30 (4): 624-638, 1983
HAYVANLARı:" PİŞJ\1EMİş YE~İLFBİLİR DOKULARıNDA SULFONAMİD
A!'\ALİzİ
A. Nazıın Özkazançl Sezai Ka.ya2
Analysis of sulfonamides in UDcooked edible tiSSUfll of anim"lı;
Suınınary: A speetrophothometrie-thin la)'er clıoromatographie proee-dure was made to adapt for the determination of sulfoııamides in animal tissues. The sulfonamiden were extraeted from the tissues with mixture of ehloroforme-acetone (l to 1). F:xtraeting solvent was evaporated. Shaking with 1 N HCL, hexane and aeetone, the residue was transferred to a separator funnel. Sulfona-mides were partitioned to acid layer that was drawn aU anather separatorfurmel. Organie phase was reextraeted with 1 N HCL and the acid extraets were eom-bined. The solution was made basic and interfering materials were extraeted fram the basic solution with ehloroforme whiclı was taken out. Then the solution was made aeidie. The Bratıon-il1arshall reaetion was developed.
if
pink-red eolor farmei withinı
5 minutes af ter eolor reagent was added, samples would be positive. Produeed sullanamide d.ye was partitioned into n-butanol prior to speetr'ophotlıomet~y. The butanol extraet was the applied thin layerehramatog-rap~y plate to separate Bratıon-lılarshall reaetants. Aeetone+n-heptane+me-tharıol+
ammonium ~droxide+
n-bu tanol (36+
ı
o .
5+
4.5+
5+
5) was used as mobil solveııt system.The reeovery experiments were earried out on liver, muscle and kidney samples of eattle and ehieken. Sulfonamides wae added to these samptes at levels of
o.
ı,
0.5 andı.
o
ppm. Ninety three reeovery anal;'sis (eonsisting of 36 liver, 24 meat andı
4kidney samples of eatıle, andı ı
liver and 8 meat samples of ehieken) were performed on the spiked samples to determine valida!y of the pro-cedure.lt was ealeulated .from the results of the reeove1)' experiments that sulfo-namides were recovered in exeess of 85
%,
with mean reeovery of percent 90. 6 :1::ı. ı
9 at the O. 1ppm level, 89. 7 ::i:: 0.32 at the 0.5 ppm level and 90.8 İl' 54 at the 1 . Oppm level. The control tissue samples read less than O. 04ıProf. Dr., A. D. Veteriner Fakültesi Farmoakoloji Toksikoloji Bilim Dalı. Ankara. 2 Dr. :vıed. Vet., A.D.Veteriner Fakültesi Farmakoloji-Toksikoloji Bilim Dalı. Ankara
HAYVANLARıN PIŞMEMiş YENİLEBiLiR DOKULARıNDA... 625
ppm. It was found that as little as O. 1ppm sulfonamide can easily be detected and identified iıı this fashion on a lOgram tissue sample.
lt is concluded that this procedure has some economical and reproducibility advantages and can be used quaııtitative and qııalitative estimation of sulfona-mides in animal tissues.
Özet: Hayvansal dokulardaki sulfonamid kalıntılarının analizi i~.in
bir spektrofotometrik-iııce tabaka kromatografik metod uyarlaması yapıldı. Sulfonamidler dokulardan kloroform-asetondan oluşan karı,nmla efestre edildi-ler. Sulfonamidler ekstrakttan sıvı sıvı partitisyonla sulu asit ortama alındılar. Çözelti alkali .yapıldıktan sonra, kloroformla çalkalanarak inieıferens yapısı maddeler uzaklaştırıldı. Çözelti tekrar asitleştirildi ve RrattorHH arshall renk reaksiyonu geliştiriidi. Renk a)'ıracı katıldıktan sonra 15 dakika içinde pembe-kırmızı bir renk şekillenen nümuneler sulfonamid kalıntıları bakımından pozitif kabul edilirler. Oluşan sulfonamidli boya maddesin butanolle ekstre edildikten sonra, butanol ekstraktın absorbaııcı spektrofotometrede akımdu. Daha sonra belli bir /ıacme kadar azaltıldıktan sonra, butanol ekstrakt ince tabaka kroma-tografisi plakasına uygulandı. Böylece reaks~yon ürünlerinin ll.yrılması başarıldı. Çeşitli sulfonamid standardları kullanarak 36'sı dana karaciğeri, 24'ü dana kası ve l4'ü dana böbreği ile ll'i tavuk karaciğeri ve 8'i tavuk kas doku-sandan olmak üzere toplam 93 rekoveri analizi .yapıldı.
Kullanılan analiz yöntemliyle, ortalama % 90 oranında rezidü kazancı
sağlandığı, O. 1 /JPm'e kadar inen sulfonamid kalıntılarının belirlenebileceği, kontrol değerlerinin düşük olduğu, iyi sayılabilecek derecede tekrarlanııbilir ve güvenilir oldu,gu sonuc/ma varıldı.
Giriş
Sulfonamidler, öncelikle ucuz ve geniş etki alanına sahip olmaları nedeni ile gcçmişte ve günümüzde besin üretimi için yetiştirilen hay-vanlarda hastalıklardan koruyucu ve sağıtıeı olarak geniş bir kullanıl-ma alanı olan ilaçlardandır. Hayvanlara yemlerine, sularına katılarak veya parenteral olarak sağltıcı yada daha az miktarlarda verilen sul-fonamidler, önerilen şekillerde kullanılmadıklarında, ilaç uygulanan hayvanl~rın yenilebilir dokularında ve bunlardan sağlanan ürünlerde kabntı bırakırlar. Böyle kalıntıları ihtiva eden besin maddeleri insan tüketimi için uygun değildir (4, 2 I, 24, 25). Zira, et ve diğer hayvan-sal ürünlerdc bulunabilecek çok az miktardaki sulfonamid kalıntısı insanlarda aBerjik etkilere (2,22), ct ve süt teknolojisinde ferman tas-yon işlemindc teknolojik problemlere (32) ve daha da önemlisi ilaçlara dirençli bakterilerin ortaya çıkmasına neden olurlar. (22).
Birle~ik Amerika'da besin üretimi için yet~tirilen hayvanların
%
70-80 kadarının yaşamlarında bir süre yemleriyle bir yada birkaç ilaç aldıkları hesaplanmıştır. Aynı ülkede, buzağı yemlerinin%
82'si-nin, kanatlı ve domuz yemlerinin%
:ıO'kadarının ilaçlı yem katkı maddesi içerdiği belirtilmiştir. Normalolarak, böyle hayvanların do-kularındaki ilaç kalıntıları, kesime göndermeden önce belli bir süre hayvanlara ilaç veya ilaçlı yem ve su verilmemesi ile ve bu süre so-nunda mezbahaya sevkedilmeleri ile kontrol edilebilir (20, 22, 28, 31). Ancak, antibiyotik ve sulfonamidlerin bilhassa verim artırıcı olarak ve bu amaçla da subterapötik miktarlarda sürekli ve kontrolsuz bir biçimde kullanımı, ette ve diğer hayvansal kaynaklı besin maddelerin-de çe~itli düzeylermaddelerin-de ilaç kalıntılarıyla karşılaşılmasını kaçınılmaz yap-maktadır (16, 22).Besin üretimi için yetiştirilen bir çok hayvan türünde çeşitli sul-fonamid türevieri ilc yapılan kontrollu denemelerle bunlarda, kesime sevkedilmeden ne kadar süre önce ilaç uygulanmasının kesilmesi ge-rektiği belirlenmiştir (4, 7, 15, 18, 22).
Righter ve arkadaşları (26) koyunlarda yaptıkları çalışmada, karaciğer, böbrek ve yağ dokusundaki sulfamerazin kalıntılarının son ilaç uygulanmasından 7 gün, kaslardaki kalıntıların i O gün sonra O.i
ppm altına düştüğünü belirtmişlerdir. Aynı araştırıcı grubu, buzağı ve piliçlerde sulfamerazinle yaptıkları başka bir çalı~mada (25), ilaç verilmesi kesildikten sonra buzağılarda sulfonamid kalıntıları mn 8. günde, piliçlerde
ıo.
günde kabul edilen O.i ppm'lik tolerans düzeyi altına indiği kaydedilmiştir.Kanatlılardan elde edilen sonuçlar böbrek ve yumurtadaki sul-fonamid kalıntılarının O.i ppm yada bunun altına inmesi için en azından 7 gün süreli bir ilaç kesilmesi periyoduna gerek olduğunu göstermektedir (27). Hatta, yumurta sarısındaki kalıntıların aynı dü-zeye inmesinin 8- iO gün aldığı da belirtilmi~tir (21).
Çeşitli hayvan türleri ve suJfonamid türevler iarasında yapılan karşılaştırmalı denemelerden elde edilen bulgularla, besin üretimi için yetiştirilen hayvanlarda, kesimden en azından iO gün önce (uy-gulama ~ekli, yolu ve prcparata göre 2-21 gün arasında) ilaç yada ilaç-lı yem ve suyun kesilmesi gerektiği ifade edilmiştir (22, 28). Bu süre USA'da i978 yılında i5 güne çıkarılmıştır.
Hayvansal kaynaklı çeşitli besin maddelerinde kalıntı halindeki sulfonamidlcr mikrobiyolojik yada kimyasal yöntemlerle belirlenir.
HAYVANLARıN PİŞMEMiş YENiLEBİLiR DOKULARıNDA... 627
Mikrobiyolojik yöntemler kuBanılacağı zaman, sulfonamidlerin an-tagonisti olan PABA ve folinik asit yoğunlukları en düşük olan ya da bu maddelerin hiç bulunmadığı bakteriyel geliştirme ortamlarını kullanmak gerekir (20, 32).
Bugün için hayvansal dokularda muhtemel sulfonamid ka1ın-tılarının aranmasında başvurulan yöntemlerin çoğu kimyasal analiz niteliği taşır ve Bratton-MarshaB tarafından geliştirilen kolorimetrik yönteme dayanır. Çeşitli besin maddelerindeki sulfonamid kon tam i-nasyonunu ortaya çıkarmak için adı geçen yöntem esasına dayanan bir çok teknik geliştirilmiştir. Bu yöntemlerin çoğunda biyolojik or-tamdan wlfonamidler kloroform (6, 17), aseton (5, 28), kloroform-ascton (30) \'e alkoBe (5) estre edilirler. Ekstre edilen sulfonamidler ekstrakttan sıvı-sıvı partitisyonla asit (9, 30) yada alkali(6) ortama alınarak doğrudan veya kolon kromatografisi ile (13, 29) yada metal ile çöktürülmcyle (12) ileri bir temizleme gerçekleştirildikten sonra Bratton-MarshaB renk reaksiyonuna maruz bırıkılırlar. Ancak, çö-zeltide renk geliştirme temeline dayanan bu yöntem sclektivite ve spe-sifiteden yoksundur. Ayrıca, kolorimetrik yöntem sadece total sulfo-namid miktarını verdiğinden, tarama nitelikli bir çalışmada diğer kim-yasal yöntemlerle birlikte uygulanması gerekir. Bu nedenle, kolori-metrik yöntem ince-tabaka kromatografisi ile (I, 3, 5, 23) yada gaz-sıvı kromatografisi ile (9, iO, i i, 19, 28) birlikte uygulandığında iste-nen yönde gelişme sağlayarak güvenilir olmaktadır. Ancak, bugün p~halı cihazları ve deneyimli personeli gerektirmesi nedeni ile, gaz-sıvı kromatografik uygulama rutin analizlerde kuBanılacak şekilde yaygın-laşmamıştır .
Bratton-MarshaB renk ayıracı, N-(- l-Naphthyl)-cthylene dia-mine dihydrochlorid (NED), genellikle diazotize olmuş aromatik, primer aminlerle kenetlenerek spektrofotometreyle ölçülen renkli maddeler oluşturur. Sulfonamidler, bu grup bilqikler içinde yer alır-larsa da, renk ayıı'acıyla yaptıkları ürünlerin ekstinksiyon koefisientleri ve absorbsiyon maksimasının dalga boyları değişkenlik arzeder. Bu du-rum sulfonamidlerin doğru ve özgün bir şekilde NED ilc ölçülmelerin-de bazı şüphelere neden olur, Zira, sulfonamidlere ilaveten NED ilc reaksiyona giren birçok ilaç ilc zirai mücadele ilaçları ve metabolit-leri bulunur. Koksidiostatik olarak kuBanılan zoalenin metaboliti ANOT (3-amino-5-nitro-0-toluamid), herbisid olarak kuBanılan ami-ben (3-amino-2,5-dichloroami-benzoic aeid), kanatlılarda yem katkı mad-desi olarak kuBanılan eyzine (2-aeetylamino-S- nitrothiazol), sulfa-nitram (2-acetyl-p-nitrophenyl) sulfanilamid), aromatik NOı
grup-ları ihtiva eden herbisid ve insektisidler(23) kolorimetrik yöntemde interferens kaynağı olabilen bahsedilmeye değer başlıca kimyasal mad-delerdir.
Yukarıda belirtilen bileşiklerden ve bunların metabolitlerinden ileri gelen muhtemel interferenslerin düzeyi henüz tamamı ile değer-lendirilmemiştir. Bu sebepten, daha önce de değinildiği gibi,. kol
0-rimetrik yöntem tTK ile birlikte uygulandığında, interferenslere mey-dan vermeyerek dokulardaki rezidüal sulfonamidlerin ölçülmesine olanak sağlamaktadır (23).
Bu çalışmanın amacı, hastalıklardan koruyucu ve sağltKı, do-layısı ile verim artırıcı olarak besin üretimi için yetiştirilen hayvanlar-da sık kullanılan, ancak öngörülen şekilde uygulanmadıklarında, bu hayvanlardan sağlanan etlerde kalıntı bırakarak, çeşitli sağlık sakınca-lan yaratabilen sulfonamidlcrin adı geçen hayvansal etlerde kalınti-lannın analiz edilebilmesi amacıyla laboratuvar şartlanmıza uygun, rutin çalışmalarda kullanılabilecek, basit, güvenilir ve ekonomik bir yöntem uyarlaması yapmaktır.
~ateryaı ve ~etot
lVIateryal olarak dana ve kanatlılara ait çeşitli doku örnekleri kullanıldı. 74 ü dana doku nümuncsinden (36 karaciğer, 24 kas eti ve 14 böbrek) 19'u tavuk doku nümuncsinden (ııkaraçiğer vı: 8 kas eti) olmak üzere 93 rekoverİ analizi yapıldı.
Çöziicüler
Aseton, kloroform, hckzan, n-heptan, metanol, amonyum hid-mksit, n-butanol. Tüm çözücüler kromatograıik analiz kalitesinde seçildi.
A)'ıraçlar
a-
%
0.1'lik SoqJ'um nitrit (Merck, Art. 6544) Çözeltisi: Distile suyla haftalık olarak hazırlandı.b-
%
0.5 lik Amoıryum sulfamat (Merck, Art. 1220) çözeltisi: Dis-tile suyla haftalık olarak hazırlandı,c-
%
0.1 'lik N-(-Napht.Jl)-eth)'lenediamine di~ydrochloride (Mcrck, Art. 6237) çözeltisi (NED). Distile suyla günlük olarak hazırlandı.d- Sülfonamid standartları i. Sulfanilamid (Riedel)
HAYVANLARıN piŞMEMiş YENİLEBiLiR DOKULARıNDA... 629
2 o Sulfadimetoksin 250 mg/go etken madde içeren Agribon (Roche) isimli veteriner spesiyaliteden
3 o Sulfamethazin i60 mg! mL. sulfamethazin sodyum içeren 1\bizatin (Top-Kim) isimli veteriner spesiyaliteden
4. Sulfakinoksalin: 32 mg! mL. sulfakinoksalin sodyum içeren Sulkoksin (Vetaş) isimli spesiyaliteden hazırlandılar.
a- Kolorimetrik ölçüm için Stok çö<.elti (I mg.! mI.): Her bir sulfo-namid türevinden 100 mg. tartılıp yada buna eşdeğer miktarda çö-zelti halindeki spesiyaliteden alınıp, i00 mL. asetonda çözdürülerek hazırlandı. ı)gıılama standardı (I !J-g.!mL.) : Stok çözeltiden 0.1 ml alınıp asetonla 100 ml'ye ulaştırıldı.
b- İnce-tabaka kromatografisi (İTK) için: Yukarıdaki sulfanamid-lerin karışımını içeren 1 !J-g!ml'lik uygulama standardı.
Adsorban
Silikajel G (tTK ıçın, Tip 60, Merek, Art. 7736). Aygıtlar
a- Spektrofotometre (Beckman, Model-B) b- Homojenizatö"r (Virtis, Model 23)
c- ince- Tabaka !lromatografisi aygıtı ve eklenti (Desaga) d- EvapOl'atif konsentratör (Buchi)
Analiz nümunderinde sulfonamidIcrin ekstraksiyonu ve renk geliştirme, Tishler ve arkadaşlarından (30) uyarlanan tekniğe göre gerçekleştirildi. Şekillenen NED-Sulfonamid ürünleri Fellig ve West-heimer'in(6) belirttiği biçimde partitisyon yapıldı. Spektrofotometrik okumadan sonra butanol ekstrakt belli bir hacme kadar azaltıldı ve tTK (23) plakasına uygulanarak sulfonamidlerin bireysel ayrımı ba-şarıldı.
Ekstraksiyon: lOg. kıyılmış doku örneği ve 20ml kloroform-ase-ton(l-l) homojenizatörün kabına konuldu. Düşük hızda
ı
dakika kadar homojenize edildi. Dokusal kısmın bir cam baget yardımıyla homojenizatör kabında kalması sağlanırken, homojenize karışım uçur-ma balonuna süzüldü. Ekstraksiyon işlemi aynı miktardaki çözücü karışımıyla iki kez yinelendi. Filtre kağıdı ve içeriği birkaç kez 2-5 ml çözücü karışımıyla yıkandı. Aseton-Kloroform ekstraku evap0-ratif konscntratördc (SO°C) uçuruldu. Uçurma balonlında kalan ka-lıntı, sırasıyla, 2X i O ml 1N HCL, 2X 10ml hekzan, 2X 1. 5 ml ase-ton ve 5 ml hckzanla çalkalandı. Her çalkalama işleminden sonr<ı eks-raktlar 100ml'lik ayırımı \ıunisinde toplandı. Ayırma hunisi 2 dakika hafif şekilde çalkalanelı. fazlann ayrılması için i O dakika kadar bek~ leneli. Altta toplanan asit ektrakt diğer bir ayırma \ıunisine si.izülcrek aktanldı. Ayırma hunisinde kalan organik fazdan ekstraksiyon işlemi 5 ml i N HCr ile yinelendi ve asit ekstrakt diğerine katıldı. Buna
2.5-3.0 ml iO N NaOH katıldı ve iyice karıştırıldı. Bazik çözelti 2X5 ml kloroformla çalkanarak yıkandı. Kloroform atıldı. Ayırma hunisinde kalan bazik sulu çözelti konsatre HCr ile asit (yaklaşık pH i) yapıldı. Çözelti 50 ml'lik bir kaba süzüldü ve süzgeç kağıdı 2 ml Il\" HCl ilc yıkandı.
Renk geliştirme: Asit çözeltiye 2 ml
%
O.I'lik N'aN02 çözeltisikatıldı, iyice karıştırıldı ve 3 dakika beklendi. 2 ml
%
0.5 lik amon-yum sulfamat çözeltisi katıldı, iyice karıştırıldı ve 2 dakika beklendi. 1 mi%
0.1 NED çözeltisi katıldı, iyice karıştırıldı ve karanlıkta 15 dakika tutuldu. Bu süre sonunda, renkli çözelti SO ml'lik ayırma hunsine aktanldı. iO g. sodyum klorür ve 5 ml n-butanol katıldı.30 saniye süreyle şiddetli bir şekilde çalkalandı ve iO dakika kadar tabakaların aynıması için bırakılelı. Renk kompleksini içeren buta-nol tabakası bir enjektör yardımı ilc i S'ml'lik konik santrifüj tübüne alındı. Örnekten butanollle ekstraksiyon işlemine renkli madde ekst-rakte edilemeyene kadar i'cr ml butanolle devam edildi. Olupn rengin şiddetine göre butanal ekstraktın hacmi S-lO ml arasında tutuldu. Butanol ekstrakt iO dakika i 500 dev Jdak. da santrifüj edildi. Butanol renk kompleksinin tabanında su yada tortu topbndığıncla, üstteki butanol tabakası bir enjcktör yardımıyla diğer bir tübe aktarıldı. Bu-tanal ektraktın absorbansı saf butanole karşı 545 nm. de okundu.
Renk ayıracı katıldıktan sonra 15 dakika içinde pembe-kır-mızı bir renk oluşması durumunda, analiz edilen örnek sıılfonamid (ler) bakımından pozitif kabul edildi. Bundan sonra, gerek tck ve ge-rekse kombine haldeki bir çok suJfonamid kalıntı çeşidinin ve mikta-rının (karışım halindekikI' için) belirlenmesi için İTK ilc devam e-dildi. Belirtilen süre içinde renk oluşmayaıı örnekler sulfonamid ka-lıntıları bakımından negatif kabul edildi.
Sulfonamid standart eğrisi: i !.LgJ ml'lik uygulama standard çözel-tisinden 50 ml'lik bcherlcre 1.0; 0.0; 2.0; 4.0; 6.0; 8.0 ve 10.0 ml ko-nuldu. Çözücü sıcak hava akımında uçuruldu. Kalıntılar 3X5 ml
HAYVANLARıN PIŞMEMIş YENILEBILIR DOKULARıNDA... 631
iN HCl ile çalkalanarak 50 ml'lik beher/ere aktarıldı. Renk geliştir-me kısmında, renk stabilizanı olarak 5 g. l\aCI kullanılması dışında "asit çözeltiye" olduğu gibi devam edilerek renk şekilkndirildi ve ana-lizde kullanılan her sulfonamid türevinin eğrisi çizildi.
İTK için 1.0-i0.0 ml sulfonamid standartları karı~ımı 50 mPlik heherlcre konuldu. Hava akımında kuruyana kadar uçuruldu. Kalın-tı1ar 3X 5 ml iN HCl ile çalkalanarak 50 ml' lik diğer beherlere alındı. Renk geliştiriidi. Renk kompleksinin butanolle partitis)'onu yapıldı. Butanol sıcak su banyosunda, N-gazı akımı altında 0.2-0.5 ml kalana kad:ır uçuruldu.
İnce-tabaka kromatografisi: Örnek ve standarda ait azaltılmış bu-tanol ektrakt 0.25 mm kalınlığında Silikajel-G ile kaplanmış plakaya 20-50 (.Ll.miktarında lekelendi. Plaka aseton -1-n-hep tan + metanal +amonyum hidroksit+ n-butanol (36-"-10.5+4.5+5+5) dan olu-~an developman sisteminde devdope edildi.
İnce-tabaka kromatogramı, gözle, total renk intensitesinin tek bir sulfonamiddcn mi yoksa sulfonamidlcrin karışımından mı yada interfcrens veren maddelerden mi ileri gelip gelmediğinin helirlenmesi bakımından incelendi. Bu kontrol sonunda, İTK'de interferens görül-mez ise, örnekteki sulfonamid miktarı ya ilk anbsorbans değerini kullanıp (ki örnekte tek bir sulfonamid bulunduğu İTK'de gösterildiği durumda) standard eğri ile yada plakada bilinen standardıa kar~ılaş-tınlarak hesaplandı.
Bulgular
Çalışmada analiz materyali olarak seçilen dana ve kanatlılara ait çeşitli dokulara 0.1-1.0 ppm kirlenme düzeyine denk gelecek ~e-kilde sulfonamidler katılarak, kalıntı analizleri yapıldı. Bu uygulama, her analizin başlangıcından önce, kıyılmı~ lOg. doku örneğine 1,5 ve LO [.Lgsulfonamid standardı katılarak gerçekleştirildi. Belirtilen mik-tarlarda, çeşitli sulfonamidlerden en az ikişer kez katılarak 93 geriye kazanç analizi yapıldı. Kanatlı dokularında iki, danalara ait dokular-da bu üç kirlenme düzeyinde, sulfonamidler/e yapıları analiz sonuç-larına ilişkin rakamsal veriler Tablo i'de görülmektedir. Ayrıca, çizi-len sulfonamie! eğrilerine bir örnek teşkil etmesi amacıyla sulfanilamid
standart eğrisi Şekil i'de verilmiştir. .
Tablo i incelendiğinde, sulfonamid tipi ve analiz edilen doku çeşidi dikkate alınmaksızın, tüm sulfonamidlcrin geriye kazanç yüzdesi
Tablo i: Karaciğer, kas ve böbrekten sulfonamidlerin geriye kazançları (%) Katılan, pmm Sulfonamid türü 0.1 0.5 1.0 Karaciğer (dana) ---.-Sulfanilamidi 88 i 93 i 82.6 Sulfamcthazin' 91 i 90 i 87.5 Sulfadimctoksin' 83.3 i 92.5 i 86.6 Sulfakinoksalin4 85 i 87.5 i 83.3 Kontrol 0.024 ppm Kas (dana) Sulfanilamid 85 i 90 i 84 Sulfamethazin 93
ı
82.5 i 97 Sulfadimctoksin 90 i 92.5 i 100 Sulfakinoksalin 89.5 i 92 i 89.5 Kontrol 0.035 ppm Böbrek (dana) Sulfanilamid 90 i - i -Sulfamethazin 92.5 i 87.5 i 92.5 Sulfadimetoksin 87.5 i 90 i 87.5 Kontrol 0.025 ppm Karaciğer (Kanatlı) Sulfamcthazİn 93.3 i - i 96 Sulfadimctoksin 101.6 i - i 96 Kontrol 0.0275 ppm Kas (kanath) Sulfamethazin 94.3 i - ! 92 Sulfadimctoksin 94.3 i -ı
97 Kontrol 0.0175 ppmi. Sulfanilamid (Riedel); 2. Topkim'in Abizatin; 3. Rochc'nin Agribon; 4. Vetaş'ın Sulkoksin isimli spesiyaliteleri.
85 üzerinde gerçekle~tiği anla~ıImaktadır. Sulfonamidlerin ortalama geriye kazanç yüzdesi O.i ppm düzeyinde 90.6 ::l: 1.19; 0.5 ppm düzeyinde 89.7 ::l: 0.32 ve 1. O ppm düzeyinde 90.8 ::l: 1.54 olarak hesaplandı. Diğer yandan, analiz edilen doku çe~idi dikkate alınmak-sızın sulfonamid türevIerinin geriye kazanç oranlarının deği~kcnlik gösterip göstermediği incelendi. Buna göre yapılan değerlendirmede
HAYVANLARıN PIŞMEMIş YENİLEBILIR DOKULARıNDA... 633 C.6 O 050 0.40 0.30 0.10 0.10 0.05 G.Sl 2 i; 8 10
vo
Sulf.ıri;ınid iSTTiŞekil i. Sulfanilamid standart eğrisi
sulfanilamidin geriye kazanç yüzdesi 88.9 ::!:: 1.6; sulfamethazinin 9 i .5 :!: 1.08; sulfadimetoksinin 92.2 :!: 1.51 ve sulfakinoksalinin 87.8::!:: 1.31 olarak bulundu. Ayrıca, dokulardan ayrım göze tmek-sizin sulfonamidlerin benzer oranda geriye kazanıldığı anla~ıldı.
Silikajel G ile kaplanmış plakaya uygulanarak ve bahsedilen de-velopman sisteminde develope edilerek sulfonamid-NED reaksiyon ürünlerinin ayrılması ba~arıldı. Rf değerlerinin aşağıdaki gibi sıralan-dığı belirlendi: Sulfanilamid 0.85; sulfadimctoksin O. 79; sulfakinok. salin 0.75 ve sulfamethazin 0.55. Ayrıca ~ekillenen bu renk kompleksi-nin 10-20 ngo miktarının TtK plakasında gözle rahatlıkla okunabil-diği anla~ıldı.
Tartışnıa ve Sonuç
Sulfonamidlerin besin üretimi için yeti~tirilen hayvanlarda sürekli ve uygunsuz şekilde kullanılmaları bunlardan sağlanacak etlerde ka-lıntı sorununu bir bakıma kaçınılmaz yapmaktadır. Etlerde doğabile-cek bu sulfonamid kalıntıları hayvanlara kesime göndermeden belli bir süre önceden ilaç verilmesinin kesilmesi, kirlenme durumunun or-taya çıkarılması, insan sağlığı yönünden sakıncalı olabilecek kirlenme
ve tolerans düzeyleri ile günlük alınabilir miktarlarının saptanması ve sakıncalı düzeyde kirlenmiş etlerin tüketimine izin verilmemekle önlenebilir (16, 22, 24).
Kısaca verilen bu literatür bilgiden anlaşılacağı gibi sulfonamid-lerle kirlenen besinlerden ileri gelecek sağlık sakıncalarının önlenmesin-de, bilimsel ve yasal önlemlerin alınmasında ve kalıntı durumunun or-taya çıkarılmasında sulfonamid kalıntı analizleri kilit uygulama niteliği taşır. Bu nedenle, sulfonamid kalıntılarının ortaya çıkarılmasına yö-nelik yöntem çalışmaları önem arzeder (2,5,8,9,13,28,29,30). Ancak, uygulanan yöntemlerin çoğunda, nümunelerden elde edilen sulfona-midli ekstraktların NED ile rcaksiyona girerek hatalı ölçümlere sebep olabilen diğer bazı primer aramatik aminlerden ileri gelen intcrferens-lerden tümüyle arındırılması başarılamamıştır. Bu nedenle, çözeitide renk geIiştirme esasına dayanan yöntemler ile, özellikle tarama nitelik-li bir çalışmada, her zaman hatalı sonuçlar elde edilmesi ve değerlen-dirmeler yapılması mümkün olabilmektedir (6,13,29,30). Bu tür in-terferensler bazı yöntemlerde renk reaksiyonu şekillendirilmeden önce (1, 30) yada sonra (12) ortam alkali yapılarak kloroformla eks-traksiyonla ortamdan etkin bir biçimde uzaklaştırılabildikleri belir-tilmiştir.
Tarama nitelikli sulfonamid kalıntı analizinde, Bratton-Marshall renk reaksiyonuna bugün genellikle bir ön deneme olarak bakılmak-tadır. Yani, bu uygulamayla sulfonamidlerce pozitif olan örnekler belirlenir; bunlar İTK'ye (2,3,5,23) yada GSK'yc (9, 28) uygulanarak, bireysel ayrım sağlanır ve kalıntıya doğruluk kazandırılır. Zira, lite-ratür bilgi kısmında ve yukarıda değinildiği gibi, günlük kullanımda olan çok sayıda ilaç ve kimyasal madde NED ile reaksiyona girerek interferens yapabilmektedir (5, 23).
Burada bahsedilen yöntemin ekstraksiyon, temizleme ve renk geIiştirme aşamaları Tishler vc arkadaşlarından (30) uyarlandı. An-cak, böbrek ve karaciğer gibi kanatlı dokuları da dikkate alındığından, analizler 10 g. doku örneğinde yürütüldü. Sulfonamidler kloroform-aseton karışımıyla ekstrakte edilip, çözücü uçurulduktan ve kalın tı sıvı-sıvı partitisyonla sulu asit çözeltiye alındıktan sonra, ortam alkali yapıldı ve ileriki aşamada intcrfercns yapabilecek maddeIer kloroform-la çalkakloroform-lanarak giderilmeye çalışıldı. Şekillenen renkli madde butanol le (6) ekstrakte edildikten sonra spektrofotometrik okuma yapıldı. Böylece, şekillenen sulfonamidli boya maddesinin absorbansı, dilue sulu asit ortam yerine konsantre butanol ekstraktında yapılarak,
yön-HAYVANLARıN piŞMEMiş YENiLEBiLIR DOKULARıNDA... 6~:)
temde istenen duyarlılığa ulaşıldı. Ayrıca, bu uygulama bazı doku örneklerinin sulu çözeltilerinde ara sıra karşıla~ılan bulanıklığı da gi-dermektcdir. Spektrofotometrik okumadan sonra, Bratton-Marshall reaksiyonu tTK ile birlcştirikrek (23) sulfonamidleriıı bireysel ayrımı gerçekleştirildi.
Yukarıda kısaca belirtilen uyadamaların, sulfonamid kalıntı analizinde kullanılan belli başlı yöntemlere göre (I ,2,6,9,2:1,28,30) iyileştirmeler getirip getirmediğini belirleyebilmek için, bu tür yön-temlerde sık kullanılan ortamdaki sulfonamidin geriye kazanılması "recovery" denemelerine başvuruldu. Duyarlılık düzeyi, geriye kazanç oranı, tekrarlanabilirlik, kontrol değerleri, analiz süresi ve ekonomik yönden diğer yöntemlerle karşılaştırıldı.
LOg. doku nümunesine 0.1-1.0 ppm'e denk gelen'k şekilde çe-şitli sulfonamidlerden katılarak yapılan geriye kazanç denemeleriyle birlikte yürütülen duyarlılık düzeyi çalışmasında, yöntemle O.i ppm' lik sulfonaınid kalıntısının güvenle ortaya çıkarıldığı bulundu. Hatta, Tablo i 'deki kontrol değerleri ile Şekiii'deki sulfanilamid standard eğrisi dikkate alındığında yöntemle 0.05 ppm'e kadar sulfonamid ka-lıntısının ölçülebileceği anlaşılır.
Bugün hayvansal dokularda sulfonamid kalıntılarının analizinde kullanılan yöntemlerin çoğunda duyarlılık düzeyi O. 1 ppm (6, 28, 30) ile 0.05 ppm (9,23) gibi dar sınırlar arasında değişmektedir. lJyar-lanan yöntemle elde edilen duyarlılık düzeyinin sıralanan aynı nite-likli bu verilerle uygunluk gösterdiği kolayca anlaşılır.
Analiz edilen doku çqidi ve sulfonamid tipi ik kirlenme düzeyi dikkate alınmaksızın ortalama ~.~ 82.5-10 i .6 arasında değişen sul-fonamid geriye bzanç oranı O.i, 0.5 ve i.O ppm düzeylerinde, sı-rasıyla,
%
90. 6 ::.~i. 19, 89.7=
0.332 ve 90.8 ::.1: 1.54 olarak ger-çekleşmiştir.Goodspecd ve arkadaşları (9) analiz materyali olarak kullandık-ları karaciğer, kas ve böbrektc 5 farklı sulfonamid türevinin O.i, 0.5 ve I. O ppm düzeyinde geriye kazanç yüzdesini, sırasıyla, 81 .5, 79. 1 ve 76. O olarak hesaplamışlardır. Phillips ve Trafton (23) aynı değeri 9 farklı sulfimamidle % 88 olarak bulmuştur. Tishlcr ve arkadaşları (30) söz konusu oranı
%
76-100; Fellig ve Westheimer (6)%
70--90; Fravolini ve Begliomini (8) %94-104; Selezer ve Banes (29) %60-91 arasında bulmuştur. Verilen bu rakamsal bilgilerden de anlaşılacağı gibi tekrarlanabilir ve güvenilir olarak kabul edilen çok sayıdakiana-liz yönteminin sulfonamid kazanç değerleri belli ölçüde variyasyon gösterebilmektedir. Çalışmada elde edilen aynı nitelikli verilerin de benzer bir variyasyon gösterdiği dikkate alınırsa, uyarlanan bu yön-temin de oldukça iyi sayılabilir derecede tekrarlanabilirlik özelliği taşıdığı ve güvenilir sonuı;lar verdiği ve ayrıca etkin bir sülfonamid geri alım yüzdesi sağladığı anlaşılır.
Çeşitli besİn maddelerindeki kalıntı halindeki sulfonamidlerin analizinde kullanılan çoğu yöntemlerin önemli bir olumsuz yönü, uy-gulanan temizleme tekniklerine rağmen (I 2, 30), kontrol değerlerinin yüksekliğidir. Fellig ve Westheimer (6) dokularda kontral değerini 0.02-0.04; Tishler ve arkadaşları (30) 0.005-0.039 ve Selzer ve Ba-nes (29) sütte 0.03-0.05 ppm arasında bulmuşlardır. Tablo i'deki görünüşte sulfonamid değerini gösteren kontrol değerleri herhangi bir karışıklığa neden olmayacak kadar düşük kalmış ve litcrati.irdekilerlc uyum göstermiştir.
Bratton-Marslıall reaksiyonu primer aramatik aminler için spe-sifik olmasına rağmen, analiz edilen nümune çoğu kez ayıraçlarla renk meydana getiren genellikle birden fazla madde ihtiva etmesi ve bun-ların da doğru bir şekilde spektrofotometrik ölçümü imkansız kılması nedeni ilc, sadece pozitif nümunelerin belirlenmesinde yararlı olmak-tadır. Bu reaksiyon, başlıca, laboratuvarlarda bireysel sulfonamidlerin geriye kazanç oranlarının hesaplanmasında ve tek bir sulfonamidi doğrulamada değer taşımaktadır (9, 23). Sıralanan nedenlerden dolayı butanol ekstrakt spektrofotometrik ölçümden sonra İTK plakasına uygulandı. Böylece nümunede mevcut sulfonamidlerin bireysel ayınmı başarıldı. İTK plakasında sulfonamid türevi dikkate alınmaksızın 10-20 ngo sulfonamid-N'ED reaksiyon ürününün gözle rahatlıkla oku-nabileceği bulundu. Analiz edilen nümune ağırlığı ve azaltılmış buta-nol ekstraktın miktarı dikkate alındığında, bu miktarın 0.05 - O i
ppm'e karşılık geldiği kolayca anlaşılır.
Alınan analiz nümunesi miktarını azaltıp, spektrofotometrik ölçümün konsantre butanol ortamında yapılması şeklindeki uyarla-mayla, sulfonamidlerin ekstraksiyonu ve ileriki aşamalarda kullanılan çözücü miktarında önemli ölçüde ekonomi sağlanmıştır. tTK plaka-sına uygulamak için, kaynama noktasının yüksekliği nedeniyle, bu ta-nolun belli bir hacme kadar azaltılması zaman almaktadır. Ancak, buna rağmen günde, paralel bir şekilde yürütülcıTk 6 nümunenin analizi gerçekleştirilebilmektedir.
HAYVANLARıN piŞMEMIş YENILEBiLiR DOKULARıNDA... 637
Sonuç olarak, uyarlanan bu spektrofotometrik-ince -tabaka kro-matografik yöntemin duyarlılık düzeyi, rezidü kazanç oranı, tekrarla-nabilirlik niteliği ve ekonomik oluşuyla etlerdeki sulfonamid kalın tı-larının analizinde başarıyla kullanılabileceği kanısına varıldı.
Literatür
1- Alexander, L.R. and Stanley, E.R. (1965): Q!ıaııtitatiue detemıitıatioıı ~f sıı(fa drugs
iıı medicatedfeds by /hiıı-Iayer clıromatogmphy ..1.A. O.A.C. 48 (2), 278-279.
2- Bevill, R.F., Sharma, R. M., Meachum, S.H., Wozniak, S.C., Bourne, D. W. A. and Dittert, L.W. (1977): Disposition of suifoııamides iııfood Iırodııciııg Illıimals:
Concm/-ratioıı of sııifome/ha:;iııc aııd its metabolites iıı plasma, uritıe and tim/es ~f lambs followiııg
iıı/-mvenol/s administratioıı. Am ..1. Vet. Res. 38 (7), 973-977.
3- Bican-Fister, T. and Kajganovic, V. (I 9(4): Quımti/ative oııa(ysis 'if sıı(foııamides
mixtures by /hiıı-Iayer clıromatogm/ı/ıy.]. Chromatog. 16, 503-509.
4-- Biehl, L.G., BeviU, R.F., Limpoka, M. and Koritz, G.D. (I 981): Sıılfame/ha::iııe
residues in swiııe ..1.Veı. Pharmaco!. Therap. 4, 285-290.
5- Cieri, U.R. (1976): De/ecıion of sııifonamides iıı aııimal feeds. A.O.A.C. 59( I), 56-59. 6- Fellig, J. and Westheimer, J. (I 9(8): Delemıina/ioıı of sııifadimetoxiııe iıı aııimal tissııes.
]. Agr. Food Chem. 16 (5), 738-740.
7- Fellig, J., Westheimer, J., Walsgh, M.J. and Marusic, W.L. (1971): Tissııe clea-ranee of Rafenaid;,ı clıiskens aııd lıırkeys. Poulı. Sci. 50 (6), 1777- 1783.
8- Fravolini, A. and Begliomini, A. (1969): Extmctioıı ond GLC de/emıiııatioıı of mi.ted
suIfoııamides infreds.]. A.O.A.C. 52 (4),757-769.
9- Goodspeed, D.P., Simpson, R.M., Ashworth, R.B., Shafer, J.W. and Cook,
H.R. (I 978): Seıısitiı'e and spesific Gas Liquid clıromatographic-speclro/ıho/hometric screening
procedılTefor trace leucl of five sııifoııamides iııliver, kidnrJ' and mıısele tissues ..J.A.O.A.C. 61
(5), 1050-1053.
10- Gyllenhaal, O. and Ehrsson, H. (1975): Determiııation of sııifoııaıııides byelectroıı-colı-lıırc gas chroma/ograp/ıy: l>reparation and IJroperties of pe~fluoroac).l alıd pentaflııorobeıı.':,}'1deri
va/ives ..J. Chromatog. 107, 327-333.
11- Gyllenhaal, O., Tjarnlund, U., Ehrsson, H. and Hartivg, P. (I 978):
Elec/roıı-eap-ture gas chromatographJ' of sıılfoııamides af ter cxlractive alkylation .J. Chromatog. 156, 275
283.
12- Hill, V.B. and Martin, E.E. (1967): Determinatioıı of sııifamethaziııe iıı mixedfeeds
Coıı-l.nining procain peııiciliill ..J.A.O.A.C. 50 (I), 42-45.
13- Houston, S. F. and Umstead, J.E. (1968): Delerminatioıı of sııifoııamides in milk ..1.
A.O.A.C. 51 (5), 1016-1019.
14-- Kim, T.K. and Stephens, J.F. (1972): Drug rezistaııee aııd Iroıısferable drug resislaııce
15- Laurencot, H.j., Schlosser, A. and Hemostead, j.L. (1972): Tlıe dispositioıı aııd
dcarOlıee of Rofı:ilaid iıı chickm aııd Tıırhey eggs. Poult. Sci. 51 (4), 1181-1189
16- Lehmann, R.P. (1972): Im/dementaliOlı q{ Ilıe reeommendatioııs coıılaüu:d iıı ıhe ri!jıol'llo Ilıe
commissioııer coııcemiJlg Ilıe lise of aıılibioıics iııanimal fteds . .I. Aııim. Sci. 35 (6),
1340-ı341.
i 7- Mainthal, M., Carol, j. and Kunze, F.M. (1961): Tlıe OIIa(ysis of mixed sulfmlamides
by qııantitaıiu papel' c1lromalograp/!l'.J. A.O.A.C. 44 (2), 313-317.
18- Messersmith, R.E., Sass, B., Berger, H. and Gale, G.O. (1967): Saft~v oıld tissue
residue evalııalioJlsiııswiıu: fed ralioııs eoıılaiııing c1ılorlelraC)'cliııe,sııljameılıa::;ine aııd pmieilliJl.
j.A.\'.1\'1.,\. 151 (6), 719--724.
19- Nose, N., Kobayashi, S., Hirose, A. and Watanobe, A. (1976) : Gas-liquid
elıromalog-ralıhie delerıııiııalimı of su/plıoııamides ..1. Chromatog. 123, 167-173.
20- Nauws, j.F.M. (ı 981): Toleraııcc llIıd deleelioıı q[ aıııimierobial I'esidııes in slauglılered aııi-mals. Are. Lehcıısıııiııcllıyg. 32, 103-1 LO.
21-- Oikawa, H., Nakamoto, K., Hirota, K. and Katagiri, K. (1977): Cleararıce q[
sul-fameılıoxa_:oleiııeggs aııd lis.<ııesof elıiekeııs. Poult. Sci. 56 (3), 813-821.
22- Penumaı.thy, L., Trabosb, H.M., Clark, G.M., Conrey, j.S., Rader, W.A and Spaulding, j.E. (1975): Sulfa dT!lg residues iıı uııcooked edible lissucs qf eat/le, calr:es, swiııe
and pOlılll). Fced~tuffs 47, 19-20,26.
23- PhiUips, W.F. and Trafton, j.E. (1975): A saceııilı.1i melhodfor sulfoııomides exlracted
from aniıııalıissııes.j.A.O.A.C. 58 (1), H--47.
24- Rieder, j. (1973): MelaboliSln and leclıııiquesfor assay of Irimeılıoprim and sulfameılıoxazole .
.1. Inf. Diasca,e 128, Supp!., 567-573.
25- Righter, H.F., Worthington, j.M. and Mercer, H.D. (1971): Tissue residile deplelioıı
ofsıılfaıııelha::;iııe in cahes and chiekens. Am. J.Vet. Res. 32(7), 1003-1006.
26- Righter, H.F., Worthington, j.M. and Mercer, H.D. (19712): TisJtle residue
deple-ıioıı of sııl{aıııera::;iııeiıı slıeep.J.Agr. Food Chem. 20 (4), 876.868.
27- Richter, H.F., Worthington, j.M., Zimmennann, H.E. and Mercer, H.D.
(1970): TissIJe-residlıe dej)leliolı ofsul{aquinoxaliııe iııpolulry. Am ..I.Vet.Rt;~. 31 (6),1051 .. 105'k
28- Saschenbrecker, P.''''. and Fish, N.A. (1980): Suljaıııet!ıa::;iııeresiduesiıı
l/IIcooleededib-le lissIJesof park followiııg recommended oral adminislrnıion llIıd wiıhdrau;al. Can. j. Comp.
Med. 44 (3), 338-345.
29- Selzer, G.B. and Banes, D. (1963): The deleclioıı and eslimalioıı of sulfoııamide I'esidues
milk . .I.A.O.A.C. 46 (4), 703--707.
30- Tishler, F., Sutter, j.L., Bathisb, j.N. and HagOlan, H.E. (1968): IIIII)l'Oüedmeıhod
fol' delermiııalion of sıılfoııamides iıımilk aııd lim/es ..1.Agr. Food. Chcm. 16 (I), 50-53.
31- Van Houweling, C.D. and Kingma, F.J. (1969): Tlıe lise of drugs iıı animals raisedfor
.rood. .1.A.V.:\1.A. 155 (12), 2197-2200
32- Yndestad, M. and Underdal, B. (1977): Residııes of sulfadiıııidiııe, .H/lfanilaıııid miLi
