Algle sentezlenmiş nanopartiküllerin patojenik bakteriler üzerine etkileri

Tam metin

(1)T.C. SELÇUK ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ. ALG’ LE SENTEZLENMİŞ NANOPARTİKÜLLERİN PATOJENİK BAKTERİLER ÜZERİNE ETKİLERİ. ALI MAHDI HAGLAN YÜKSEK LİSANS BİYOLOJİ Anabilim Dalı. Temmuz-2019 KONYA.

(2) Her Hakkı Saklıdır.

(3)

(4) ÖZET YÜKSEK LİSANS ALG’LE SENTEZLENMİŞ NANOPARTİKÜLLERİN PATOJENİK BAKTERİLER ÜZERİNE ETKİLERİ. ALI MAHDI HAGLAN Selçuk Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. CENGİZ AKKÖZ 2019, 88 Sayfa. Jüri Prof. Dr. Yusuf DURAK Prof. Dr. CENGİZ AKKÖZ Doç.Dr. Bülent YORULMAZ Bu çalışmada biyosentez yolu ile nanopartikül elde etmek amacıyla farklı bölümlere ait alg türlerinden Enteromorpha intestinalis (Linnaeus)Nees. ve Codium fragile(Suringar) Hariot.(Chlorophyta), Pterocladia capillacea (S.G.Gmelin) Bornet. (Rhodophyta) ile Halopteris scoparia (Linnaeus) Sauvageau.(Phaeophyta) türlerinin sulu ekstraktları kullanılarak gümüş nitrattan (AgNO3 ), gümüş nanopartikülü elde edilmiştir. Elde edilen gümüş nanopartiküllerin karakterizasyonu için çeşitli parametrelere bakılarak, Uv-Spektrofotometre ve yüzey plazmon rezonansı (SPR) ile gümüş nanopartiküllerin varlığı ve biyozsentezlenmesi doğrulanmıştır. Biyosentez aşamasi için en uygun dozlar belirlenmiş olup, ekstraksyon için 100ml saf su içerisine, 2.5 gram alg ile 1mM gümüş nitrattan (AgNO3) eklenerek 72 saat boyuna tepkime izlenmiştir. Elektron mikroskobu(TEM) ile yapılan incelemelerde, TEM görüntüsüne göre gümüş nanopartiküllerin küresel biçimde ve ortalama boyutlarda (8.17 ± 2.2 nm, 6.390 ± 2.7 nm, 15.21 ± 3.2 nm ve 12.24 ± 3.4 nm) olduğu hesaplanmıştır. Fourier taramalı kızılötesi (FTIR) analizi ile, AgNP'lerin sentezinden sorumlu olan protein ve polisakkarit kabuğunun varlığını ortaya konmuştur. Halopteris scoparia algi tarafından sentezlenen AgNP‘ ler iki patojenik bakteriye karşı aktivite gösterirken, bu tür dışındaki algler tarafından sentezlenen diğer AgNP‘ ler tüm patojenik bakterilere karşı antimikrobiyal aktivite göstermiştir Anahtar Kelimeler: Makroalg, gümüş nanopartikülleri, antimikrobiyal aktivite. iv.

(5) ABSTRACT MS EFFECTS OF NANOPARTİCLES SYNTHESİZED BY ALGAE ON PATHOGENİC BACTERİA. ALI MAHDI HAGLAN THE GRADUATE SCHOOL OF NATURAL AND APPLIED SCIENCE OF SELÇUK UNIVERSITY THE DEGREE OF MASTER OF SCIENCE IN MECHANICAL ENGINEERING Advisor: Prof. Dr. CENGİZ AKKÖZ 2019, 88 Pages Jury Prof. Dr. YUSUF DURAK Prof. Dr. CENGİZ AKKÖZ Doç.Dr. Bülent YORULMAZ In this study, in order to obtain nanoparticles by biosynthesis, silver nanoparticles were obtained by using aqueous extracts of Enteromorpha intestinalis (Linnaeus)Nees. and Codium fragile (Suringar) Hariot.(Chlorophyta) from different algae groups, Pterocladia capillacea (S.G.Gmelin) Bornet. (Rhodophyta) from red algae and Halopteris scoparia (Linnaeus) Sauvageau. (Phaeophyta) species from brown algae. The presence and biosynthesis of silver nanoparticles were confirmed by Uv-Spectrophotometer and surface plasmon resonance (SPR) by looking at various parameters for characterization of the obtained silver nanoparticles. The most appropriate doses were determined for the biosynthesis step and the extraction was carried out for 72 hours by adding 1mM silver ion in 100ml of purified water with 2.5 grams of algae. According to the TEM image, silver nanoparticles were calculated to be spherical and average in size (8.17 ± 2.2 nm, 6.390 ± 2.7 nm, 15.21 ± 3.2 nm and 12.24 ± 3.4 nm) in the evaluations made with electron microscope. Fourier scanning infrared Fouirer Transform Infrared Spektrofotometre(FTIR) analysis demonstrated the presence of protein and polysaccharide shell responsible for the synthesis of AgNPs. AgNPs synthesized by Halopteris scoparia algae showed activity against two pathogenic bacteria, while AgNPs that synthesized by other algae species showed antimicrobial activity against all pathogenic bacteria. Keywords: Macroalgae, silver nanoparticles, antimicrobial activity. v.

(6) ÖNSÖZ. Bu çalışmada alg’le sentezlenmiş nanopartiküllerin patojenik bakteriler üzerine etkileri araştırılmıştır. Tez çalışmamın planlanmasında, araştırılmasında, yürütülmesinde ve oluşumunda ilgi ve desteğini esirgemeyen, engin bilgi ve tecrübelerinden yararlandığım, yönlendirme ve bilgilendirmeleriyle çalışmamı bilimsel temeller ışığında şekillendiren sayın hocam Prof. Dr. CENGİZ AKKÖZ’e sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Çalışmada kullandığımız Enteromorpha instestinalis dışındaki Alg örneklerinin toplanması ve teşhislerinde bize yardımcı olan Akdeniz Üniversitesi Su Ürünleri Fakültesi Öğretim Üyesi Dr.E. Şükran OKUDAN’a ilgi ve desteklerinden dolayı teşekkürü bir borç bilirim. Laboratuvar çalışmalarım sırasında desteklerini gördüğüm Doç. Dr. Serdar KARAKURT’a ayrıca teşekkür ediyorum. Tez konumun belirlenmesinde, tüm laboratuvar çalışmalarımda desteğini esirgemeyen ve tez yazım aşamamda bana bilgileriyle yardımcı olan sayın Arş.Gör.Dr. Baran AŞIKKUTLU ve Arş. Gör. Hatice Banu KESKİNKAYA’ya teşekkür ediyorum. Ayrıca mikrobiyoloji çalışması sırasında engin bilgi ve çalışma tecrübesiyle bana yardımcı olan sayın hocam Arş. Gör. Dr. Erdoğan GÜNEŞ’e teşekkürler. Bilgilerinden ve tecrübelerinden faydalandığım, Mısır, Ulusal İlaç Kontrol ve Araştırma Merkezinde görevli sayın Dr. Heba Salah ABBAS’a, tez çalışmamda verdiği manevi destekden dolayı kendisine ne kadar teşekkür etsem azdır. Yaşamım boyunca ışığında ilerleyeceğim ve verdiği desteği asla unutmayacağım. Kendisine her daim minnettar kalacağım. Çalışmamın tüm aşaması boyunca bana rehberlik eden Tikrit Üniversitesi / Eczacılık Fakültesi, Biyokimya bölümünden Dr.Ali Hussein AL-OABİDİ’ye sonsuz teşekkürler. Ayrıca tecrübesiyle bana yardımcı olan biyokimya bölümü öğrencilerinden arkadaşım Farah Samir SALIM’e çok teşekkürler. Tüm çalışma aşamamda desteklerinden ve yardımlarından dolayı tüm Selçuk Üniversitesi’nde bulunan öğrenci arkadaşlarıma ve hocalarıma sonsuz teşekkürler. Sonuç olarak, tüm çalışmalarım boyunca desteklerini esirgemeyen aileme sonsuz teşekkürlerimi bir borç bilirim.. ALI MAHDI HAGLAN KONYA-2019. vi.

(7) İÇİNDEKİLER ÖZET .............................................................................................................................. iv ABSTRACT ..................................................................................................................... v ÖNSÖZ ........................................................................................................................... vi İÇİNDEKİLER ............................................................................................................. vii SİMGELER VE KISALTMALAR ............................................................................... x 1. GİRİŞ ........................................................................................................................... 1 2. KAYNAK ARAŞTIRMASI. ...................................................................................... 4 2.1. Nanopartikül çeşitleri. ......................................................................................... 5 2.2. Nanopartiküllerin Özellikleri. .......................................................................... 10 2.3. Nanopartiküllerin sentezi için yöntemler. ....................................................... 11 2.4. Nanopartiküllerin uygulanması........................................................................ 11 2.5. Gümüş nanopartiküller. .................................................................................... 12 2.6. Np Belirleme Sistemleri. .................................................................................... 13 2.7. Gümüş Nanopartikül ve Alg. ............................................................................ 13 2.8. Gümüş nanopartiküllerin Antimikrobiyal Etki Mekanizması ve Gösterdikleri Direnç Faktörleri. ............................................................................. 16 3. MATERYAL VE YÖNTEM.................................................................................... 19 3.1.Alglerin toplanması (biyokütle):........................................................................ 19 3.2.Alg ekstraktlarının hazırlanması. ..................................................................... 19 3.3. Gümüş nanopartikül biyosentezi (AgNP'ler). ................................................. 19 3.4.Nanopartiküllerin Karakterizasyonu: .............................................................. 20 3.4.1. UV-spektrofotometrik analizi. ...................................................................... 20 3.4.2. Dinamik ışık saçılımı (DLS). ........................................................................ 21 3.4.3. Fourier Dönüşümü Kızılötesi (FTIR) Spektroskopisi analizi. ...................... 22 3.4.4.Geçirimli elektron mikroskopu (TEM) .......................................................... 23 3.5. Nanopartiküllerin antimikrobiyal etkilerinin değerlendirilmesi. ................. 24 3.5.1. Antibakteriyal ve Antifungal Duyarlılık Testleri.......................................... 24 3.5.1.1. Agar Difüzyon Testi: ................................................................................. 24 3.5.1.2. Minimum İnhibitör Konsantrasyon (MIC) ve Minimum Bakterisidal Konsantrasyon (MBC) Testi. .................................................................................. 24 3.5.1.2.1.Mikrodilüsyon yöntemi............................................................................ 25 4. BULGULAR .............................................................................................................. 27 4.1.Yeşil Alg’ in (Chlorophyta) Ekstraktı ile Gümüş Nanopartikül sentezlenmesi, karakterizasyonu ve Patojenik Bakteriler Üzerine Etkileri. ................................ 27 4.1.1. Enteromorpha Intestinalis'in Ekstraktıyla Gümüş Nanopartiküllerin Yeşil Sentezi (Biyosentezi) . .................................................................................. 27 vii.

(8) 4.1.1.1. UV Spektrofotometre Analizi. ................................................................... 27 4.1.1.1.1. AgNP lerin Zamana Bağlı Etkileri.......................................................... 28 4.1.1.1.2. Enteromorpha ıntestinalis ekstresi konsantrasyonunun (algal biyokütle) ve gümüş nitrat çözeltisinin konsantrasyonun biyosenteze etkisi. ......................... 29 4.1.1.2. Fourier Taramalı Kızılötesi (FTIR) Spektroskopisi analizi. ...................... 30 4.1.1.3. Dinamik Işık Saçılımı (DLS): .................................................................... 32 4.1.1.4. Geçirimli Elektron Mikroskobu (TEM). .................................................... 33 ................................................................................................................................ 33 4.1.1.5. AgNP lerin Antimikrobiyal Etkileri. ......................................................... 35 4.1.1.5.1. Minimum İnhibitör Konsantrasyon (MIC) ve Minimum Bakterisidal Konsantrasyon (MBC) Testi. .................................................................................. 36 4.1.2. Codium fragile’ in Ekstraktıyla Gümüş Nanopartiküllerin Yeşil Sentezi (Biyosentezi). ......................................................................................................... 37 4.1.2.1. UV Spektrofotometre Analizi. ................................................................... 37 4.1.2.1.1 AgNP lerin Zamana Bağlı Etkileri........................................................... 38 4.1.2.1.2. Codium fragile ekstraktı konsantrasyonunun etkisi (algal biyokütle). ... 39 4.1.2.2. Fourier Taramalı Kızılötesi (FTIR) Spectroscopy analysis. ...................... 40 4.1.2.3. Dinamik ışık saçılımı (DLS). ..................................................................... 41 4.1.2.4. Geçirimli Elektron Mikroskobu (TEM). .................................................... 43 4.1.2.5. AgNP lerin Antimikrobiyal Etkileri. ......................................................... 45 4.1.2.5.1. Minimum İnhibitör Konsantrasyon (MIC) ve Minimum Bakterisidal Konsantrasyon (MBC) Testi. .................................................................................. 46 4.2. Kırmızı Alg’ in (Rhodophyta) Ekstraktı ile Gümüş Nanopartikül sentezlenmesi, karakterizasyonu ve Patojenik Bakteriler Üzerine Etkileri. ....... 47 4.2.1.Pterocladiella capillacea 'in Ekstraktıyla Gümüş Nanopartiküllerin Yeşil Sentezi (Biyosentezi). ............................................................................................ 47 4.2.1.1. UV Spektrofotometre Analizi. ................................................................... 47 4.2.1.1.1. AgNP lerin Zamana Bağlı Etkileri.......................................................... 48 4.2.1.1.2. Pterocladiella capillacea ekstraktı konsantrasyonunun etkisi (algal biyokütle). ............................................................................................................... 49 4.2.1.2. Fourier Dönüşümü Kızılötesi (FTIR) Spektroskopisi analizi. ................... 50 4.2.1.3. Dinamik Işık Şaçılımı (DLS). .................................................................... 51 4.2.1.4. Geçirimli Elektron Mikroskobu (TEM). .................................................... 53 4.2.1.5. AgNP lerin Antimikrobiyal Etkileri. ......................................................... 55 4.2.1.5.1. Minimum İnhibitör konsantrasyon (MIC) ve Minimum bakterisidal konsantrasyon (MBC) Testi. ................................................................................... 56 4.3. Kahverengi Alg’in (Phaeoyophyta) Ekstraktı ile Gümüş Nanopartikül sentezlenmesi, karakterizasyonu ve Patojenik Bakteriler Üzerine Etkileri ........ 57 4.3.1. Halopteris scoparia'ın Ekstraktıyla Gümüş Nanopartiküllerin Yeşil Sentezi (Biyosentezi). ............................................................................................ 57 4.3.1.1. UV spektrofotometre analizi. ..................................................................... 57 4.3.1.1.1. AgNP lerin Zamana Bağlı Etkileri.......................................................... 58 4.3.1.1.2. Halopteris scoparia ekstraktı konsantrasyonunun etkisi (algal biyokütle). ................................................................................................................................ 59 4.3.1.2. Fourier Dönüşümü Kızılötesi (FTIR) Spektroskopisi analizi. ................... 60. viii.

(9) 4.3.1.3. Dinamik Işık Saçılımı (DLS). .................................................................... 61 4.3.1.4. Geçirimli Elektron Mikroskobu (TEM). .................................................... 63 4.3.1.5. AgNP lerin Antimikrobiyal Etkileri. ......................................................... 65 4.3.1.5.1. Minimum İnhibitör Konsantrasyon (MIC) ve Minimum Bakterisidal Konsantrasyon (MBC) Testi. .................................................................................. 66 6. SONUÇ ve TARTIŞMA .......................................................................................... 69 7. ÖNERİLER ............................................................................................................... 74 KAYNAKLAR .............................................................................................................. 75 EKLER .......................................................................................................................... 85 ÖZGEÇMİŞ .................................................................................................................. 89. ix.

(10) SİMGELER VE KISALTMALAR Kısaltmalar. AgNps. Silver Nanoparticles, Gümüş Nanopartiküller. UV-Vis. Ultraviolet–visible spectroscopy. DLS. Dynamic Light Scattering. PDI. Poly Dispersity Index. FTIR. Fourier Transform Infrared Spectrophotometer. TEM. Transmission Electron Microscope. SEM. Scanning Electron Microscope. ATM. Atomic force Microscopy. SPR. Surface Plasmon Resonance. EDX. Energy Dispersive X-Ray Analysis. XRD. X-Ray Diffraction. ROS. Reactive Oxygen Species. PS. Polysulfone. x.

(11) 1 1. GİRİŞ Nanoteknoloji, nano ölçekli düzeyde gerçekleştirilen, yeni ve gelişen bir bilim dalı olmakla beraber özellikle mühendislik, biyoteknoloji ve tıp alanında gelişim göstermektedir. Nanoteknolojinin ürünleri, 10−9 nm aralığında bulunan ve 1-100 nm boyutlarında olan nanopartiküller (NP) veya nanomalzeme diye adlandırılmaktadır. NP’ ler üç tipe ayrılmaktadır: doğal nanopartiküller, antropojenik nanopartiküller ve mühendislik nanopartiküller şeklindedir. Nanopartiküllerin geniş yüzey/hacim oranı, diğer partiküllerle kolay etkileşim kabiliyetleri ve diğer birçok özellikleri, onlara çeşitli alanlarda ilginin artmasına neden olmuştur. NP’ ler elektronik, kozmetik, biyomedikal ve biyoteknolojik. uygulamalarda. yaygın. olarak. kullanılmaktadır.. NP'lerin. etkili. kristalografik ve fizikokimyasal özellikleri, nanoteknolojiyi odaklanmak için mükemmel bir alan yapmaktadır (Buzea ve ark., 2007). NP’ lerin sentezi bazı fiziksel ve kimyasal yöntemlerle elde edilebilir. Nanoparçacık sentezi için geleneksel ve yaygın olarak kullanılan yöntem ıslak yöntemdir. Kimyasal sentezde, nanopartiküller, özellikle sodyum borhidrür, potasyum bitartartarat, metoksipolietilen glikol veya hidrazin gibi çeşitli indirgeyici ajanlar içeren sıvı bir ortamda geliştirilerek elde edilmektedir (Kim ve ark., 2007). Metalik nanoparçacıkların topaklaşmasını önlemek için reaksiyon aşamasında sodyum dodesil benzil sülfat veya polivinil pirolidon gibi bazı dengeleyici maddeler eklenir (Li ve ark., 1999). En yaygın kullanılan kimyasal yöntemler, kimyasal redüksiyon, elektrokimyasal teknikler ve ters misellerdeki fotokimyasal reaksiyonlardır (Taleb ve ark., 1997). Yaygın olarak kullanılan fiziksel yöntemler ise yıpratma ve pirolizdir. Parçacıklar daha sonra hava ile sınıflandırılır ve oksitlenmiş nanopartiküller geri kazanılır. Piroliz, prekürsörün, yüksek basınçta bir delikten geçirilerek yanmasını içerir. Elde edilen kül, okside olmuş nanoparçacıkların geri kazanılması için sınıflandırılmıştır. Kimyasal yöntemler yüksek hacim için düşük maliyetlidir ve başlıca dezavantajları öncü kimyasallardan kaynaklanan kirliliği, toksik çözücülerin kullanımı ve ürünler tarafından tehlikeli maddelerin oluşmasını içerir ve fiziksel yöntemlerin belirsizlikleri ise düşük üretim oranı, yüksek üretim maliyeti ve yüksek enerji tüketimidir (Buzea ve ark., 2007). NP’ lerin sentezlenmesi için toksik bileşenlerin çevre açısından güvenli bir yöntemle değiştirilmesi gerekir. Bunun üstesinden gelmek için araştırmacılar nanopartiküllerin sentezi için biyolojik yöntemleri kullanmaya odaklanmaktadır. Nanopartiküller genellikle uygun maliyetli, toksik olmayan ve çevre dostudur (Thakkar ve ark., 2010)..

(12) 2 Şimdiye kadar, bazı bitki özleri, bakteriler, mantarlar, enzimler ve algler NP'lerin sentezi için kullanılmıştır (Saifuddin ve ark., 2009; Gilaki, 2010). Yapılan literatür araştırmaları doğrultusunda, son yıllarda alg kullanarak NP sentezleme eğilimi giderek artmaktadır (Saifuddin ve ark., 2009; Singh ve ark., 2015). Algler ekonomik ve ekolojik olarak önemli bir fotosentetik organizma grubudur. Bunlar tatlı su, deniz suyu veya nemli kayaların yüzeyi gibi farklı çevrelerde yaşayan tek hücreli veya çok hücreli organizmalardır (Thajuddin ve Subramanian, 2005; LewisOscar ve ark., 2014). Algler, mikroalg (mikroskobik) ve makroalg (makroskobik) olarak kategorize edilir. Medikal, ilaç, tarım, su ürünleri yetiştiriciliği ve kozmetik uygulamalarında anahtar rol oynamaktadır. Algler, doğal boyalar ve biyolojik yakıtlar gibi çeşitli ticari ürünler için değerli bir kaynaktır (Sing ve ark., 2013). Bugüne kadar, metalik NP’ lerin biyosentezi için, Chlorophyceae, Phaeophyceae, Cyanophyceae, Rhodophyceae gibi farklı alg grupları kullanılmıştır (Sharma ve ark., 2016). Alglerin metal biriktirme ve metal iyonlarını azaltma yeteneği onları nanopartiküllerin biyosentezi için üstün bir rakip haline getirmektedir. Ayrıca, algler nispeten daha elverişli ve kullanımı kolaydır, ayrıca daha yüksek enerji verimliliğine sahip düşük sıcaklıkta sentezleme, daha az toksisite ve çevre için risk oluşturmaması gibi başka avantajlar da vardır. Fiziksel ve kimyasal yöntemde, ticari olarak temin edilebilen farklı yüzey aktif cisimleri, farklı morfolojilere sahip NP'lerin sentezinde şablonlar gibi maddeler olarak kullanılmaktadır. NP sentezini doğal olarak çevre dostu yöntemlerin kullanıldığını dikkate alırsak ve farklı biyolojik gelişmelerle yeni yöntemler belirlemesi NP sentezinin gün geçtikçe kullanım alanlarını artıracağı açıktır (Sharma ve ark., 2015). Organizmaların nanoparçacık sentezindeki yetenekleri, bu doğal nano üretimdeki gelişimine yönelik yeni ve heyecan verici bir yaklaşım başlattı. Reaksiyon koşullarının optimizasyonunun morfolojileri ve nanopartiküllerin diğer özelliklerini kontrol edebileceği öngörülmektedir. Bu nedenle araştırmacılar, metal iyonlarının azaltılmasında ve nanopartiküllerin oluşumunda rol oynayan en uygun reaksiyon koşullarını ve hücresel mekanizmaları bulmaya dikkat etmişlerdir (Riddin ve ark., 2006; Govender ve ark., 2009). İyi karakterize edilmiş nanopartiküller üretme sürecinde göz önünde bulundurulabilecek önemli hususlar şunlardır; 1. En iyi ve uygun organizmanın seçimi: En iyi örneği seçmek için, araştırmacılar büyüme oranı, enzim aktiviteleri ve biyokimyasal yollar dahil olmak üzere bazı organizmaların önemli içsel özelliklerine odaklanmışlardır (Mohanpuria ve ark., 2008)..

(13) 3 2.. Biyokatalizör. durumunun. seçimi:. Organizmaların. enzimlerinin. (biyokatalizörler) nanopartikül biyosentezindeki ana ajanlar olduğu görülmektedir. Biyokatalizörler, bütün hücrelerde ham enzimler veya saflaştırılmış enzimler olarak kullanılabilir. Kültür süpernatantı veya hücre ekstresinin kullanılmasının reaksiyon hızını arttırdığı görülmekteydi ancak, bu nanopartiküllerin uzun süreli stabilite göstermediği görülmüştür (Smetana ve ark., 2005). Dahası, nanopartiküllerin hücrelerden salınması, hücre içi üretilen nanopartiküllerin durumunu da göz önüne alabilecek önemli bir husustur. Nanoparçacık üretiminden sorumlu olan reaksiyonların çoğu, biyo azaltım gibi görünmektedir.. Bioredüksiyonlarda. stokiyometrik. miktarlarda. tedarik. edilecek. koenzimlere (NADH, NADPH, FAD vb.) ihtiyacımız vardır. Pahalı olduklarından, bütün hücrelerin kullanımı tercih edilir, çünkü koenzimler canlı bütün hücrelerde yollar sırasında geri dönüşmektedir (LewisOscar ve ark., 2016). 3. Hücre büyümesi ve enzim aktivitesi için en uygun koşullar: Daha fazla biyokütle üretimi ile gerçekleştirilebilmek için daha fazla miktarda enzim üretmemiz gerekir. Bu nedenle, büyüme koşullarının optimizasyonu çok önemlidir. Besinler, inokulum ebadı, pH, ışık, sıcaklık, tampon kuvveti ve karıştırma hızı optimize edilmelidir. Sorumlu enzimlerin indüksiyonu da çok önemli görünmektedir. Subtoksik seviyelerde substratların veya ilgili bileşiklerin büyümenin başından itibaren varlığı aktiviteyi arttırır. Hasat zamanı, bütün hücrelerin ve ham enzimlerin kullanılması durumunda önemlidir. Bu nedenle, büyüme süreci boyunca enzim aktivitesini izlemek gerekli olabilir (LewisOscar ve ark., 2016). 4. Optimal reaksiyon koşulları: İstenmeyen kalıntı besinleri ve metabolitleri uzaklaştırmak, istenmeyen reaksiyonları önlemek ve daha iyi ve daha kolay analiz için daha temiz bir ortam sağlamak için hücreleri (biyokatalizörler) toplamak daha iyidir. Endüstriyel ölçekte nanoparçacık üretimi için organizmaları kullanmak için, verim ve üretim oranı göz önünde bulundurulması gereken önemli konulardır. Bu nedenle, reaksiyon karışımında biyo-indirgeyicilerin koşullarını optimize etmemiz gerekiyor. Substrat konsantrasyonu (biyokatalizör için subtoksik seviyede olması), biokatalizör konsantrasyonu, elektron donörü (ve konsantrasyonu), maruz kalma süresi, pH, sıcaklık, tampon kuvveti, karışım hızı ve ışığın hepsinin optimize edilmesi gerekir. Araştırmacılar, morfoloji, boyut ve reaksiyon hızını etkileyebilecek görünür ışık veya mikrodalga ışınlama ve kaynatma gibi bazı tamamlayıcı faktörleri kullanmaktadırlar (LewisOscar ve ark., 2016)..

(14) 4 2. KAYNAK ARAŞTIRMASI. Nanoteknoloji alanı, modern malzeme biliminde en aktif araştırma alanlarından biridir.. Nanoteknolojinin. bir. sonraki. sanayi. devrimi. olarak. adlandırılması. nanomalzemelerin çok önemli özelliklerine (veya 1 ile 100 nm arasında en küçük boyuta sahip parçacıklar) dayanmaktadır. Nanoteknoloji fikri ilk olarak 29 Aralık 1959’ da California Institute of Technology'deki dersinde ünlü Nobel ödüllü Richard Feynman tarafından vurgulanmış (Standard, 2012). Nano boyutta önemli olan şey, toplu ölçek özelliklerinden çok farklı olan parçacıkların özellikleridir. Kimyada, boyut aralığı kolloidler, miseller, polimer molekülleri ve çok büyük moleküller veya agrega molekülleri ile ilişkilidir. Fizik ve elektrik mühendisliğinde, nanobilim en çok kuantum davranışı ve elektronların nano ölçekli yapılardaki davranışı ile ilişkilidir. Biyoloji ve biyokimyada nanobilim ile yakından ilişkilidir, çünkü DNA, RNA ve hücre içi organelleri gibi yapılar nanoyapılar olarak. düşünülebilir.. Biyoteknoloji. ile. biyomedikal. mühendisliği. arasındaki. nanoteknoloji arayüzü, tanı, gen dizilimi ve ilaç dağıtımında nano ölçekli yapıların kullanılmasıyla gelişmektedir (Dowling, 2004). Kraliyet Topluluğu ve Kraliyet Mühendislik Akademisi (2004), nano bilimi: “Özelliklerin daha büyük ölçekte olanlardan önemli ölçüde farklı olduğu durumlarda, atomik, moleküler ve makromoleküler ölçeklerde malzemelerin işlenmesi ve manipülasyonu” ile “Nanometre ölçeğinde şekil ve büyüklüğü kontrol ederek yapıların, cihazların ve sistemlerin tasarımı, karakterizasyonu, üretimi ve uygulaması” şeklinde tanımlamalar yapmıştır. Nanoteknoloji, iletkenliği, dayanıklılığı, reaktiviteyi veya diğer ürünlerin özelliklerini iyileştiren yeni fiziko-kimyasal özelliklere sahip parçacıklar üretmek üzere maddenin atomik ve moleküler seviyede dikkatlice manipüle edilmesiyle nano ölçekte yeni ürünler ve malzemeler oluşturmak için kullanılır ve uygulanmaktadır (Tiede ve ark., 2009). Nanoteknoloji, enerji tasarrufu ve çevreye en az düzeyde zarar vermesi bakımından potansiyel olarak büyük etkilere yol açacaktır. Halen, piyasada nanoteknolojiyi bir şekilde kullanan 800’den tüketici ürünü bulunmaktadır (Vance ve ark., 2015). Nanoteknoloji sektörü zaten milyarlarca ABD doları değerinde bir pazara sahip ve bunun 2020 yılına kadar 1 trilyon ABD dolarına, 2025 yılına kadar 3 trilyon ABD dolarına yükseleceği öngörülüyor. Şu anda, dünya çapında her yıl milyonlarca.

(15) 5 nanomalzemeler üretiliyor ve üretim yakın bir gelecekte keskin bir şekilde artacaktır (Aitken ve ark., 2006). 2.1. Nanopartikül çeşitleri. Nanomalzemeler karbon (fullerenler, nanotüpler, vb.) veya inorganik bazlı malzemelerden yapılabilir ve bunlar metal oksitler (çinko oksit, demir oksit, titanyum dioksit, seryum oksit vb.), metaller (gümüş, altın, demir vb.) ve kuantum noktalarını (kadmiyum sülfit ve kadmiyum selenit) içerir (Ju-Nam ve Lead, 2008). Doğal nanopartiküller (1-100 nm), sucul yüzeylerde ve yer altı sularında(Lead ve ark., 2005)(Lead ve ark., 2005)(Lead ve ark., 2005)(Lead ve ark., 2005)(Lead ve ark., 2005)(Lead ve ark., 2005), 25 nm'den küçük askıya alınmış partiküller olarak bulunur (Baalousha ve Lead, 2007). Biyolojik sistemlerde, örnek olarak DNA’ yı ve polisakkaritler, virüsler ve bir dizi biyolojik aktiviteyi kontrol eden bakteri eksüdeleri gibi karmaşık nanoyapılı proteinleri içerir. Kaya oluşumunda, volkanlar, yangınlar ve denizsel bölgeler nano boyutta bileşenlerin üretilmesinden sorumludur, diğer kaynaklar arasında mikrobiyal aktivite ve kimyasal hidrolizlerde bulunmaktadır (Wigginton ve ark., 2007). Antropojenik (insan kaynaklı) nanopartiküller, uygarlığın ilk günlerinden beri var olmuştur. Bununla birlikte, inorganik nanomalzemelerin antropojenik emisyonları, atmosfere doğal nanopartiküllerin kütlesini iki katından fazla arttırmıştır (Farré ve ark., 2009). Son zamanlarda nanomalzemeler havada ultra ince partiküller (dizel ve benzinle çalışan araçlar ve sabit yanma kaynaklarından elde edilen nanomalzemeler), topraktaki kolloidler (killer, organik maddeler, demir oksitler ve biyojeokimyasal işlemler için önemli olan diğer mineraller), suda (makromoleküller, hümik ve fulvik asitler, proteinler ve peptitler ve sulu demir ve manganez oksit içerir) ve ayrıca sadece kolloidler olarak adlandırılmıştır. (Klaine ve ark., 2008). Karbon bazlı nanomalzemeler, optik, elektronik ve biyotıp dahil olmak üzere çeşitli uygulamalarda ve alanlarda kullanılır (De La Zerda ve ark., 2008). Fullerenler 60 karbonlu bir moleküldür (C60). Fullerenler ve türevleri, tıbbi alanda uygulamalarını sınırlayan biyo-akışkanlarda çok çözünmezler. Ancak, birçok bilim insanının bu alandaki ilginç uygulamaların çeşitliliği konusundaki dikkatini çekmişlerdir ve ön çalışmalar HIV-Proteaz inhibisyonu, DNA fotoğrafı, nöro-koruma,.

(16) 6 antimikrobiyal, apoptoz ve diğer biyolojik etkileri üzerindeki rollerini araştırmıştır (Wilson ve ark., 2000). Karbon nanotüpler (CNT'ler) 1-10 nm çapında ve birkaç mikrometre uzunluğunda, bir duvarlı (SWCNT) veya bir çok duyarlıklı (MWCNT) ve silindirik şekilli karbon parçacıklarıdır. Oldukça sağlam yapıları vardır ama bir o kadar da esnektirler. Sadece imalat endüstrisinde (örneğin uçaklar, spor malzemeleri, vb.) değil, aynı zamanda elektron alan yayıcıları, atomik kuvvet mikroskobunda nano-problar olarak da kullanılırlar. Heterojen kataliz, elektrokimyasal reaksiyonlarda mikroelektrotlar ve potansiyel hidrojen depolama cihazları olarak araştırılmaktadırlar (Dresselhaus ve ark., 2004). Demir oksit nanoparçacıkları, ortamdaki yüksek konsantrasyonlarda doğal olarak bulunur. Süper manyetik özelliklerinden ve genellikle düşük toksisite yapılarından dolayı bu durumlar onları nano biyoteknolojik uygulamalar için ideal kılmaktadır ve bunlar manyetik rezonans görüntüleme, ilaç sunumu, gen tedavisi (etkili) için kontrast madde olarak kullanılmışlardır. İstenilen genin iletimi ve hücre içinde salınması, klinik tanısı için birkaç yöntemde de kullanılmıştır (Duguet ve ark., 2006; Mohanpuria ve ark., 2008). Çinko oksit nanoparçacıkları konvansiyonel bant aralıklı yarı iletkenlerdir (elektron durumlarının olmadığı katı bir enerji aralığındadır) ve elektronik cihazlardaki potansiyel uygulamaları nedeniyle özellikleri araştırılmıştır, bunlar; kimyasal sensörler, güneş pilleri antimikrobiyal çalışmaları, su iyileştirme teknolojileri, UV-A, UV-B ışınlarını güneşten koruyucular ve kozmetikler gibi optik olarak saydam iken bloke edebilmeleri nedeniyle titanyum dioksit, stabilitesi ve düşük maliyeti nedeniyle fotokatalitik aktivite. ve. fotoseller alanlarındaki uygulamalara büyük ilgi göstermiştir (Wang ve ark., 2007); (Ogura ve Uchida, 1987) (Hattori ve Fujino, 2006) (Kachynski ve ark., 2008) (Li ve ark., 2008)) . TiO2 partikülleri ayrıca enerji depolama cihazları ve boya ve kaplamalarda, güneşten koruyucularda. kullanılabilir. Ti02, üç kristal fazda sentezlenebilir: rutil,. brookite ve anataz (Hwang ve ark., 2008). Metal nanopartiküllerin, elektronik, kataliz, ilaç sunumu veya algılama gibi farklı alanlardaki uygulamaları ile eşsiz optoelektronik ve fizikokimyasal özellikleri nedeniyle büyük bir bilimsel ilgisi vardır (Cheng ve ark., 2008; Vilela ve ark., 2012). Bazı malzemelerin mükemmel özellikleri kuvvetle kristalografik ve morfolojik özelliklere bağlıdır. Sonuç olarak, bilim adamları araştırmayı nanoparçacıkların kontrollü şekli ve.

(17) 7 büyüklüğü ile sentezi üzerinde yoğunlaştırdılar. Nanorotlar, nanoteller, nanoküpler ve nanodiskler gibi çeşitli şekiller, çeşitli kimyasal ve fiziksel yöntemler kullanılarak elde edilmiştir. Bununla birlikte, bu yöntemlerde, indirgeyici ajanlar, organik çözücüler veya biyolojik. olarak. çözünmeyen. dengeleyici. ajanlar. olarak. toksik. kimyasallar. kullanılmaktadır (Yuan ve ark., 2010; Gao ve ark., 2011; Weinberger ve Cai, 2012). Ayrıca, soy metallerin geri dönüşümü, yüksek küresel piyasa fiyatları, cevher yatakları ve aşırı ve zararlı madencilik süreçleri nedeniyle hem ekonomik hem de çevresel açıdan ilgi çekicidir. Günümüzde daha az enerji gerektiren ve daha az kirliliğe neden olan alternatif pirometalurjik ve hidrometalurjik geri dönüşüm işlemlerinin aranması gerekmektedir. Günümüzde, nanoparçacıkların biyosentezi, yeni temiz, uygun maliyetli ve verimli sentez teknikleri geliştirme zorunluluğu nedeniyle bilim adamlarının dikkatini çekmiştir. Toksik metallerin iyileştirilmesi gibi birçok biyoteknolojik uygulama bakteri (Stephen ve Macnaughtont, 1999) ve mantarlar (Mehra ve Winge, 1991) gibi organizmalar kullanmasına rağmen, bu organizmalar olası çevre dostu nano yapılar olarak tanımlanmıştır (Southam ve Beveridge, 1994). Nano ve mikro uzunluktaki skalalarda inorganik maddelerin sentezi için tasarlanan süreçler, nanomalzemelerin biyosentezinde farklı organizmaların kullanımına dayanan nispeten yeni ve büyük ölçüde keşfedilmemiş bir araştırma alanının geliştirilmesine katkıda bulunmuştur (Sastry ve ark., 2004). Metal nanopartiküllerin biyosentezi, bakteri, maya, aktinomisetler, mantarlar ve bitkiler kullanılarak bildirilmiştir (Narayanan ve Sakthivel, 2010). Algler ökaryotik sucul oksijenli fotoototroflardır ve bazıları çeşitli ağır metalleri biriktirebilir. Bununla birlikte, soy metal nanoparçacıkların yosun kullanılarak biyolojik sentezi hakkında çok az rapor vardır. Tek hücreli bir yeşil alg olan kurutulmuş alg Chlorella vulgaris’ in, sonradan Au (0)’ a düşürülen alg bağlı altın oluşturmak için tetrakloroaürat iyonlarına karşı güçlü bağlanma kabiliyetine sahip olduğu bulunmuştur. Algal bağlı altının yaklaşık % 88'i metalik hale getirilmiş ve altın kristalleri tetrahedral, onhedral ve ikosahedral yapılarla hücre yüzeylerinin iç ve dış kısımlarında birikmiştir (Luangpipat ve ark., 2011). Spirulina platensis, yenilebilir bir mavi-yeşil algtir ve kurutulmuş alg, altın, gümüş ve Au / Ag bimetalik nanopartiküllerin hücre dışı sentezi için kullanılmıştır (Govindaraju ve ark., 2009). Daha yakın bir zamanda, Singaravelu ve ark. (2007) ve Rajasulochana ve ark. (2010), sırasıyla Sargassum wightii ve Kappaphycus alvarezii kullanılarak hücre dışı metal biyonanopartiküllerinin sentezini bildirmişlerdir. Ayrıca,.

(18) 8 Senapati ve ark. (2012) Tetraselmis kochinensis kullanarak hücre içi altın nanoparçacık üretimini bildirmişlerdir. Dahası, daha önce kahverengi alg Fucus vesiculosus’ un biyokütlesini kullanarak Au (III) –Au (0)’ nın biyolojik olarak azaltılması konusunda çalışma yapılmıştır (Mata ve ark., 2009). Bu çalışmada, altın nano taneciklerinin biyosentezi, seyreltik çözeltilerden altın elde etmek için sulu kloroaurat iyonları ve ölü algler kullanılarak temiz bir teknoloji olarak araştırılmıştır. Bu prosedür, sınırsız bir hammadde kaynağı olan yosun kullanmanın olağanüstü avantajını sunar. İncelediğimiz kadarıyla, indirgeyici ajan olarak yosun kullanan metal nanoyapıların biyosentezi sıkça bildirilmemiştir. Sıfır-valentin demir nanoparçacıklarının ana uygulaması, büyüklüklerinden ötürü, ve büyük ölçüde kısmen bağımlı olan kirletici maddeleri parçalama ve adsorbe etme yeteneklerinden dolayı biyoremediasyon teknolojilerindedir (Yang ve Gao, 2005). Yüzey alanından büyük hacimsel etkinliklerini genişletir ve toksik atomları elimine etmek için gereken elektron transferini arttırır (Lee ve ark., 2008). Gümüş nanopartiküller, iletkenlik, kimyasal stabilite, katalitik aktivite, doğrusal olmayan optik davranış ve bakterisit aktivite gibi benzersiz özellikleri nedeniyle yoğun bir şekilde araştırılmıştır (Yang ve ark., 2007). (Şekil 1) Bu özellikler, mürekkepler, mikroelektronikler, kateterler, infüzyon sistemleri ve tıbbi tekstiller (Capek, 2004) gibi tıbbi. ekipmanlardaki. bakteriyel. dezenfektanlar. gibi. çeşitli. uygulamalar. için. kullanılmaktadır (Lee ve ark., 2008). Gümüş nanopartiküllerin üretimi nispeten ucuzdur ve bu partiküllerin ürünlere (plastikler, giysiler, kremler ve sabunlar vb.) eklenmesi, tüketici değerli antimikrobiyal özellik nedeniyle piyasa değerlerini arttırır. Bugüne kadar, gümüş NP, diğer tüm nanomalzemelerden daha fazla tüketici ürününde kullanılmaktadır (Frattini ve ark., 2005). Gümüş nanopartiküller, antimikrobiyal özellikleri nedeniyle, hastanelerde, tıbbi ve yaraların iyileştirilmesinde, çeşitli materyal ve tekstillere eklenmekte, yanıkların tedavisi için sargılarda kullanılması gibi geniş bir spektruma sahiptir. Yerli ürünlerdeki gümüş nanoparçacıkların kullanımı, çamaşır makinelerinde, buzdolaplarında ve yüzey kaplarının büyümesini azaltmak için yiyecek kaplarında daha yaygın hale gelmektedir (Roe ve ark., 2008)..

(19) 9. Şekil 1. Gümüş nanopartiküllerin yapısı Gümüş Nanopartiküller insan yaşamını kolaylaştıracak bir çok alanda ve üründe kullanılmaktadır (Durán ve ark., 2007). Aynı şekilde, su arıtımında ve sistemlerinde kullanıldığında kirlenme önleyici ajan olarak görev yapabilmektedir (Maneerung ve ark., 2008). Çevresel sensörler olarak, altın ve gümüş, herbisiti tespit etmek için kullanılabilecek, gümüş nanopartiküller gibi çevresel kirleticilerle temas ettiğinde optik tepkilerinden dolayı kullanımı giderek yaygınlık göstereceği düşünülmektedir (Benn ve Westerhoff, 2008). Kirlenmiş yeraltı suyunun arıtımındaki uygulamalar için, yeraltı reaktif bariyerlerini oluşturmak için sıfır değerli demir kullanılabilir (Geranio ve ark., 2009). Altın nanoparçacıkları oldukça kararlıdır, elektronik ve optik özellikleri ayarlanabilmektedir (Cheng ve ark., 2008). Altın nanopartiküllerin morfolojisi. Tıbbi uygulamalar için biyomoleküller ile birleştirmek için kullanılmıştır. Örneğin, yüksek hassasiyet ve seçiciliği olan DNA’ yı tespit edebilmek (Zodrow ve ark., 2009) ve mutasyonlar, tek nükleotid polimorfizmleri (SNP'ler), kromozomal translokasyonlar, gen ekspresyonu ve klinik örneklerden patojenler gibi kontrast ajanları olarak potansiyel uygulamalarda kullanılmış ve bu özelliklere sahip olduğu vurgulanmıştır (Jiwaji ve ark., 2014). Yukarıdakilere ek olarak, Nanopartikuller, organik ve inorganik olmak uzere başlica 2 grupta siniflandirilir. Karbon nanopartiküller, polimerik nanopartikuller ve katı lipit nanopartiküller organik nanopartiküllere örnektir. Magnetik nanopartiküller, asil.

(20) 10 metal nanopartiküller (platin, altın ve gümüş) ve yarı iletken nanopartiküller (titanyum dioksit ve çinko oksit) ise inorganik nanopartiküller olarak gruplandırılır (Bhatia, 2016). 2.2. Nanopartiküllerin Özellikleri. Bir malzeme boyutunun azaltılması, fiziksel özellikleri üzerinde belirgin etkiler gösterir ve bunlar, karşılık gelen malzemeden önemli ölçüde farklı olabilir. Nanomalzemelerin sergilediği fiziksel özelliklerden bazıları şunlar olabilir: (i) çok sayıda yüzey atomu, (ii) büyük yüzey enerjisi, (iii) mekansal sınırlama ve azaltılmış kusurlar. Nanomalzemelerin birkaç özelliği kapsamlı olarak aşağıda belirtilmiştir (Weinberger ve Cai, 2012). Son birkaç on yıl boyunca, metalik nanoparçacıklar renkli kolloidal çözümleri nedeniyle geniş bir yankı uyandırmaktadır. Mie, Maxwell’ in küçük metalik küreler ile etkileşime giren bir. elektromanyetik ışık dalgası. denklemini. çözerek altın. nanoparçacıkların (1908’ de) kırmızı rengini açıklayan ilk kişi olma özelliği taşımaktadır. Metalik nanoparçacıklar tarafından sergilenen renk, iletken bant içindeki tüm "serbest" elektronların tutarlı bir şekilde uyarılmasından kaynaklanmakta ve bu, yüzey plazmon rezonansı (SPR) olarak bilinen bir faz içi salınıma yol açmaktadır. Bu nedenle, metalik nanoparçacıkların rengi SPR nedeniyle büyüklükleriyle değişebilmektedir (Rai ve ark., 2011). Nano yapılı malzemelerin manyetik özellikleri, dökme malzemelerinkinden belirgin bir şekilde farklıdır. Ferromanyetik parçacıklar, parçacık boyutu belirli bir boyutun altına düştüğünde kararsız hale gelir, çünkü yüzey enerjisindeki artış, alanların kutuplaşma yönlerini kendiliğinden değiştirmesi ve paramanyetik olması için yeterli enerji. sağlar.. Ancak. bu. dönüştürülmüş. para-manyetizma,. geleneksel. para-. manyetizmadan farklıdır ve bu nedenle süper para-manyetizma olarak adlandırılır (Lu ve ark., 2002). Başka bir deyişle, dökme malzemelerin ferromanyetizması ortadan kalkar ve yüksek yüzeyden dolayı nano ölçekte süper paramanyetizma ile yer değiştirilir. Manyetik nanoparçacıklar, proteinlerin ve enzimlerin devamlılığını, biyolojik ayrılmayı, immünolojik testler, ilaç dağıtımı ve biyosensörler gibi geniş uygulama alanlarından dolayı büyük ilgi görmektedir. Ferromanyetik malzemelerin nanoparçacıkları, yalnızca tek manyetik alanları destekleyebilen küçültülmüş boyutları nedeniyle oldukça önemlidir (Lu ve ark., 2002; Duguet ve ark., 2006)..

(21) 11 Nanomalzemelerin mekanik özellikleri, boyutunda azalma ile artmaktadır. Son çalışmaların çoğu nanoteller gibi tek boyutlu bir yapının mekanik özelliklerine odaklanmıştır. Nanotellerin veya nanorotların artan mekanik mukavemeti, nanotellerin yüksek iç mükemmelliklerinden kaynaklanmaktadır (Dresselhaus ve ark., 2004).. 2.3. Nanopartiküllerin sentezi için yöntemler. Çok çeşitli malzemelerin nanopartikülları çeşitli yöntemlerle hazırlanabilir. Genel olarak üretim teknikleri iki kategoriye ayrılır: "aşağıdan yukarıya" ve "yukarıdan aşağıya" yaklaşımlarıdır. Aşağıdan yukarıya yaklaşımı, "aşağıdan", yani atom boyutunda bir malzemenin birikimi ile ifade edilir. Molekül molekül veya küme küme: nanolitografi ve nanomanipülasyon teknikleri de aşağıdan yukarıya yaklaşımın örnekleridir. Yukarıdan aşağıya yaklaşım, bir blok kütle malzemesi ile başlar ve onu istenen şekle göre tasarlamayı veya öğütmeyi içermektedir. Her iki yaklaşım da modern endüstride ve büyük olasılıkla nanoteknolojide çok önemli roller oynamaktadır. Metal nanopartiküller çeşitli fiziksel (fiziksel buhar biriktirme, lazer ablasyonu ve iyon implantasyonu vb.), kimyasal (koloidal ve sol-gel ile sentezlenebilir.) ve biyolojik (mikroorganizmalar, bitki ve meyve özleri kullanılarak yeşil sentez) yöntemlerle elde edilmektedir (LewisOscar ve ark., 2016). 2.4. Nanopartiküllerin uygulanması. Nano boyutta üretilen nanopartikküller son yıllarda boyalardan kozmetiklere ve otomobil. lastiklerine,. kendi. kendini. temizleyen. pencereler. gibi. ürünlerde. kullanılmaktadır (Aitken ve ark., 2006; Schmid ve Riediker, 2008). Araştırmalar, dökme formda iyi huylu kabul edilen malzemelerin nano boyutta olduğunda toksik veya olumsuz etkiler gösterebileceğini göstermiştir (Adams ve ark., 2006; Grassian ve ark., 2007). Örneğin, Ti02 nanoparçacıkları bakteriler için toksiktir, oysa insan implantlarında dökme titanyum rutin olarak kullanılır ve biyolojik uyumlulukları nedeniyle gıda ve boyada makro titanyum tozları kullanılır. Bazı nanopartiküller sitotoksiktir ve biyolojik olarak kullanılabilirliğe bağlı olarak çevre ve ekolojik sağlık için tehlikeli olmaları da muhtemeldir. Bu nedenle, nanoparçacıkların çevresel etkilerini anlayabilmek için çevresel risk değerlendirme analizi hayati önem.

(22) 12 taşımaktadır. Nano partiküllerin maruz kalması ve nano partikül tehlikesi için bağımsız değerlendirmeler yapılması ve bunun farklı koşullar altında nasıl değişebileceği konusunda değerlendirme yapılması gerekir (Tiede ve ark., 2009). 2.5. Gümüş nanopartiküller.. Metal nanopartiküllerin sentezi için bir dizi fiziksel ve kimyasal yöntem kullanılmıştır. Solüsyon fazı, UV fotolizi, metal buhar biriktirme, kimyasal ayrışma, elektrokimyasal teknikler, lazer ablasyonu ve mikrodalga plazma sentezi yaygın olarak fiziksel ve kimyasal olarak kullanılır (Mallin ve Murphy, 2002; Smetana ve ark., 2005; Isaeva ve ark., 2006). Metalik nanoparçacıkların biyosentetik işlemlerle sentezi ve geliştirilmesi nanoteknoloji alanında alternatif bir araç olarak büyük ilgi görmüştür. Son birkaç yıldır, enerji tasarruflu, düşük maliyetli ve toksik olmayan metalik nanoparçacık üretimi için algler, mantarlar, bakteriler, virüsler ve bitkiler kullanılmıştır (Begum ve ark., 2009). Son zamanlarda, bu yeşil yöntemin diğer yöntemlerin karşılaştığı çeşitli sorunları potansiyel olarak ortadan kaldırabileceği bildirilmektedir (Sharma ve ark., 2009). Gümüş nanopartiküllerin yeşil sentezi veya biyosentezi, çevre dostu bir üretim yapmayı amaçlar ve organizmalardan (biyomoleküller), toksik olmayan indirgenlerden ve partikül stabilitesi için iyi huylu maddelerden elde edilen özütleri kullanır (Sharma ve ark., 2009). Gümüş nanoparçacıklar için, kimyasal indirgeme metodu, borohidrit, sitrat, askorbat veya elementel hidrojen kullanarak sulu bir çözeltide Ag iyonları indirgeyerek çalışır. Ag iyonları azaldığında, nihayetinde oligomerik kümelere toplanacak ve sonunda kolloidal gümüş nanoparçacıklarına yol açacak olan gümüş atomları oluştururlar. Farklı indirgeyiciler, farklı kolloidal partikül boyutlarını verecektir. Sitrat (ayrıca bir kapaklama maddesi) gibi daha zayıf indirgeyicilerin kullanılması, daha yavaş bir azalma oranıyla (ve daha büyük parçacıklar) sonuçlanır ve daha büyük boyut dağılımlarına yol açar. Büyük boyutlu dağılımlar probleminin üstesinden gelmek için, önce küçük nano partiküllerin üretimi için güçlü bir indirgeyici ajan kullanılarak ve ikinci olarak da zayıf bir ajan ile boyut dağılımının daraltılmasıyla iki aşamalı kontrollü bir sentez kullanılır (Singh ve ark., 2015)..

(23) 13 2.6. Np Belirleme Sistemleri. Nanopartiküllerin fiziko kimyasal özellikleri, biyolojik dağılımları, güvenlikleri ve etkinlikleri için önemlidir. Bu nedenle, sentezlenen parçacıkların işlevsel yönlerini değerlendirmek için AgNP ’lerin karakterizasyonu önemlidir. Karakterizasyon UVspektroskopisi,. X-ışını. difraktometrisi. (XRD),. Fourier. dönüşümü. kızılötesi. spektroskopisi (FTIR), X-ışını fotoelektron spektroskopisi (XPS), dinamik ışık saçılımı (DLS), taramalı elektron mikroskobu (SEM), transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ve atomik kuvvet mikroskobu (AFM) gibi çeşitli analitik teknikler kullanılarak yapılmaktadır. Bazı nitelikli araştırmalar ve incelemeler, AgNP'lerin karakterizasyonu için çeşitli analitik tekniklerin prensiplerini ve kullanımını sunmuştur; ancak, AgNP'lerin karakterizasyonu için kullanılan önemli tekniklerin temelleri, anlama kolaylığı için aşağıda detaylandırılmıştır (Zhang ve ark., 2016). Yeşil sentez yoluyla elde edilen ve karakterizasyonu yapılan gümüş nanopartiküller çok çeşitli uygulamalara sahiptir. Karakterizasyonları, biyoloji ve tıp gibi birçok alandaki kullanım imkanları nedeniyle ortaya çıkmış bir nanoteknolojidir (Begum ve ark., 2009). Metalik nanopartiküller, fiziksel, kimyasal veya biyolojik yöntemlerle elde edilebilir. Ancak, biyolojik sentez güvenilir, çevre dostu bir yöntemdir ve özellikle günümüzde giderek önem kazanmaktadır (Kalishwaralal ve ark., 2008). Gümüş, biyolojik sistemler, canlı organizmalar ve tıp alanında tercih edilen bir metal türevidir (Parashar ve ark., 2009). Zira gümüş bazlı antiseptiklerin kullanımı, antibiyotiklere göre mikrobiyal direnci indüklemek için geniş spektrumlu aktiviteye ve çok daha düşük maliyet ile olabilmektedir. Asit sıvısının histopatolojik analizinin, AgNP' lerle tedavi edilen tümör taşıyan farelerde DLA hücre sayısında bir azalma gösterdiğini bildirmişlerdir (Jones ve ark., 2004). 2.7. Gümüş Nanopartikül ve Alg.. Algler, ekonomik ve ekolojik olarak önemli fotosentetik organizma grubudur. Bunlar deniz suyu veya nemli kayaların yüzeyi gibi farklı ortamlarda yaşayan tek hücreli veya çok hücreli organizmalardır (Thajuddin ve Subramanian, 1992). Algler mikroalg (mikroskobik) ve makroalgler (makroskobik) olarak sınıflandırılır. Tıp, eczacılık, tarım, su ürünleri yetiştiriciliği ve kozmetik uygulamalarında anahtar rol oynarlar. Algler, doğal boyalar ve biyoyakıtlar gibi çeşitli ticari ürünler için değerli bir kaynaktır (LewisOscar.

(24) 14 ve ark., 2014). Şimdiye kadar, metalik NP'lerin biyosentezi için, Chlorophyceae, Phaeophyceae, Cyanophyceae, Rhodophyeae ve diğerleri (diatomlar ve öglenoidler) gibi farklı alg grupları kullanılmıştır (Sharma ve ark., 2016). Alglerin metalleri biriktirme ve metal iyonlarını azaltma yeteneği, onları nanopartiküllerin biyosentezi için üstün bir rakip haline getirmektedir. Ayrıca, algler nispeten rahat ve kullanımı kolaydır, düşük sıcaklıkta sentez gibi daha fazla enerji verimliliği, daha az toksisite ve çevre için risk gibi diğer avantajlar da vardır. Fiziksel ve kimyasal yöntemde, farklı morfolojilerle NP sentezinde şablonlar ve kapaklama maddeleri olarak farklı ticari olarak temin edilebilen yüzey aktif maddeler kullanılmıştır. Artık bileşenlerin çıkarılması önemli bir sorun haline gelmektedir. Doğal olarak çevreye duyarlı yöntemlerin bu kullanımı göz önüne alındığında, gelişmiş bir kristalin şeklini veya büyüklüğünü doğal olarak değiştirebilen farklı biyolojik kaynaklar kullanılarak NP'nin sentezini içeren bir yöntem geliştirilmiştir. Biyolojik materyaller arasında, algler biyonano materyaller olarak adlandırılır, çünkü hem canlı hem de ölü kurutulmuş biyokütleler metalik nanopartiküllerin sentezi için kullanılmaktadır. Algler denizlerde tatlı sulara oranla daha dar bir alan içerisinde yaşama olanağı bulurlar. Fakat primer ürün olarak denizlerin verimliliği üzerinde önemli bir etkiye sahiptirler. Aynı zamanda atmosfer, su ve sediment arasındaki kimyasal değişim zincirinin de önemli bir halkasını oluştururlar. Deniz algleri yağ, vitamin ve mineral açısından zengin olup polisakkarit, protein ve polifonlar gibi biyoaktif maddeler içerirler. Bu özellikleri ile kanser, oksidatif stres, inflamasyon, alerji, lipidemi, yüksek tansiyon ve diğer dejeneratif hastalıklara karşı potansiyel faydaları bulunmaktadır. Diğer yandan, sahip oldukları fitokimyasallar tek bir adımda NP sentezini sağlayabilen hidroksil, karboksil ve amino fonksiyonel gruplarını içermektedir. Lyngbya majuscule, Spirulina platensis ve Chlorella vulgaris gibi çeşitli algler gümüş nanopartiküllerin sentezi için uygun. bir. yöntem. olarak. kullanılmıştır.. Ulva. fasciata. kullanarak. gümüş. nanoparçacıkların sentezi bir indirgeyici ajan olarak kullanılmaktadır. Algler mantarlar, mayalar ve bakteriler gibi diğer organizmalarla karşılaştırıldığında, NP'lerin sentezinde daha önemli bir konumda yer almaktadır, çünkü algler, ekonomik ve ekolojik olarak önemli fotosentetik organizmalar olmakla birlikte, deniz suyu veya nemli kayalar gibi çok çeşitli bölgelerde bulunmasından ve örnek fazlalığından dolayı çalışma olanakları geniştir (Thajuddin ve Subramanian, 1992; LewisOscar ve ark., 2016; Sharma ve ark., 2016). Özel ve benzersiz biyolojik, kimyasal ve fiziksel özelliklerinden dolayı metallerden türetilen metalik nanopartiküllerin değerlenmesi ve biyomedikal alanlarında.

(25) 15 kullanımı ve bu konuya olan ilgi artmaktadır (Abou El-Nour vd., 2010). Araştırmacılar, farklı biyomedikal uygulamalar için gümüş nanopartiküllerinin (AgNP’ ler) metal bir nanopartikül olarak kullanımını araştırmışlardır (Sharma ve ark., 2009). AgNP'ler, yeni antimikrobiyal ajanlar veya ilaç sanayi, biyomalzemelerin tespiti ve analizi, tıbbi alet kaplamaları ve geliştirilmiş terapötik alternatiflerin ilerlemesi için ilginç özelliklerini olduğunu bildirmişlerdir (Burdușel ve ark., 2018). Codium, çok fazla türe sahip olup yaklaşık 150 tür içeren bir yeşil alg cinsidir (Verbruggen ve ark., 2007). Dünya çapında popüler ve yenilebilir yeşil alglerden biri olan C. fragile, genellikle Doğu Asya sahilinde bulunmasıyla birlikte kuzey Avrupa, bu alg türünden elde edilen tripsin benzeri serin ile proteazları saflaştırırlar (Lee, Ohta, Hayashi, & Hayashi, 2010). (Kadokami, Yoshida, Mizusaki, Noda, & Makisumi, 1990) Bu yeşil alg, sülfatlanmış polisakaritler bakımından zengindir ve antikoagülan, immün uyarıcı ve antianjiyogenik aktiviteler üzerinde önemli bir etkiye sahiptir. (Ganesan et al., 2010). Usmanghani ve Shameel tarafından yayınlanan önceki çalışmanın sonuçları, Codium'un su ekstraktının gram-pozitif bakterilerin üremesini engelleyebildiğini bildirmişlerdir (El Kassas ve Attia, 2014). Ulva kompresa ve Cladophora glomerata ekstraktı ile yeşil biyosentez yoluyla gümüş nanopartikülleri (Ag-NPs) Polisülfon (PS) kompozit membran yötemiyle, spin kaplama tekniği ile hazırlanmış ve ilk kez doğrudan temas testi kullanılarak antimikrobiyal aktivite açısından test etmişlerdir (Minhas ve ark., 2018). Günümüzde, çevre dostu nanoparçacık sentezi aşamalarını ilerletmek için artan çalışma sayısında artış ve bu çalışmalara benzer analizlerin geliştirilmesi ve sayısının artması gerekmektedir. Mikroorganizmalar, bitkiler ve algleri kullanan nanopartiküllerin çevreye duyarlı biyolojik sentez yöntemi, tehlikeli ve masraflı kimyasal ve fiziksel yöntemlerin yerine geçebilecek önemli bir yöntem olarak görülmektedir. Algler, polimerik malzemelere ve hücre çeperi veya hücre içi metal alımına yüksek toleranslı metal bağlanması nedeniyle diğer mikroorganizmalara göre bazı avantajlar kazanmıştır (Rai ve ark., 2011)..

(26) 16 2.8. Gümüş nanopartiküllerin Antimikrobiyal Etki Mekanizması ve Gösterdikleri Direnç Faktörleri. Ag-NP toksisitesi iki ana kaynaktan ortaya çıkar: bozulmamış nanoparçacık ve salınan Ag iyonudur. Literatürde hangisinin daha önemli bir rol oynadığı düşünüldüğünde tartışmalıdır. Ag-NP'lerin partikül spesifik toksisitesi üç kategoriye ayrılır: membran bozulması, reaktif oksijen türleri (ROS) üretimi ve DNA ve protein ile doğrudan etkileşim. Ag-NP'ler hücre zarına doğrudan temas yoluyla zarar verebilir (Lok ve ark., 2006; Rai ve ark., 2009) ve solunum zincirine saldırabilir (Sondi ve Salopek-Sondi, 2004) ROS, Ag-NP toksisitesinde hücre zarına, enzimlere ve DNA'ya zarar vererek önemli bir rol oynar (Song ve ark., 2006; Kim ve ark., 2007; Choi ve Hu, 2008) ROS'un temel olarak nanoparçacık formundan üretildiği bildirilmiştir(Verano-Braga ve ark., 2014). Bununla birlikte, nano silika gümüş nanokompozitin ROS bağımsız antibakteriyel aktivite gösterebildiği de bildirilmiştir (Parandhaman ve ark., 2015) Ag-NP'nin DNA gibi fosfor içeren bazlar bulunduran bileşiklerle etkileşime girebileceği öne sürülmüştür (Morones ve ark., 2005). Ökaryotik hücrelerde bu onaylanmıştır. Bununla birlikte, bakterilerde böyle bir kümelenme (Ag-NP-DNA bağlanması) görülmemiştir ve doğrudan DNA hasarına ilişkin kanıtlar eksiktir (Morones ve ark., 2005; Hwang ve ark., 2008). Bakterilerdeki direkt Ag-NP-protein etkileşiminin kanıtı da nadirdir (Wigginton ve ark., 2007; Wigginton ve ark., 2010). Tartışmaya rağmen, Ag-NP toksisitesinin büyük çoğunluğunun serbest Ag iyonundan geldiği iddia edilmiştir ve araştırmalar, Ag iyonunun Ag-NP'lerden daha düşük bir konsantrasyonda bulunduğunu göstermiştir. Aslına bakılırsa, bazı araştırmalar, Ag iyonunun, partikül formunun hücre zarı, DNA, protein ve solunum zincirinde olduğu gibi aynı hasarı yapabileceğini ve ayrıca ROS ürettiğini ve Ag’ in hücre zarına nüfuz etmesinin daha kolay olduğunu göstermektedir (Feng ve ark., 2000). Başlangıçta Ag-NP'lerin yeşil sentezi, AgNO3'ün indirgenmesi ile yeşil makroalglerden. Ulva. compressa. ve. Cladophora. glomerata. kullanılarak. gerçekleştirmişlerdir. Her iki algten elde edilen Ag-NP'ler / PS kompozit membranları, çoğu bakteriye, (K. pneumonia, P. aeruginasa, E. coli, E. faecium ve S. Aureus) karşı üstün antimikrobiyal aktivite göstermiştir. Bakteriyel gelişim, sıcaklık kontrolü sağlanarak bir mikroplaka ile spektrofotometresindeki değişimler 17 saat boyunca izlemişlerdir. Bu çalışmayla ile Ag-NP'leri üretmek ve PS kompozit membran üzerinde.

(27) 17 antimikrobiyal ajan olarak kullanılmasını sağlamak uygun, ucuz ve verimli bir alternatif olduğunu ileri sürmüşlerdir (Minhas ve ark., 2018). Xiu ve ark. Ag iyonunun oluşmadığı anaerobik koşullar altında toksisitenin gözlenmediğini göstermiştir, bu da Ag iyonunun toksisite uygulamak için orada olması gerektiği anlamına gelir (Xiu ve ark., 2012). Ayrıca kısmen oksitlenmiş AgNP'lerin oksitlenmemiş formdan daha toksik olduğu bildirilmiştir (Lok ve ark., 2006). Toksisitenin, metalik partikül değil Ag’ e bağlı olduğu iddia edilmiştir, çünkü test edilen bakterilerin spesifik büyüme hızı gümüş türlerinden bağımsız olarak azalmıştır (Priester ve ark., 2014). Ancak, bu ifade bir çelişkidir çünkü Ag-NP örneğindeki Ag’ in konsantrasyonu çok daha düşüktür ve aynı tür gümüş konsantrasyonu düşünüldüğünde spesifik büyüme oranının düşmesi farklı olacaktır. Nispeten nadir görülmekle birlikte, Ag-NP’ lerin aynı konsantrasyonda Ag iyonundan daha toksik olduğunu gösteren bir araştırma da vardır, bu da parçacık formunun Ag-NP’ nin etkileri üzerindeki rolünün ihmal edilmemesi gerektiğini gösterir (Pal ve ark., 2007; Choi ve Hu, 2008). Nanoparçacık formunun toksisitesinin azaltılması, pasivasyon, adsorpsiyon, toplanma ve çevresel koşullar altında fiziksel ayrılmadan kaynaklanabilir (Bradford ve ark., 2009; Gao ve ark., 2011). Ag-NP’ ler için önerilen toksisite mekanizması, azalmış Ag diss iyon çözünmesinin Ag-NP toleransı ve direncine önemli ölçüde katkıda bulunabileceğini göstermektedir. Ag’ e dirençli bakteriler daha önce tartışıldığı gibi Ag-NP’ ye de sıklıkla dirençlidir. Ag dirençli bakteriler daha önce tartışıldığı gibi Ag-NP’ ye de sıklıkla dirençlidir. Ag bakteri direnci iyi çalışılmıştır. Ag-NP’ lerin etkilerinin ve Ag-NP’ lere karşı direncin etkilerinin arkasındaki mekanizmaların her ikisi de Ag ile yakından ilişkili olduğu için Ag-NP’ lere karşı direnç ve uyarıcı yanıtın, tıpkı iyonları için olduğu gibi, alt konsantrasyonlarda bulunması da mümkündür. Biyolojik atık su arıtımında saf kültürden karmaşık mühendislik ekosistemlerine kadar sistemlerde Ag-NP'lerin bu uyarıcı etkisine dair kanıtlar vardır (Sondi ve Salopek-Sondi, 2004; Kim ve ark., 2007; Benn ve Westerhoff, 2008). Bu çalışmada yeşil, kırmızı ve kahverengi alg olan Enteromorpha intestinalis ve Codium fragile, Pterocladiella capillacea ve Halopteris scoparia AgNP’ leri oluşturma yetenekleri için model biyolojik sistemler olarak belirlenmiş ve bu algler üzerine çalışmalar yapılmıştır. Ayrıca, ekstraselüler olarak elde edilen ekstraktlar, AgNP üretme yetenekleri açısından testedilecektir. Sentezlenmiş AgNP’ lerin antibakteriyel aktivitesi bazı önemli patojenik bakteriyel suşa karşı test edilecek olup ayrıntılı olarak rapor.

(28) 18 edilecektir. AgNP' lerin patojenik bakteriler üzerindeki potansiyel kullanımı, toksisiteleri ve olası etki mekanizmaları hakkında bir araştırma yapılmıştır. AgNP' lerin yeşil sentezi düşük maliyetli ve çevresel açıdan yarlı ve kullanışlı bir yöntem olabilmektedir (Durán ve ark., 2007). Bu çalışmanın amacı, Enteromorpha intestinalis ve Codium fragile (Chlorophyta) , Pterocladiella capillacea (Rhodophyta) , Halopteris scoparia (Phaeophyta)’ dan, farklı fiziksel şartlarda NP sentezlenmesi ve bunun sonucunda elde edilen ürünlerin boyutunun, stabilitesinin karakterizasyonu yapılıp optimizasyon sağlanacaktır. Elde edilen ürünlerin özellikle insanlarda patojen olan bakteriler üzerinde etkileri incelenerek karşılaştırma yapılacaktır. Yapacağımız bu çalışma ile özellikle optimizasyonu belirsizliklerinin giderilebileceği düşüncesindeyiz..

(29) 19 3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1.Alglerin toplanması (biyokütle): Çalışmada kullandığımız alg örnekleri Akdeniz kıyılarından(Antalya-Muğla) toplanmıştır. Bu algler deniz ortamından toplanırken öncelikle yabancı maddeleri uzaklaştırmak için bulundukları ortam suları ile yıkanmış olup ardından steril polietilen torbalar içerisinde laboratuvar ortamına getirilmiştir. Laboratuvarda da numuneler üzerindeki epifitik canlıları ve nekrotik parçaları uzaklaştırmak için steril su ile yıkanarak temizlenen algler kurutulup ekstraksiyon aşamasına kadar -20 C de saklanmıştır (Horincar ve ark., 2011). 3.2.Alg ekstraktlarının hazırlanması. Alg ekstraksiyonunda su kullanılmıştır. Her biri toz haline getirilmiş alg numunelerinden 2.5, 5 ve 10’ar gram tartılarak 100’er ml su içerisine konulup 80°C de 20 dakika manyetik ısıtıcılı karıştırıcıda işleme tabi tutulmuştur. Daha sonra elde edilen karışım Whatman No 1 filtre kağıdı kullanılarak algler ortamdan uzaklaştırılmıştır. Filtre kağıdından geçirilen numune ikiye ayrılmıştır.Bir bölümü antibakteriyolojik denemeler için işleme kadar - 4 ° C’ de buzdolabında saklandı. Geriye kalan ikinci bölüm Karekterizasyon aşamasına kadar - 20 ° C’ de saklanmıştır. Filtrasyonla ayrılan algler de oda ısısında muhafaza edilmektedir (El Shafay ve ark., 2016). 3.3. Gümüş nanopartikül biyosentezi (AgNP'ler). AgNP biyosentezi için optimum koşulları belirlemek üzere, farklı Koşullarda deney yapılmıştır, gümüş nitrat'tan farklı konsantrasyonlarda (1mM, 3mM ve 5mM) alınmış, alglerin farklı konsantrasyonlardaki ekstrakları (2.5, 5 ve 10 gram) için farklı inkübasyon süreleri kullanılmıştır. Bu deneyin sonuçlarına göre Nanopartiküllerin biyosentezi için alg biyokütle ağırlığı, gümüş nitrat konsantrasyonu ve inkübasyon süreleri belirlenmiş ve elde edilen sonuçlara göre 1mM’ lık AgNO3 konsantrasyonunda tepkime oluşurken, 3 ve 5 mM konsantrasyonları tepkime vermediğinden deney düzeneği olarak bütün alg türleri için 1mM’ lık AgNO3 çözeltileri kullanılmıştır..

(30) 20. Deney için 50 ml sulu Alg ekstraktından, 50 ml sulu 1 mM gümüş nitrat çözeltisine ilave edilmiştir. Pozitif Kontrol (gümüş iyonları olmadan, sadece Alg'in sulu ekstraktı) ve negatif kontrol (sadece gümüş nitrat çözeltisi) koşulları da göz ardı edilmemiştir. Süspansiyonun renginin saydamdan kahverengiye dönüşmesi AgNP' lerin oluştuğunu gösteren endikasyonlardır (Baskar, 2013). Alg ekstraktları ve hazırlanmış AgNO3 solüsyonları 1:1 oranında ve 80 rpm de 72 saat boyunca manyetik karıştırıcı ile oda sıcaklığında sürekli olarak karıştırılmıştır. Bu işlem başlamadan öncesinde pH 7’ ye ayarlanmıştır. Alg ekstraktları ile metal solüsyonlarının karışımı sırasında renk değişimi gözlenmiştir. 2 ya da 3 saatin sonunda kolloid bir yapı oluşması beklendi ve bu yapı nanopartikül oluştuğunun göstergesi gibi değerlendirildi. Daha sonrasında nanopartiküllerin glomerat oluşturmasını engellemek için 1730 rpm ‘de 5 dakika şeklinde santrifüj edildi (Rónavári ve ark., 2017). Bu işlem tekrar tekrar gerçekleştirildi. Bu işlemler sırasında sıcaklık değişimi, pH ayarlaması ve karıştırma hızı gibi fiziksel faktörlerle de sentez işlemi gerçekleştirildi. Böylece boyut farkı tespit edilmeye çalışıldı. 72 saat sonunda, son kolloid iki bölüme ayrılmıştır. İlk bölüm, 20 dakika boyunca -15 °C 8000 rpm hızında santrifüjlendi. Nanopartiküller üç kez saf su ile yıkandı, oda sıcaklığında kurumaya bırakıldı. Nano çözeltinin (kolloid) ikinci kısmı, karakterizasyon aşamasında kullanıldı.. 3.4.Nanopartiküllerin Karakterizasyonu: Yeşil sentez yöntemiyle elde edilen nanopartiküller için çeşitli karakterizasyon tekniklerini kullanıldı.. 3.4.1. UV-spektrofotometrik analizi. Ultraviyole spektrofotometreler bir ışık kaynağı, referans ve örnek ışınlarından, bir monokromatörden ve bir detektörden oluşur. Bir bileşik için ultraviyole spektrumu, bir bileşik numunesinin, bir zenon lambası gibi bir ışık kaynağından ultraviyole ışığa maruz bırakılmasıyla elde edilir (Hall ve ark., 2007). Spektrofotometrede referans ışını, ışık kaynağından dedektöre numuneyle etkileşime girmeden hareket eder. Numune ışını, sürekli değişen dalga boyunda ultraviyole ışığına maruz kalan numune ile etkileşime girer. Yayılan dalga boyu, bir.

(31) 21 elektronu daha yüksek bir moleküler yörüngeye teşvik eden enerji seviyesine karşılık geldiğinde, enerji emilir. Detektör referans ile numune ışını yoğunlukları arasındaki oranı (Io / I) kaydeder. Bilgisayar, iki ışın arasındaki en büyük boşluğu tarayarak, numunenin hangi dalga boyunda büyük miktarda ultraviyole ışığı absorbe ettiğini belirler. Numune ışını yoğunluğunun referans ışından daha zayıf olduğu yoğunluklar arasında büyük bir boşluk bulunduğunda, bilgisayar bu dalga boyunu ultraviyole absorbans spektrumunu hazırlarken en yüksek ultraviyole ışık absorbansına sahip olarak bizlere çizer ve tablo halinde elde edilir (Sharma ve ark., 2015). Sentezlenen nanopartiküller ayrıca UV-Vis spektroskopi ile de doğrulanabilir, sentezlenmiş gümüş (Ag), bakır (Cu) ve demir (Fe) nanopartiküllerinin UV-Vis spektrumlarını temsil eder. Gümüş ve bakır, UV-Vis bölgesinde yaklaşık başına (550600) nm'de ve gümüş için 400-450 nm'de absorpsiyon sağlayan yüzey plazmon rezonansı (SPR) olarak adlandırılan benzersiz özelliklere sahiptir. Absorbans zirveleri, yaklaşık 450 nm'de (AgNP’ ler) ve 570 nm'de (CuNP’ ler) oluşturulmuştur. Demir nanopartiküllerinin UV-Vis spektrumu, (270.1 nm) demir nanopartiküllerinin oluşumundan kaynaklandığı için gösterilmektedir (LewisOscar ve ark., 2016). Gümüş iyonlarının azalması, çözeltinin UV spektrumları ölçülerek çalışılmış ve not edilmiştir. 1 ml' lik örnek süpernatanının absorbansı, 300-700 nm dalga boyunda UVgörünür spektrofotometre (Thermofisher Scientific Oy Ratasie 2 FI-01620, Vantaa Finlandiya) kullanılarak belirli zaman aralıklarında ölçülmüştür. Spektrum, 300-700 nm'den 0.1 nm'lik bir çözünürlükte kaydedilmiştir. (Dhas ve ark., 2013)(Dhas ve ark., 2013)(Dhas ve ark., 2013) Zamanın aralıklarının değiştirmenin etkisi, ekstraktın konsantrasyonunu değiştirmenin etkisi (Alglerin biyokütle ağırlığını değiştirin) ve gümüş nitrat solüsyonu konsantrasyonunun değiştirilmesinin, nanopartiküllerin yeşil sentezi süreci üzerindeki zamanın geçişi ile (deneyin başlangıcından 72 saate kadar) olduğu gözlenmiştir. 3.4.2. Dinamik ışık saçılımı (DLS).. Kolloidal. çözeltilerin. ve. nanopartiküllerin. karakterizasyonu. DLS. ile. gerçekleştirilir. Kolloidal çözeltiden geçen lazerden saçılan ışık, DLS ile ölçülür. Saçılan.