AnLıra Gniv Yet rak Derg, 48, 27-34,2001
İçme suyu ile farklı dozda ve değişik sürede kurşun alımının albino
farelerde böbrek ve sinir sistemi üzerine etkisi'
Arif ALTINTAŞı, Ali BİLGİLF, Sefa ÇELİKI, Gökhan ERASLAN
2iAnkara Cniversitesi, Ycteriner Fakültesi, Biyokimya Anahilim Dalı, Ankara; : Ankara Üniversitesi, Yeterliler hıkıiltesl.
Farmakoloji ve Toksikoloji Anahilim Dalı, Ankara
Özet: Çalı~mada, ıçme suyu ile kronik olarak 250 ve ](}()O ppm kurşun (asetat şeklinde) alımının hıihrek \T sinır .sistemi
ıiıe-rine ctkisinin alhino farelcrde ineelenmesi amaçlanmıştır. Aynı deneme koşullarında pelct yem ile heslenen ve aynısııyu tliketcıı
3S-40 g a~ırlığında 6 aylık toplam 120 erkek heyaz fare (Swiss alhino) çalışmanın ımıteryalinı oluştıırmuştur. Denemenin ikınl'1. (içlineıı ve dtirdlinl'li aylarında hayvanlardan kan \'e idrar örnekleri alınarak biriktirilmi~ (pool) ve serum örneklerinde iirc. kre,llinin. alhlinıın. kreatinin-fosfokınaz. kolinesteraL ve monoaminoksidaL analizleri; idrar örneklerinde ise. protein ei"ktroforezi gerçekle.~tırilnnş ve Iıay\'anların davranı~ı.ırı izlenmi~tir. Araştırma sonunda, kronik kurşun alımıııın fareİerde höbrek ve sinir sistemini oluııısuı etkiledığı ve klıııik hiyokimyasal olarak tuhulcr proteinliri. serum eıııim değerlerinde artış, titremeler ve davranı~ hozuklukları ile kcndini gıis tı:rdıği, titremeıcrin yliksek serum MAO aktivitesi ilc ilişkili olduğu. serıım kreatinin de~erlerinin denemenin dilrdiinl'ii ayında yiik seldiği saptanmı~ ve serumda CPK ve idrarda 36 kDa protein değer artışlarıııın kronik kurşun alımının dol. ili~kilı helinel,lerı ola-Inleeeği kaııısına varılmıştır.
Anahtar kelimeler: Alhino fare. höhrek toksisitesi, idrar protein clektroforezi. kronik kurşun alımı. sinir toksisitesi
Effeets of the chronic Icad intake via drinking water on the kidney and nervous
system of albino mice
Summary: The purpose of this stııdy was to investigate the efrı:cts of the ehronil' Iead intakl' \'ia drinking water ,ıt tlıe dosages
of 2S0 and
ı000 ppm of Icad aeetate on tlıe kidney and nervous system of alhino mil'e. Sixınonths
old 120 white male alhıno Illıel' witlı a weiglıt of35 and 40 g fed with same pelet feed and water were used as the material in this study. Samples of hlood and ıırıne were taken from the animals and pooled together in the second. third and foıırth months of the trials. Analysıs of urea. C1-catınıne. ,dhıııııın. creatine-phosphokinase. eholinesterase and monoaminoxidase in senını and elcetrophoresis of proteins iıı urine were performed in these eolleeted samples. and hehaviours of animals were followed. Resıılts of the experiments are as follows: Clıronil' Icad intakl' via driııking.water showed toxie effeet on the kidney and nervous system with clinieal syıııptoıns of tııhıılar proteınml. treınur and dısorders of behaviour in aniınals. Moreover, death of animals was seen sporadieally. Urine protein elcl'trophoresis deternıınes the effeeLS of Icad intakl' on the kidney without inerease in serıım urea and ereatinine. There was an increased level of creatınine in thc founh months of trials were proportiona! with amount of Iead intakl'. Tremors seen in the trial groııps may he reı.ııed to high serıım \1AO aetivity. Serum CPK activity and a urine protein hand seen at 36 kDa size on lIıe gel were increased regularly during the Icad intakl' of trial groups ancl therefore. they can he suggested to use as a dose dependent markers ın the l'hronıl' lead loxicosis eonditions.Ke)' WOlds: Albino mil'e. clıronil' lead exposure, ncphrotoxieity. neurotoxicity, urine protein elcetrophoresi.s
Giri~
Vücut sıvıları ve dokularında eser miktarda rast-lanan kur~un kontamine toksik elementlerden olup (ı) tüm ıllinyada endüstri dallarında yaygın olarak kul-lanılmakta Cı!\) ve hu nedenle önemli hir çevre kirletici olarak ekolOjik dengenin hozulmasına veya hesin zin-cirine girerek insan ve hayvanlarda akut ya da kronik ze-hirlenmelere neden olmaktadır (6.9,21,22,4 ı). Kurşun. ilk emildiğinde üncelikle eritrositlerde difosfatları halinde yoğunla~ır. daha sonra hlı.1a böhrek ve karaciğer gihi yu-111l1~akdokularda ve son olarak da kemik dokusunda bi-rikerek (I 4.39) alım düzeyine ve hula~manın süresine bağlı olarak süz konusu doku ve organ fonksiyonlarını et-kiler (34).
Kur~unun, insanlarda ve ratlarda hi1hrek ve sinir sis temi üzerİnde nefrotoksik. nürotoksik ve ncfrokarsinoje nik etkiler sergilediği (39.40), farelerde ise. daha ç(lk Ilii. rotoksik etkisini esas alan davranı~ hozukluklarına da neden olduğu hildirilmi~tir (8- i I). Içme suyu' ilc
ir
0.2.')' lik kur~un-asetat çözeltisi şeklinde kur~un alan laboratuvar farelerinde davranışlann ve sosyal ili~kilerin hozulduğu. hUyüme ve geli~l11enin yavaşladığı giizlenmi~tir (12) İçme suyu ilc 1000 ppm kur~un alan ratlarda da davra1l1~ fonksiyonlan incelcnmi~ ve kurşun alımının ratların öğ-renme kapasitesini deği~tİrnıediği, lokomoıör aktivitcyi arttırdığı saptanıl11~tır (24).Kur~un alımının hiyokimyasal etkileri. nürotransmiı ter sistem hozuklıığıı ve protein-kinazlardaki dcği~ikliklcr
28 Arif Altınta~ - Ali Bilgili - Sefa Çelik - Gökhan Era,ian
Materyal ve Metot
Tahlo i. Fare pelet yemin içeriği ve kalari düzeyi. Tahle i. Calone level and eontent of the mouse', feed.
1\1atcryal
Çalışma, 120 adet, 35-40 gram ağırlığında ve 6 aylık erkek beyaz fare (Swiss albino) üzerinde gerçekleş-tirilmiştir. Fareler deneyaşamasında Korkuteli Yem Sa-nayii'nden temin edilen fare pelet yemi ile heslenmişlcr-dir (Tablo I). Her birinde 40'ar fare hulunacak şekilde hir kontrol ve iki deneme olmak üzere üç grup oluşturulmuş-tur. Çalışma süresince (4 ay) kontrol grubuna kurşunsuz su. hirinci deneme grubuna 250 ppm ve diğer deneme grubuna 1000 ppm kurşun içeren su önlerinde sürekli ola-rak «({d fibidl/m) bulundurulmuştur.
ile karakterize olup. davranış bozukluklarının nörohiyo-Ic)jik mekanizmasının da temelini oluşturur. Gelişme dö-nemlerine gi\re bunlar dopaminerjik, kolinerjik, se-rotoninerjik. GABAnerjik. glutaminerjik ve narkotik sis-temleri içerir (n). Kolinesteraz (ChE: EC3.1.I.7) ve ıııonoaminoksidaz (MAO: EC3A. 1.4) bu sistem içindeki balı nörotnııısmiııerlerin metabolizmasından sorumlu iki enzimdir (26,42). Sinir ve davranış hozukluklarında serum kreatinfosfokinaz (CPK: EC2.7.3.2) aktivitesinde artış beklenir (5).
Kurşunun nörotoksik etkisi, muhtemelen memhran geçirgenliğini hozarak kan-beyin engelini aşması sonucu merkezi sinir sisteminde. bilhassa beyinde yaptığı hasar ik ilişkilidir (32). Ndrotoksik etkisi ise karmaşık olup (40) idrarın. kurşunu vücuttan uzaklaştırmada başlıca yol olması (15) ve bilhassa proksimal tubuııerin esas en yük-sek olan kurşun geri emilimine duyarlı olması ile ilgilidir ( 15.25). Ndroıoksik etki kurşunun kimyasal şekline, do-ıuna ve alımlılin akut ya da kronik oluşuna göre değişir (25).
Nefrotoksik etkinin erken belirteci olarak idrar N-aset il ~-()-glikozaminidaz aktivitesindeki artıştan ya-rarlanılahileceği, ancak, bunun kronik kurşun ncl'-ropatisinin bir helirteci olarak kuııaııışlı olmadığı ve bu nedenle. kronik kurşun alımının neden olduğu nd-ropatinin erken biyolojik belirteçlerinin tespitine ge-reksinim olduğu ifade edilmiştir (7).
Üzerinde çalışma yapma kolaylığı ve sonuçların çiftlik hayvanlarına aktarılabilirliği açısından bir model oluşturacağı düşüncesiyle materyal seçilen farelerde de-ğişik dozda ve sürede kurşun alımının böhrek ve sinir sis-temİ üzerindeki etkisinin incelenmesi ve kronik kurşun alımının helirteci olabilecek parametrelerin araştırılması amar; lanmı ştır.
Bulgular
Deneme sonunda elde edilen ortalama değerler ile gruplar arası farklılıkların istatistik önemlilikleri Tablo 2' de sıınulmuştur. İçme suları ilc 250 ve i 000 ppm kur-şun alan gruplarda idrar proteinlerinin elektroforetik in-celenmesi sonucu elde edilen elektroforegramlara bir örnek ŞekilI'de, hamiların dansitonıetrik dağılımlarına hirkaç örnek Şekil 2' de gösterilmiştir.
Içme suları ile iki ay, üç ay ve dört ay 250 ve 1000 ppm kurşun alan farelerin idrar protein elektrafarezinde kantitatif olarak 36 kDa'llk bantta gözlenen farklılıklar önemli hulunmuştur (Şekil i ve 2; Tablo .1). Söz konusu proteinin gruplar arasındaki dağılımı denemenin üçüncü ayı dışında doza bağlı bulw1muştur. Dencmenin ikinci
Metot
Serum üre analizleri Gentl.kow'un modifiye metodu (3) ile. kreatinin analizleri hemolizsiz örneklerde Jaffe re-aksiyonu ile (37), albümin miktarı ise biliret reaksiyonu ile (29) tayin edilmiştir. Serum MAO aktivitesi 0,2 M fos-fat tamponda (pH 7.2) substrat olarak 8 mM benzilaminin kullanıldığı spektrofotometrik yöntemle (28), CPK ve ChE enzim aktiviteleri tieari kitleri (Diasyes kreatin fos-fokinaz; Boehringer, Mannheim Kolinesıeraz) kullanan spektrofotometrik yöntem ile ölçülmüştür Idrar pro-teinlerinin SDS-PAGE ile incelennıesi ultrafilırasyon iş-lemini takiben (Millipor 10.000 NMWL rejenere selüloz. ultrafiltrasyon filtresi ile) c/olO poliakrilamid jel üzerinde gerçekleşti ri Imiş ve protein boyası olarak Coomasie blue kullanılmıştır (4). İdrar proteinlerine aiı bandların dan-sitometrik değerlendirilmesinde Helena Junim 24 model dansi tometreden yararlanılmıştır.
Kontrol ve deneme gruplarına ail ortalama değerler arası fark varyans analizi ilc Iılcelenmİş ve önemlilik için dönemler arası Kruskal Waııis, gruplar arası ise Mann-Whitney testleri hilgisayar ortamında uygulanmıştır (3 i)
Denemenin 2. 3. ve 4. aylarında hayvanlardan hafif eter anestezi si altında kalhe girilerek kan ve sistosenteı yolu ilc de idrar örnekleri alınmıştır. En az 3 fareden alı-nan ve biriktirilen (pool) kan örneklerinden senım elde edilmiştir. İdrar örnekleri ise 7-8 fareden alınan ve bi riktirilen (poal) idrardan oluşmuştur,
f"arelerin barındırıldıkları yer ve çenc koşulları de-neme süresince sık sık kontrol edilmiş. altlıklar temizlen-miş ve davranışları izlenmiştir.
İçme sularının hazırlanması
Stok kıı rşıııı ('iizeltisi (5000 pp111): Kurşun asetat
IMerek, (CH)COO),Pb;3H,O)] 9.153 g tarıılarak hir ha-lana alınmış, biraz deiyonize su ile çözdürülerek btreye tamamlanmışıır (5000 ı..ıg/ml=5000 ppm). Bu stok çöıelti her hafta yenilenmiştir.
250 ppm kıırşıııı iÇe'erelı i(.ıııe .11/)'11: Stok çözeltiden
50 ml alınmış ve deiyonize su ile litreye tamamlanarak her gün taze hazırlanmıştır.
/000 pp111 kUl}II11 iÇe'eren iÇeme .1/1)'11:Stok çöıeltiden 200 ını alınmış ve deiyonize su ile litreye tamamlanarak her gün taze hazırlanmıştır.
%12.00 %23.00 %7.00 %8.00 %2.00 % 1.00 %I.OO-I.SO %0.90 %1.00 °k,O.30 2600 En çok En az En çok En çok En çok En çok Enal. En az En az En az En az Sıl Ildın proiein
ı
bın selidol. Ham kUlILCI' de çiiziinmeyen kUl NaCl
Kal,iyum Fosfor Li/in 'vIelıonin
Ankara Üniv Vet rak Derg. 4R. 2001 29
T;ıblo 2. Içme suyu ilc farklı dOl.da kronik kur~un alımının farelerin kan parametrelerine etkisi. '1"<lble 2. The effeet of the ehronıc Iead iıııake at various dosages on the blood parameters of mice.
Kontro! 250 ppm i 000 ppm
P,ıranıctre n x Sx n x Sx n x Sx P
Denemede ikinci ay
Ure 5 40.20a 3.2 i 9 77.XRb 10.39 'J 93.31 b
x.n
P< 0.01(mg/dı) (32.5 - 49.3) (44,4 - 136.5) (59Ji - 139.2)
Kreatinın 5 O.37a 0.01 9 O.54a 0.09 9 0,4 i a 0.0
ı
Ö.D(mg/dı) (O.D - 0,4 i) (0.30 - 1.20) (0.33 - OA6)
Albumin X 2.80a 0.02 X 3.02b 0.04 8 2.92b
o.m
P< 0.01(g/dl) (2.73 - 2.(2) (2.80 - 3.22) (2.RS - 3. i5)
MAO 5 20.16a 1.42 5 27.R4b 0.59 5 25.46c 0.45 P< 0.05
(McFwÜnite) ( 16.0 - 24.0) (25.6 - 28.8) (24.0 - 26.4)
ePK 8 26.25a 2.80 8 58.13b 2.73 R 7:' 2Sc :n:2 P< 001
(IClL) (14.0 - 37.0) (45.0 - 70.0) 156.0 .89.0)
ChE X 4.15a 0.09 8 5.14h O. i 3 R S.84c 0.18 P«WI
(LlL) (3.RO - 4.50) (4.70- 5.RO) (5.00 - 6,40)
Denemede iiçiincLi ay
Ure 5 53.Ma 0.71 5 60.6Rh 2A7 5 5i .95a 1.43 P< 005
img/dı) (5 1.2 -- 55.<'i) (54.5 - 66.3) (4S.R - 55,4)
Krcatinin 5 O.SOa 0.02 5 O.42b 0.0 i 5 OA7ah
o.m
P< 005img/dı) (OA(ı - O.5X) (0,40 - 0.46) (0,40 -- O.SS)
Albıımin S 2.S0a 0.02 8 3.17b 0.06 R 2.81la (LIlS P< 005
19/cil) (2.73 -- 2.(2) (2.91 - 3.56) (2,4R - 3.(5)
MAO 5 21.04a 1,43 5 3S.20h 1.73 6 2S.00c
ı
.29 P< OLIS(\--lcEw. Ünıte) (I 7.6 - 25.2) (29.6 - 40.0) (25.6 -- :BJ)) CPK X 29.38a 3.82 S i 35.38h 6.R2 R i 55.63c 7.43 P< 11.111 il Ü/L i (16.0 - 49.0) ( iO(J.O - 156.0) (i 24.0 - 198.0) ChF. 8 4.15a 0.09 8 S.87b O. i 7 8 5.19c 0.30 P< ILIl5 (L"lL) 0.80 - 4.50) (5.10- 6.50) (4.50 - 6.9()) Denemede dördiineıi ay
tre 5 M.70a 7.00 5 R5,46a 18.R5 5 82.24a l(ı.37 Ö.D.
(mg/dı) (SOl) --81,7) (42.R - 151.0) (54.5 - 143.9)
Kreatınin 7 O.33a
o.m
5 O.36h 0.0ı
(ı OAOh 1l.1)1 P< il 05img/dı) (0.30 -- 0.37) (0.33 - 0.4J ) ({l.33 - 0,46)
Alhumin R 2.80a
o.m
8 3.02h 0.08 X 3,45c o. ii P< il III(g/cll) ( 2.73 - 2.(2) (2.86 - 3.50) (.1.20 - 3.90)
MAO 5 2S.76a 1.93 5 30.56ab 1.02 5 33.92b 2.00 P< 1l.05
(McEw.Ünlte) (20.80 -- 3V}O) (2R.O - 33.6) (28.0 - 40.0)
ePK 8 29.7Sa 3.71 8 i R6.8Rb 2.19 8 206.25b 2X.02 P< Olll
deA) (16.1l - 46.1l) (i 7'J.O - i<)(ı.O) ('J4.0 - 306.0)
ChE 8 4. i 'la
o.m
8 5,4911 (UR S 5.22h O.IS P< 1l.01lU/L) n.so - 4.50) n.90 - 6.60) (4.80 - 5.90)
--_._--n ,aYı'i--_._--nı--_._--n herhiri en ;11 3 fareden dıman kan örneğini temsil etmektedir. n demon,rates the number of the hlood samples taken from 3 miee.
Tahlo 3. Idrarın 36 kDa proteın handına ait değerlerin deneme sLiresi ve do/a göre dağılımları (%).
Tabıı: 1. According to trial time and dose distrihution of the 36 kDa urine protein (%).
Denemenin 4. ayı
Proiein Denemenin 2. ayı Denemenin 3. ayı
h;ındı K 250 ppm i 000 ppm K 250 ppm i000 ppm 3.8 iO. i 9.0
n,o
51 13.5 22,7 12.9 2.9 IS.O 2 i .0 15.6:ır)
kDa (%.1 2.3 7.4 9.5 LU 21.'J 14.0 6.7 9.8 16.6 7.R 20.7 14.4 10.8 22.6 29.1 7,4 22.2 Onal,ıına 2.3 rı.49 14.32 LU 18.65 17.66 Kuııtrolun kau 2.82 6.22 1.65 1.56 K: Kontrol K 3.0 .l.O 250 ppm '-).S 12.2 9.6 X.5 1'-).6 i 1.94 3.'-)8 i 000 ppm 13.4 14.X IIl.O 1'7.8 14.1l 4.67jO Arif Altıntaş - Ali Bilgili - Sefa Çelik - Gökhan Erasıan
ayında 250 ppm kurşun alan grupta kontrollerine göre yaklaşık .1 kat olan artış 1000 ppm kurşun alan grupta 6 katıneian fazla hesaplanmıştır. Bu durum, denemenin 4. ayında da gözleıınıiştir (Tablo .1).
Idrarda l.1,5 ve 13,8 kDa protein bloğunun kont-nıllere göre 2. 3 ve 4 ay süreyle 250 ve i000 ppm kurşun alan deneme hayvanlarında düşüşe meyilli olduğu göz-lenmiştir (Şekil 2).
Denemenin ikinci ayı sonunda elde edilen ve-rilerden hareketle. höbreklerin hafif, sinir sisteminin ise alınan kurşun miktarına hağlı olarak önemli düzeyde et-kilendiği sonucuna varılmıştır. Bu dönem içerisinde serum MAO, CPK ve ChE aktivitelerinde doza bağlı ünemli artışlar (p<0.05) gözlenmiştir. Enzim aktivitele-rindeki don hağlı bu artışlar denemenin .1. ayında da devam etmiştir. Bu dönem 250 ppm kurşun alan grupta senım üre artl'şı, albümin düşüşü ve proteinüri göz-lenmiştir. Bu farelerin .16 kDa idrar protein bandında kontrollerine oranla hafif, 1000 ppm kurşun alan grupta önenıli artış gözlenmiştir (Şekil 2; Tahlo 1).
Denemenin 4. ayında, serum kreatinin miktarı ile id-rarın 36 kDa protein bandında ve serum MAO İle CPK aktivitelerinde alınan kurşun dozuna hağlı düzenli, ChE aktivitesinde ise doza bağlı düzensiz artışlar gözlenmiştir (Tahlo 2 ve 3). Serum alhümin değerlerinde doza bağlı ve ünemli (p<0.05), üre değerlerinde ise önemsiz artışlar saptanımştır (Tablo 2).
Deneme gruhul1l1 oluşturan farelerde birhirlerini ısır-ına girişimleri, endişeli bakışlarla etrafı izleme. dur-gunluk vb. davranış bozuklukları ve titremeler göz-lenmiştir. Sinirsel helirtiler olarak değ~rlendirilen hu gözlemler. alınan kurşun dozu ile orantılı bulunmuş ve gözlenen titremelerden. alınan kurşun dozuna ilişkin ola-rak deneme hoyunca kaydedilen yüksek MAO aktivitesi
sorumlu tutulmuştur. Deneme süresince, her grupta 2-3 ölüm olayına rastlanmış ve hireysel olarak değerlendiril-miştir.
Tartı~ma
ve Sonuç
Eldc edilen serum parametrelerine aiı ortalama de-ğerler ile gruplar arası farkların istatİstik önemlilikleri kontrol ve deneme gruplarına ve deneme süresine güre Tahlo 2'de karşılaştırmalı olarak sunulmuştur.
Farelerde normal serum değerleri albümin i\in 2.X gl dı (36), 3,5 :t0,7 g/dl (27); üre için 41,4 mg/dı (36), 33.6 mg/dı (23),49,86 :t 8. i mg/dı (27); kreatinin için 0,5- 1.4 mg/dı (I 9). O,4R mg/dı (36) ve 0.6 :t 0.1 mg/dı (27); ePK için 368 tÜ/L (16) ve 334 :t 229 tÜ/L (27) olarak bil-dirilmiştir. Serum MAO ve ChE aktiviteleri için farelerde normal değerler hakkında herhangi bir veriye rastlanıla-mamıştır.
Kontrol farelerde serum üre ve alhümin değerleri li-teratür veri ile uyumlu bulunmuştur. Deneme süresine bağlı olarak serum üre artışı yaş ile ilişkilendirilebilir Serum kreatinin ve CPK değ~~'lerinin literatür değerin al-tında kaldığı helirlenmiştir. Serum MAO aktivitcsi.
yk-Ewen Ünite hiriminden, kontrol farelerde ikinci ay 20. 16 :t 1,42; üçüncü ay 21.04 :t 1,43 ve diirdüncü ay 25.76 :t 1,91 olarak hesaplanmış ve ikinci ay ilc dördüncü ay de. ğerler arasında önemli farklılık olduğu saptanınıştır. Serum ChE aktivitesi ortalama değerleri ise. ikinci. ü\ün-cü ve dördünü\ün-cü aylarda 4,15 :t O,OC) U/L olarak bulunımış ve gruplar ve dönemler arasında fark olnıadığı gö-rülmüştür (Tablo 2).
Denemenin 2. ayında. senım kreatinin dışındaki diğer parametrelerde istatistik olarak öncmli (pdJ.05 J farklılıklar saptanmıştır. Senım kreatinİnde kontrol gruba oranla deneme gruplarında belirgin artışlar gözlenmiş.
.... ;.,
t.
kDa..
St '
.,'
~4S .
•~, ~,., .~.~i ~.,. . ')~;:;<.. 0"\ 1:'.'?~i
\,\>\.
'"
"':'IIioı.:¥iıi:IP
...•....<: •.~
Şekil J. ldrar protein elektroforegnıını.
Ankara Ünıv Veı EıkDerg. 48.2001 1
,.
. ." A ." ~.,::-;"~ı ...,.-,..-,-. i i i i •,-••
7.& 7,4 1.6 2.9 2.2 ~.7 ".0 69,4 2 LU tl .4.7 12 :,8 il ıL~ 3 \Lu 4 ı ı 11 ıı..
,
u••
ı • ii•
•
,.
u,
..
'"
..
,
"
ii U .•••
.1.
,
"
ı..,
••
ıı,.
U••
•• i"
.
20 LU 5 ~•• •• lt , - :,- , . .....
.,...-.,..,.." ,lJ ıo i i i i i • i 6 LU ı,
.,
11.,
'I
LI••
II ,"
u,' i.,-
,.
l,':"
.ı ı, ii,.
"
.
"
,
.
••
.,
,
7 LU 8 Sı LU"
"
, ~'i~i' ',.,-y:y:-';=: r i 11"
ii LO"
ii"
t. P.3."
ıS..
,
U..
~
HL , ~.1: 11"
"
,.
"
ii"
ı LI , S,;-2~ ) i'" ,
.ı
"
.
Şekıl 2. lçıne sııları ilc 250 vc 1000 ppın kıırşun alan (deneme) ve almayan (kontrol) farelere ait idnıriirııeklcrındL' proteınlenn L'lcktroforetik (SDS-PAGE) ve daıısitoınctrik incelenmesi.
ı:
250 ppm. 2.ay; 2: 1000 ppm. 2.ay; 3: 250 ppm. :Lıy;4 IOIH) ppın. 3.ay 5 250 ppın. 4.ay; 6: 1000 ppın. 4.ay; 7: Kontrol: 8; StandartFıgurc 2: Protein electrophoresis (SDS PAGE) and densitomeıriL' analysis of the mine taken from mil'e consııınL'd ıhe 250 <ıIllI 10(1)
ppm Pb \ ia dnnkin); water, and from control mice wİth no Pb intake. i: 250 pp, 2nd monıh; 2: i000 ppm, 2nd month; 3: 250 ppın. 3rd month; 4: 1000 ppm. 3rd ınonth; 5: 250 ppm. 4th month; 6: 1000 ppm. 4th month; 7: Control; 8: Standard
ancak htmların istatistik önem düzeyinde olmadıkları gö-rülmüştür. Serum ürc, ePK ve ChE değerlerinde göz-lenen artışların alınan kurşun düzeyleri ile doğru ilişkili oldukları gözlenmiştir. Farclnin 250 ppm kurşun alan-larında olduğu gibi, i000 ppm kurşun alanlarında da ar-tışlar devam etmiş ve 250 ppm kurşun alanlardakinden i\nemli dcrccede farklı bulunmuştur. Senını üre, kreatinin
vc albümin miktarları açısından 250 ve i000 ppm 'lik gruplar arası fark ünemli değildir (rablo :2)
Senını MAO aktivitesi, 250 ppm kur~un alan de-ncme grubunda i000 ppm kurşun alan gruptakındcn daha büyük artış göstermiş ve klinik olarak giizlencn ıiı
remelerden sonımlu tutulmuştur. Senım albümin mik-tarında heklencnin aksine her iki dcneme gnıbul1lhl da
32 Arif /\Itınta~ -/\11 Bilgili - Sera Çelik - Gökhan Eraslan
kontrollerine oranla artış gözlenmiştir. Serum üre de-ğerleri deneme gruplarında kontrollerine aranla oelirgin artış göstermiş, ancak artışlar sadece 250 ppm'lik grupta istatistik iinem düzeyinde (p<O.OS) oulunmuştur (Taola
2)
İdrar proteinlerinin elektrofaretik dağılımında 36 kDa protein bandı dikkat çekici oulunmuş (Şekil ı) ve handın 250 ppm kurşun alan grupta hafif artış giis-termesine karşın. i000 ppm kurşun alan gnıpta belirgin olduğu gözlenmiştir (Şekil 2). 250 ppm'lik grupta artış kontrol değerin yaklaşık 3 katı iken 1000 ppm'lik grupta bu değerin kontrollerin 6 katından da fazla olduğu he-saplanmıştır (Tahlo 3).
Bu oulgular ışığında, içme suları ilc 2. ay süreyle 2S0 ve
ı
000 ppın kurşun alımının alhino farelenlc böb-rekleri hafif sinir sistemini ise alınan kurşun miktarına bağlı olarak önemli düzeyde etkilediği söylenebilir.Seruın MAO. CPK ve ChE aktivitelerindeki doza bağımlı önemli artışlar (p<0.05) denemenin 3. ayında da gözlenmiştir. Serum üre ve alhümin miktarlarındaki ar-tışlar sadece 2.50 ppm kurşun alan grupla sınırlı kalmıştır. Serum kreatininde ise. kurşun alan gruplardJ kontrol gruba göre dlişüş gözlenmiştir (Tablo 2).
İçme suları ile 3 ay boyunca kurşun alan farclerin 250 ppm kurşun alanlarındJ gözlenen serum üre artışı ya-nında proteinliri Ye serum alhümin düşüşü höbrek fonk-siyonlarının olumsuz etkilendiği ne yorumlanahilir. Bu aşaınada. 250 ppm kurşun alan fare idrarlarında 36 kOa protein oandında kontrollerine oranla hafif,
ı
000 ppm kurşun alan grupta ise önemli artış gözlenmesi (Şekil 2; Tablo 3) kurşun dow ilc ilişkilcndirilebilir ve muh-temelen proteinin idrarda kurşun taşımada görevli hir kol-loid olabileceğini Ye kronik kurşun alımında böhrekteki varlığından söz edilen inklüzyon cisimlerini düşündür-nıektedir. Çünkli, kronik kurşun alımında, kurşununrklJO'dan fazlasının böhrekte protein-kurşun kompleksieri olan inklüzyon cisimleri halinde görüldüğü ve hunların detoksifikasyon görevi üstlendikleri bildirilmiştir (39). Bu proteinin kaynağı tam olarak oilinmemekle heraber
nlJ). izole inklüzyon cisimlerinde merkezi sinir sis-teminin hir kurucu proteininin yoğun olarak hulunduğu ileri süıtilmüştür (13).
Serumda CPK, MAO ve ChE aktivitelerindeki ar-lJşlar da sinir sisteminin önemli düzeyde etkilendiğine yo-nımlanahilir (5,
ı
6,18,26,30). Kolil1l:steraz sinir uyarıları-nın ileticisi asetilkolin yapımında ve yıkımında görevli olup sinirsel bozuklukların sorumlusu olabilir. Çünkü, enzim inhihisyonu sonucu heyinde asetilkolin hirikir ve hayvanda epileptiform benzeri bozukluklar görülehilir. Kolinerjik sistemin aşırı aktivitesinde ise, insanlardaki Parkinson benzeri belirtilere rastlanır (26). Sempatik sinir sonlarında. adrenal medullada ve heynin değişik höl-gelerinde mitokondrial enzim olan MAO aktivitesi de si-nirsel bozukluklarda rol alabilir (16,18,42). Çünkü, enzim aktivitesinde yetersizlik beyinde aminlerin hirikimine neden olur ve sinirsel helirtiler gelişebilir (30,42).Nor-adrenalin ve serotonin insanda manyak deprcssil' psı-kozun moleküler mekanizmasına iştirak eden nörotrans-miııerJerdir. Noradrenalin değerinde artış manyak hali oluşturahilir, aminlerde azalma ise depresif hali uyarabilir (30). Sinirsel rahatsızlıklarda ya da davranı~ hozukluk-larında klinik biyokimyasalolarak serum CPK aktjvitc-sinde artış beklenir (5).
Denemenin 4. ayında. serum kreatinin nıiktarı ilc id-rarın 36 kOa protein handında ve senım MAO vc ePK aktivitelerinde gözlenen kurşun dozuna hağlı düzcnli vc ChE aktivitesinde ise doza bağlı dliıensiz artışlar (1'<0.05) böbrek ve sinir sisteminin olumsuz etkilendiğinc yonımlanahilir (Tah lo 2 ve 3). Senım üre değerlerinde gözlenen artışların istatistik önem düzeyinde olmadığı. al-hümin miktarında gözlenen artışların ise dma hağlı ve önemli olduğu saptanmış (Tah lo 2) ve hayvanların grup özellikleri ile ilişkilendirilememiştir.
Deneme hoyunca CPK aktivitesinin içnıe suyu ilc alınan kurşun miktarına bağlı olarak düzenli bir artış gös-terdiği ve bu nedenle kurşun zehirlenmesinin klinik la-boratuvar göstergesi olabileceği kanısına varılmıştır Diğer iki enzimin de (MAO ve ChE) deneme hoyunca artl~ gös-terdikleri dikkat çekici bulunmuş fakat. ou artışların daha çok 250 ppm kurşun dozu ik doğru orantılı oldukları sap-tanmı~lır. Deneme hoyunca gözlenen senım M/l.O ak-tivite artışları farelerde Parkinson benzeri titremelerden sorumlu tutulmuştur. Çünkü. yüksek MAO aktivitesi mer-kezi sinir sisteminin nöromediyatörleri olan noradn:nalin. dopamin ve serotonin gibi monoaminlerin aşırı yı-kılmaları nedeniyle aminlcrin yetersizliğine \e bu yolla da Parkinson benzeri titremclere neden olabileceği kay-dedilmiştir (26).
Serum üre artışlarının denemenin 2. ve 3. aylarında önemli düzeylerde seyrettiği. fakat 4. ayda hireysel ar-tışlara rağmen istatistik önem düzeyine ulaşal11adığl göı-lenmiştir. Serum kreatinin değerlerinde önemli artı~lanı denemenin aneak 4. ayında rastlandığı ve artı~ların alınan kurşun dozu ile doğru orantılı olarak seyrettiği he-lirlenmi~tir.
İçme suları ile iki ay 250 ppm kurşun alan fareleI'in idrar protein clektroforczinde kantitatif olarak 36 kDa'lık hantlarda gözlenen önemli tarklılık dikkat çekici bu-lunmuştur (Şekil 2, no 1; Tablo 3). Kontrollerde zayıf olan protein bandı deneme hayvanlarında oelirgin olarak elde edilmiştir (Şekil 2, no i ve no 7). Bu farklılık 2 ay süre ile
ı
000 ppm kurşun alan deneme hayvanlarında daha da be-lirgin hal almıştır (Şekil 2, no 2-7). Aynı farklılık de-nemenin 3. ve 4. ayında da kendini göstermiştir (Şekil 2, no 3-4-5-6). Bu protein ya da peptid bandından kronik kurşun zehirlenmesinin helirteci olarak yararlanılabilir Benzer şekilde. tavşanların böorek proteinlerinde göz-lenen değişikliklerin kurşun zehirlenmesinin ve dolayısıy-la nefrotoksisitenin göstergesi olahileceği bildirill11lştir(20).
İdrar proteinlerinin SOS-PAGE ile incelenmesinde
Ankara Ül1iv Vet Fak Derg. 4R. 2001 33
ve deneme grubunda % değerlerin kontrollerine göre ge-nelde düşmeye meyil gösterdiği (Şekil 2, no 1-8) sap-tannıış fakat, bu bandı alınan kurşun dozu ile iliş-kilcndirmenin hatalı olacağı kanısına varılmıştır.
Deneme gnıhunu oluşturan farelerde idrarla protein uzaklaştırıldığı (proteinüri) gözlenmiştir. Özellikle idrar [oplam proteinin %70'den fazlasının 13.5+ 13,8 kDa pro-ıeinin ve yaklaşık '7r80'ini çok düşük molekül ağırlıklı «25kDa) handların oluşturması (Şekil 2, no 1-8) tubuler bozukluğa yorumlanabilir (2). Benzer şekilde, içme su-Lırıyla 5 ay sürede %0,5 kurşun-asetat almış gelişmekte olan ratlarda böbrek fonksiyonları incelenmiş ve her iki cinsiyette de kurşun maruziyetinin böbrek ağırlığını önemli dereeede arttırdığı ve uygulamanın 3. ayından sonra erkek ve dişi ratların tubuler bozukluk belirtileri sergiledikleri gözlenmiş ve kurşunun nefrotoksik et-kisinin cinsiyet farkı gözetmediği saptanmıştır (35). Ancak. bu hayvanların senı m üre ve kreatinin değerlerinin normal sınırlarda olması idrar protein elektroforezinin hiibrek hozukluklarının erken tanısında kullanılabilir ol. 111ası ile (2) açıklanabilir. Rutin klinik lahoratuvar test-lerinin ağır metal alımının erken böbrek etkilerinin be-lirlenmesinde duyarsız oldukları bildirilmiştir. Kurşun alıınındaki 6 yetişkin üzerinde böbrek glomenıler ve tu-huler fonksiyonları detaylı araştırılmış ve tüm hireylerde biibrek hasarına rağmen, senım üre ve kreatinin yo-ğunluklarının normal sınırları içinde bulundukları sap-ıanmıştır (17).
Idrarın 36 kOa'lık protein bandında rastlanan en büyük artış denenıenin 2. ayında i000 ppm kurşun alan farelere ait idrar örneklerinde ortaya çıkmıştır. ArtıŞ, kontrollerin yaklaşık 6 katı olarak hesaplanmıştır (Tablo 3). Farklılık. alınan kurşun miktarı ve süresi ile ilişkili olarak ncfrotoksik etki derecesinin de farklı oluşu ile (25) açıklanabilir.
])oza hağlı olarak 36 kDa idrar protein bandında artış farkı 2. ve 4. aylarda gözlenmiş. 3. ayda belirgin bir fark bulunamamıştır. İki ay 250 ppm kurşun alan grupta 3(ı kDa idrar proteini kontrollerin 2.82 katı iken 1000
ppın alan grupta 6.22 kat olarak hesaplanmıştır. Dört ay 250 ppm kurşun alan grupta kontrollerin 3.98 katı ve i()(JO ppm kurşun alan grupta 4.67 katı olarak he-saplanmıştır (Tablo 3). Bu sonuca göre, alınan kurşun miktarına paralelolarak idrarda 36 kDa protein frak-,iyonlında artış olduğu ve proteinin muhtemelen idrarla kurşun uzaklaştırılmasında koIloid görevi üstlendiği dü-şünülehilir.
Sonuç olarak. içme suyu ile kronik kurşun alımının. farelerde böhrek ve sinir dokuları üzerine zehir etkisi gös-terdiği. klinik olarak davranış bozuklukları ve titremeler ilc. biyokimyasalolarak da serum CPK, MAO, ChE, üre, kreatinin artışı. idrarla düşük molekül ağırlıklı protein uzaklaştırılması (ıuhuler proteinüri) şeklinde kendini gös-ıerdiği. davranış bozuklukları ilc titremelerin senını MAO artışı ile ilişkili olduğu; senlIlI CPK ve 36 kDa idrar protein bandındaki artışlarının kronik kurşun alı-mının klinik tanısında ve izlenınesinde gösterge ola-bilecekleri kanısına varılınıştır.
Kaynaklar
i. Altmtaş A (t990): Min/'ml ııııııld/' mel({hol17mılsl/1£I hıl'
hakış. Tarıında Kayn. I. 19-21.
2. Altmtaş A, Şahal M, Çelik S, Duru Ö, Öeal "i (20()(1)
Saum v/, idral' prol/'inlenlUlI elf'kırojfl/'eıik (//l£Ili71 ve V{'-lerina Ilekıınlikıeki iil/eıııi. Turk J Vct Anı nı Sci. 25. (8~1.
sıında).
3. Annino .lS (1964) CiıııiCClI ehemisliT Lıtlle. Brown alHI Co. London.
4. Anonim (1993): Iıısımcrions S/~ 250-Mighll Smollll Slal,
Ct'! Uecrrophol'ni.ı Vııiı Hoel'er Scienıifıc Instrtıınenh.
San Francisco.
5. Remard S(19R5): l/iochimıe Ciiniqıw. ImInI/nemI' el
7'Th-niııues de L({homıoirp Di({gııoslics Medıco-Chımrg{(.uıır.
Maloine. Paris.
6. Bilgili A, Şanh Y
(ı
9(7): .'iı::[ırlıırd(l kur,IUIIIIII sehep0/-duğu zehirlenm/'. Eılik Mikrobıol Derg. 9.22-30.
7. Chia KS, .Teyaratnam .T, Lee .I, Tan C, Ong HY, Ong Cl';, Lee E (I (95): Lnıc/-inducednephropıııhı' I'p./aııııııshıp heıwf'f:n \'{ırious hi%gic(ll p..rposure indıees oııd e(ll'lr
11701'-kas OrneIJhroıoxieil\'. ;\ıncr J Ind Med. 27. 883-895.
8. Cutler MG (I977): 1:'Ifi'eıs or erplJSul'/' ıo lead 011 socıul iJehoviour iıı ıh/' l(liJomıor\' 1/1OUSI'.P,)'Choplıarıııacol. 52.
279-282.
9. Deberdt P, Darnis L, Rambse .T, Lepareur F (i 087)
Le({c/ poisoning ilı uıııle. Point Vet. 19.249.252.
ı
O. Donald .IM, Cutler MG, :Vloore MR (I<)871 {})ecıı o) le(/(ן in ıhe lahomıol')' mouse. /)eı'e/opııwııı ({ııd socııı!lıe-Iwviour ({jier lile/mıg nposur/' ro 12 pM /eml iii drinkıııg
jluid. Neuropharınacol. 26.39 i -399.
i
ı.
Donald .lM, Cutler "lG, 1\'loore MR, Braclley NI (198 i)Developmoıl ıınd soeiıı/ helllll'{()Ur in 117/ce ({lıer pl'elı({I(I/ (ını! posınıııııl (ldminisıraıinn ot Ii)\v /I:'vds OL/,,(/(I (lcelole
Neııropharınaeol. 20. 1097- i104.
12. Donald .TM, Cutler MG, Moore MR, Bradley NI (1986)
EiTecls or le(/(I in !ııhomlor." mouse. 2. Dl'I',,/ol'lI7/'nı (lnd sociııl iJehııviour ıılier lili'long ııı!lI7inisıraıi{)l1 Old low dos/' or Il:'ıld ııcl:'lııle iıı dnııkiııg J/lIId I\'eııropharnıacol. 25.
ı5
J-1(ı(J.
13. Egle P, Shelton KR (19S6): C/mil/iı lewl 1II10.riuııiolı cıı. us/'s ııhrııiıı specijic nuc!eıır pl'of/'iıı lo ııCellllllll({f/' ;n ıh"
nW.lei or ce/Is linıng kulnel' ıuhules J Bıol Chenı. 261.
2294-229S.
14. Ellenhorn M.I (1997): Ellenhom 's M('(llcııl Tur;,ologr' Diııl{nosis ııııd Treıılnwnı or HıııllWI I'oi.loııiııg. 1",1ed.
E1-lenhorn Seth Sehonwalcı Gary Ordog. Jonathan
\\'<1,-scrhergen.
15. Fowler BA (1993): Mech(/llisl17.1 ,ilkidııl'\' cel/ iııjUlT Imm
melııls. Emiron Health Perspecı. 100.57 (ı3.
ı6. Goridis
C, Neff NH(ı
(71): MII/UHlmilw (i.rir/({ıı' IIIsrl17p(/lheıic Ile/Tes. A ımıısmiller spni/;c ell7.'l11ell'llt'. Br .i
Pharmacol. 43. 814-R iS.
i7. Hong Cd, Hanenson
ın,
Lerner S, Hammond PB. Pesee A.1, Pollak VE (19RO): ()cCIIl'ıllimwl e 1'1i(!iııre lo Imde/-fecrs 011 relıııljilııcli(JIl. Kidncy ını. IS. 4S'i-494
18. JaroU B (ı (71): ()ccıırreııce (/Iıdl'mpalil:'s ot moııoumiıı,' oxic/(/se iıı ııdreııergie ııeıımlls. J Neııroclıcın. ıl!.7 -I(ı. 19. Kaneko .J.J, Harvey JW, Bruss ML (1997): C/Illiıul
1//-ochemisır\' ol DOl17esıic Allilııuls Fiflh cd .. XIII+932 .
..\UI-demie Press Ine. eılifornia.
20. Kanitz MH, Witzmann FA, Zhu H, Fultz CD, Skagg.s S. Moorman WJ, Savage RE.Tr (1999) A/II:'ml;olı iiiruh/Jıı kilıııer proleiıı e.rpr/'ssioıı 10110ll'ilıg I('ud ı'ı/){)sııre uı
34 Arif Altll1ta~ - Ali Bilgili - Sefa Çelik - Gökhan Eraslan
oııoll',,,d h\' ıwo-dinıell.ıimwl gt'1 dt'Clrophoresis. [lcet-rophoresis. 211.2977-2985.
21. Kaya S, Yavuz H (I 9R9): Sıj:fırlordo okll! k urşıııi
1.t'-hirleıınıesi. Ankara Univ Vet Fak Derg. 36. 745-749.
22. Kwatnı \IS, GilI BS, Singh R, Singh M (1986): I_t'(/()
w-.\ıco.ıis 111 huf/olo/'S oııd mıllı' iıı P{(Iıjoh. Indian J Aniııı Sel. 56. 412-413.
:n. Long C (i9()i): Biocht'nıısıs' lJillıdhook. E and FN Spon Uel. L.ond(m.
24. Ma T. Chen HH, Ho IK (1999): FIIlTIl' of ehrlJllie It'od
(Pi,) e''t,oı'ııı'e mı lleuroht'iwI'iol'(ll .timCliml oııd
do-IJllnılıwrgic IWl/I'olrOIlSll1illl'r recepwrs iıı 1'011'.Toxicol Lcll. 105. \\ 1-12\.
25 Madden El', Fowler HA (20()()) Mechmıisms oj /wph-m/o.\iciı." .tmm me/{{I ClJJllbillOlilJlls: 1/re\'iew. Dnıg CheIn T()xieol. 23. 1-12.
26. Mandel P, Vineendon G (i 977): Nt'uI'IJlogit' el
l's)'chi-o/rie. 44
ı
46R. In: P Boıılanger. J Polonovski. F Taycau. PMandeL. G Bıserte (Eds). Bioehiıııie Medicak. Faseicule LV. Bioehiııııe P,ıtolügiquc. Massoıı. Paris.
27. Matsuzawa '1', :\omura M. Unııo 'i' (i993): Cliııicol poı-holııg.' refereııce roııges ojlohol'(llor\' oııimols. J Vet Med Seı. 55.3'\ i 362.
2R. Mc Ewen CM .Jr, Cohen .JD(i963): Aııomi/w ıı,ridose III
llorll1olllıımilll serum. J L.ab CIin Med, 62. 766-770. 29. Natclson S (i96i): MicI'IJlf'Chlıiqut's oj Cliııiml Chp/Ilisır)'.
2"ded. Charles C Thoıııas. Puhlisher. Springfielct, Illinois. 30. Robinson DS, Nies A. Davis .JN, Hunney WE, Davis J
(! <)72): Ageing. Ilwlloillniııes oııd mmıııml1ilı-oxidose if'-ITIs. Lıııecl. 5. 2')0-29 I.
31 SI'SS (-) Version 7.5 Bilgisayar istatistik prograıııl. 32. Struzynska L. Wa.lski M, Gadamski R,
Dahrowska-Houta B. Rafalowska U (I 997): l.f'{/(I-iııducf'd ohıııırmo-lilti'S iıı hlood.hruiıı borrier pf'l'meobiluv iııexperimeıı1ll1
dımııi!. lo.liUI.". Mo! Ch CIn :\'europathol. 3. 207 -224.
33. US EPA (ı9R6):Air Qııolitı' CrilNio /or I"t'(/(I IVıııhilıg/olı
De. Environıııental Prnteeıion Ageney ı.[PA 60()fR-R,/ 02RaF-dF).
34. Van Dcr Veen NG, Vreman K (19R61 Tnıı/sfero/<.({(I. miunı. Inıd. mercur\' oııd ({!'Seli/c /i'ııın jeed 1111111'111'101./1
or-!imıs oııd ItHlteS o!.!(llIl'llilıg lombs Nethcrİdlıds J A).'r Sel. 34.145-153
35. Vyskoeil A, Scmecky V, Fiala Z, Cizko"a \1, Viau C (I 995): Rf'l/ol allf'I'mioll.\ in 1('llwle rul, Jollow/lıg 1111)('. hmnic lt'wI I'Xfl0,l"ure.J Appl Toxieol. IS. 257-262.
36. Waynforth HB (ı980): bperil11f'1/III1 and Sl/r,~{(:uI Tnh. lıiqui'1 iıı ıhe Ra/. Acadcıııic ')re,s. L.ondon.
37. White WL, Erickson M\1, Stevens SC (1976) Clıı"I11/I/lT /i)r ıhf' Clinical L.ııbo/'{{ıor\,. 4ıh cd. IX+75(,. The Mo,hy
Coıııp. Saint l.otIJS.
38. WHO (i977): Envirll/llııl'llwI /-lealılı Crill'rio 3 Leod Ge.
neva.
39. WHO (lPCS) (1995): Eııvımlılııl'//1II1 I-/eill/h Ci'ileriu 165.
Illorgwıic Lead Geneva.
'lO. Witzmann FA. Fultz CD, Grant RA. Wright LS, Korn-guth SE, Sicgel FL (1 ')99): Rt'gioııul pmli.'iıı 1ı111'I'IIIioIıS111
1'(11kidııe."s /lıdl/ced h\' leild e\posul'l'. I:.ieetl'l.)phorc,j,. 20. 943-95 I.
41. Yarsan E, Özdemir M, Turhan E (199()) SI::fo-{o}'(lıı kur şW/lii akLlI ,ehirlt'lll11l' olguı/.(. /\nLIl'd LIJI\' Vel Lıl-; Dcrg. 43. 277 -27<).
42. Youdim, MBH (1975): Moııoaıııiıı dl'illI1lllaııng s\s/ell1e iıı IIWll1mOliilll ıissut's Physiol Ph,ırıııacol Rıaclıcın. 12. 169-209 .
Yazışma <ıdresi:
Pml. [Jr. AnjAlıın/{{ş AÜ Vt'lerllll'l' Fukiillesi Bi\'l!kill1."o Aııahilim Doli
