonu (YBMD) için bir risk faktörü olup olmadığını araştırdık. Bu vaka kontrollü prospektif çalışma, 144 YBMD ve 172 kontrol grubundan oluşturuldu. MMP2-1306C/T ve TIMP2G-418C için genotipik ve allelik dağılımları hasta ve kontrol grubu için farklılık göstermedi. Benzer şekilde kuru ve yaş tip YBMD ile bu iki polimorfizm arasında bir fark bulunamadı.
Anahtar Kelimeler: Matriks metalloproteinazlar, polimorfizm, retinal ven tıkanıklığı, yaşa bağlı makula dejenerasyonu.
(*) Bu çalışma Gaziosmanpaşa Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu tarafından desteklenmiştir. (Proje No: 2012/22)
ii ABSTRACT
Matrix metalloproteinases (MMPs) are large groups of zinc-dependent proteases that play an important role in many diseases and pathological processes such as cancer, angiogenesis, atherosclerosis, and vascular disease. Moreover, the presence of metalloproteinase activity and endogenous inhibitor activity in vitrectomy samples are associated with neovascularization of several retinal diseases such as exudative age related maculopathy, proliferative diabetic retinopathy, and central retinal vein occlusion. In this study, we aimed to investigate the possible association of the matrix metalloproteinase 2-1306C/T (rs 243865) and tissue inhibitors of matrix metalloproteinase 2 G-418C (rs 8179090) polymorphisms with the risk of retinal vein occlusion (RVO). Genotyping of the MMP2-1306C/T and TIMP2G-418C polymorphisms were performed using real-time polymerase chain reaction. The MMP2-1306 T allele carriers (CT + TT) had a significantly increased risk of RVO compared with the CC homozygotes (p < 0.001, odds ratio = 4.78; 95% CI = 2.85-8.09). MMP2-1306C/T, but not TIMP2G-418C, gene variants are a risk factor for the development of retinal vein occlusion.
We also investigated that the possible association between the matrix metalloproteinase 2 (-1306C>T) (rs 243865) and tissue inhibitors of matrix metalloproteinase 2 (-418 G>C) (rs 8179090) polymorphisms and the risk of age-related macular degeneration. This case-controlled prospective study included 144 age-related macular degeneration patients and 172 control subjects. Genotype distributions or allelic frequencies of MMP2 (-1306C>T) and TIMP2 (-418 G>C) did not significantly differ between patients with AMD and control subjects. Similarly, no significant differences in either genotype distributions or allelic frequencies of MMP2 (-1306C>T) and TIMP2 (-418 G>C) were found between dry and wet AMD.
Key words: Matrix metalloproteinase, polymorphisms, retinal vein occlusion, age-related macular degeneration
iii ÖNSÖZ
Bu çalışmaya destek veren Gaziosmanpaşa Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu‘na en içten teşekkürleri borç biliriz.
iv İÇİNDEKİLER ÖZET……….i ABSTRACT………ii ÖNSÖZ………...iii ÇALIŞMADAKULLANILAN MALZEMELER……….iv TABLOLAR DİZİNİ……… v 1.GİRİŞ VE GENEL BİLGİLER ... 1 2.MATERYAL VE YÖNTEM ... 2
- Çalışma grubunun seçimi - Örneklerin toplanması ve saklanması - DNA izolasyonu - Polimorfizmlerin tesbit edilmesi -MMP2-1306C/T polimorfizminin tesbit edilmesi -TIMP2G-418C polimorfizminin tesbit edilmesi. 3. BULGULAR ………..………….8
4. SONUÇ VE TARTIŞMA………..12
5. KAYNAKLAR………...14
v
ÇALIŞMADA KULLANILAN MALZELER
-MMP9-1562C/T polimorfizm kiti
-MMP2-1306C/T polimorfizm kiti
-TIMP-2 -418G/C polimorfizm kiti
-PCR plate
TABLOLAR DİZİNİ
Tablo 1. MMP2 (-1306C>T) gen polimorfizminin tespitinde kullanılan primer ve prob setinin dizileri
Tablo 2. MMP2 (-1306C>T) gen polimorfizminin tespitinde kullanılan PCR koşulları Tablo 3. MMP2 (-1306C>T) gen polimorfizminin tespitinde kullanılan PCR prosedürü
Tablo 4. TIMP2 (-418G>C) gen polimorfizminin tespitinde kullanılan primer ve prob setinin dizileri
Tablo 5. TIMP2 (-418G>C) gen polimorfizminin tespitinde kullanılan PCR koşulları Tablo 6. TIMP2 (-418G>C) gen polimorfizminin tespitinde kullanılan PCR prosedürü
Table 7. RVT ve Kontrol grubunundaki MMP2-1306C/T ve TIMP2G-418C‘lerin genotipik ve allelik dağılımı.
Table 8. YBMD ve Kontrol grubunundaki MMP2-1306C/T ve TIMP2G-418C‘lerin genotipik ve allelic dağılımı.
Table 9. Kuru-yaş YBMD ve Kontrol grubunundaki MMP2-1306C/T ve TIMP2G- 418C‘lerin genotipik ve allelic dağılımı
vi
GİRİŞ VE GENEL BİLGİLER
Retinal ven tıkanıklığı (RVT) sınırlı oranda tedavi seçeneği ile en sık görülen körlük nedenlerinden biridir. Vizyon kaybı temel olarak, makuler ödem, neovaskülarizasyon ve neovasküler glokom nedeniyle oluşur. RVT temel olarak, santral retinal ven tıkanıklığı (SRVT) ve dal tıkanıklığı( RVDT) olmak üzere ikiye ayrılır. RVT venöz duvardaki dejeneratif değişiklikler, hemodinamik değişiklikler yanı sıra, koagülasyon bozuklukları sonrası da oluşabilmektedir (Rehak and Wiedemann, 2010). Aterosklerozis sonrası damar duvarındaki hasar, komşu vende staz, tromboz ve oklüzyona neden olabilir (Wong and Scott, 2010). Matriks metalloproteinazlar (MMPs) konnektif dokuda ekstrasellüler matriks döngüsünden sorumlu olan çinko bağımlı proteazlardır. MMP‘ler kanser, anjiogenez, ateroskleroz ve vasküler hastalık gibi pek çok patolojik durumda önemli rol oynar (Benjamin ve Khalil, 2012). Dahası De La Paz ve arkadaşlarının yaptığı bir çalışmada matriks metalloproteinaz aktivitesi, virektomi örneklerinde eksudatif yaşa bağlı makula dejenerasyonu, proliferatf diabetik retinopati ve SRVT ile ilişkisi bulunmuştur (De La Paz ve ark. 1998). İlaveten platelet aktivasyonu, plateletlerden salınan MMP-2 sonucu olabileceği çeşitli çalışmalarda sunulmuştur (Sawicki ve ark.1997; Fernandez-Patron ve ark 1999). MMP‘ler gen transkripsiyonu veya TIMP yolu ile inhibe veya aktive edilir (Zitka ve ark. 2010). Single nukleotid polimorfizmler (SNPs) RVT‗li bazı hastalarda inflamasyon, ateroskleroz ve koagülasyon ilişkili gen polimorfizmlerini etkileyebileceği rapor edilmiştir (Steinbrugger ve ark. 2009; Ortak ve ark. 2012). MMP-2 geninin promotor bölgesinde Sp1-tipi promotor bölgesinde bozulma olduğu ve bunun sonucunda daha düşük aktiviteli T aleline yol açtığı bildirilmiştir. (Price et al.,2001). MMP-2 G-418C (rs 8179090) polimorfizmi TIMP-2 regülatör bölgesi için Sp-1 bağlanmasında azalmaya neden olacağı bildirilmiştir (De Clerck et al., 1994; Hirano et al., 2001).
YBMD, makulada dejeneratif ve neovasküler değişikliklerle karekterize bir hastalıktır (Ambati ve ark. 2003). YBMD klinik ve patolojik özelliklerine göre kuru (nonexudative form) ve yaş (exudative) tipler olmak üzere ikiye ayrılır. Bu hastalık, fotoreseptörleri, retina pigment epitelini (RPE), bruch membranını (BM) ve korikapillarisi etkiler. Klinik teşhis makuladaki druzen, pigmenter değişiklikler ve koroidal neovasküler membranların identifikasyonu ile konur (Ambati ve Fowler 2012). Druzen, RPE ve BM arasında lokalizedir. Druzenin, RPE tarafından ekstrasellüler matriks proteinlerinin atılım yetersizliği sonucu oluştuğu düşünülmektedir (Johnson ve ark. 2000). Erken tip YBMD‘de matriks expansiyonundan dolayı BM‘deki kalınlaşma gösterilmiştir (Nagai ve ark. 2009). BM ‗deki
vii
anormallik, RPE ve koroid arasındaki sıvıların, besinlerin, ve metabolik ürünlerin geçişini bozarak fotoreseptör dejenerasyonuna yol açabilir ( Booij ve ark. 2010). RPE iyonların, besinlerin, ve metabolitlerin transportunda hayati öneme sahiptir. Bu yüzden RPE fotoreseptör metabolizmasında ve vizüel siklüste önemli role sahiptir (Strauss, 2005). Ekstrasellüler matriks komponentleri genellikle MMP‘ler ve onların inhibitörleri tarafından regüle edilir (Vu ve Werb, 2000). MMP‘ler ve inhibitörleri arasındaki dengesizlik kardiyovasküler ve vitreoretinal hastalıklarla ilişkilendirildi. MMP-2 jelatinazların bir üyesi olup kollojen, elastin ve jelatine yapışır (Sethi ve ark. 2000). TIMP2, MMP-2 nin major regülatörüdür ve MMP2 ile MMP-2 doku inhibitörü (TIMP2) koroidal neovasküler membranlarda tesbit edildi (Steen ve ark. 1998). Aynı zamanda, YBMD‘li hastaların interfotoreseptör matrikslerinde artmış MMP2 tesbit edildi ( Plantner ve ark. 1998).
Biz bu çalışmada, MMP9-1562C/T, MMP2-1306C/T ve TIMP-2 -418G/C olimorfizmlerinin hem retinal ven tıkanıklığı grubunda hem de yaşa bağlı makula dejenerasyonu grubunda bu hastalıkaların oluşumunda bir risk faktörü olup olmadıklarını araştırmayı planladık.
MATERYAL ve YÖNTEM
Çalışma Grubunun Seçimi:
Çalışmaya Gaziosmanpaşa üniversitesi göz klinğine başvuran 162 RVT ve 174 kontrol grubundan oluşturuldu. Kontrol grubu rastgele olarak seçilmiş olan konjuktivit, kaşınma, presbiyopi gibi non-spesifik şikayeti olan kişilerden seçildi. 138 (85.2%) hasta BRVT(dal tıkanıklığı) ve 24 (14.2%) hastada CRVT(santral retinal ven tıkanıklığı) tesbit edildi. Teşhis için kullanılan metot daha önce tanımlandığı gibi uygulandı. (Arakawa et al., 2011). Herbir kişiye, biomikroskobik muayayene, fundus muayenesi sorası, renkli fundus fotoğrafları ve fundus floresein anjiografi (FFA) çekildi. (Topcon TRC 50IX; Topcon Corporation, Tokyo, Japan),
Bir diğer çalışmada, FFA ve oftalmik muayene ile tesbit edilmiş 144 YBMD hastası ve 172 kontrol hastası dahil edildi. Kanser, travma, antikoagülan tedavi, anormal karaciğer ve böbrek fonksiyonları olan hastalar çalışma dışında bırakıldı. YBMD için değerlendirme, Age-Related Eye Disease Study (AREDS)‘ e gore yapıldı. . Druzen, pigmenter anomaliler (artmış pigment, depigmentasyon, geografik atrofi) ve neovaskülarizasyon bulguları (retinal pigment epitel dekolmanı, seroz veya hemorajik retina dekolmanı, pigment epitelial hemoraji,
viii
subretinal fibroz doku) tesbit edildi. Çalışma yürütülürken hastane etik onayı alındı. Çalışmalar aynı zamanda Helsinki deklarasyonuna göre yürütüldü.
Örneklerin Toplanması ve Saklanması
Çalışma için gerekli koşulları taşıyan bireylere çalışmamız hakkında bilgi verilmiş ve ―Aydınlatılmış Onam Formu‖ imzalatılarak çalışmaya katılmaları konusunda onayları alınmıştır. Çalışmaya katılan bireylerin rutin tetkikler için verdikleri EDTA içeren tüplere alınan tam kan örnekleri Gaziosmanpaşa Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyokimya Anabilim Dalı Moleküler Biyokimya Laboratuarı‘nda +4 °C‘de muhafaza edilmiştir. Toplanan tam kanlardan elde edilen DNA örnekleri çalışma için gerekli sayıya ulaşana kadar -80 °C‘de saklanmıştır.
DNA İzolasyonu
Tam kandan DNA izolasyonu Vivantis marka GF-1 Blood DNA Extraction Kit kullanılarak yapıldı. DNA izolasyonu için aşağıdaki prosedür uygulanmıştır.
EDTA‘lı tüpte bulunan tam kan oda sıcaklığına getirildikten sonra alt-üst edilerek homojenize edilmiştir.
EDTA‘lı tüpte bulunan tam kandan 200 μL 1,5 mL hacimli tüpe alınmıştır.
Tüpe alınan tam kanın üzerine 200 μL binding buffer ve 20 μL proteinaz K konduktan sonra karıştırılmıştır.
Isı bloğunda 10 dakika boyunca 65°C sıcaklığında beklemeye bırakılmıştır.
Bekleyen karışım üzerine 200 μL saf etanol eklendikten sonra tekrar karıştırılmıştır. Filtreli tüpe konulan karışım 1 dk süreyle 5000 rpm‘ de santrifüj edilmiştir.
Dipte kalan sıvı uzaklaştırılmıştır.
Filtreli tüpe 500 μL wash buffer 1 eklenmiştir.
Filtreli tüp1 dk süreyle 5000 rpm‘ de santrifüj edilmiştir. Dipte kalan fazla sıvı uzaklaştırılmıştır.
Filtreli tüpe 500 μL wash buffer 2 filtreli tüpe eklenmiştir. Filtreli tüp 1 dk süreyle 5000 rpm‘ de santrifüj edilmiştir. Dipte kalan fazla sıvı uzaklaştırılmıştır.
ix
Filtreli tüpe 500 μL wash buffer 2 tekrar eklenmiştir. Filtreli tüp 3 dk süreyle 5000 rpm‘ de santrifüj edilmiştir. Dipte kalan fazla sıvı uzaklaştırılmıştır.
Filtreli tüp10 saniye süreyle 13,000 rpm‘de santrifüj edilmiştir. Filtreli tüp yeni bir tüpe alınmıştır.
Önceden 65°C sıcaklıkta ısıtılmış 100 μL elution buffer filtreli tüpe konulmuştur. 5000 rpm‘de 1 dk süreyle santrifüj edildi ve filtre uzaklaştırılmıştır.
Tüp içerisinde kalan sıvıda DNA elde edilmiştir.
Polimorfizmlerin Tespit Edilmesi
MMP2 (-1306C>T) ve TIMP2 (-418G>C) polimorfizmlerinin tespiti Real-Time PCR yöntemi ile Floresan Rezonans Enerji Transfer (FRET) hibridizasyon probları kullanılarak ve erime eğrisi analizi yapılarak gerçekleştirilmiştir. Hibridizasyon prob yönteminde farklı floresan boyalarla etiketli, donör ve akseptör adı verilen istenen diziye özgü oligonükleotit problar kullanılmıştır. Bu problar PCR ile çoğalan DNA fragmanının hedef dizilerine hibritleşmektedir, bu durum floresan boya ile işaretli iki probu birbirine yakın hale getirmektedir. Donör boya uygun uyarma filtresi seçilerek uyarılmaktadır. İki boya birbirine yakınken floresan işaretli akseptör prob farklı bir dalga boyunda floresan ışığı yaymaktadır. Floresan işaretli iki probun arasındaki bu etkileşime FRET denilmektedir. Yayılan floresan ışıma miktarı, PCR sırasında üretilen hedef DNA miktarı ile doğru orantılıdır. Bu sayede PCR ile gerçekleşen DNA artışı gözlenebilir hale getirilmektedir. PCR işleminin hemen sonrasında uygulanan erime eğrisi analiziyle polimorfizm tespiti yapılmaktadır. Erime eğrisi analizi PCR ürünlerinin PCR sonrası analizi, PCR ürün karakterizasyonu veya mutasyonların tespiti için kullanılmaktadır. Erime eğrisi analizinin prensibi mutasyon taşımayan hedef diziye göre tasarlanmış bir hibridizasyon probunun kendine mükemmel uyan mutasyonsuz diziyle eşleşmesi durumunda, tek nükleotit polimorfizmi taşıyan hedef diziyle eşleşmesinden daha yüksek sıcaklıklarda erimesi temeline dayanmaktadır. Çünkü mükemmel olarak eşleştirilmiş prob (örneğin normal tipe özgül prob) daha kararlı olduğundan, yanlış eşleştirilmiş tekli nükleotit mutasyonu taşıyan bir hedef diziye bağlı olan probdan daha yüksek sıcaklıkta eriyecektir. Hibridizasyon problarının altındaki sıcaklıklarda, floresan işaretli prob çifti hedef diziyle eşleşir ve bu donör probu akseptör probla yakınlaştırarak FRET üretir. Sıcaklık
x
probların erime derecesine yükseldikçe prob çifti ayrılacak ve artık FRET üretmeyecektir. Bu erime floresan sinyalinde düşüşe neden olur. Sonuçta polimorfizm taşıyan ve taşımayan diziler tespit edilebilmektedir.
Real-Time PCR ve erime eğrisi analizi LightCycler® 480 II (Roche Diagnostics Ltd., Rotkreuz, Swirzerland) cihazında, LightCycler® 480 Software 1.5.0 yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Uygulanan Real-Time PCR işlemi sonunda DNA miktarındaki artışı gösteren amplifikasyon eğrisi, erime eğrisi analizi sonucu elde edilen eğrime eğrisi ve erime eğrisinden elde edilen erime piki grafikleri elde edilmiştir. Elde edilen bu grafiklere göre MMP2 (-1306C>T) ve TIMP2 (-418G>C) gen polimorfizmlerinin tespiti yapılmıştır.
MMP2 (-1306C>T) Gen Polimorfizminin Tespit Edilmesi
MMP2 (-1306C>T) gen polimorfizminin tespiti için gerekli primer ve hibridizasyon prob seti (Metabion international AG, Deutschland) sentezlettirilmiştir. Primer ve probe dizileri Tablo 1‘de gösterilmiştir.
Tablo 1. MMP2 (-1306C>T) gen polimorfizminin tespitinde kullanılan primer ve prob setinin dizileri
Primer/Prob Oligonükleotit Dizisi
Forward Primer: 5‘- ACTTTCTTCTCCAGTGCC-3‘
Rewerse Primer: 5‘-TAAACTAGTAAAGACAATCAAGGAAGG-3‘
Prob1: 5‘-ACCCAGCACTCCACCTCTTT—FL
Prob2: 5‘-LCRed640-CTCTTCAGGTCTCAGCTCAGAAGTCACTTC-PH
MMP2 (-1306C>T) gen polimorfizminin tespiti için PCR karışımı optimizasyonu Tablo 2‘de görüldüğü gibi gerçekleştirilmiştir.
xi
Tablo 2. MMP2 (-1306C>T) gen polimorfizminin tespitinde kullanılan PCR koşulları
İçerik Hacim Başlangıç
Konsantrasyonu
Son Konsatrasyon
Forward Primer 2 µL 5 pmol/mL 0,5 mM
Reverse Primer 2 µL 5 pmol/mL 0,5 mM
Prob1 2 µL 1,5 pmol/mL 0,15 mM
Prob2 2 µL 1,5 pmol/mL 0,15 mM
MgCl2 1,6 µL 25 mM 2 mM
FastStart Master Mix 2 µL 10X 1X
Kalıp DNA 5 µL 40 ng/mL 10 ng/mL
H2O 3,4 µL - -
Toplam hacim 20 µL - -
Hazırlanan PCR karışımı polimorfizm tespiti yapmak üzere LightCycler 480 II cihazına yerleştirilmiştir ve aşağıdaki Tablo xxx.‘de gösterilen PCR prosedürü izlenecek şekilde PCR işlemi başlatılmıştır.
Tablo 3. MMP2 (-1306C>T) gen polimorfizminin tespitinde kullanılan PCR prosedürü
PCR Aşaması Sıcaklık Süre Döngü Sayısı
Denaturasyon 95°C 600 sn 1 Amplifikasyon 95°C 10 sn 35 52°C 15 sn (Tek Okuma) 72°C 25 sn
Erime Eğrisi Analizi
95°C 30 sn
1
45°C 60 sn
80°C 0,1 °C/sn (Sürekli Okuma)
xii
Çalışma sonunda oluşan erime eğrisinde, pik derecelerine göre hasta ve kontrol grubuna ait bireylerin genotiplendirilmeleri MMP2 (-1306C>T) polimorfizmi için; MMP2 (-1306 C/C), MMP2 (-1306 C/T) ve MMP2 (-1306 T/T) olarak belirlenmiştir.
TIMP2 (-418G>C) Gen Polimorfizminin Tespit Edilmesi
TIMP2 (-418G>C) gen polimorfizminin tespiti için gerekli primer ve hibridizasyon prob seti (Metabion international AG, Deutschland) sentezlettirilmiştir. Primer ve probe dizileri Tablo 4’de gösterilmiştir.
Tablo 4. TIMP2 (-418G>C) gen polimorfizminin tespitinde kullanılan primer ve prob setinin dizileri
Primer/Prob Oligonükleotit Dizisi
Forward Primer: 5‘-GGGATCTGTCAGTTTCTCAATA-3‘ Rewerse Primer: 5‘-CCCTTCAGCTCGACTCT-3‘
Prob1: 5‘-CCCCGGGGTCCCTTCGAG-FL
Prob2: 5‘-LCRed640-CAGCCTCGGGGCGAG-PH
TIMP2 (-418G>C) gen polimorfizminin tespiti için PCR karışımı optimizasyonu Tablo 5‘de görüldüğü gibi gerçekleştirilmiştir.
xiii
Tablo 5. TIMP2 (-418G>C) gen polimorfizminin tespitinde kullanılan PCR koşulları
İçerik Hacim Başlangıç
Konsantrasyonu
Son Konsatrasyon
Forward Primer 2 µL 5 pmol/mL 0,5 mM
Reverse Primer 2 µL 5 pmol/mL 0,5 mM
Prob1 2 µL 1,5 pmol/mL 0,15 mM
Prob2 2 µL 1,5 pmol/mL 0,15 mM
MgCl2 1,6 µL 25 mM 2 mM
FastStart Master Mix 2 µL 10X 1X
Kalıp DNA 5 µL 40 ng/mL 10 ng/mL
H2O 3,4 µL - -
Toplam hacim 20 µL - -
Hazırlanan PCR karışımı polimorfizm tespiti yapmak üzere LightCycler 480 II cihazına yerleştirilmiştir ve aşağıdaki Tablo xxx.‘de gösterilen PCR prosedürü izlenecek şekilde PCR işlemi başlatılmıştır.
Tablo 6. TIMP2 (-418G>C) gen polimorfizminin tespitinde kullanılan PCR prosedürü
PCR Aşaması Sıcaklık Süre Döngü Sayısı
Denaturasyon 95°C 600 sn 1 Amplifikasyon 95°C 10 sn 45 50°C 15 sn (Tek Okuma) 72°C 25 sn
Erime Eğrisi Analizi
95°C 60 sn
1
40°C 90 sn
75°C 0,1 °C/sn (Sürekli Okuma)
Soğutma 40°C 30 sn 1
Çalışma sonunda oluşan erime eğrisinde, pik derecelerine göre hasta ve kontrol grubuna ait bireylerin genotiplendirilmeleri TIMP2 (-418G>C) polimorfizmi için; TIMP2 (-418 G/G), TIMP2 (-418 G/C) ve TIMP2 (-418 C/C) olarak belirlenmiştir.
xiv BULGULAR:
RVT hastaları ve kontrol grubunundaki, MMP2-1306C/T ve TIMP2G-418C‘lerin genntipik ve alleleik frekanslarının dağılımı tablo 7’de sunulmuştur. MMP2-1306 T alleli taşıyıcılarında (CT+TT), CC homozigotlara gore RVT için önemli bir risk artışı olduğu tesbit edildi. (p<0.001, odds ratio=4.78; 95% CI=2.85-8.09).
Tablo 7. RVT ve Kontrol grubunundaki MMP2-1306C/T ve TIMP2G-418C‘lerin genotipik ve allelik dağılımı. RVO patients N=162 Control subjects N=174 P (Pc) 0R (95%CI) MMP2-1306C/T C/C 78 (48%) 142 (82%) ≤0.001(≤0.001) C/T 80 (50%) 32 (18%) T/T 4 (2%) 0 (0%) CC:CT+TT 78 (48%): 84 (52%) 142 (82%): 32 (18%) ≤0.001(≤0.001) 4.78(2.85-8.09) Allele frequency C 236 (73%) 316 (91%) ≤0.001(≤0.001) 3.68(2.39-5.76) T 88 (27%) 32 (9%) TIMP2G-418C G/G 162 (100%) 170 (98%) 0.124 G/C 0 (0%) 4 (2%) C/C 0 (0%) 0 (0%) Allele frequency G 324 (100%) 344 (99%) 0.071 0.12 (0.46-157.37) C 0 (0%) 4 (1%)
xv
RVO: retinal vein occlusion, MMP: matrix metalloproteinase, TIMP: tissue inhibitors of matrix metalloproteinase
YBMD hastaları ve kontrol grubunundaki, MMP2-1306C/T ve TIMP2G-418C‘lerin genntipik ve alleleik frekanslarının dağılımı tablo 8‘de sunulmuştur. MMP2 1306C>T) and TIMP2 (-418 G>C) genotipik ve allelic frekansaları açısından YBMD ve kontrol grubu arasında öenmli bir fark tesbit edilmedi. Genotype distributions or allelic frequencies of MMP2 (-1306C>T) and TIMP2 (-418 G>C) did not significantly differ between patients with AMD and control subjects. Benzer şekilde yaş-kuru tip YBMD ve kontrol grubu arasında MMP2 (-1306C>T) veya TIMP2 (-418 G>C) için allelic ve genotipik olarak fark tesbit edilmedi. Tablo 9
xvi
Tablo 8. YBMD ve Kontrol grubunundaki MMP2-1306C/T ve TIMP2G-418C’lerin genotipik ve allelic dağılımı.
YBMD n= 144 (%) Kontrol n=172 (%) P 0R (95%CI) MMP2 (-1306C>T) (rs 243865) C/C 80 (55%) 108 (63%) 0.051 C/T 60 (42%) 64 (37%) T/T 4 (3%) 0 (0%) Allele frequency 0.063 0.74(0.50-1.09) C 220 (76%) 280 (81%) T 68 (24%) 64 (19%) TIMP2 (-418G>C) (rs 8179090) G/G 144(100%) 170 (99%) 0.50 G/C 0 (0%) 2(1%) C/C 0 (0%) 0 (0%) Allele frequency 0.29 4.21(0.20-87.63) G 288 (100%) 342 (99%) C 0 (0%) 2 (1%)
xvii
Tablo 9. Kuru-yaş YBMD ve Kontrol grubunundaki MMP2-1306C/T ve TIMP2G-418C’lerin genotipik ve allelic dağılımı
Kuru YBMD n=107 YAŞ YBMD n=37 Kontrol n=172 (%) P (Pc) 0R (95%CI) MMP2 (-1306C>T) (rs 243865) C/C 59(55%) 21(57%) 108 (63%) a0.023(0.07) C/T 44(41%) 16(43%) 64 (37%) b0.519 T/T 4(4%) 0(0%) 0 (0%) Allele frequency a 0.097 b 0.467 a 1.40(0.93-2.12) b 1.21(0.64-2.21) C 162(76%) 58(78%) 280 (81%) T 52(24%) 16(22%) 64 (19%)
Pc Bonferroni correction, a Dry v.s control, bWet v.s control
xviii
TARTIŞMA VE SONUÇ
Bu çalışmada, MMP2-1306C/T, TIMP2G-418C polimorfizmlerinin RVT için bir risk faktörü olup olmadığını araştırmayı amaçladık. RVT ile MMP2-1306C/T polimorfizmi arasında bir ilişki bulurken, TIMP2G-418C arasında bir ilişki bulunamadı. MMP2-1306 T allel taşıyıcıları (CT + TT), CC homozigotlara göre RVT için önemli bir risk faktörü idi.
Retinal arter/ven çaprazlaşma yerlerindeki aterosklerotik değişiklikler venöz endotelial hücrelerde değişime neden olmakta ve bu da RVDT patogenezinden sorumlu tutulmaktadır (Yu ve ark. 2012). Artan arter rijiditesi alttaki veni komprese eder ve kan akımında türbülansa neden olur. Artan bu türbülans endotelial hücreleri hasara uğratır ve bu da venöz oklüzyona neden olabilir (Rehak ve Rehak, 2008). Biz hipotez ettik ki, artmış RVT riski daha önce bildirilmiş olan MMP-2 ile ilişkili ateroskleroz ile bağlantılı olabilir (Li ve ark. 1996). Buna ilaveten MMP‘ler aynı zamanda platelet fonksiyonu ile de ilişkili idi (Fernandez-Patron ve ark. 1999). Platelette oluşabilecek agregasyona eğilim RVT gelişimine katkı sağlayabilir (Leoncini ve ark. 2007). Damar duvarındaki platelet kollojen etkileşimi, en trombojenik durum olduğu düşünülür (Harsfalvi ve ark. 1995). Aynı zamanda MMP-2 platelet stoplazmasında latent olarak depolanır ve platelet agregasyonu , plateletlerden MMP-2 aracılı olarak yapılır (Sawicki ve ark. 1997). Fibrinojene platelet adhezyonu, plateletlerden MMP-2 salınımı ile artırılır (Martinez ve ark. 2001) Dahası MMP-2 proagratuvar etki gösterir (Falcinelli ve ark. 2005).
DNA-protein protein etkileşimleri gösterdi ki, ciddi koroner ateroskleroz ile ilişki olarak T allelleri daha yüksek aktiviteye sahiptir (Zhang ve ark. 1999 ;Medley ve ark. 2004). Aynı zamanda, MMP-9 1562 T allelleri mikroanjiopatili diabetli hastalarda daha yüksek olduğu bulundu (Wang ve ark. 2010). Das ve arkadaşları tarafından, proliferatif diabetik retinopatili hastalardan elde edilen epiretinal membranlarda, normal retinalardakinden daha fazla pro-MMP2, aktive pro-MMP2, pro-MMP9 olduğu tesbit edildi (Das ve ark. 1999). Daha sonra Steen ve ark. tarafından neovasküler yaşa bağlı makula dejenerasyonu olan hastalardan elde edilen fibrovasküler membranlardan elde edilen dokuda MMP2 ekspresyonunun temel olarak vasküler endotelial hücrelerde lokalize olduğu sunuldu. (Steen ve ark. 1998). Bir diğer çalışmada ise, Lambert ve arkadaşları gösterdi ki koroidal patolojik anjiogenezis MMP2/MMP9 geni eksik ratlarda neredeyse tama yakın inhibe edildiğini gösterdiler (Lambert ve ark.2003).
xix
Ekstrasellüler matriks döngüsündeki bozulma YBMD patogenezinde önemli bir rol oynar (Marin-castano ve ark. 2006). MMP2, RPE ‗de bulunan en bol ve en önemli proteazdır ( Plantner ve ark. 1998). İlaveten MMP2 RPE bazal membranı ve BR ‗deki ECM(ekstrasellüler matriks) proteinlerinin yıkımından sorumludur ( Evans, 2001). Dahası BM‘deki, sub-RPE depozitlerin progresyonu için ECM proteinlerin yıkımı gereklidir. BR aynı zamanda koroid ve sub-RPE arasında fiziksel bir bariyerdir. Aynı zamanda MMP2 aracılı ECM döngüsü için bu fiziksel bariyerin bozulması gereklidir (Pons ve ark. 2011). BM‘nin elastik tabakası YBMD‘li hastalarda daha kalın ve daha düşük integriteye sahiptir (Chong ve ark. 2009). Aynı zamanda elastin fibrillerindeki disfonksiyon neovasküler proçesin başlamasında önemli bir rol oynayabilir (Nackman ve ark. 1997). Sorsby‘s fundus distrofisi gibi hastalıklarda genetik değişikliklerden dolayı koroidal neovasküler membran oluşabilir (Weber ve ark. 1994). TIMP3 mutasyonları ile ilişkilendirilen Sorsby‘s fundus distrofisi YBMD‘ye benzer şekilde BM‘de depozitler ve neovaskülarizasyonla karekterizedir (Weber ve ark. 1994). Biz bu çalışmada aynı zamanda MMP2 (-1306C/T) ve TIMP2 (-418 G/C polimorfzimleri ile YBMD arasındki ilişkiyi araştırdığımızda genotip dağılımları ve allelik frekansları arasında anlamlı bir fark bulamadık. Aynı zamanda kuru ve yaş tip YBMD açısından değerlendirdiğimizde de anlamlı bir fark bulamadık.
MMP gen ekspresyonu temel olarak transkripsiyonel mekanizmalar yanında epigenetik mekanizmalarla kontrol edilir (Yan ve Boyd, 2007). YBMD hastalarının subretinal alanında artmış miktarda MMP2 bulundu fakat tesbit edilen bu enzimlerin büyük çoğunluğu inaktif durumda idi (Plantner ve ark. 1998). İnaktif MMP, BM‘nin remodelinginde sebepten ziyade bir muhtemelen bir sonucu idi. Artmış ECM komponentleri MMP‗lerin artışına neden olmuş olabilir. Ancak bu olay TIMP‘lerin konsantrasyonunda da artışa yol açabilir (Ambati ve ark.2003). Daha sonra Hussain ve arkadaşları rapor etti ki, aktif MMP2 sonucu oluşan BM deki bozulmuş matriks yıkımına ve sonucunda da bunun da YBMD gelişiminden sorumlu olabilir( Hussein ve ark. 2011). İlaveten Ahir ve ark. gösterdi ki in vitro aktive MMP2, MMP9 BM‘deki sıvı akımını artırmıştır (Ahir ve ark. 2002). Chau ve arkadaşları plasma MMP2 seviyelerini YBMD‘li hastalar ve kontrol grubu arasında fark bulamazken, plasma MMP9 seviyesi ise kontrol grubuna göre yaklaşık üç kat yüksek bulunmştur (Chau ve ark. 2008)
Sonuç olarak MMP2 (-1306C/T) polimorfizmi ile RVT riski arasında önemli bir ilişki bulunurken, TIMP2 (-418 G/C) polimorfizmi arasında bir ilişki bulunamadı. YBMD ile MMP2 (-1306C/T) ve TIMP2 (-418 G/C) polimorfizmleri arasında bir ilişki bulunamadı.
xx
MMP9-1562C/T polimorfizm kiti, pek çok kez denenmasine rağmen PCR’da yeterli ve güvenli pik elde edilemediği için çalışmaya dahil edilmedi.
KAYNAKLAR
Ahir A, Guo L, Hussain AA, Marshall J. Expression of metalloproteinases from human retinal pigment epithelial cells and their effects on the hydraulic conductivity of Bruch‘s membrane. Invest Ophthalmol Vis Sci 2002;43: 458–465.
Ambati J, Ambati BK, Yoo SH, et al. Age-related macular degeneration: etiology, pathogenesis, and therapeutic strategies. Surv Ophthalmol 2003;48:257–293.
Ambati J, Fowler BJ. Mechanisms of age-related macular degeneration. Neuron 2012;75:26– 39. 3. Hageman GS, Mullins RF. Molecular composition of drusen as related to substructural phenotype. Mol Vis 1999;5:28.
Arakawa, S., Yasuda, M., Nagata, M., Ninomiya, T., Hirakawa, Y., et al., 2011. Nineyear incidence and risk factors for retinal vein occlusion in a general Japanese population: the Hisayama Study. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 5905e5909.
Benjamin, M.M., Khalil, R.A., 2012. Matrix metalloproteinase inhibitors as investigative tools in the pathogenesis and management of vascular disease. EXS 103,209e279.
Booij JC, Baas DC, Beisekeeva J, et al. The dynamic nature of Bruch‘s membrane. Prog Retin Eye Res 2010;29:1–18.
Brassart, B., Randoux, A., Hornebeck, W., Emonard, H., 1998. Regulation of matrix metalloproteinase-2 (gelatinase A, MMP-2), membrane-type matrix metalloproteinase-1 (MT1-MMP) and tissue inhibitor of metalloproteinases-2(TIMP-2) expression by
elastin-xxi
derived peptides in human HT-1080 fibrosarcoma cell line. Clin. Exp. Metastasis 16, 489e500.
Chau KY, Sivaprasad S, Patel N, et al. Plasma levels of matrix metalloproteinase-2 and -9 (MMP-2 and MMP-9) in age-related macular degeneration. Eye (Lond) 2008;22: 855–859.
Chong NH, Keonin J, Luthert PJ, et al. Decreased thickness and integrity of the macular elastic layer of Bruch‘s membrane correspond to the distribution of lesions associated with age-related macular degeneration. Am J Pathol 2005;166:241–251.
Das, A., McGuire, P.G., Eriqat, C., Ober, R.R., DeJuan Jr., E., et al., 1999. Human diabetic neovascular membranes contain high levels of urokinase and metalloproteinase enzymes. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 809e813.
Davis MD, Gangnon RE, Lee LY, et al; Related Eye Disease Study Group. The Age-Related Eye Disease Study severity scale for age-related macular degeneration: AREDS Report No. 17. Arch Ophthalmol 2005;123: 1484–1498.
De Clerck, Y.A., Darville, M.I., Eeckhout, Y., Rousseau, G.G., 1994. Characterization of the promoter of the gene encoding human tissue inhibitor of metalloproteinases-2 (TIMP-2). Gene 139, 185e191.
De La Paz, M.A., Itoh, Y., Toth, C.A., Nagase, H., 1998. Matrix metalloproteinases and their inhibitors in human vitreous. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39, 1256e1260. Diagnosis and classification of diabetes mellitus. Diabetes Care 33 (Suppl. 1), 2010, S62eS69.
Evans JR. Risk factors for age-related macular degeneration. Prog Retin Eye Res 2001;20:227–253.
Falcinelli, E., Guglielmini, G., Torti, M., Gresele, P., 2005. Intraplatelet signaling mechanisms of the priming effect of matrix metalloproteinase-2 on platelet aggregation. J. Thromb. Haemost. 3, 2526e2535.
xxii
Fernandez-Patron, C., Martinez-Cuesta, M.A., Salas, E., Sawicki, G., Wozniak, M., et al., 1999. Differential regulation of platelet aggregation by matrix metalloproteinases-9 and -2. Thromb. Haemost. 82, 1730e1735.
Harsfalvi, J., Stassen, J.M., Hoylaerts, M.F., Van Houtte, E., Sawyer, R.T., et al., 1995. Calin from Hirudo medicinalis, an inhibitor of von Willebrand factor binding to collagen under static and flow conditions. Blood 85, 705e711.
Hirano, K., Sakamoto, T., Uchida, Y., Morishima, Y., Masuyama, K., et al., 2001. Tissue inhibitor of metalloproteinases-2 gene polymorphisms in chronic obstructive pulmonary disease. Eur. Respir. J. 18, 748e752.
Hussain AA, Lee Y, Zhang JJ, Marshall J. Disturbed matrix metalloproteinase activity of Bruch‘s membrane in agerelated macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci 2011;52:4459–4466.
Johnson LV, Ozaki S, Staples MK, et al. A potential role for immune complex pathogenesis in drusen formation. Exp Eye Res 2000;70:441–449.
Lambert, V., Wielockx, B., Munaut, C., Galopin, C., Jost, M., et al., 2003. 2 and MMP-9 synergize in promoting choroidal neovascularization. FASEB J. 17, 22MMP-90e 22MMP-92.
Leoncini, G., Bruzzese, D., Signorello, M.G., Armani, U., Piana, A., et al., 2007. Platelet activation by collagen is increased in retinal vein occlusion. Thromb. Haemost. 97, 218e227.
Li, Z., Li, L., Zielke, H.R., Cheng, L., Xiao, R., et al., 1996. Increased expression of 72-kd type IV collagenase (MMP-2) in human aortic atherosclerotic lesions. Am. J. Pathol. 148, 121e128.
Marin-Castan˜o ME, Striker GE, Alcazar O, et al. Repetitive nonlethal oxidant injury to retinal pigment epithelium decreased extracellular matrix turnover in vitro and induced sub-RPE deposits in vivo. Invest Ophthalmol Vis Sci 2006;47:4098–4112.
Martinez, A., Salas, E., Radomski, A., Radomski, M.W., 2001. Matrix metalloproteinase-2 in platelet adhesion to fibrinogen: interactions with nitric oxide. Med. Sci. Monit. 7, 646e651.
xxiii
Medley, T.L., Cole, T.J., Dart, A.M., Gatzka, C.D., Kingwell, B.A., 2004. Matrix metalloproteinase-9 genotype influences large artery stiffness through effects on aortic gene and protein expression. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24,1479e1484.
Nackman GB, Karkowski FJ, Halpern VJ, et al. Elastin degradation products induce adventitial angiogenesis in the Anidjar/Dobrin rat aneurysm model. Surgery 1997; 122:39–44.
Nagai N, Klimava A, Lee WH, et al. CTGF is increased in basal deposits and regulates matrix production through the ERK (p42/p44mapk) MAPK and the p38 MAPK signaling pathways. Invest Ophthalmol Vis Sci 2009;50: 1903–1910.
Ortak, H., Sögüt, E., Demir, H., Ardagil, A., Benli, I., Sahin, S., 2012. Predictive value of the vitamin K epoxide reductase complex subunit 1 G-1639A and C1173T single nucleotide polymorphisms in retinal vein occlusion. Clin. Experiment. Ophthalmol. 40, 743e748.
Plantner JJ, Jiang C, Smine A. Increase in interphotoreceptor matrix gelatinase A (MMP-2) ssociated with age-related macular degeneration. Exp Eye Res 1998;67: 637–645.
Pocsai, Z., Tóth, Z., Paragh, G., Széles, G., Adány, R., 2003. Rapid genotyping of paraoxonase 55 and 192 mutations by melting point analysis using real time PCR technology. Clin. Chim. Acta 332, 31e36.
Pons M, Cousins SW, Alcazar O, et al. Angiotensin II-induced MMP-2 activity and MMP-14 and basigin protein expression are mediated via the angiotensin II eceptor type 1-mitogen-activated protein kinase 1 pathway in retinal pigment epithelium: implications for agerelated macular degeneration. Am J Pathol 2011;178: 2665–2681.
Price, S.J., Greaves, D.R., Watkins, H., 2001. Identification of novel, functional genetic variants in the human matrix metalloproteinase-2 gene: role of Sp1 in allelespecific transcriptional regulation. J. Biol. Chem. 276, 7549e7558.
Rehak, J., Rehak, M., 2008. Branch retinal vein occlusion: pathogenesis, visual prognosis, and treatment modalities. Curr. Eye Res. 33, 111e131.
xxiv
Rehak, M., Wiedemann, P., 2010. Retinal vein thrombosis: pathogenesis and management. J. Thromb. Haemost. 8, 1886e1894.
Sawicki, G., Salas, E., Murat, J., Miszta-Lane, H., Radomski, M.W., 1997. Release of gelatinase A during platelet activation mediates aggregation. Nature 386, 616e 619.
Sethi CS, Bailey TA, Luthert PJ, Chong NH. Matrix metalloproteinase biology applied to vitreoretinal disorders. Br J Ophthalmol 2000;84:654–666.
Srivastava, P., Lone, T.A., Kapoor, R., Mittal, R.D., 2012. Association of promoter polymorphisms in MMP2 and TIMP2 with prostate cancer susceptibility in north India. Arch. Med. Res. 43, 117e124.
Steen B, Sejersen S, Berglin L, et al. Matrix metalloproteinases and metalloproteinase inhibitors in choroidal neovascular membranes. Invest Ophthalmol Vis Sci 1998;39: 2194– 2200.
Steen, B., Sejersen, S., Berglin, L., Seregard, S., Kvanta, A., 1998. Matrix metalloproteinases and metalloproteinase inhibitors in choroidal neovascular membranes. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39, 2194e2200.
Steinbrugger, I., Haas, A., Maier, R., Renner, W., Mayer, M., 2009. Analysis of inflammation- and atherosclerosis-related gene polymorphisms in branch retinal vein occlusion. Mol. Vis. 15, 609e618.
Strauss O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol Rev 2005;85:845–881.
Vu TH, Werb Z. Matrix metalloproteinases: effectors of development and normal physiology. Genes Dev 2000;14: 2123–2133.
Wang, Y., Su, Y., Xu, Y., Pan, S.H., Liu, G.D., 2010. Genetic polymorphism c.1562C>T of the MMP-9 is associated with macroangiopathy in type 2 diabetes mellitus. Biochem. Biophys. Res. Commun. 391, 113e117.
xxv
Weber BH, Vogt G, Pruett RC, et al. Mutations in the tissue inhibitor of metalloproteinases-3 (TIMP3) in patients with Sorsby‘s fundus dystrophy. Nat Genet 1994;8:352–356.
Wong, T.Y., Scott, I.U., 2010. Clinical practice. Retinal-vein occlusion. N. Engl. J. Med. 363, 2135e2144.
Yan C, Boyd DD. Regulation of matrix metalloproteinase gene expression. J Cell Physiol 2007;211:19–26.
Yu, P.K., Tan, P.E., Morgan, W.H., Cringle, S.J., McAllister, I.L., Yu, D.Y., 2012. Agerelated changes in venous endothelial phenotype at human retinal artery-vein crossing points. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 1108e1116.
Zhang, B., Ye, S., Herrmann, S.M., Eriksson, P., de Maat, M., et al., 1999. Functional polymorphism in the regulatory region of gelatinase B gene in relation toseverity of coronary atherosclerosis. Circulation 99, 1788e1794.
Zhang, L.Y., Ren, K.,W., 2011. Meta-analysis of MMP2 -1306T allele as a protective factor in digestive cancer. Arch. Med. Res. 42, 239e243.
Zitka, O., Kukacka, J., Krizkova, S., Huska, D., Adam, V., et al., 2010. Matrix metalloproteinases. Curr. Med. Chem. 17, 3751e3768.
