Aııbra Uııı\ Veı Fak Dcrg 46.93-104.1')')9
TAVŞAN EMBRİYOLARININ GELİşME HızLARıNı
VE
X KROMOZOMUNA BAGLI ENZİM AKTİv ASYONLARıN}
ÖLÇEREK CİNSİYETLERİNİ SAPTAMA ÜZERİNDE
ÇALIŞMALARI
Murat FINDIK2
Studies O/l sexi/lg ofrabbit embryos by measuri/lg ofgrowth rate a/ld X-lillked enzyme activity.
Summary:
This study was perlormed with the pul,JOse ol' determining oj there{({tionship between sex ({nd growth rate as well X-/inked enzyme ({divitv of
rabbit embrvos and to investigate to usefillness ol these features pır derermining
the embrymıic sex in early periodı'.
/n the study, 40female and /0 male New Zealand white rabbits were used ({S
({ m({reri({/. Twenty out ol 40 female rabbits have be en operated ({t postcoir({l 9(j'/ı
hour ({nd the other twenty at 12(yt' hour. Em/JI)'os were co!lected by j/ushing
ovidud ({nd uterus. Then, embryos were examined microscopiuı!ly ({nd their
s{((ges H.'ere determined. Next, morphologica!ly nonnal embryos have be en put in
petri dishes ({ccording to the stage ol embryos and their enzyme activities were
me({sured /n orderj(ır sex identification by detennining X-Iinked enzyme ({ctivitv.
Bri/tim1r eresyl Blue (Sigma) and readion mixture (PBS
+
0.3% BS;\+
0.05 mMf3-NAf)P + 0.5 mM Na-G6P; Sigma) was used. So as to specif)' l1'hich sex rhey
possess rhe k({ryot'rpe ol embryos ol which their .itage and en7.yme ({ctivities
derennined was prepared
/n rhis study //3 female and /22 male embryos h({ve been obr({ined v({ri({!JIe
in stage. According to GoPD (glucose-6-phosphate dehydrogenase) a('{ivir.",
60. J 8% oflemale embryos and 5R.2% ol male embryos were correctly identified ({S
to sex (p>O,05). As a result ol chromosome alwlysis, in 53.7% oL male embn'os
({nd 50% o/f£'male embryos sex identilication was correct as to their srages.
/n rhe srudy, 119 embryos have be en determined as fe17wle and //6 embrvos
h({ve been derermined as maIl' according ro enzyme aetivity. Finallv, 55.320/c of
119fel1wle embryos and 60(10 ol//6 male embryos were correctlv derermined. In
92 ol /47 embryos (62.59%) used for chromosome l/Iwlysis embryonic se.ring
spnified OL these el7lbryos. 48 (52.17%) and 44 (47. 83%) wae fllUnd to be
17w/ew1df£'17wle respectively (17)0,05).
As a consequence, as to embıyo stage, correct embryo sexing r({te w({S 53.7%
in males and 50% infemales. Asfıır G(jPD activity this rate was 60% in m({/es aııd
i Alj. Ar;ı~ıırıııd Foıııı ıarafından desteklenen (94-3(J-(J(J-27) doktora tezinden iil.etlcnıııi~ıir. 2. Ara~.Gör.J)I'. A.U. Veteriner Fakiiltesi Doğum ve Jinekoloji Anahilim Dalı. Ankara.
M FINDIK
55.32% in !i'/1U1/es. /n both techniques. m(//e~fem(//e ratio ı.vas {(JUnd to be simi/ur
(p>0.05).
Key words:
Rabbit, embıyo sexinK, Kmwth nLle, X-/inked emyme activitv.Özet:
Bu {'altŞlna, tav,wn embriyolannın Kelişme hızlan ve X kromozoJnUlJ({bo'!:f/ı enzim aktivusyonlan ile cinsiyetIeri arasmdoki ili,ı'kiyi belirlemek ve bu
iizelliklerin erken diinemde embriyonik cinsiyet saptan/1UlSlııda kullonılobilirli!!,ini
o
my
tt mUlk wnacıvla yaptldl.Çalışmaııın huyvan //Ulteryalini 40
di,l'i
ve /0 erkek Yeni Zelanda bewctav,wl1l olu,ı.turdu. Dişilerden 20'si ç:iftleşmeden sonraki 96. ve di/fer 20'si ise J 20.
watk operasyona almdl. Oviduct ve uterus yıkanarak elde edilen el7lbri,volartn
ge!i,lI11C evreleri belirlendi ve dÜZKün morj(Jlojik ya/n lı embri)'olar gefi,mU'
a,l'ullUlillrt/W Kiire ayn ayn petri kurulanna konularak ell7.im aktivas)'onlart
ii/p:ildü. X kromozol7luna balflt emim aktivasyonunu belirleyerek cinsiyeti
saptamak iç'in Brillimıt eres)'l Blue ve Reaksiyon Kan,wnt kullmııldl. GeliYl17e
oşo/1ut/art ve enzim aktivasyonlan belirlenen embriyolaruı gerçekte fUlI/gi
cinsivette olduklannı saptamak için karyotipleri hm.ırlmıdl.
Çaltlll1Ulda geli,l'IJ1e a,wmalanna Kiire J J 3
di,l'i
ve /22 erkek embrivo eldeedildi. G6PD (Klikoz.-6~j(J.ıfat dehidmjenaz.) aktivitesine giire
di,l'i
el7lbriyolardmı1((;60.J S'inin, erkek embriyolardan ise %58,2 'sinin tanısı dolfru yapıldı (p>0.05).
KrIııI'lO?OI7l analizi sonucunda, Ke!i,l'IJıe aşamaslıUl giire erkek olarak 0\'1'I1alı
cl17briyo/ardan %53, Tsinde ve
di,çi
olarak aynlan el17briyolardon o/c50'sindecinsivet tWll.ımlıı do{frulu/fu belirlendi.
Çall,ı'ma .ımısıııda enzim aktivitesine Kiire dişi olduklart belirlenen //9
cl17brivodolı o/c55,32'sinin di,çi; erkek olduklan belirlenen //6 embrivodon ise
'((;60'1I1In erkek oldulfu dolfrulandl. Kmmozom analiz.i iç:in kullanılan /47
embriyoııun 92'sinde (%62,59) embriyonik cinsiyet belirlendi. Bu embriyo/artn
4X'inin erkek (%52, /7) ve 44 'ünün (%47.83)
di,l'i
oldulfu saptandı (p>O,05).Ça/ı,ıma sonucunda geli,mıe aşamaslıUl giire cinsiyetin erkeklerde %53,7.
di.yilerde Cfe50; G6PD aktivitesi sonU!,:laruUl Kiire de erkeklerde %60, dişi/erde
%55.32 orwlIIıda dolfmlulfu belirlendi. Her iki yiintemde de erkek:di,1'i oranlort
genelde birbirine yakııı bulundu (p>O,05),
Anahtar Sözcükler:
Tav,wn, embriyonik cinsiyeti saptwna, Kelişme /7171, Xkromo7.oJnUlıa ba.!flı emim aktivitesi.
Giriş
lnsanuğlu
yU/yıllar hoyunca hem kendi
ço-Luklarının
ve hem de heslediklcri
hayvanların
yavrularının
cinsiyetierini,
yavrular
doğmadan
<ince çok çe~itli
yöntemlerle
belirlemeye
ça-lı~ını~ıardır.
GUnUmUz
dUnyasında
pekçok
hekim,
çocuğunun
cinsiyetini
önceden
sap-tamak
isteyen
insanlara
çe~itli gıda rejimieri,
cinsel ili~ki takvimieri
ve teknikleri
önermektc,
ayrıca halk arasında
da birçok ampirik
yöntem
bulunmaktadır
(i O, II,
15, 22, 46)Son
15-20yılda gelişen spermatolojik
ve emhriyolnjik
tek-nikler sonucunda,
hirçok bilimsel
yi)l1tem
kul-lanılarak,
cinsiyet saptama çalışmaları
yapılmış
ve bunların
bir bölümünden
iyi sonuçlar
eldeedilmiştir.
Özellikle
son yıllarda
daha da
ge-lişen laboratuvar
ko~ulları
ve yeni kUltür
or-tamları sayesinde
bu konuda önemli gcli~mckr
sağlanmıştır
(22,
40, 46).GünümU/e
değin
hay-van embriyolarında
yapılan
cinsiyeı
belirleme
uy-TA VŞAN EMBRIYOLARININ GELIŞME HızLARıNı VE X KROMOZOMCNA BAGU ENZIM .. 0)
gulanahilirliği tüm dünyada tartışılmakta~ır
(i 0, 22)
Memeli hayvanlarda cinsiyetin genetik
te-meli X ve Y kromozomlarına dayanmakta, Y
kromoZOll1lınun varlığı ya da yokluğu yavrunun
cinsiyetini helirlemektedir (30). Cinsiyeti
bi-linen yavruların elde edilebilmesi için, ya
to-humlamada kullanılacak spermatozoonların
hangi cinsiyet homozamunu taşıdığını
be-lirlemek ve tohumlamaları istenilen cinsiyet
kroınolOmunu ta~ıyan sperınatozoonlarla
yap-mak ya da in vivo veya in vitro koşullarda elde
edilen emhriyoların cinsiyetierini helirleyerek istenilen cinsiyellekileri alıcı hayvanlara
trans-fer etmek gerekmektedir (i I, 12). Bundan
ha~k<ı, gehe hayvanlarda da fötal cinsiyet,
ult-rasonografi ve amniosentez gibi yöntemlerle
belirlenebilmektedir (I, 9, 24, 29). Emhriyonik
cinsiyet saptama çalı~ması, ilk olarak Hare ve
ark. (21) tarafından sığır emhriyolarında
ger-çe kleştirilm iştir.
Testislerde üretilen X ve Y homozamu
ta-~ıyan spermatozoonları hirhirinden ayırıp, farklı
tnhumlama payetlerine toplayarak yapılacak
cinsiyet saptama işleminin, en ideal cinsiyeti
saptama yimtemİ olacağı (2, 33, 44), ancak
gü-nümüzde ticari kullanım için
pra-tikleştirilcbilmi~ ekonomik hir ayırma
yön-teminin bulunmadığı hildirilmektedir (12, 23).
Spermada cinsiyeti saptama teknikleri, X ve Y
kromozomu ta~ıyan spermatozoonların kiitle,
haeim, yoğunluk, hareket ve motilite gibi
fi-ı.iksel karakterleri arasındaki farklılıklara da-)anmaktadır (3, i 1, iS, 30,46). Bu karakterler
arasındakİ farklılıkları saptayabilmek için
de-nenmekte olan yöntemler ise spermatozoonları
hasınç ve pH değişikliği, milipor filtrasyon,
sephadex jel filtrasyon. elektroforezis, santrifüj,
sedimentasyon, selektif imha ve now sitometri
ile ayırma. H- Y antijenine kar~ı
im-munil.asyoııla, immunomanyetik teknikle veya
albüınin süııınları üzerinde fraksiyonlanı
ayır-ma olarak hildirilmi~tir (LS, 17,23,43).
Emhriyonik cinsiyeti sap ta ma
yön-temlerinin ticari kullanım potansiyeline sahip
olduğu, verici hayvanlardan toplanan veya in
vitro koşullarda üretilen implantasyon öncesi
eınhriyoların cinsiyetierinin helirlenmesiyle,
alıcı hayvanlara sadece istenilen cinsiyeııcki
embriyolar nakledilerek, istenilen cinsiyellen
is-tenildiği kadar gebelik oluştunılahileceği
hil-dirilmektedir (S, 6, 14, 40). Hücresel analizleric
HaIT cisimciğinin, cinsiyet homozomlarının,
erkeklere özel antijenlerin, erkek ve di~i
eınh-riyolar arasındaki gelişme hızı ve gidişindeki
farklılıkların, erkek ve dişi emhriyolar
ara-sındaki metaholik aktivite farklılıklarının
he-lirlenmesi veya Y homozamuna özel DNA
zin-cirlcrini kullanarak embriyonik cinsiyet tanısı
gibi yöntemler implantasyon öncesi
emh-riyolarda cinsiyeti saptamak ıçın
kul-lanılmaktadır (22, 43).
Emhriyonik cinsiyeti saptama
yön-temlerinin etkinliğinin değerlendi ri lmes iııde
yöntemin doğruluk derecesi, embriynnun
ya-şama giicii üzerine yaptığı etki, uygulanan
tek-niğin toplam maliyeti, tekniğin çalı~ma hııı ve
gereksinim duyulan teknik uzmanlık derecesi
gihi parametreler kullanılmaktadır (3, 22. 32,
33,43).
Hücresel analizIeric cinsiyeti saplama ya
da karyotiplendirme yönteminin tavşan. inek ve
koyunlarda gerçekleştirilen ilk cinsiyeti
sap-tama yöntemi olduğu hildirilmektedir (22, 25.
43). Bu teknikte, iki X homozomunun ya da
bir Y kromozamunun tanınanilmesiyle veya
BaIT cisimciğinin belirlenmesiyle cinsiyet
sap-tanmaktadır.
Araştırıcılar (I 7,25, 32,43), hücresel ana-lizler kullanılarak yapılan cinsiyet tanılarının
doğruluk oranlarının % iOO'e yakın olduğunu:
ancak, tanının doğruluğuna karşın. cinsiyeti
he-lirlenen embriyoların çoğunun analizden
et-kilenerek ya~ama güçlerini kayhettiklerini
hil-dirmektedirler.
Gates (I 6), çiftleşme sonrası değişik
za-manlarda toplanan emhriyolann gelişme
aşd-malarının büyük farklılıklar gösterdiğini ve
bunun 3 değişik faktör (fcrtilizasyon
ıa-manındaki farklılıklar, emhriyonun hölünme
oranı, gelişmenin duraklaması veya tamamen
durması) nedeniyle olu~ahileceğini
bil-dirmektedir. Emhriyonun cinsiyeti ilc gelişme
hızı arasındaki ilişki ilk olarak Tsunoda ve ark.
İn-')Cı
celenmi~tir. Ara~tırıcılar hızlı gelişen ve
hlas-tnsölü daha önce oluşan embriyoların transfer
edildiği alıcı hayvanlardan doğan canlı
yav-ruların
cr;
71 'inin erkek olduğunube-lirlemişlerdi r.
İn vitro üretilen sığır emhriyolarından
erkek olanların, fertilizasyonu izleyen 8 gün bo-yunca kü ltür ortamında dişilerden daha hızlı
bö-lündüğü ve hüyüdüğü hildirilmekte ve buntın
L~mhriyonik genomun aktivasyona haşlamasının
hemen ardından cinsiyete hağlı genler etkisiyle
oluştuğu öne sürülmektedir (5, 6, 7, 8). Yadav
ve ark (48) ise, sığır embriyolarında seksüel
di-morfizmin embriyonik genom aktivasyonundan
iince bile görülehildiğini bildirmektedirler.
Xu vc ark. (47), tohumlamayı izleyen 8.
glinde açılmış blastosist evresine ulaşan
emb-riyoların büyük çoğunluğunun erkek olduğunu
ve erkek emhriyoların dişilerden önemli oranda
fazla hlicreye sahip olduklarını, diğer
araş-tırıcılar ise (34. 39. 42) aynı şekilde erken
bö-lünen embriyoların blastosist evresine ulaşma
olasllıklarınll1 yavaş hölünen embriyolardan
d,ıha yühek olduğunu hildirmektedirler.
Peippo ve Bredbacka (38), çiftleşmeyi
iz-leyen 3. ve 4. günlerde topladıkları fare
emb-riyolarını 24 saat süreyle in vitro kültüre
et-mhler ve her iki grupta da cinsiyete hağlı bir
gelişme farklılığı belirlemişler, ayrıca uzun in
\ivo periyotla dişilerin, kısa in vivo periyodu
takiben in vitm kültür sonrasında ise erkek
emhriyoların ağırlıkta olduklarını
sap-tamışlardır.
Araştırıcılar (I 9, 26) mikromaniplasyon,
kültür ve/veya dondurma sonrası sığır ve fare
embriyolarının yaşama gücündeki değişimlerin
cinsiyetic ilgili olabileceğini ve erkek
emb-riyoların olumsuz küıtür ortamlarına dişilerden
daha dayanıklı olduklarını huna karşılık diğer
araştırıcılar ise (18.28) farklı in vitro kültür or-tamlarında geliştirdikleri emhriyolarda cinsiyet
oranlarında bir fark görülmediğini
bil-dirıncktedirlcr.
Güniimlize değin yapılan çalışmalar
son-raQnda, erkek emhriyoların, dişi
emhriyolar-dan daha hıılı geliştiği ve hepsi aynı anda
döl-knen emhriyoların gelişme hızlarına hakılarak
MFINDIK
erkek veya dişi olarak ayırahilmenin mümkün
olabileceği kanısına varılmıştır (6,14.47.48).
Süperovulasyon yaptırılan hay\',ınlarda.
ovulasyonlar helirli bir zaman peri yodu içinde
oluşmaktadır. Bu nedenle, tüm ovulasyonlar
aynı zamanda şekiııenmemektedir. Dah,ı öııce
ovule olan ve X kromozomu taşıyan hir
sper-matozoon tarafından döııenen bir oosil. daha
sonra ovule olan ve Y kromozomu taşıyan hir
spermatozoon tarafından döııenen oositleıı daha
önce gelişebilmekte ve yanlış olarak erkek bir
yavru gibi değerlendirilehilmektcdir (5. n, 7. 8. 41 ).
Emhriyonun taşıdığı X kromowmu sayısı,
aktivasyonu X homozamuna bağlı bulunan
en-zimlerin hücresel konsantrasyonuna ve
ak-tivitesine aksetmektedir. Bu enzimlerin
hüc-resel konsantrasyonu ve aktivitesi iki X
kromozomu taşıyan dişilerde. bİr X
krn-mozomu taşıyan erkeklerdekinin iki katı
ol-maktadır (33.35,36.43,45).
Gelişimin erken dönemlerinde. HCPRT
(Hypoxanthine guanine phosphoribosyl
trans-ferase), HPRT (Hypoxanthine phosphorib()~yl
transferase), a-gal (a-galactosidase) ve GnPD
(Glucose-6-phosphatc dehydrogenase) gihi
cn-zimlerin hücresel konsantrasyonu. hüereni n
sahip olduğu X kromolOmu sayısına bağlıdır
(45). Monk ve Harper (36), dişi embriyolarclaki
HGPRT seviyesinin, erkek embriyolardakinin
iki katı olduğunu bildirınektedirler. Eınhriyo
metaholizmasındaki bireysel farklılıkların
he-sabını yapabilmek için, X kromolOımına hağlı
enzim aktivitesi hem dişilerde ve hem de
er-keklerde, otozomal kromo7.0mlara hağlı
en-zimlerin aktiviteleriyle kıyaslanabilil' X
kro-mozomuna bağlı enzim akti\'itesiyle, otomınal
kromozomlara bağlı enzim aktiviteleri
ara-sındaki oranın, dişi cmbriyolarda,
er-keklcrdekinden daha yüksek olacağı hirote/ine
dayanan araştırıcılar (35, 45), süperovııiasyon
yaptırılan ve tohumlanan farelerden elde edilen
implantasyon öncesi cmhriyolarda cinsiyeti
saptayabilmişlerdir.
Araştırıcılar
(30.
35, 36. 45). buyiin-temlerin embriyolar için belirli bir düzeyde
Ti\VŞA\! EMBRIYOlARININ GELlŞ\IIE HızLARıNı VE X KROMOZO\llUNA BAGU ENZtM .. '17
da emhriyo
üzerinde
kalan
hoya artıkları
ne-deniyle
emhriyonik
ölümlerin
oluşabildiğini,
memeli hayvanlarda,
(Ii~i hücrelerinde
hulunan
ikinei
X
kromozomunun
inaktivasyon
za-manının
kesin olarak
bilinmediğini
ve bu
ne-denle
haıalı
sonuçların
olu~ahilcceğini,
emb-riyonik genomun
aktivasyon
zamanının
türlere
g(irc değişiklik
gösıerebildiğini,
her enzim
ak-ıiviıesi
düzeyinin,
loplam
hücresel
ak-ıivasyonun
hir parçası olduğunu
ve bu nedenle,
doğru sonuçlar elde elmek için toplam hücresel
akıivasyonun
da değerlendirilmesi
gerektiğini
hcl irtmektedirler.
Sunulan bilgilerin
ı~ığı aııında bu çalı~ma,
lav~an emhriyolarının
geli~me hızları ve X
kro-mozomuna
hağlı enzim
akıivasyonları
ile
ein-siyctleri arasındaki
ili~kiyi belirlemek,
bu
yön-temlerin
el11hriyonik
cinsiyet
saptanmasında
kullanılabilirliklerini,
hilinen hir yöntemle
kar-~ıla~tırmak amacıyla
yapıldı.
Materyal ve Metot
Çalı~manın
hayvan materyalini
8-
i2 aylık,
doğum yapınamı~, 40 di~i ve
iO erkek Yeni
Ze-landa
heyaz
ıav~anı
olu~ıurdu.
Tavşanlar
ça-lışmadan
önceki
3 hafta ve çalışma
süresince
A.Ü. Veteriner
Fakültcsi,
Doğum ve Jinekoloji
Anahilim
Dalında
hazırlanan
tekli
kafeslcrde
harındırıldı.
Tav~anların
hulunduğu
ortamın
12
saal aydınlık
ve 12 saat karanlık
olması
sağ-landıÇalışma maıeryalindeki
40 di~i tav~anın
ta-ı;ıamı embriyo
elde elmek
için kullanıldı.
Ça-11~l11adaçok sayıda follikül geli~imini sağlamak
amacıyla
PMSG
(Folligon@,
lntervet);
ovu-lasyonu
uyarmak
amacıyla
da hCG (Pregnyl@,
Organon)
hormonları
kullanıldı.
Di~i tav~anlaı'a
PMSG
i ..2. ve 3. gün SO
LU.im., hCG ise 4.
gün öğleden
sonra SO
ıu.
iv. verildi. HCG
en-jeksiyonundan
sonra
tav~anlar
çiftleştirildi.
Çiftleştirme
için her uygulama
grubunda
farklı
erkek ıavşanlar
seçildi
ve erkek tavşanlar
din-lendirilerek
kullanıldı.
Dişi
tavşanlardan
20'sine
hCG uygulamasını
izleyen 96. ve diğer
20' sine
ise
ı
20.
saatle
meclian
çizgiden
la-paralomi
yapılarak,
her iki ovaryum
üzerindeki
corrus
!uıeııııı,
patlamamış
follikül
ve
he-morajik
folliküller
sayılarak
not
edildi.
La-paratomi
işlemi S mg/kg
xylazjne
(Rompun@.
Bayer)
ve 35 mg/kg
ketamin
HCl (Ketalar@,
Parke-Davis)
ile sağlanan
genel anesıai
altıııda
gerçekle~tirildi.
Oviduct
ve utertısu
yıkamak
için S-
LOml kadar
37"C'de
steril
PBS
kul-lanıldı.
Tav~anlar
operasyon
sonrası
1 ay
sü-reyle gözlem altında tutuldular.
Elde edilen
emhriyolar
stereo
mikroskop
aııında
IOx40
hüyüımede
incelenerek
uıa~-tıkları gelişme
aşamaları
Avery ve ark. (7)'nın
bildirdiği
~ekilde helirlendi.
Düzgün
morfolojik
yapılı embriyolar
gcli~me aşamaları na g()re ayrı
ayrı
petri
kutu ları na
konularak
en/.İm
ak-tivasyonumı
ölçmek
için
kullanıldı.
Emh-riyoların
glukoz-6-fosfat
dehidrojena/.
enzım!
aktivitelerini
helirlemek
amacıyla,
Williams
(4S)'ın
tarif ettiği
kolorimetrik
ölçüm
ıekniği
modelolarak
alındı. Bu amaçla emhriyolar
0,05
mg/ml BCB (Briııiant
Cresyl Blue, Sigına)
s{)-lusyomı içinde
iS- 20 dakika hoyandılar
ve daha
sonra Reaksiyon
Karı~ımı (PBS + (}H),3 BSA +
0,05 mM 13-NADP + 0,5 mM Na-GoP:
Sigma)
içinde 37°C'de
30 dakika
süreyle
İnkiihe
edil-diler. lnkubasyondan
sonra
her emhriyo
içer-diği boya miktarına
göre değerlendirildi
ve bu
değerlendirme
i~leminde
skala "O" ile
"S"ara-sında tutuldu. Hiç boya içermeyen,
yani yüksek
enzim
aktivasyonu na sahip
olan emhriyoların
skalası
"O", çok hoya içeren yani düşUk en/im
akıivasyonuna
sahip olan embriyolann
skalası
ise
"S"olarak değerlendirildi.
"O", "I" ve "2"
skalada
değerlendirilen
emhriyoların
di~i, "3".
"4" ve
"S"skaladaki
embriyoların
ise erkek
ol-dukları
kabul
edildi.
Değerlendirınelcr
iOx
iO
bUyütmeele stereo mikroskorıa
yapıldı.
Gelişme aşamaları
ve enzim aktivasyonları
helirlenen
embriyoların
gerçekte
hangi
cin-siyete
sahip
olduklarını
belirlemek
için
ta-şıdıkları
kromozomları
görmek
amacıyla
da hu
embriyolar
King (2S)'jn
hildirdiği
şekilde
4-0
saat süreyle
FCS ile desteklcnmh
Ham'"
F-
ı()
mcdyumu
içinde 37"C'de
kUlliire edildiler.
Bu
külliir i~lcminin
son 2 saati içinde
kiilıiır
or-tamına O,OS mg/ml demecoleine
(Sigma)
ilave
edildi.
KüILUr sonrasında
emhriyolar
U,c)S!vl
KCl içinde
i0-
iS dakika
hekletildilcr
ve hunu
takiben
methanol:
asetik asit
O:
1) karışımı
ilc
tespit edildiler.
Son olarak tespit edilen hu
emh-riyolar
%4 giemsa
ile boyandı
ve immersiyoıı
objektini
mikroskopta
kromozomları
hel İrlcndi.
M.FJNDIK
T,ıhlü i. T,ıv~anlarda PMSG +hCG uygulamasıııdan sonra ovaryumJardaki fonksiyonel yapıleır ve utenıs yıkantısıııdaki oosıt ve embriyo sayıları.
Table i. Funetional stnıctmes on ovaries and ooeytcs and embryo eounts in the uterine flush following the PMSG +hCG applicaııon
i
Opcr'L'V"n 'aaI i96.saat (n=20) 12ll. ,aat (n=2ll) Topl;ım (n=40) Onalama :t Std. Sapma (n) Ortalama:t Std. Sapıııa (n) Ortalaıııa:t Std. S;lpl1la (n)
i Corpus IUlculıı ,;ıyısı IS,4S:t 4.7" (3ll9) 13.0:t 5.13" (260) 14.22:t S.O (5(,')) Heıııoraıık follıktıl s;ıyısı 10.15 :t 3,4h (203) Ill.7:t 3.4h (214) IOA2:t 3.4 (417) I';ıılanı;l\nı~ follikııl .,ayısı lS.2:t 3.3" (304) IS.6 :t 9,6' (372) 16.9:t 7.31(76) Tnplanan eıııbrıyo ,ayı,ı 8.1 :t 4.Sd (162) 6.6 :t 4,4d (132) 7.35:t 4.6 12')4) Toplandn oo'ıı saYL'1 J.35 :t 1.3" (27) I.7S:t
I.s
c(35) 1.55 :t lA (62)Elele edılıne oranı ('l) 61.17 64.23 62.57
I\vlll "11]](1<1 aynı harflerle göstcrilen değerler arasındaki fark öneııısizdir (p>ll.OS).
Elde edilen sonuçlar SPSS bilgisayar
prog-ramı kullanılarak değerlendirildi.
Bulgular
Ta\~anlarda yapılan laparatomide
ovar-yumlarda sayılan corpus luteum ve follikül gibi
yapılar ile embrİyo elde edilme oranları tablo
I'de sunulmuştur. Tüm tavşanlarda ortalama
14,22:t5.0 adet corpus luteum, 1O,42:t3,4 adet
hemorajik folliktil ve i6,9:t 7,3 adet patlamamış folliktil sayılmıştır. Çiftleşmeyi izleyen 96. ve
120. saatlerde yapılan gözlemlerde
ovar-yumlardaki corpus luteum, hemorajik follikül
ve patlamanıı~ folliktil sayıları karşılaştırılmış
ve aralarında önemli hir fark bulunmadığı
be-lirlenmiştir (P>0,05).
Çiftle~mcyi takip eden 96. saatte yapılan
llushing sonucunda embriyo ve oosit elde
edil-me oranı '/('6
ı, ı
7(ı
H9/309) ol urken, bu oranı
20. saatle yapılan l1ushingde %64,23 (167/2(0) olarak helirlenmiştir. Bu çalışmada
kul-lanılan 4() tavşandan 34'tinde flushing sonucu
cmhriyn ve oosit elde edilebilmiş vc toplam
elde edilme oranı i/v62,57 (356/569) olmuştur.
Çiftleşme sonrası 96. ve 120. saatte elde edilen
emhriyo ve oosit sayıları karşılaştırılmış ve
ara-larında imenıli hir fark hulunmadığı
be-lirlenmiştir (P>O,O:,)).
Çalışmada elde edilen embriyoların
mor-folojik değerlendirme sonuçları tahlo 2'de
sll-mdmuştur. Çiftleşme sonrası 96. saatle yapılan
Ilushing işleminde toplam 162 emhrİyo elde
edilmiş, hunlardan 44'ünün erken hlastosİst,
46'slnın blastosist, 37'sinin gelişen hlastosist,
ı
:rünün genişlemiş hlastosist ve 22'sİninde-jenere emhriyo olduğu belirlenmi~tir
Çifı-leşmeyi izleyen
ı
20. saatte yapılan llushing İ~-leminde ise 6'sl erken blastosist, lX'i hlastosist,39'u gelişen blastosist, 22'sİ geni~lemış
hlas-tosİst ve 37'si dejenere olmak üzere toplam 132
embriyo elde edilmi~tir. Çiftleşme sonrası <.]6.
ve
ı
20. saatte elde edilen erkek ve dişi cıııbriyosayıları arasındaki fark önemli bulunmuştur
(p<O,OO i). Doksanaltıncı ve 120. saatlerde elde
edilen erken blastosist, genişleyen hlaQosİst ve
gelişmi~ blastosist aşamasındaki eıııhriyo
sa-yıları arasındaki fark önemli (sırasıyla p<O.()() I. p<0,05 ve p<O,Oi) bulunurken. blastnsist
aşa-masındaki embriyo sayıları arasındaki fark ise
önemsiz (p>O,05) bulunmuştur.
Elde edilen emhriyoların morfolojik
de-ğerlendirme sonuçları ilc enıim aktivitesi
skor-ları ve kromozom analiıi değerlcrinin
kar-~ı1aştırıml sonuçları tablo Jde sunulımıştur.
Erken hlastosisı evresindeki enıbriyoların tümü
gelişme aşamaları na giire dişi olarak
TA VŞAN EMBRIYOLi\RININ GELIŞME HızLARıNı VE X KROMOl-OMUN;\ BAGLI ENZIM .. Tablo 2. LJtcnls yıkaması sonucu elde edilen eınbriyolann morfolojik değerlendinne sonuçları'
Tahlc 2. Morphologiea! exaıninaıion rcsulıs of eınbryos thaı obtained af ter uıerine Ilushmg.
TES Gcli~me Eınbriyo
Erkek embriyo Di~ı emhrıyo %
evresi sayısı Sayısı (0;,,) Sayısı (%)
FR 44" 31,43
o'
O 44Y 100 96 saat IJ 46g 32.86 17' 36.95 29' 63.05 (ıı=17) 140 XIJ 37" 26.43 36x 97.3 iY 2.7 GR 13c 9.28 13' 100 ()J O i:R 6h 6.32o'
O 6' 100 i 120. saat IJ 28g 29.47 2x 7.14 26' 92.86 (ıı=17) 95 XIJ 39J 41.0S 32x 82.ll5 7Y iF)) GR 22' 23.16 22' 100 lll' II Toplaııı (11=34) 23S 235 122 113Emhrıyo sayısı sütununda farklı harflerle gösterilen değerler arasındaki fark ünemli (a:b=p<ll.llll I. cd=p<ll.llS yc ef=p<ll.ll i)bulunurken ayııı harfle gösterilen değerıcı' arasıııdaki fark ünemsiz (g:g=p>ll.05).
Aynı s~Hırd,1 farklı harflerle (x:y) gösterilen değerler arasındaki fark önemlidir (p<O.Olll).
TES: Toplam eıııbriyo sayısı (deJenere eınbriyolar hariç). EB: Erken blastosist. B: Bla.sıosisl, XB: Geli~en blasıosısı. GB' Ge-ııışleıııi~ hlasıosısı.
htmların rj,,60'lnın di~i olduğu saptandı.
Ge-lişme aşamasına göre belirlenen oran ile enzim
aktivitesi ilc helirlenen oran arasındaki fark
önemli hulundu (p<O,OOI). Bu emhriyolardan
'1r53.85'inin dhi olduğu kromozam analizi ile
doğrulandı. Enzim aktivitesi ilc helirlenen oran
ile kmmozom analizi ile elde edilen oran
ara-,ındaki fark ise önemsiz bulundu (p>O,OS).
Blastosist evresindeki emhriyoların
ge-lişme aşamalarına göre %74,32'si dişi ve
ck'2:'i,68'i erkek olarak belirlendi. G6PD
ak-tivitesi sonuçlarına göre ise hu embriyoların
'It
:'i4,O)'i dişi ve'Y<45,9S'i
erkek olarak ayrıldı.Bu oranlar arasındaki fark önemli bulundu
(p<O.O I). Blastosist evresindeki embriyolar için
enzim aktivitesi ile helirlenen oran ile
kro-mozom analizi ile elde edilen oran arasındaki
fark ise linemsiz hulundu (p>0,05).
Geli~en blastosist evresindeki embriyoların
gelişme aşamalarına göre % iO,53'ü dişi ve
%89,47'si erkek olarak helirlendi. G6P!)
ak-tivitesi sonuçlarına göre ise hu embriyoların
'k46.05'i dişi ve %S3.9S'i erkek olarak ayrıldı.
Bu oranlar arasındaki fark önemli hulundu
(p<O,ooı). Bu evredeki emhriyolar için enıim
aktivitesi ile belirlenen oran ile kromoıom
ana-Iiıi ile elde edilen oran arasındaki fark ise
önemsiz bulundu (p>0,05).
Genişlemiş blastosist evresindeki
eınh-riyoların tümü gelişme aşamalarına göre erkek
olarak helirlendi. G6PD aktivitesi sonuçlarına
göre ise bu embriyoların %40'1 dişi ve %60'ı
erkek olarak ayrıldı. Bu oranlar arasındaki fark
önemli bulundu (p<O,OO I). Geni~lcmiş
blas-tosİst evresindeki embriyolarda enzim aktivİtesi ilc helirlenen oran ile kromozom analizi ilc elde
edilen oran arasındaki fark önemsiz hulundu
(p>O,05).
Bu çalışmada elde edilen embriyoların
(n=235) gelişme aşamalarına göre i 13 adeti
ola-IIH) \ııYINDIK Tıhlı) 3. Eınbııyoların morfolojik değerlendirme sonuçlarının. glikoz-6-fosfaı dehıclıo.lenaz enzımı ,ıkli"iıesı skorLıı. Vı:
kram()zoın analııi sonuçları ilc kar~ı1a~ıırılması.
T,ıhk
:ı.
('O[npdnSOn of morphulugıea! cXdmination results wıth gluc()sc.6-phosph'lle c1ehydrogenase cnıynıe deliı ııy ',cuıes ,ınci ehromosume analysıs resıılts of embryos.G6PD aktivitesi Kramozom Analııı
GL'lı~lnc Cl'ıcsi
_._-Doğrıılıık Kıılıanılan Cinsiyeti be- Emhıiyonık cınsıye!
LS: embnyu Siıyısı) Skala ES
---oranı ES lirlenen ES (Ok) Eıkek (%) Dı~ı (Si i
EH li-o-ıj D (iO) 0-1-2 30 °k60 14 8 (57.14) 3 (37.5) i i(ı2.i)
3-4i 20 12 5 (41.67) 3 ((,O) 2(40) _.-0-
ı
-2 7 4 2 (50) i (SO) 1(50) __ E (IL)) 'Yr63.16 34-5 12 6 4 (66.67) 3 (75) i (25) 13 (74) --O-I -2 33 18 13 (72.22) 6 (46.15) 7(5Us..~ D (55) %60 3-4-S 22 17 L)(52.94) 5 (55.56) 4144.44)-_
.. .-O-I -2 30 23 15 (65.22) 6 (40) i)(60) E (68) 'Y,,55.88 i 3-4-5 38 25 17 (68)ı
0(58.82) 7141.1:-;) XB (76)---'---O-I -2 5 2 2 ( 1(0) i (SO) i iSO)
D (8) "i(62.5 .--345 3 3 J (33.33) i(i (0) Oill) O-I 2 14 ii 7 (63.64) 4 (57.14) 3 (.C.86) __ (iB (35) E
ns)
o,i{,O 345 21 12 9 (75) 51.SS.S6) , 4144.44 ) --Tupldlll iD (lll) O-I -2 68 °k60.18 66 38 (S7.58) 19 (50) i i)iSOi (235)i
E (122) 3-4-S 71 '1('S8.2 81 54 (66.67) 2L) (53.7) 25 (46.:;) ..--D --D[~ı. E Eıkck. EB: Erken blastosİst. B: Hlasıosisı. XB: Gcli~en blastosist. GB: Geni~leınl~ bl,ısiosısı
rak helirlendi. G6PD aktivitesi sonuçlarına göre
di1i olarak ayrı lan emhriyolardan 0/1,,60,iR'inin (n=6H) di1i. erkek olarak ayrılan embriyolardan ise lYi5H.2\inin (n=7 i) erkek olduğu belirlendi.
Bu oranlar arasındaki fark önemli bulunmadı
([1>0.05). Bu embriyoların 92 adetinde
kro-mü mm analizi ilc cinsiyet belirlenebiIdi (44
di~i. %47.R3 ve 48 erkek (fr;52.17). Enzim
ak-ıivitesi ile belirlenen oran ile kromozom analizi
ilc e1dc edilen oran arasındaki fark önemsiz
bu-lundu (p>O.05)
Geli1me aşamasına göre erkek olarak
ay-rılan 122 embriyodan Hi tanesi (%66,39)
kro-mOlOm analizi için kullanıldı ve hunlardan
54'iindc (1;;'66.67) cinsiyet helirlendi. Gelişme
i1~amasına göre erkek oldukları belirlenen bu 54
cmhriymbn 29'unun (';;53,7) erkek olduğu
km-moznın analizi ile doğrulandı. Gelişme
a~a-masına göre dhi olarak ayrılan i 13 embriyodan
66 tanesi
(I;;
58,41) kromnzom analizi içinkul-lanıldı ve hunlardan 38'inde (Ok57,58) cinsiyet
hclirlendi. Gelişme a~amasına göre dişi
01-duklan helirlenen bu 38 emhriyodan
ı
9'unun(0/150) di~i olduğu kromozom analiıi ile
doğ-nılandı.
Bu çalışmada elde edilen 235 emhriyonun
glikoz-6-fosfat dehidrojenaz enzimi akıi'./iıesi
sonuçlarına göre i i <)'unun (%50,64) di~i ve
i i 6'slnın (%49,36) erkek olduğu helirlendi.
Enzim aktivitesine güre di1i oldukları
be-lirlenen 119 embriyodan 72'si (llr6(),))
kro-mozom analizi için kullanıldı ve 47
cmh-riyonun (%65.28) cinsiyeti belirlendi. Bu 47
embıiyodan 26'slnın (%55,32) dişi olduğu
doğ-nılandı. Enzim aktivitesine göre erkek oldukları
belirlenen 116 emhriyodan 7S'i (0/(,64.66)
km-mozom analizi için kullanıldı ve 45
cınh-riyonun (%60) cinsiyeti helirlendi. Bu 45
cmh-riyodan 2Tsinin (%60) erkek olduğu doğrulandı
(Tahlo 4).
Elde edilen 235 embriyodan 14Tsi
(£'k62,55) kromozom analizi için kullanıldı.
T.-\VŞAN L\18RIYOLARIl\'IN GELlŞ\1E HIZI.ARI!'JIVE X KROMOZOMUNA BAGLI ENZl\1 .. Tablo 4. Eıııbrıyoların glikoz-o-fosfat dehidrojenaz enziıııi aktivitesı skorları ile kmıııozoııı analizı
sonuçlarının karşılaştırılması.
Table 4. Coıııparısoıı of glucose-(ı-phosphate dehydrogenase enzyıııe activiıy scores wıth chroıııosoıııc analysıs resııl!s of eıııbryos.
ıoı
i
(;(jPD aktivitesi Kroıııozoııı Analizı --..-Skala ES %) Kullanılan Cinsiyeti belirlenen Emhriyoııik cinsiyeı Dogrıılıık
i
ES(%) ES(%) Erkek Dişi oranıi
Tophıııı ()- i-2 11915().64)" 72 (6().5) 47(65.27) 21 26 '/'.55.32"i
(n5).._--L
; 34-5 116 (49.36)h 75 (64.66) 45«(i()) 27 Iii oj, (j()h!
Ayııı qtırda ayııı harrıerle (,Gl / h:b) giislerilen değerler arasındakı fark öneımizelır (p>().())). ES Eıııbrıyo'ayı"
helirlcnehildi. Bu embriyoların 48'inin erkek
('i; 52. i 7) ve 44'linlin (o/tı47.83) dişi olduğu
be-lirlendi. Enzim aktivasyonu ve kromozom
ana-lizi ilc helirlenen erkek ve dişi embriyo oranları arasındaki fark iinemsiz hulundu (p>0.05).
Tartışma ve Sonuç
Bu çalışmada kolay hir şekilde, kısa sliredc
ve dlişlik maliyetle emhriyonik cinsiyeti
sap-tayahilecek hir yöntem araştırılmıştır. Materyal
olarak tavşanların seçilme nedeni. embriyo
üze-rinde gcn,:ekleştirilecek çalışmalar için en ideal
hayvanlardan birisi olmasıdır. Tavşan
emb-riyosu diğer emhriyolara oranla daha büyüktür
(-140 ı..ını) ve 40-47 saat içinde 16 hücre
aşa-masına. 75-96 saat içinde de blastosit evresine
ulaşmaktadır. Dördüncü güne kadar uterusa
inen tavşan emhriyoları 7-8. günlerde implante
olmaktadır
cı
I). Tavşanların seksücl sikluslarıdeğhkendir ve gebelik süreleri kısadır. Tavşan,
kolayca hulunahilcn. hesIcnehilen ve
ba-kılabilen hir hayvandır. Bir defada çok sayıda
emhriyo elde edilehilir. Tavşan. bu çalışmalar
için en uygun hayvan türlerinden biridir (4. 20,
27. 37) Bu çalışmada kullanılan hiçbir tavşan
iildürülmemiştir. Embriyolar cerrahi yöntemle
toplanmış ve hütlin tavşanlar operasyon
son-rasında iyileşineeye dek barındırılmıştır.
Çi ftleşme sonrası değişik zamanlarda
top-lanan emhriyoların gelişme aşamalarının hüyük
farklılıklar gösterdiği ve hu farklılıkların. fer-tilizasyon zamanındaki farklılıklar, gelişmenin
duraklaması veya tamamen durması,
emb-riyonun hiillinnıe oranı. embriyoların genetik
olarak sahip olduğu hüyüme kapasitesi ve
cin-siyetc bağlı büyüme farklılıkları gi bi değişik
faktörler nedeniyle oluşahileceği öne
.sü-rlilmektedir (6. 16). Bu çalışmada da çi ftlc~mc
sonrası 96. ve i20. saatlerde toplanan
cmh-riyoların gelişmc aşamalarının hUyiik
fark-lılıklar gösterdiği helirlenmi~tir. 96. saatte 44
erken blastosist, 46 hlastosist, 37 gelhen
hlas-tosist, 13 genişlemi~ hlastosist ve 22 dejencrc
cmbriyo elde edilirken, 120. saatte 6 crkcn hlas-tosist, 28 hlastosist. 39 gelişen hlastosist. 22
gc-nişlemi~ blastosİst ve 37 dcjenerc emhriyo eldc
edilmiştir.
Gelişme hızına görc emhriyonik cinsiyet
tanısı gerçekten çok hızlı bir yöntemdir. İn vitm
koşullarda üretilen ya da canlı hayvanlardan
toplanan emhriyolar kısa bir sUreçtc geliş mc
aşamalarına göre hirhirlerinden ayrılahilmckte
ve farklı gclişme aşamalarındaki cmhriyolar
farklı alıcılara transfer edilerek cinsiyet
.sap-taması yapılmaktadır. Ancak. hu teknikle
ya-pılacak cinsiyet tanısının doğrulıık oranı daha
dUşüktür. Çünkü emhriyoların
değerlendirilme-sinde kişisel deneyime gerek.sininı
du-yulmaktadır.
Bu çalışmada, gelişme hızına görc
cin-siyeti belirlenen 92 emhriyonun karyotipleri
ha-zırlanmış ve hunların 48'inde (%52.
ı
7) cinsiyetdoğru teşhis edilmiştir. Bu oran. Tsunoda ve
ark. (41)'nın belirlediği ';.(.71 doğruluk oranının çok altında kalmıştır. ancak ineklerde (I X).
do-muzlarda (13) ve tavşanlarda (20) yapılan
ça-lışma sonuçları ilc uyumluelur. Bu sonuçlar
erkek ve dişi embriyolar arasında geli~me h1l.1
baklınından önemli bir fark bulunmadığını
1112
Sunulan
çalı~mada
emhriyoların
gelişme
hızları
ile viabiliteleri
arasındaki
ilişkiyi
be-lirlemek mlimklin olamamıştır.
Çlinkü elde
edi-len
embriyoların
gelişme
aşamaları
be-lirlendikten
hemen
sonra enzim aktivasyonları
iil~lilmliştlir
Bu
ilişkiyi
doğru
olarak
sap-tayahilmek
i~in
geli~me
a~aması
belirlenen
embriyoları
daha uygun hesi yerlerinde
kültüre
etmek veya alıcı hayvanlara
transfer etmek
ge-rekmektedir
Erkek embriyoların
neden dişilerden
daha
hızlı gel iştiği tam olarak anlaşılamamıştır
(19,
41).
Bununla
birlikte,
gcli~me
hızındaki
hu
farklılığın
en erken
tohumlamayı
izleyen
3.
glinde
göriilmesi,
hunun
emhriyonun
ilk
ge-nomik
ekspresyonu
ile
ilgili
olduğunu
dü-şündürmektedir
(5, 6, 7, 8). Erken embriyonik
gelişimin
uldukça
kompleks
bir i~lem olduğu
ve in viım üretilmiş
emhriyolarda
gelişme
hı-I.ının. innrganik
iyonlar,
buflcr'lar,
gaz
kom-pozisyunu,
aminoasitler,
büyüme
faktörleri,
vi-l<ıminlcr ve makromoleküııer
gihi hirbirinden
farklı pek çok faktör tarafından
etkilenehilcceği
kahul edilmektedir
(12, 19).
Bu çalışmada
emhriyoların
glukoz-6-fosfat
dehidmjenaz
enıimi
aktivitelerini
belirlemek
amacıyla.
Wiııiams
(45)'ın
tarif
ettiği
ko-lnrimetrik
iilçlim
tekniği
modelolarak
alın-mıştır
ve indikatür
olarak
reaksiyona
katılan
boya
miktarındaki
azalma
ölçLilmüş
ve
de-ğerlendirme
işleminde
skala "O" ilc "5" arasında
ıutulmuştur.
Çalışmada
tuplam olarak 235
emb-riyonun enzim aktivasyonu
incelenmiş
ve
bun-ların
(j,,]7,RTsi
"O",
% i6,6\1
"I",
o/r16,
iTsi
"2", CIi i
7AYi
'T.(/()16,1Tsi "4" ve o/£ıl5,74'ii
de ")" skala ularak değerlendirilmiştir.
"O", "I"
ve
"2"skaladaki
emhriyolar
(%50,64)
dişi
ola-rak.
"3".
"4"
ve
"5"
skaladaki
emhriyolar
(ii
4Y.36) ise erkek olarak ayıılmıştır.
Bu oran
Williams
(45) 'ın (k50 oranı ile uyumludur.
Sunulan
çalışmada
embriyolar
alıcı
hay-vanlara
lranslcr
ı'dilmedikleri
için gebelik
so-nuçlarına
ulaşılamamış
ancak,
embriyoların
kınmı)ıom
analizleri
yapılarak
yünternin
doğ-nıluğu
belirlenmeye
çalışılmıştır.
Enzim
ak-ıiV
cısYlll1una giire dişi ularak belirlenen
47
emb-riymbn
26\ının
(Iı,55,32)
ve
erkek
olarak
belirlenen
4.'1embriyodan
2Tsinin
(%60)
cin-,\1 Fli\DIK
siyetinin doğru teşhis edildiği ve yöntemin
top-lam
doğruluk
oranının
%57,6
iolduğu
be-lirlenmiştir.
Bu oranları Williams
(45) dişilerde
%72, erkeklerde
%57 ve toplamda
(;U14ıılarak
bildirmektedir.
G6PD
aktivitesi
ile belirlenen
erkek
ve dişi embriyo
oranları
ile kmmozom
analizi
ilc elde edilen oranlar
arasında
iinemli
düzeyde fark belirlenememiştir
(p>(),()5).
HPRT
ve APRT
(adenin
phosphorıhosyl
transferase)
aktivitelerini
belirleyen
ve bunlar
arasındaki
oranı cinsiyet
tanısı için kull<ınarak
emhriyolar
arasındaki
hücresel aktivasyun
lark-Iılıklarını
da hesaha katan Monk ve Handyside
(35) ise dişi embriyolarda
(7,91. erkek
cmb-riyolarda
ise %100 doğrulukla
cinsiyeti
teşhis
edebilmişlerdir.
Elde edilen
sonuçlar
vc
Wil-liams
(45)'ın
bulguları
bu sonuçlar
ilc
kar-şılaştırıldığında,
daha yüksek doğruluk
oranları
elde
edehilmek
için
her embriyonun
toplam
enzim
aktivasyonunun
belirlenmesi
gerekıiğı
görülmektedir.
Bu çalışmada
hücresel
analizler
diğer ıki
yöntemin sonuçlarını
doğrulamak
amacıyla
kul-lanıldı.
Kromozom
analizi yapılan
toplam
147
cmbriyonun
92'sinde
(%62,59)
cmbriyonik
cin-siyet helirlenchildi.
Bu oran araştırıcıların
(21.
25) hildirdikleri
sonuçlar
ile uyumludur
ancak,
bu oranın düşük olmasında
enzim akıivasyunu
için kullanılan
hesi yerinin
emhriyo
ü/(:rinde
yaptığı
olumsuz
etkinin
rolü
olahileeeği
dü-şünülmektedir.
Hücresel analiz sonucunda
cmb-riyoların
%52, lTsinin
erkek
ve (j,,47Jn'iinün
dişi olduğu ve erkek:dişi
oranının
i.()l):iutduğu
belirlendi.
Çalışma
sonucunda.
G6PD
en/iıııı
ak-tivasyonunu
belirleyerek
yapılan
cinsiyeı
la-nısındaki
doğruluk
oranlarının,
gelişmc
hı/ına
bakarak
yapılan
cinsiyet
tanısındakindcn
daha
yüksek olduğu görülmüştür.
Kaynaklar
Alaçam, E .. Tekeli, '1'., Güven, B., Dinç. IL\., Özsar. S., GliIer. '\1. (i'.ll)i). "wk/e,,/,' (ıil,,/
.1/-ı.t/"rel"hi lesluslerıın hıınllll/1l1 eI"~n/ellıl/l!
"m,.'-1ןI'l/117"1/ tle cıl/sn el "'"hiıı I-Lıy i\rd~ Deı,;.
ı
il)-:ı 2. Anderson, Co.B. (i '.l~7). Idenlı/iCl/ııl1n u! ı'Iıi/JlTUlllısex by "efr:,uitlll til H- Y(1ııIi,ı:elıs. Tlıcrwgcf)ul,lgy 27
TAVŞ/\'\I ı::MBI~IYOL\RINI'\I (iELl~ME HızLARıNı VE X KROvıOZOMl~NABACiu ENZIM.. i(i~
.'. Anderson. (;.B. (J 9<)I). Fl'rıili7(1/iml. mr/\, de-:'eIIlIJllıelıl ılııtI el11hr\,1ı IrWlSIN 279-313. In: Rep-mduclJun ın Duıııc'iic /\niıııals, Ed.: Cupps. P.T .. 41h
Edılıun. ACddcınıl' Prcs-s. San Diegu.
4. Aral, S. (i '.)<)3). I'MSe iiI' SÜIJNOl'lIll' I'dill'lI 1(/1'. 5(/IIIi/rdi/ hCe 1'1'GııRIl'1ı1 ovul((syoıı 11/"(//11 lll' I'lIlhriw)
/-i/II/I'SI lItenlıl' eıkisl. Doktora Tezi. l.sıanhul eııı-ver-sıle-sıSdg!ık Bilimleri Enstitüsil.
5. Avery, B., Bak, A., Sehmidl, \1. (198'.»). Dijl'Nelıli((1 cll'IIl'(/ge mles ((ııd sex detemıiıııııioıı iıı Iım'llıl'
1'1Il1ı-rms. Therıngenology. 32: 139147.
(ı Avery. B.• .lorgensen, CB., \1adison, V., Greve, T. f1<)92).H(}/pholııgıwl dl'vI'Iofll71e1l1 ııııd sn o/ bOl'ilıl'
LLL vtlm./I'rtihz.ed I'mhnııs. Mo! Reprod Dev, 32: 265-27ll.
7. Avery. B.. \1adison, V.• Greve, T. (1991). Sex (/ııd devl'lııl'I11('IIII11 hm'ıııe iii. l'l/rlı/i,rtiliz.ed emlJrl'os. The-rıogenology. 35 953-%3.
~. Avery, B.. Sehmidl. M .. Greve, T. (1989) Sn
de-ı,'mlllli/ıiıııı 0/ IıOl'iılf' eıııhrros hi/sl'd iili eI!'i/Iı(/g!'
mın Acl,ı Veı SeııııL.3LL: 147-153.
'J Basrur. B.K.. Bongsn, A.T. (1981l).Aıııııiocl'lıll'Sls/iJr Im'Il,II"1 dl'leelıolı 11/Sl'X i/ııd crlogellf'llc de/n:ıs iıı
Ci/Ille 1185-1189. In: Curreııı Therapy in The-rıngenology. Ed. \1ormw. 0 ..1'1" W.B. Saııııders
Com-p,m)'. I'hilddelphl~1.
iII Belteridge, K ..I. (j'.)84) The /olklıır!' ot sniııg. The-rıogcııolugy. 21 3-(ı.
i i Belteridge. K ..I.• Hare, W.CD, Singh, E.L. (1981).
Aflflmilthe' iıısnseleelıoıı ilı/iınn ilııimills. ! ll9-125. In: New Technolo[.:ies in Aniıııal Breeding, Eds: B.G. Araekeıı. Cl.E. ScıdeL. S.M. Seidel. Al'ddemıl' Press. New York.
12.Carvalho. R.V., Del Campo, \1.R., Palasz, A.T .. Plantc. Y.. Maplcloft. R..I. (J '.)<)6). Surııiliiii /'iIles wıd
l'I'.ı mılıı lll Iım'iııe IVF I'ıııhn()sli'o~eıı iiI di/Yereııı
de-\TI(}I'lııelll"I"Ii/,~eS (}ii dur 7. Thertugcnology, 45: 489.
4')~
i~.Cassar'. (; .. Dc La Fııenle, R., Yu, Z .. King, G ..T., King, \V.A. (1'1'15). Sn,,/ırı!1110solııt' cıııııplemeııı ııııd dt'l'el(}pııı('ııwl diveniıy iiipre- ilııd posı-hulchiııg por-ciııe ı'mlın(}s Ttıeriogenology. 44: 879-884.
14. Cılt, S.L., O'Bricn, .I.K .. Maxwell. W.M.C., Evans,
(;. ( 1<)'.)7). n1nls o/I'II/(' 0/ dl'l'eloIJmelll (}r iıı I'ilm.
I'JDdull'" (}1'OIe eıııhr."os iili SI'.1' ruıio ilııd iıı l'ilıO
sur-\'J
""i
"lıer f'/lıhnD ImllSl"r Thel'ıogcnoiogy. 48:ı
369-1~7R15 Danicll . .1.1'. (! '183).Se.r.sell:'uioıı pmCl'durn. J
Rep-IlllIMcd. 28. 235-237.
16Gates. A.H. (10(5). Rule ot o\'lllilr del'elojJmelıl as ii liiCi(}1 LLL ('mlın'lJlıic IWTil'iI/. 27ll-288. In: Pre-InıpLuııdlJun Sld[.:es or Prt'gnanl'Y. Ed: Wols(cnhoime, G.EW .. W B. S,ıunders Cu" London.
17.Gorelon, i. (i '.)<)4). L(Jhorl/l(}I'I' Produııııııı 11/Ci/Illı' Emhn'o5. 399--t 13.CAB InternationaL. Londoı\ 18.Grisart, B., Massip, A., eollete, L.. Dessy. F. (1<)<)5)
Th!' sex rıılio or hoııiııl' I'mhr\,os l,rodUlı'd iii 1'/11'11 iii
s/"rum-li'!'!' Ol'idııel eell-cııııdiıilJlınl medııııı/ 1.1 ii(}i "i. lere£! Therıogcnology. 43 i()'.)7-I1116.
19. Gutierrez, A.. Behhoodi. E .. Medrano • .1.1'.• \1ur-ray, ,LO. (1996). Relilııoııshıps IJI'{\-l'el'lI .ı/(l~e uııd dı" l'elolJIIWIII "ııd .Wl' or hOl'ilı1' IVM/IVF ,'mlırms iili' lur"d iii I'ilro ı'!'/'Sus iii ıhe shl'l'p !!I'ıdu,,/.
Theriogenology. 46: 515525.
2ll. Harez, LS.E. (1962). Difl"relllwl eleil\'(/ge mIl' iii 2.
dııy Iiller ııwle I'IIhhil emhrms. Pmc Sol' Exp Bıol. HO: 142-
ı
45.21. Hare, W.C.D .• Mitchell. D.. Betleridge. K ..I.• Eag-lesome, M.D., Randeli. G.C.B. (197(ı) Sn/lig 2.
week-old hl)J'iııe eıııhrr(}s hı, chl'lJllwsoııwl (///(//\'IIS
ı,rior lo suri'icul Il'IIııs/er: Prl'ltmillillT 111e/I/ııds oııd rl:'suIıs. Theriogenology. 5: 243.253.
22 . .Tarar, S.I., Flint. A.P.F. (19l)(ı). Snsel('cll(}lıl1/ lIIi1m-/J1i1ls.'A review. Theriogcnology. 46: !'.)1-2Il1)
23. Johnson, L.A. (19'.)5).Sn lırl'Sl'leclilJll In' 11ןil-,.n/ıı.
meiri" S!'I"II'lIIiIJlI ot Xiiııd Y chromol(}lIl(' Iı('uriııg spI'I'm hilsed iili DNA dWI'I'I'llı:e' A rnlt'II. Rl'prod
Fertil Dev. 7 893-903.
24. Kamimura. S., "iishiyama. 1\.• Ookutsu. S., (;010.
K., Hamana, K.(ı'.)<)7). Delermillilıioıı Iıth(}liııell'/ill sex hı' PCR usiııl.:11'1(/1/lu id ilslJil'll/ed Iıl Il'IIıısı'u,~III"1 ulıra.I(}Ll/1d-guided wnııioc!'lılesis. Therıugenolugy. 47
1563 156<).
25. King. W.A. (1')84). Sniııg emhrms
ı".
c\I(}log"ul meıh(}ds. Theriogenology. 21: 7-17.26. King, W.A., Yadav, B.R. Xu, K.P .. PicarCı, L.. Si-rard. M-A, Verini Supplizi A .. Helteridge. K ..I.
(ı
991). The .11'.1' mlios ot h(}I'iııe elıılın'(}.I' 1,,(}duLI'I1 {ii I'il'o w/(i iıı I'ilm. Theriogcnol[Jgy, 36: 77'J-/X';', 27. Kılıçoğlu,ç..
Tekeli, T. (1'.)81). l'/I',wllli/rdu mılmı'(}Il'llııs/eri. Ankara Üniv Ve( Fak Derg. 28 2~.~5. 28. Lazzari, G., Landriscina, R., Duehi. R.. (;alli. C
(1995). Snshifi iıı cillı.'es deril'l'd/mm IVM.IVI-' 1'1ıı1ı.
rl'os culıured iii i/li' sheeı' olıidlıCI \'('r.ı/ls Ci/hı" 1ןI'l). duced hı, C(}III'I'III/IJIIUI sul)('r(}I'Ulilliolı uııd ('mlınD
Il'llııs!"r. Theriogenology. 43 263.
29. Leiho, S.P .• Rall, W.F. (IIJ9ll). frelı(ll,,1 "/(J.~Iı{1\i.1 11/ sex lll hm'iııe li'ıuses hı, (i/l111iııceııle LLS. The-riogeııology, 32:531-551.
3ll. MeEvoy, .I.D.(1992). AllemıiOlI ııııhe snr"l/o Anı-nıal Breeding Ahs(rae(s. 60: 97 -II i.
31. MeLaren, A. (1972). ltıe Emhl'w i 42. III
Rep-roduction iıı Maıııınai.". Auuk 2 Enıhryoıııc "ii(i Fel,,1 Dcvc!opmclll. hı'. Aus(lll. CR" Shurl. R. V. i,i cd:.
1114
T2 Miller~ .i.R. (I 091). l::nıhryn s~xinj.;. A hrood SUr\'t'Y.
Reprol! Duııı Aıııııı. 2(): 54-57.
.'-'. Millcr . .I.R. (199i). Isolurum ot Y-chmmosome sıw-<:ı/ıcI('lll.I('II(I'I. uııd r/1t'lr USeiii emhryo sexiilI'. Rcprod
Doııı ..\111111. 26 5X-Cı5.
:ı-ı
Millcr. (;.F., Glicdt, D.W .• Rakes • .1.1'1., Rovi, R.W. ( 19'J-l), Addıı({)ıı ot l)eııu:il/ul17ilıl'. hvpo((luriııe uııd l'pın"/,i7l11l" !PUt:) or /ıoviııe ovidUc.1all'pirheliul Cl'l/s(!Jore) ((10111'or comh(lwnoıı ro /ıov(lıt' (ıi ı'irm .ticr-ııliz((rUJII /11/'<1ill/l1(lıı:rl'({SI'S ro su/,seqlıellT emhryıı
ci,,-((ı,((gl' mre Therıogcııology. 41: 6X'J-696.
:ıs
:Vlonk. M., Handyside, H. (1'J88). Spxiııg ot ı,rp-Implwll((nOIl IIl11l1St' pnıhrros hr nıeaSlırell1t'lır otX-iınked ,~t'II(, doı((g" iıı u sıııgle hlasromere. J Reprol! FertıL. 82 :ıü5-368
36 Monk, \1., Harpcr, MJ. (1978). X chmmosoll1e uc-nl'lIs iii pr"ınıpiwırmioıı enıhrros li.ml1 XX aııd XO
mıı/hers. J Lllıbryul Exr Morrh. 46 53-64.
37. Pahuççuoğlu. S. (10'Ji). 7ilı'şun emhrtrolartlllll ku-:((IııII11U.l1H' külrüre elillm,,/,'rinlieıı sonra IrWl.l/f.-rlt'ri
ı"enııdl' um,ırırnıalur Doktora TezI. Istaııhul Üni-ıersııesı S<tğlık Hilıınıeri Enstıliısil.
:ıX.
Pcippo . .I.. Bredhaeka, P. (1095). S<'X-relurl:'d Rmwrh rale dıllereııces iıı /lliilisi:' preimplaTlıarioTl emhr\'os iıı vim uııli iii ı.llm. Mol Reprod Dcv. 40: 56-61. 30. Rotlmann. 0 ..1.. Lampeter, W.W. (19R i).DI:'-I."/O/JIIWIII o/ eur/\. IIl11l1SI:'anli ruhhiı enıhrros wirhoıır :iiiiu /Jd/u<:ıd(( .i Reprot! FertiL. 61: 303-306.
-ıo. Thihier. M .. Nihart, \1. (1995). Thl:' .Wtfııg ot hoviııl:'
emhnııı ın IhelıeM Therıogenology. 43: 71-80. -ll. Tsunoda. Y., Tokunaga, T., Sugie, T. (1985). Alraed
Wf mn" "jleuve yoU/ıg alrn ııwısln oUiısr wıd slow deve/"/Jln,~ molıli:' I:'mhryos. Gaıncte Rcs. 12:301-304. -l2. Van Soon. A .• Van Vlaenderen, 1., '\1ahmoudzadeh,
A.R .. Deluyher. H., Dekruif. A. (1992). COl17puCriml roı" "j iii ,.ıım .fnıili~eli hm'ıne emhrws rplıııed lo rhe
M FINDIK
iıırervııl .froll1 iıısemiıııırioıı ro linı ı:/ı'ıımgı. Thc-riogcnology. 38: 905-920
43. Van Viict, R.A .• Verrindcr Gihhins. A.M .. Wa1tlln. .I.S. (1989). !,il'PSlod enıhrw sning: A r",,,ın ot
Ll/i-rl:'ıır II1dhods. wiıh ell1/,/wsıS 011 Y-s/'nt/ic f)NA pro. bl:'s. Theriogenology. 32: 421-438.
44. Vanderhoom, R.J., MeCauley, T.C., Tappan, R.• Ax, R.L. (1097). Roviılt' lepmliUCril'e hiornlın%gr 457-473. In: Current Thcrapy in Lırgc 1\lllln;ı1 The riogcııology. I" ediıion. Ed: Y,)ungquısl. R5.. W.B Saunders Comrany. Philadelphı;\.
45. Williams, T ..J. (1086). Areclıllllfue .foı ıcwıg Illoul,' emhryos hra visulıl colorimeıric U.ISUl. oııhe X-Iıııked 1:'117.1'1111:"ı:lucose-(j-phospu/wıe delırdmg/'1/(lw. The-riogcnology. 25: 7)3-739.
46. Windsor, DJ'., Evans, G., White, LG. (1993 l. Se.\
prl:'deıerıııiııulioıı hı' sepurarioıı oj X aııri Y ,lım-lIlosomt'-hpuritıg spenn: A revıew Rern)(! Ferlll De\'. 5 155-171
47. Xu, K.P .• Yadav. B.R., King, W.A, Betteridge. KJ. (1'J92). Se.\-reluIl:'d dlltNelıCt's III del'elo/'lJ1enıırl mIn o(hoviııe t'lIlbrws pmduced 1111£1clIlıııred iıı nliD \'101 Rerrod Dev. 31: 249-252.
48. Yadav, B.R., King, W.A., Betleridge, K..I. (10')3) Relıırioııship herwl:'l:'lI rlıe complerwıı ol 111-.11cI,'umge uııd rili' clıroıııos(lll1111 compluneııı. 'e.f. und de-l'eloı)nıl:'1I1 nill:'s oll){}I.lIle emhrnl.l gel/enıınl in ,'IIU,
Mol Reprod Dcv. 36: 434-439 Yazışma Adresi:
Dr. Murar FI/ıdık
Aııkuru Olıil'I:'Tsiresi Verl:'rinN Faküllesi DO,i(ulI1 VP.Iiııekol,,;i AIlII/Jllim Dıılt OM LO -AnkaraITürki\'<'
Tel +90(312)31703/5/270 Fax. +(,10(312) 3178381
