Kolon ve rektum kanserlerinde endostatinin matriks metalloproteinaz -2 üzerine gösterdiği etkinin araştırılması

T.C.

DOKUZ EYLÜL ÜNİVERSİTESİ

SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

KOLON VE REKTUM KANSERLERİNDE

ENDOSTATİN’İN

MATRİKS METALLOPROTEİNAZ-2 ÜZERİNE

GÖSTERDİĞİ ETKİNİN ARAŞTIRILMASI

ZAHİDE ÇAVDAR

BİYOKİMYA ANABİLİM DALI

DOKTORA TEZİ

T.C.

DOKUZ EYLÜL ÜNİVERSİTESİ

SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

KOLON VE REKTUM KANSERLERİNDE

ENDOSTATİN’İN

MATRİKS METALLOPROTEİNAZ-2 ÜZERİNE

GÖSTERDİĞİ ETKİNİN ARAŞTIRILMASI

BİYOKİMYA ANABİLİM DALI

DOKTORA TEZİ

ZAHİDE ÇAVDAR

Danışman Öğretim Üyesi: Prof. Dr. Gülgün Oktay

TEŞEKKÜR

Bu araştırmanın planlanması, yürütülmesi ve sonuçlandırılmasında, beni daima destekleyerek bilgi ve deneyimlerini aktaran değerli danışman hocam Prof. Dr. Gülgün Oktay’a,

Değerli katkı ve önerileri ile çalışmamın tamamlanmasına yardımcı olan tez izleme komitesindeki değerli hocalarım Prof. Dr. Banu Önvural ve Prof. Dr. Meral Sakızlı’ya,

Materyal sağlamamızda büyük katkıları olan Sayın Prof. Dr. Cem Terzi’ye, hastalara ait klinikopatolojik değişkenlerin düzenlenmesi ve istatistiksel analizlerin gerçekleşmesinde elinden gelen her yardımı esirgemeyen Sayın Uzman Dr. Emre Canda’ya,

Laboratuar olanaklarını kullanarak tezimin in vitro bölümünü Ege Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Biyomühendislik Bölümü, Hayvan Hücre Kültürü Laboratuvarı’nda gerçekleştirmemi sağlayan, bilimsel gelişimimde önemli katkıları olan değerli hocam Prof. Dr. İsmet Gürhan Deliloğlu’na ve hücre kültür çalışmalarında bilgi ve deneyimlerinden yararlanmamı sağlayan Sayın Araş. Gör. Sultan Gülçe İz’e,

İn vitro deneylere ait bulguların istatistiksel analizlerin gerçekleşmesinde yardımlarını esirgemeyen Araş. Gör. Gül Saatli’ye,

Bilgi ve deneyimlerini her fırsatta paylaşan, Sayın Doç. Dr. Şermin Genç, Sayın Doç. Dr. Kürşad Genç ve Uzman Dr. Mehtap Yüksel Eğrilmez’e,

Deneysel çalışmalarım sırasında ARLAB olanaklarından yararlanmamı sağlayan Sayın Doç.Dr. Halil Resmi’ye, Dr. Memduh Bülbül ve tüm ARLAB çalışanlarına,

Ve yeniden Dokuz Eylül Üniversitesi’ndeki tüm eğitimim boyunca Biyokimya’ya ilgi duymamı sağlayan, bana her türlü mesleksel bilgi-deneyimlerini aktaran, bilimsel motivasyonumu sağlayan ve destekleyen Biyokimya Anabilim Dalı Başkanı Sayın Hocam Prof. Dr. Banu Önvural ve Sağlık Bilimleri Enstitüsü Müdürü ve ARLAB Yöneticisi Sayın Hocam Prof. Dr. Gül Güner’e ve diğer tüm hocalarıma,

Doktora eğitimim süresince sabır ve özveri ile her zaman desteğini hissettiğim değerli eşime ve doktora eğitimim ile beraber büyüyen canım oğlum Arman’a sonsuz teşekkürü borç bilirim.

Zahide Çavdar İzmir, 2008

İÇİNDEKİLER

Tablo Listesi ...vii

Şekil Listesi ...ix

Kısaltmalar ...xi

Türkçe Özet ...xiii

İngilizce Özet...xvi BİRİNCİ BÖLÜM 1. GİRİŞ VE AMAÇ ...1 İKİNCİ BÖLÜM 2. GENEL BİLGİLER...3 2.1. Ekstrasellüler Matriks...3 2.1.1. Bazal Membran...4

2.2. Ekstrasellüler Matriks Proteolizi 2.2.1. Matriks Metalloproteinazlar ...5

2.2.1.1. Genel Yapısal Özellikleri ...5

2.2.1.2. Matriks Metalloproteinazların Biyolojik Rolleri...5

2.2.1.3. Matriks Metalloproteinazların Sınıflandırılması ...5

2.2.1.3.1. Jelatinazlar: MMP-2 ve MMP-9...5

2.2.1.3.1.1. Jelatinazların Regülasyonu...9

2.2.1.3.1.2. Endojen MMP-2 Aktivatör Proteini: MT-1 MMP ...11

2.2.1.3.1.3. Endojen MMP-2 Doku İnhibitör Proteini: TIMP-2 ...11

2.2.1.3.1.3.1. TIMP-2 Bağımlı MT-1 MMP aracılı ProMMP-2 Aktivasyon Mekanizması ...12

2.3. Endostatin: Anjiogenez İnhibitörü...13

2.3.1. Endostatinin Yapısal Özellikleri...13

2.3.2. Endostatinin Hücre Yüzey Reseptörleri ...14

2.4. Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörü: Anjiogenez Stimülatörü...16

2.4.1. VEGF Ailesi ...16

2.4.2. VEGF Reseptörleri ...17

2.4.3. VEGF Ekspresyonunun Regülasyonu ...17

2.5. Tümör Hücre İnvazyonu ve Metastaz Oluşumu...19

2.5.1. Tümör-Stroma Etkileşimi ve Matriks Metalloproteinazların Sekresyonu ...20

2.6. Kolorektal Kanser...22

2.6.1 Kolorektal Karsinomların Evrelendirilmesi ...22

ÜÇÜNCÜ BÖLÜM 3. MATERYAL VE YÖNTEMLER...24

3.1 DOKU ÇALIŞMALARI ...24

3.1.1 MATERYAL...24

3.1.1.1 Kolon ve Rektum Doku Örneklerinin Eldesi ...24

3.1.1.2 Hasta Bilgileri...24

3.1.2 YÖNTEMLER ...24

3.1.2.1 MMP-2, TIMP-2 ve MT-1 MMP İle İlişkili Analizler...24

3.1.2.1.1 Dokuların Hazırlanması...24

3.1.2.1.2 Protein Analizi...27

3.1.2.1.3 Jelatin Zimografi ...27

3.1.2.1.4 TIMP-2 Analizi ...30

3.1.2.1.5 MT-1 MMP Analizi...33

3.1.2.2 Endostatin İle İlişkili Analizler ...34

3.1.2.2.1 Dokuların Hazırlanması...34

3.1.2.2.2 Protein Analizi...35

3.1.2.2.3 ELISA Analizi ...35

3.1.2.2.4 Western Blot Analizi ...37

3.1.2.2.4.1 SDS-PAGE Jellerinin Hazırlanması...37

3.1.2.2.4.2 Örneklerin Hazırlanması ...38

3.1.2.2.4.3 Jelin Yüklenmesi ...38

3.1.2.2.4.4 Elektroforetik Yürütme ...38

3.1.2.2.4.6 İlgili Proteinin Görünür Hale Getirilmesi...41

3.1.2.3 VEGF Analizi...43

3.1.2.4 İstatistiksel Analiz ...45

3.2 İN VİTRO DENEYLER...46

3.2.1 MATERYAL...46

3.2.1.1 Besi Ortamı Hazırlanması ...46

3.2.1.2 Fetal Sığır Serumun (FBS) İnaktive Edilmesi...46

3.2.2 YÖNTEMLER ...46

3.2.2.1 Dondurulmuş Hücrelerin Çözülmesi...46

3.2.2.2 Hücre Sayımı ve Tripan Mavisi Canlılık Testi...47

3.2.2.3 Hücrelerin Pasajlanması ...49

3.2.2.4 Hücrelerin Dondurulması ...49

3.2.2.5 Rekombinant Endostatinin Hazırlanması ...50

3.2.2.6 Hücrelerin Analiz İçin Hazırlanması...50

3.2.2.6.1 MTT Testi...52

3.2.2.6.2 Protein Analizi...53

3.2.2.6.3 Jelatin Zimografi Analizi...53

3.2.2.6.4 TIMP-2 Analizi ...53 3.2.2.6.5 MT-1 MMP Analizi...53 3.3.2.6.6 İnvazyon Analizi ...54 3.3.2.6.6 İstatistiksel Analiz ...56 DÖRDÜNCÜ BÖLÜM 4. BULGULAR ...57 4.1. DOKU ÇALIŞMALARI ...57

4.1.1. MMP-2, TIMP-2 ve MT-1 MMP Analizlerine İlişkin Sonuçlar ...57

4.1.1.1. Kolon ve Rektum Tümör ve Eşlenik Normal Dokularında Protein Düzeyleri...57

4.1.1.2. Jelatinaz Aktivite Düzeyleri ...58

4.1.1.2.1. Kolon Tümör ve Eşlenik Normal Dokularda Jelatinaz Aktivite Düzeyleri ...58

4.1.1.2.2. Rektum Tümör ve Eşlenik Normal Dokularda Jelatinaz Aktivite Düzeyleri ...60

4.1.1.3. TIMP-2 Düzeyleri ...61 4.1.1.3.1. Kolon Tümör ve Eşlenik Normal Dokularda TIMP-2 Düzeylerinin Karşılaştırılması...62 4.1.1.3.2. Rektum Tümör ve Eşlenik Normal Dokularda

TIMP-2 Düzeylerinin Karşılaştırılması...62 4.1.1.4. MT-1 MMP Düzeyleri...63 4.1.1.4.1. Kolon Tümör ve Eşlenik Normal Dokularda

MT-1 MMP Düzeylerinin Karşılaştırılması ...63 4.1.1.4.2. Rektum Tümör ve Eşlenik Normal Dokularda

MT-1 MMP Düzeylerinin Karşılaştırılması ...64 4.1.1.5. TIMP-2

/

Dokularda TIMP-2/MT-1 MMP Oranları ...64 4.1.1.5.2. Rektum Tümör ve Eşlenik Normal

Dokularda TIMP-2/MT-1 MMP Oranları ...65 4.1.2. Endostatin Düzeylerine İlişkin Sonuçlar ...65 4.1.2.1. Kolon ve Rektum Tümör ve Eşlenik Normal Dokularda

Protein Düzeyleri...65 4.1.2.2. ELISA Sonuçları ...66 4.1.2.2.1. Kolon Tümör ve Eşlenik Normal Dokularda Endostatin Düzeylerinin Karşılaştırılması...67

4.1.2.2.2. Rektum Tümör ve Eşlenik Normal Dokularda Endostatin Düzeylerinin Karşılaştırılması...68

4.1.2.3. Endostatin Protein Ekspresyonunun Western Blot İle

Gösterilmesi...68 4.1.2.3.1. Kolon Tümör ve Eşlenik Normal Dokularda Endostatin Protein Ekspresyonu...68 4.1.2.3.2. Rektum Tümör ve Eşlenik Normal Dokularda Endostatin Protein Ekspresyonu ...69 4.1.3. VEGF Düzeyleri...71 4.1.3.1. Kolon Tümör ve Eşlenik Normal Dokularda VEGF Düzeylerinin Karşılaştırılması...71

4.1.3.2. Rektum Tümör ve Eşlenik Normal Dokularda VEGF Düzeylerinin

Karşılaştırılması...72

4.1.4. Klinikopatolojik Değişkenler İle Biyokimyasal Parametreler Arasındaki İlişkinin Değerlendirilmesi...72

4.1.4.1. Kolon Kanseri Klinikopatolojik Değişkenler İle Biyokimyasal Parametrelerin Anlamlı İlişkileri...72

4.1.4.2. Rektum Kanseri Klinikopatolojik Değişkenler İle Biyokimyasal Parametrelerin Anlamlı İlişkileri...73

4.2. İN VİTRO DENEY SONUÇLARI ...77

4.2.1. HT-29 Hücrelerinin Morfolojileri ile İlgili Gözlemler...77

4.2.2. Rekombinant Endostatinin HT-29 Hücre Canlılığına Etkisi...77

4.2.3. Rekombinat Endostatinin HT-29 Hücre Dizisinde MMP-2 ve TIMP-2 Üzerine Etkisi ...79

4.2.3.1. Hücre Kültür Ortamı Protein Düzeyleri ...79

4.2.3.2. Rekombinant Endostatinin HT-29 Hücre Dizisinde MMP-2 Jelatinolitik Aktivitesine Etkisi ...81

4.2.3.3. Rekombinant Endostatinin HT-29 Hücre Dizisinde TIMP-2 Düzeyine Etkisi. ...83

4.2.4. Rekombinat Endostatinin HT-29 Hücre Dizisinde MT-1 MMP Üzerine Etkisi...84

4.2.4.1. Protein Düzeyleri...84

4.2.4.2. Rekombinant Endostatinin MT-1 MMP Aktivitesine Etkisi...86

4.2.5. Rekombinant Endostatinin HT-29 Hücre Dizisinde TIMP-2/MT-1 MMP Oranına Etkisi...87

4.2.6. Rekombinant Endostatinin HT-29 Hücre İnvazyonuna Etkisi...88

4.2.7. Biyokimyasal Parametreler Arasındaki Korelasyonlar ...91

4.2.7.1. ProMMP-2 Jelatinolitik Aktivite Düzeyi ile Hücre Canlılığı Arasındaki Korelasyon ...91

4.2.7.2. Aktif MT-1 MMP Düzeyi ile İnvazyon Arasındaki Korelasyon...92

BEŞİNCİ BÖLÜM

5. TARTIŞMA VE SONUÇ...94 ALTINCI BÖLÜM

TABLO LİSTESİ

Tablo 1: MMP’lerin substratlarına göre sınıflandırılması...7

Tablo 2: Kolorektal karsinomların Dukes evrelendirme sistemi...23

Tablo 3: Kolorektal karsinomların TNM evrelendirme sistemi ...23

Tablo 4: Kolon tümörlü hastaların klinikopatolojik özellikleri...25

Tablo 5: Rektum tümörlü hastaların klinikopatolojik özellikleri ...26

Tablo 6: Jelatin Zimografi yönteminde poliakrilamid jellerin hazırlanması...29

Tablo 7: Jelatin Zimografi yönteminde kullanılan çözeltilerin hazırlanması...31

Tablo 8: SDS-PAGE yönteminde ayırıcı jelin hazırlanması ...39

Tablo 9: SDS-PAGE yönteminde paketleyici jelin hazırlanması...39

Tablo 10: Kolon tümör ve eşlenik normal dokularında protein düzeyleri ...57

Tablo 11: Rektum tümör ve eşlenik normal dokularında protein düzeyleri...58

Tablo 12: Kolon tümör ve eşlenik normal dokularında jelatin zimografi sonuçları ...59

Tablo 13: Rektum tümör ve eşlenik normal dokularında jelatin zimografi sonuçları...61

Tablo 14: Kolon tümör ve eşlenik normal dokularında TIMP-2 protein düzeyleri...62

Tablo 15: Rektum tümör ve eşlenik normal dokularında TIMP-2 protein düzeyleri...62

Tablo 16: Kolon tümör ve eşlenik normal dokularında MT-1 MMP düzeyleri ...63

Tablo 17: Rektum tümör ve eşlenik normal dokularında MT-1 MMP düzeyleri ...64

Tablo 18: Kolon tümör ve eşlenik normal dokularında TIMP-2/MT-1 MMP oranları...64

Tablo 19: Rektum tümör ve eşlenik normal dokularında TIMP-2/MT-1 MMP oranları....65

Tablo 20: Kolon tümör ve eşlenik normal dokularında protein düzeyleri ...66

Tablo 21: Rektum tümör ve eşlenik normal dokularında protein düzeyleri...66

Tablo 22: Kolon tümör ve eşlenik normal dokularında endostatin düzeyleri ...67

Tablo 23: Rektum tümör ve eşlenik normal dokularında endostatin düzeyleri...68

Tablo 24: Kolorektal kanserli hastalarda klinikopatolojik değişkenler ile endostatin ekspresyonu arasındaki ilişki ...70

Tablo 25: Kolon tümör ve eşlenik normal dokularında VEGF düzeyleri ...71

Tablo 26: Rektum tümör ve eşlenik normal dokularında VEGF düzeyleri...72

Tablo 27: Kolon tümör aktif MMP-9 düzeyi ile tümör invazyon derinliği arasında saptanan ilişki… ...73

Tablo 29: Rektum tümör MMP-9, rMMP-9 ve rMMP-2 değerleri ile tanı anı

metastaz arasında saptanan ilişki……...74

Tablo 30: Rektum tümör proMMP-9 ve proMMP-2 ile lenf nodu metastazı arasında saptanan ilişki…… ...74

Tablo 31: Rektum tümör aktif MMP-9 ve VEGF düzeyleri ile perinöral invazyon arasında saptanan ilişki………...75

Tablo 32: Rektum tümör TIMP-2 düzeyleri ile nüks arasında saptanan ilişki…...75

Tablo 33: Kontrol ve deney gruplarında canlılık yönünden anlamlılık düzeyleri……...78

Tablo 34: Kontrol ve deney gruplarının ortalama protein düzeyleri…… ...80

Tablo 35: Kontrol ve deney gruplarında proMMP-2 jelatinolitik aktivite düzeyleri yönünden anlamlılık düzeyleri…………. ...83

ŞEKİL LİSTESİ

Şekil 1: MMP’lerin yapılarına göre sınıflandırılması ...6

Şekil 2: Jelatinazların transkripsiyonel düzeyde regülasyonu...9

Şekil 3: Pro-enzim aktivasyon mekanizması...10

Şekil 4: MMP aktivasyon kaskadı...10

Şekil 5: TIMP-2 bağımlı MT-1 MMP aracılı MMP-2 aktivasyon mekanizması...12

Şekil 6: Kollajen XVIII’in yapısı ve endostatin oluşumu ...13

Şekil 7: Endostatinin etki mekanizmaları...15

Şekil 8: VEGF reseptörleri ve etki mekanizmaları...18

Şekil 9: VEGF ekspresyonunun regülasyonu...19

Şekil 10: Tümör hücre invazyonu ve metastazı...20

Şekil 11: Tümör stroma etkileşimi ...21

Şekil 12: Doku çalışmaları ile ilgili deney akış çizelgesi...28

Şekil 13: TIMP-2 için ELISA ile ölçüm yöntem şeması...32

Şekil 14: MT-1 MMP ölçümü için kullanılan yöntem şeması ...33

Şekil 15: Endostatin için ELISA ile ölçüm yöntem şeması...35

Şekil 16: Proteinlerin SDS ile denatüre edilerek negatif yüklenmesi ...37

Şekil 17: Western Blot yönteminde yarı-kuru transfer sistemi ...41

Şekil 18: Western Blot yönteminde ilgili proteinin görünür hale getirilmesinde izlenen aşamalar...43

Şekil 19: Bürker tip hemositometre...47

Şekil 20: İn vitro deneyler için akış çizelgesi...51

Şekil 21: İn vitro invazyon deneyi...55

Şekil 22: BSA standart kalibrasyon eğrisi...57

Şekil 23: Kolon tümör ve eşlenik normal dokularında jelatin zimogram görüntüsü...58

Şekil 24: Rektum tümör ve normal dokularında jelatin zimogram görüntüsü ...60

Şekil 25: TIMP-2 standart kalibrasyon eğrisi...61

Şekil 26: MT-1 MMP standart kalibrasyon eğrisi...63

Şekil 27: BSA standart kalibrasyon eğrisi...65

Şekil 28: Endostatin standart kalibrasyon eğrisi...67

Şekil 29: Kolon tümör ve eşlenik normal dokularında endostatin ekspresyonu ...68

Şekil 31: VEGF standart kalibrasyon eğrisi ...71

Şekil 32: Çoğalmakta olan HT-29 hücreleri...77

Şekil 33: Pasaja hazır HT-29 hücreleri...77

Şekil 34: Rekombinant endostatinin HT-29 hücrelerinin canlılığı üzerine etkisi ...78

Şekil 35: BSA standart kalibrasyon eğrisi...79

Şekil 36: Rekombinant endostatinin HT-29 hücrelerinde proMMP-2 jelatinolitik aktivitesi üzerine etkisinin jelatin zimografi yöntemi ile incelenmesi...81

Şekil 37:Rekombinant endostatinin HT-29 hücrelerinde proMMP-2 jelatinolitik aktivite düzeylerine etkisi...82

Şekil 38: TIMP-2 standart kalibrasyon eğrisi...83

Şekil 39: Rekombinant endostatinin HT-29 hücrelerinde TIMP-2 düzeylerine etkisi...84

Şekil 40: BSA standart kalibrasyon eğrisi...85

Şekil 41: MT-1 MMP standart kalibrasyon eğrisi...86

Şekil 42: Rekombinant endostatinin HT-29 hücrelerinde MT-1 MMP düzeylerine etkisi .87 Şekil 43: Rekombinant endostatinin HT-29 hücrelerinde TIMP-2/MT-1 MMP oranına etkisi ...88

Şekil 44: Rekombinant endostatinin HT-29 hücrelerinin invazyonuna etkisi...89

Şekil 45: İnvazyon deneyinde kontrol ve deney gruplarına ait mikroskopik görüntüler ....90

Şekil 46: ProMMP-2 aktivite düzeyi ve canlılık arasındaki korelasyon grafiği ve regresyon doğrusu ...91

Şekil 47: MT-1 MMP aktivite düzeyi ile invazyon arasındaki korelasyon grafiği ve regresyon doğrusu ...92

Şekil 48: TIMP-2/MT-1 MMP oranı ile invazyon arasındaki korelasyon grafiği ve regresyon doğrusu ...93

KISALTMALAR

ESM ... : Ekstrasellüler matriks

VEGF ... : Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörü MMP ... : Matriks Metalloproteinaz

MMP-2... : Matriks Metalloproteinaz-2 MMP-9... : Matriks Metalloproteinaz-9

MT-1 MMP ... : Membrana bağlı Tip 1 Matriks Metalloproteinaz TIMP-2 ... : Matriks Metalloproteinaz-2 Doku İnhibitör Proteini HT-29 ... : İnsan kolon adenokarsinoma hücre dizisi

Arg ... :Arjinin amino asidi Gly... :Glisin amino asidi Asp ... :Aspartat amino asidi RGD ... : Arg-Gly-Asp

PA... : Plasminojen Aktivatörü

TIMP... : Metalloproteinaz Doku İnhibitörü EGF... : Epidermal Büyüme Faktörü

TGF-α ... : Transforme Edici Büyüme Faktörü-α TNF-α ... : Tümör Nekroz Edici Faktör-α

MAP Kinase ... : Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) MAPKKK... : MAPK kinase kinases

ERK ... : Extracellular Signal-Regulated Kinase JNK ... : c-Jun N-Terminal Kinase

AKT ... : Active serine/threonine kinase AP-1 ... : Aktivatör Protein-1

ETS... : Transkripsiyon Faktörü

NF-Kß ... : Nuclear factor kappaß Transciption Factor EOMA... : Murine Hemanjiomaendotelyoma

NC-1 ... : Non-Collagenous domain-1 Src-kinaz... : Sinyal İleti Yolağı

PIGF... :Plasental Büyüme Faktörü NRP-1... : Nöropilin-1

PI3K ... : Fosfotidil İnozitol-3-Kinaz

Sp-1 ... : Spesifik protein-1 transkripsiyon faktörü HIF-1... : Hipoksi ile indüklenen transkripsiyon faktörü Stat-3... : Sinyal ileten ve aktivatör transkripsiyon faktör-3 TNM... : Tumour, Node, Metastasis

BCA... : Bicinchoninic Acide Cu+2... : Bakır elementi BSA ... : Sığır Serum Albumin SDS... : Sodyum Dodesil Sülfat

SDS-PAGE ... : Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforez ELISA ... : Enzyme-Linked İmmunosorbent Assay

TMB ... : Tetrametilbenzidin

PMSF ... : Fenil Metil Sülfonil Florid (Serin proteaz inhibitörü) APS... : Amonyum persülfat

TEMED ... : Tetraetilmetildiamin PVDF ... : Polivinildendiflorid

DMEM ... : Dulbecco’s Modified Eagle’s Media FBS... : Fetal Bovine Serum

MTT ... : 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide rMMP-2 ... : Aktif MMP-2

/

ÖZET

KOLON VE REKTUM KANSERLERİNDE ENDOSTATİN’İN

MATRİKS METALLOPROTEİNAZ - 2 ÜZERİNE GÖSTERDİĞİ ETKİNİN ARAŞTIRILMASI

Zahide Çavdar

Dokuz Eylül Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü 35340 Balçova-İzmir

Giriş: Kolorektal kanser, görülme sıklığı en yüksek olan kanserler arasındadır. Anjiogeneze bağımlı olan tümör metastazı ve progresyonu; bazal membran (BM) ve ekstrasellüler matriksin (ESM) degradasyonu, hücre adezyonunun değişmesi ve tümör hücresinin fiziksel hareketliliğini kapsar. Tüm bu aşamalar içinde; aşırı ESM yıkımı tümör metastaz ve progresyonunda önemli rollere sahiptir. ECM’in degradasyonunda birçok proteinaz sistemleri rol oynamakla birlikte matriks metalloproteinazlar (MMP) bunların başında yer alır. Yapılan deneysel kanser modellerinde ve hasta çalışmalarında MMP-2 ve MMP-9’un kolorektal kanser progresyonu, invazyonu ve metastazında rolleri olduğu bildirilmektedir. Bu enzimlerin aktiviteleri ekstrasellüler olarak regüle edilir ve regülasyonları pro-enzim aktivasyonu ile doku inhibitör proteinleri olan TIMP’ler arasındaki dengeye bağlıdır. Bundan başka MMP-2 ve MMP-9’un VEGF gibi proanjiogenik ve endostatin gibi antianjiogenik moleküllerin oluşumunda da rol aldığı bildirilmektedir. Bu nedenle bu enzim sisteminin aktivasyonu tümör progresyonunda farklı aşamalarda büyük önem taşımaktadır.

Amaç:Kolon ve rektum kanserlerinin gelişim mekanizmalarına ilişkin literatür incelediğinde bu mekanizmaların birbirinden farklı olduğunu bildiren çalışmalar ve bunların total kolorektal olarak değil homojen ayrı iki tip tümör grubu olarak çalışılmasını savunan görüşler vardır. Biz de bu görüşü savunarak, gerçekleştirdiğimiz bu çalışmada kolorektal kanserleri kolon ve rektum tümörü olarak homojen ayrı iki grup olarak değerlendirdik. Bu araştırmanın temel amacı jelatinaz aktivasyon düzeylerini, MMP-2’nin endojen inhibitör proteini TIMP-2, aktivatör proteini MT-1 MMP ve anjiogenez regülasyonunda rol oynayan anjiogenik potansiyeli yüksek olan VEGF ve anjiogenez inhibitörü endostatin düzeylerini her iki tip tümör ve eşlenik normal dokularda ayrı ayrı araştırmak ve bu parametrelerin klinikopatolojik

değişkenler ile ilişkisini tanımlamaktır. Ayrıca in vitro koşullarda HT-29 kolon adenokarsinoma hücre dizinde rekombinant endostatinin hücre canlılığı, invazyonu, MMP sekresyonu ve aktivitesi üzerine etkilerini araştırmaktır.

Materyal ve Yöntem: Çalışma 50 kolon ve 34 rektum tümörlü hastadan alınan tümör ve eşlenik normal dokularda gerçekleştirildi. MMP-2, MMP-9 aktivasyon düzeyleri jelatin zimografi ile incelenmiştir. MT-1 MMP aktivite düzeyleri enzim aktivite ölçüm yöntemi ile analizlenmiştir. VEGF, endostatin ve TIMP-2’nin protein düzeyleri ise ELISA ile belirlenmiştir. Ayrıca tümör ve eşlenik normal dokulardaki endostatin ekspresyonu Western Blot yöntemi ile araştırılmıştır. İn vitro deneylerde HT-29 hücrelerinin canlılığı MTT testi ile değerlendirildi. Hücrelerin invazyon yetenekleri, matrijel ile kaplanmış 8 μm büyüklüğünde por içeren hücre plaklarında değerlendirilmiştir.

Bulgular: Kolon tümör dokusunda MMP-2’nin pro ve aktif, MMP-9’un ise aktif formları eşlenik normal dokuya göre anlamlı olarak yüksek bulundu (p<0.05). Kolon tümör ve eşlenik normal doku TIMP-2, MT-1 MMP, endostatin ve VEGF protein düzeylerinde anlamlı olarak farklılık saptanmadı (p>0.05). Parametreler ile klinikopatolojik değişkenler incelendiğinde tümör dokusu aktif MMP-9 ile tümör invazyon derinliği pT1 vs pT3-4 (p=0.011) ve uzak metastaz varlığı arasında anlamlı ilişki saptandı. Rektum tümör dokusunda ise MMP-2 ve MMP-9’un hem pro hem de aktif formlarının aktivite düzeyleri, eşlenik normal doku aktivite düzeylerine göre istatistiksel olarak anlamlı yüksek bulundu (p<0.05). Rektum tümör ve eşlenik doku TIMP-2, MT-1 MMP, endostatin ve VEGF protein düzeylerinde anlamlı olarak farklılık saptanmadı (p>0.05). Parametreler ile klinikopatolojik değişkenler arasındaki ilişki incelendiğinde ise rektum tümör aktif MMP-9 ve aktif MMP-2/ProMMP-2 (rMMP-2) ile tanı anı metastaz arasında (sırasıyla; p=0.002 ve p=0.006); ve tümör aktif MMP-9 ile perinöral invazyon varlığı arasında (p=0.042); tümör proMMP-9 ve proMMP-2 ile lenf nodu metastazı (sırasıyla; p= 0.012, p=0.021); tümör TIMP-2 düzeyleri ile nüks arasında (p=0.011) ve tümör VEGF düzeyleri ile perinöral invazyon arasında anlamlı ilişki saptandı (p=0.044). Ayrıca rektum tümör çapı ile VEGF düzeyleri arasında anlamlı orta derecede pozitif korelasyon belirlendi (p=0.009 r=0.454). İn vitro deneyler ile rekombinant endostatinin HT-29 hücre dizinde hücre canlılığını ve proMMP-2 aktivite düzeylerini anlamlı olarak azalttığı saptandı (p<0.05). Korelasyon analizi ile proMMP-2 aktivite düzeyleri ile hücre canlılığının olumlu orta derecede pozitif korele olduğu gösterildi (p=0.007 r= .423). Rekombinant endostatinin MT-1 MMP aktivitesi ve invazyon üzerine azaltıcı etkisi olduğu gözlendi fakat aradaki fark,

anlamlı olarak bulunmadı. Bununla birlikte TIMP-2/MT-1 MMP oranının endostatin eklenen deney gruplarında kontrol grubuna göre anlamlı olarak arttığı saptandı (p<0.05). İnvazyon ile MT-1 MMP arasında pozitif yönde çok güçlü pozitif (p=0.000, r= .991) korelasyon saptandı. İnvazyon ile TIMP-2/MT-1 MMP oranı arasında ise ters yönde çok güçlü anlamlı (p=0.00, r= -.962) korelasyon bulundu.

Sonuç: Kolon tümörlerinde aktif MMP-9 ile tümör invazyon derinliği “pT1 vs pT3-4” ve uzak metastaz varlığı arasında saptanan anlamlı ilişki, kolon kanserinin agresif kliniğinde önemli rol oynayabilir. Rektum tümörlerinde MMP-2 ve MMP-9 aktivite seviyeleri, TIMP-2, VEGF seviyeleri ile tanı anı metastaz, perinöral invazyon, lenf nodu metastazı ve nüks arasında saptanan anlamlı ilişkilerin rektal kanser prognozuna yönelik ileri çalışmalar için katkısı olabileceğini düşünmekteyiz. Rekombinant endostatinin HT-29 hücrelerinde hücre canlılığı ve MMP-2 sekresyonuna yönelik bulgularımızın da kolon kanserinde antikanser stratejilerin geliştirilmesine yönelik çalışmalar için yararlı olacağını düşünmekteyiz.

Anahtar kelimeler: Kolon kanseri, rektum kanseri, endostatin, matriks metalloproteinaz-2 (MMP-2)

ABSTRACT

THE INVESTIGATION OF THE EFFECT OF ENDOSTATIN ON MATRIX METALLOPROTEINASE - 2 IN COLON AND RECTUM CANCERS

Zahide Çavdar

Dokuz Eylül University Health Sciences Institute 35340 Balçova-İzmir-TURKEY

Background: Colorectal cancer, one of the most prevalent cancers worldwide, is the second leading cause of cancer-related mortality in developed countries. Tumor metastasis and progression, which depend on angiogenic process, include the proteolytic degradation of the basement membrane (BM), and the extracellular matrix (ECM), altered cell adhesion and the physical movement of tumor cells. Among these steps, excessive degradation of the matrix is one of the hallmarks of this process. Many proteinases are capable of degrading ECM components, but the proteinase system primarily responsible for ECM degradation is matrix metalloproteinase (MMPs). MMP-2 and MMP-9 have been implicated to play a role in colorectal cancer progression, invasion and metastasis in animal models and patients. The enzyme activity is regulated extracellularly and its regulation is mainly based on the balance between pro-enzyme activation and inhibition by tissue inhibitors of MMPs (TIMPs). Furthermore previous studies have shown that MMP-2 and MMP-9 may directly regulate angiogenesis by generating pro-angiogenic factors, such as vascular endothelial growth factor (VEGF), as well as the anti-angiogenic factor endostatin. Hence the regulation of the activity of these proteinases appears to be of great importance in tumor progression at different stages. Aim: Since observations support the theory that development of colon and rectal cancers may involve different mechanisms, we classified colorectal cancer into colon and rectal cancer. We focused on the activity level of MMP-2, MMP-9, TIMP-2, MT-1 MMP, VEGF and endostatin protein level between tumor areas compared with normal tissue specimens and investigated potential relationships between these parameters and clinicopathological variables in colon and rectal cancers. With in vitro experiments, we also examined how these MMP-2 secretion and activity may be regulated by recombinant endostatin and we also determined the possible role of endostatin on cell viability and invasion of human colorectal

Material and Method: Tumor and normal tissue specimens were obtained from colon (n=50) and rectal carcinoma (n=34). MMP-2 and MMP-9 activity levels were examined using gelatin zymography. MT-1 MMP activity level was analysed by activity assay. TIMP-2, VEGF and endostatin protein levels were examined using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Also the protein expression level of endostatin was assessed by Western Blotting. The in vitro invasion assay was carried out using Transwell chamber with 8 μm diameter polycarbonate membrane precoated with Matrigel.

Results: In colon tumors activity levels of pro and active MMP-2 and also active MMP-9 were significantly higher than in the corresponding normal tissue (p<0.05). The protein levels of TIMP-2, MT-1 MMP, VEGF and endostatin did not reach a statistically significant difference between tumor and normal tissue. Significant relationships were found between colon tumor active MMP-9 and tumor invasion depth “pT1-2 vs pT3-4” (p=0.011) and distant metastase. (p=0.047). However, MMP-2 activity in colon tumor tissue did not correlate with any of the clinicopathological parameters investigated. In rectal tumors, the activity levels of both pro and active MMP-2 and MMP-9 were significantly higher than those in normal tissues, the differences being significant for all (p<0.05). No significant differences between tumor and normal tissue were found for the protein level of TIMP-2, MT-1 MMP, VEGF and endostatin. Tumor active MMP-9 levels and the ratio between active and proMMP-2 (rMMP-2) showed statistically significant relationships with metastatic disease during the diagnosis (p=0.002, p=0.006, respectively) and also tumor active MMP-9 level showed a significant relationship with perineural invasion (p=0.042). Also we found statistically significant relationship between tumor proMMP-9, proMMP-2 activity levels and lymph node metastasis (p= 0.012, p=0.021, respectively). Tumor TIMP-2 levels showed a significant relationship with recurrence (p=0.011). The significant relation was found between tumor VEGF level and perineural invasion (p=0.044). Also there was a statistically significant correlation between tumor VEGF and tumor size (p=0.009 r=0.454). Cell culture experiments revealed that recombinant endostatin decreased the cell viability of HT-29 cells. It was found that both proMMP-2 secretion and activity were significantly lower in endostatin treated groups than the control group (p<0.05). There was a significant positive correlation between cell viability and proMMP-2 (p=0.007 r= .423). In the study group, MT-1 MMP level and cellular invasion were found lower compared with the control group, but these differences were not statistically significant. However, the ratio between TIMP-2 and MT-1 MMP in

experiment groups were significantly higher than in the corresponding control group (p<0.05). There was a very strong negative and statistically significant correlation between invasion and TIMP-2/MT-1 MMP ratio (p=0.00, r= -.962). Also the very strong positive and statistically significant correlation was found between invasion and MT-1 MMP level (p=0.000, r= .991).

Conclusion: The significant relationships between the increased activity of MMP-9 and tumor invasion depth “pT1-2 vs pT3-4”and distant metastases reflect that MMP-9 may play a role in predicting the agressive behavior of colon cancer. In addition, a number of significant relationships demonstrated between MMP-2, MMP-9 activity level, TIMP-2, VEGF levels and tumor pathology including metastatic disease during the diagnosis, perineural invasion, lymph node metastasis, recurrence might contribute to further investigation of possible prognostic significance in rectal cancer. Also the results of the cell culture experiments on the effect of recombinant endostatin on cell viability and MMP secretion of the HT-29 are expected to contribute to further investigation for anticancer strategies in colon cancer.

BİRİNCİ BÖLÜM 1. GİRİŞ ve AMAÇ

Anjiogenez, tümör ilerlemesi ve metastazı için en temel mekanizmalardan biridir ve ekstrasellüler matriksin (ESM) yeniden modellenmesini gerektiren bir süreçtir (1). Endostatin, kollajen XVIII’den proteolitik bir işlem sonucu oluşan ve güçlü anjiogenez inhibitörü olarak tanımlanmış bir moleküldür (2). Endostatinin bu güçlü in vivo ve in vitro antianjiogenez etki mekanizması tam olarak anlaşılmış değildir. Endostatinin antianjiogenik özelliğinin yanısıra matriks metalloproteinaz inhibitörü olma özelliğinin tanımlanmasına yönelik çalışmalar da devam etmektedir (3). Vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) ise tümör anjiogenezi için en güçlü stimülatördür (4). Matriks metalloproteinazlar (MMP), anjiogenez ve tümör metastazında önemli yeri bulunan endopeptidazlar olarak bilinmektedir. Bu endopeptidazlar endotel hücrelerinin migrasyonu ve invazyonu için zorunlu basamak olan ESM’nin seçici olarak proteolitik degradasyonunu gerçekleştirmektedirler. Substrat özgüllüklerine göre 6 sınıfta toplanmaktadırlar: İnterstisyel kollajenazlar, jelatinazlar (MMP-2, MMP-9), stromelizinler, matrilizinler, membran tip MMP’ler (MT1-MMP) ve diğerleri. Çalışmamızda odaklandığımız MMP-2 ve MMP-9, bazal membranın başlıca komponenti olan Tip IV kollajeni yıkabilme yeteneğindedirler. MMP-2’nin endojen inhibitör proteini ise TIMP-2 dir. Membran tip metalloproteinazlar grubunda yer alan MT-1 MMP, düşük TIMP-2 varlığında hem MMP-2’ yi aktive eder hem de tüm ESM komponentlerini yıkabilme yeteneğindedirler (5, 6). Ayrıca MMP-9’un, ekstrasellüler matrikse VEGF salınımındaki rolü ile tümör anjiogenezinin düzenlenmesindeki rolleri yapılan çalışmalarda vurgulanmaktadır (7). MMP’lerin anjiogenik etkilerinin yanında endostatin oluşumunda rol alarak (8) gösterdikleri anti-anjiogenik etkileri, anjiogenez regülasyonunda proteinler arası etkileşimin karmaşıklığına dikkat çekmektedir.

Literatür incelendiğinde kolorektal kanserde; MMP-2, MMP-9 ve bunların regülasyonlarında görevli inhibitör proteinlerin TIMP-2, TIMP-1 ve aktivatör protein MT-1 MMP’nin ekspresyonlarına ve prognostik anlamları üzerine yapılan çalışmalar mevcuttur. Bu çalışmalarda jelatinazların ve ilgili düzenleyici proteinlerin mRNA, protein ve aktivite seviyelerinde incelenmek üzere farklı teknikler ile değerlendirildiği ve bu nedenle elde edilen veriler arasında uyumsuz sonuçlar bulunduğu görülmektedir (9, 10). Bununla birlikte, bu proteinazların fonksiyonel durumları, ilgili enzimlerin aktiviteleri ile ilişkilidir. ProMMP-2 ve

ProMMP-9’un aktivasyonlarını incelemeyi mümkün kılan tekniklerin başında Jelatin Zimografi analizi yer almaktadır. Diğer yandan kolon ve rektum kanserlerinin gelişim mekanizmalarına ilişkin literatür incelediğinde bu mekanizmaların farklı olduğunu bildiren çalışmalar (11, 12) ve bunların total kolorektal olarak değil homojen ayrı iki tip tümör grubu olarak çalışılmasını savunan görüşler vardır (13). Biz de bu görüşü savunarak, gerçekleştirdiğimiz bu çalışmada 50 kolon ve 34 rektum tümörü teşhisi alan hastaları total kolorektal olarak değil, kendi içinde homojen olan ayrı iki grup olarak değerlendirdik.

Bu araştırmanın temel hipotezi, anjiogenez inhibitörü olan endostatinin matriks metalloproteinazlar üzerine inhibisyon etkisi aracılığı ile tümör hücre invazyonu üzerindeki olası azaltıcı etkisinin araştırılmasıdır. Hipotezimizi aydınlatmak amacıyla jelatinaz aktivasyon düzeylerini, MMP-2’ nin endojen inhibitör proteini TIMP-2, aktivatör proteini MT-1 MMP ve anjiogenez regülasyonunda rol oynayan anjiogenik potansiyeli yüksek olan VEGF ve anjiogenez inhibitörü endostatinin protein düzeylerini her iki tip tümör ve eşlenik normal dokularda ayrı ayrı araştırarak bu parametrelerin klinikopatolojik değişkenler ile ilişkisi tanımlandı. Ayrıca in vitro koşullarda HT-29 kolon adenokarsinoma hücre dizisinde rekombinant endostatinin tümör hücre canlılığı üzerine etkisi incelendi ve tümör hücresinin invazyon yeteneği üzerine olası inhibisyon etkisinin, MMP-2 ve MT1-MMP aktivitesinde meydana getireceği inhibisyon özellikleri ile ilişkilendirerek tanımlandı.

İKİNCİ BÖLÜM 2. GENEL BİLGİLER

2.1. EKSTRASELLÜLER MATRİKS

Ekstrasellüler matriks (ESM), hücrelerarası boşluklarda özel bir ortam oluşturan doku bütünlüğü ve homeostazından sorumlu dinamik, interaktif bir yapıdır. ESM, hücre gelişimi, migrasyonu, proliferasyonu ve metabolik fonksiyonlar gibi bir hücreyi ilgilendiren olayların düzenlenmesinde, hücreleri yönlendirecek intrasellüler sinyalleme yolakları ile direkt ya da indirekt olarak etkileşerek hücrelere pozisyonel ve çevresel bilgi aktarımında önemli rollere sahiptir (14, 15).

Matriksi oluşturan başlıca iki temel ekstrasellüler protein vardır. Bunlar kollajen ve proteoglikanlardır. Kollajen, ECM yapısında en fazla bulunan proteinler arasındadır. Genetik olarak birbirinden farklı 20 kollajen tipi tanımlanmaktadır. Total vücut proteinlerinin % 30, total vücut ağırlığının % 6’sını oluşturur. Kollajenin yapısında, yüksek oranda glisin (% 33) ve prolin (% 10) ile amino asit türevleri olan hidroksiprolin (% 10) ve hidroksilizin bulunmaktadır (% 1). Bazı kollajen molekülleri (Tip I, II, III, V ve XI) bir araya gelerek kollajen fibrilleri oluştururlar. Kollajen fibril oluşumu ekstrasellüler bir işlemdir ve terminal prokollajen peptidlerinin prokollajene spesifik metalloproteinazlar aracılığı ile yıkılmasıyla oluşur. Uzun kollajen fibrilleri matrikse destek verir ve organize olmasını sağlar. Bazı kollajen tipleri ise (Tip IV), ağsı bir yapı oluştururlar. Tip IV kollajen bazal membran yapısında yer alan başlıca proteinler arasındadır. Kollajen başlıca fibroblastlar, miyofibroblastlar, osteoblast ve kondrositler tarafından sentezlenmektedir. Proteoglikanlar, kovalent bağlı glikozaminoglikanlar içeren peptid zincirleridir. Yapılarında % 95 karbonhidrat, % 5 oranında protein içerirler. Hyalüronik asit, kondroitin sülfat, keratan sülfat I, ve II, heparin, heparan sülfat ve dermatan sülfat olmak üzere yedi çeşit glikozaminoglikan vardır. Proteoglikanlar, doku kompartmanları arasında besin, metabolit ve hormonların difüzyonunu mümkün kılan bir faz oluştururarak matriksin organizasyonunda önem taşırlar. Elastin ise diğer önemli lifsel proteinler arasında yer almaktadır. Elastin dokuların uzayıp, tekrar orijinal şekline geri dönmesinden yani esnekliğinden sorumlu olan ekstrasellüler matriks proteinidir (16).

Glikoprotein yapısında olan fibronektin ve laminin de önemli role sahip ESM temel proteinleri arasında yer almaktadır. Fibronektin C-terminalinden iki disülfid köprüsüyle bağlı

iki aynı polipeptid zincirinden oluşmuş bir dimerdir. İki temel formda bulunur. Çözünür dimerler olarak çeşitli vücut sıvılarında, plazmada ve çözünmez fibriler formda mezenkimal dokularda, arter ve ven duvarlarında, böbrek, dalak, akciğer stromasında bulunur. Çözünmez fibriler fibronektin embriyonik gelişimde oldukça önemlidir. Çünkü embriyonik hücrelerin fibronektine adezyonu hücre migrasyonu için gerekli basamaklardandır.Fibronektinler, Arg-Gly-Asp (RGD) dizilimleri aracılığı ile integrinlerle de etkileşim içindedirler(17). ESM, tüm bu proteinlerin yanında gikozaminoglikan yapısında olan hyaluronan proteini de içermektedir. Hyaluronan, [D-glukronik asit (1-β−3) N-asetil-D-glukozamin (1-ß-4)] tekrarlayan disakkarid ünitelerinden oluşmaktadır. Başlıca fibroblast ve diğer stromal hücrelerden salgılanan hyaluronan, sinyal ileti ve adhezyon gibi birçok hücresel fonksiyonların düzenlenmesinde rol oynamaktadır. ESM, yapısını oluşturan tüm bu komponentlerle birlikte doku bütünlüğünü koruyan, destekleyen bir yapı oluşturarak, hücre homeostazının sağlanması, hücrelerarası sinyal iletimi, hücre büyüme ve çoğalmasının regülasyonu ve nörotransmisyon gibi dinamik olaylarda önemli rollere sahiptir (18).

2.1.1. BAZAL MEMBRAN

Yoğun ESM tabakası olarak tanımlanan bazal membran, epitel ve endotel hücreleri yanısıra, kas, adipositler ve periferal sinir aksonlarını doku stromasından ayıran bir bariyer görevi görür. Bazal membran, hücreye yapısal bir destek sağlamakla birlikte hücre davranışının düzenlenmesinde de önemli roller üstlenir. Tüm hücre tiplerinin; başlıca tip IV kollajen, laminin, heparan sülfat ve proteolikan komponentlerinden oluşmuş bazal membrana sahip oldukları bilinmektedir. Minör komponentleri arasında Tip XV ve Tip XVIII kollajen, agrin ve fibulin yer almaktadır. Bazal membran içeriği dokudan dokuya değişir ve bu farklılığın da doku spesifitesinde önemli olduğu bilinmektedir (19).

2.2. EKSTRASELLÜLER MATRİKS PROTEOLİZİ

Doku morfogenezi, anjiogenez, kemiğin yeniden modellenmesi, yara iyileşmesi, trofoblast implantasyonu gibi fizyolojik olaylar, ESM’nin yeniden modellenmesi ile koordinasyon gerektirir. ESM’nin yeniden-modellenmesi; komponentlerinin yıkımı ve sentezi aşamalarından oluşmaktadır. ESM’nin proteolitik degradasyonundan sorumlu çok sayıda proteaz sistemleri tanımlanmış olmakla birlikte başlıca proteazlar; serin proteazlar

(Plasminojen aktivatör (PA) - Plasmin Sistemi) ve matriks metalloproteinazlar olmak üzere iki ana sınıfta incelenmektedir (20).

2.2.1. MATRİKS METALLOPROTEİNAZLAR 2.2.1.1. GENEL YAPISAL ÖZELLİKLERİ

Matriks metalloproteinazlar (MMP), çinko metalloproteaz ailesinin “matriksin” olarak tanımlanan alt grubunda sınıflandırılmaktadırlar. Bugüne kadar tanımlanmış 28 üyesi vardır (21). Sekrete edildiklerinde inaktif zimojen formda bulunan MMP’ler, çeşitli ortak özelliklere sahiptirler: Tüm MMP ler pre-, pro-, katalitik ve hemopeksin benzeri bölgeler içerirler. Pre-domain, sekretuar yolak için gerekli olup hücresel olarak MMP’lerin lokalizasyonunda rol almaktadır. Pro-domain enzim latentliğinden sorumludur ve enzimin aktivasyonu sırasında kaybolur. MMP’ler katalitik bölgelerinde Zn+2 iyonu içerirler. Hemopeksin benzeri bölge ise substrat özgüllüğünden ve endojen doku inhibitör proteinlerin (TIMP) bağlanmasından sorumludur (22).

2.2.1.2 MMP’LERİN BİYOLOJİK ROLLERİ

MMP’lerin başlıca fonksiyonları ECM moleküllerinin degradasyonudur. ECM moleküllerinin dışında non-ECM molekülleri de MMP’lerin hedefleri arasında yer almaktadır. Örneğin, EGF, TGFα, TNFα gibi birçok büyüme faktörü inaktif formda salgılanırlar. MMP’ ler bunların aktivasyonlarını sağlayarak biyoaktif forma dönüştürürler (10).

2.2.1.3 MMP’LERİN SINIFLANDIRILMASI

MMP’ler içerdikleri yapısal organizasyonlarına (Şekil 1) (16) ve substrat spesifitelerine (Tablo 1) (23) göre Kollajenazlar, Jelatinazlar, Stromelisinler, Matrilizinler, Membran tip MMP, diğer MMP’ler olmak üzere 6 ayrı alt grupta sınıflandırılmaktadırlar.

2.2.1.3.1 JELATİNAZLAR: MMP-2 ve MMP-9

Diğer MMP’lerden yapısal olarak katalitik bölge içinde 3 adet fibronektin tip II benzeri tekrar içeren ilave bir bölge bulundururlar. Bu kısım jelatinazların jelatin ve kollajene yüksek afinite ile bağlanmalarını sağlar, proteolitik aktivitelerini arttırır.

Şekil 1: MMP’lerin yapılarına göre sınıflandırılması Sinyal dizilim

Pro bölge Furin tanıma bölgesi

Tip II fibronektin Çinko bağlayan bölge

Katalitik bölge

Hemopeksin benzeri bölge Transmembran bölge

Sitoplazmik bölge GPI tutunma bölgesi

Tip II fibronektin benzeri tekrarlayan bölge: MMP-2, 9 Minimal bölge: MMP-7, 26

Furin aktive basit hemopeksin bölge: MMP-11, 28

Membrana bağlı: MMP-14, 15, 16, 24

GPI bağlı:MMP-17, MMP-25 Basit hemopeksin bölge:

Tablo 1: MMP’lerin substratlarına göre sınıflandırılması

2.2.1.3.1.1.JELATİNAZLARIN REGÜLASYONU

MMP’lerin yapısal gen ekspresyonu normal koşullarda düşük olarak bildirilmektedir. Bununla birlikte ECM’nin yeniden modellenmesini gerektiren fizyolojik veya patolojik koşullarda ekspresyonları indüklenmektedir. MMP’lerin regülasyonu transkripsiyonel ve posttranskripsiyonel seviyede düzenlenmektedir.

Transkripsiyonel Düzeyde MMP Regülasyonu

MMP-2 ve MMP-9 ekspresyonunu düzenleyen sinyal ileti yolakları, p38 kinaz, c-Jun N-terminal Kinaz (JNK), ve ERK yolağı (Extracellular signal-regulated kinase) olmak üzere

ALT GRUP MMP İSİM SUBSTRAT

1. Kollajenazlar MMP-1 MMP-8 MMP-13 Kollajenaz-1 Kollajenaz-2 Kollajenaz-3

Kol I, II, VII, VIII, X, Jelatin Kol I, II, III, VII, VIII, X Kol I, II, III, IV, IX, X, IV 2. Jelatinazlar

MMP-2 MMP-9

Jelatinaz- A Jelatinaz -B

Jelatin, Kol I, II, III, IV, VII, X Jelatin, Kol IV, V

3.Stromelizinler MMP-3 MMP-10 MMP-11 Stromelizin-1 Stromelizin-2 Stromelizin-3

Kol II, IV, IX, X, XI, Jelatin Kol IV, Laminin, Fibronektin Kol IV, Laminin, Elastin 4. Matrilizinler MMP-7 MMP-26 Matrilizin-1 Matrilizin-2 Fibronektin, Laminin Fibrinojen, Fibronektin

5. MT-MMP MMP-14 MMP-15 MMP-16 MMP-17 MMP-24 MMP-25 MT-1 MMP MT-2 MMP MT-3 MMP MT-4 MMP MT-5 MMP MT-6 MMP

Jelatin, Fibronektin, Laminin Jelatin, Fibronektin, Laminin Jelatin, Fibronektin, Laminin Fibrinojen, Fibrin

Jelatin, Fibronektin, Fibrin Jelatin 6. Diğerleri MMP-12 MMP-19 MMP-20 MMP-21 MMP-23 MMP-27 MMP-28 Makrofaj metalloelastaz Enamelizin XMMP CMMP Epilizin

Elastin, Fibronektin, Kol IV Agrekan, Elastin, Fibrillin Agrekan

Agrekan

Jelatin, Kazein, Fibronektin Bilinmiyor

üç MAP-kinaz (Mitogen-activated protein kinase) yolağından oluşmaktadır. p38 ve JNK yolağı inflamatuar sitokinler, ozmotik stres ve apoptotik sinyallere yanıt olarak aktive olurken; ERK yolağı sitokinler, büyüme faktörleri ve forbol esterlere yanıt olarak aktive olur. Sonuç olarak bir grup protein kinazlar, MAP-kinazı aktive ederler. Aktif MAP-kinazlar nükleusa transloke olurlar ve MMP gen ekspresyonu ile ilgili transkripsiyon faktörlerinin aktive olmasını sağlarlar. MMP-2 ve MMP-9 gen ekspresyonu ile ilişkili sinyal ileti yolakları Şekil 2’de şematize edilmektedir.

İnsan MMP gen promotör sekans analizleri ile “Aktivatör protein-1 (AP-1)” bağlanma bölgelerinin trankripsiyonel aktivasyonda önemli bir role sahip olduğu gösterilmiştir. AP-1 bağlanma bölgelerini tanıyan ve etkileşime giren transkripsiyon faktörleri Jun ve Fos ailesi içinde yer almaktadır. Ayrıca AP-1 transkripsiyon faktörlerinin yanında ETS transkripsiyon

faktörlerinin de MMP ekspresyonunun düzenlenmesiyle ilişkili olabileceği gösterilmiştir (10).

MMP-9 ve MMP-2 nin ekspresyonları birbirinden farklı şekilde düzenlenmektedir. Bu farklılık promotör bölgelerinin farklılığından kaynaklanmaktadır. MMP-9 promotör bölgesi AP-1, AP-2, nükleer faktör kappa B (NFKB) ve ETS gibi birçok transkripsiyon faktörleri için bağlanma bölgeleri içermektedir. MMP-9 ekspresyonu, promotör bölgesinin bu özelliği ile değişik uyaranlara karşı indüklenebilir özellik göstermektedir. MMP-2 promotör bölgesi ise AP-1 ve ETS gibi transkripsiyon faktörleri için bağlanma bölgelerinden yoksun olduğu için, MMP-2 ekspresyonun yapısal olduğu bildirilmektedir (24).

Posttranskripsiyonel Düzeyde MMP Regülasyonu

MMP’lerin posttranskripsiyonel (protein) düzeyindeki regülasyonları ise aktivasyonlarına bağlıdır. İnaktif zimojen formda sekrete edilen MMP’ler, pro bölgelerini “sistein switch” olarak tanımlanan aşamalı aktivasyon mekanizması ile kaybederler ve böylece aktif forma dönüşürler. Bu aktivasyon mekanizmasının aşamaları, pro bölgede bulunan sistein rezidüsü ile aktif bölgede yer alan Zn+2 arasında bulunan sistein bağının kopmasına dayanmaktadır (Şekil 3). Bazı MMP’ler için bu aktivasyon mekanizmasına plasmin, ürokinaz plasminojen aktivatör (uPA) ve diğer aktif formdaki MMP’ler aracılık edebilir (Şekil 4) (25, 26).

Şekil 2: Jelatinazların transkripsiyonel düzeyde regülasyonu

İntegrinler

MMP-2/MMP-9 ekspresyonu

Sitokinler Büyüme faktörleri

İkincil haberciler

Şekil 3: Pro-enzim aktivasyon mekanizması İnaktif

Aktif

2.2.1.3.1.2. ENDOJEN MMP-2 AKTİVATÖR PROTEİNİ: MEMBRAN TİP-1 MMP (MT-1 MMP)

Membran tip MMP’ler (MT-MMP) integral membran proteinleridir. Şekil 1’de açıklandığı üzere MT-1, MT-2, MT-3, MT-4, MT-5, MT-6 MMP olmak üzere tanımlanmış 6 üyesi vardır. Tüm MMP’ler de olduğu gibi MT-1 MMP’nin de hücre yüzeyinde proteolitik olarak fonksiyon gösterebilmesi için propeptid bölgesinin yapısından kopması gerekmektedir. Propeptid bölgesinin C-terminal ucunda yer alan bazik aminoasit motifi (RXKR) serin proteaz grubu enzimlerden pro-protein konvertaz (örneğin; furin veya furin ilişkili) enzimleri aracılığıyla koparak aktif form meydana gelmektedir. Hücre içinde gerçekleşen bu aktivasyon işleminden sonra aktif MT-1 MMP hücre yüzeyine transfer olmaktadır. Bununla birlikte, pro-MT-1 MMP’de konvertaz-tanıma bölgeleri içeren ikinci bazik motiflerin yer aldığı böylece alternatif aktivasyon yolaklarının da mevcut olabileceği yapılan sekans çalışmalarıyla gösterilmiştir. Ancak latent MT-1 MMP’nin aktivasyonun veya enzimatik aktivitesinin fizyolojik olarak nasıl regüle edildiği tam olarak bilinmemektedir. Aktifleşen MT-1 MMP, TIMP-2 bağımlı pro-MMP-2 aktivasyonunda rol almakla birlikte (Bölüm 2.1.3.1.3.1); fibronektin, vitronektin, laminin-1, laminin-5 fibrin, dermatan sülfat proteoglikanların, jelatin, kazein, elastin, kollajen Tip I, II ve III gibi ekstrasellüler matriks proteinlerinin degradasyonunda görev almaktadır. Ayrıca non-ESM proteinleri içinde yer alan başlıca hyaluronan reseptörü olan CD44, proalfa V integrin ve fibronektine bağlanan doku transglutaminaz gibi hücre adezyon moleküllerinin de yıkımında görev almaktadır (27, 28).

2.2.1.3.1.3. ENDOJEN MMP-2 DOKU İNHİBİTÖR PROTEİNİ: TIMP-2

MMP’lerin katalitik aktivitesi MMP’lerin doku inhibitörleri (TIMP) tarafından inhibe edilir. TIMP’ler bu fonksiyonlarını metalloproteinazlar ile 1:1 oranında kompleks oluşturarak gösterirler. Bu inhibitör etkinin oluşmasında TIMP moleküllerinin N-terminal bölgesi önemli role sahiptir. MMP aktivitesinin ESM substratları üzerine etkisi enzimler ve inhibitörleri arasındaki dengeye (MMP aktivitesi/TIMP) bağlıdır. Bu denge birçok fizyolojik ve patolojik olayda merkezi rol oynamaktadır. Malignite, invazyon ve metastazda bu denge bozulmaktadır.

Tanımlanmış dört ailesi vardır (TIMP-1, 2, 3, 4). Her biri farklı MMP türlerine spesifiktir. TIMP-1, 184 amino asit içeren 28 kDa ağırlığında glikoproteindir. Tüm MMP’leri inhibe edebilir fakat MMP-9’a afinitesi daha fazladır. TIMP-2 ise MMP-2’ye spesifik

inhibitör proteindir. 194 aminoasit içeren 21 kDa’luk glikozillenmiş bir proteindir. TIMP-1 ile %40 sekans homolojisi göstermektedir. Hücre yüzeyine aktif olarak yerleşen MT-1 MMP’nin enzimatik aktivitesi de spesifik olarak TIMP-2, TIMP-3 ve TIMP-4 tarafından inhibe edilmektedir (21)

2.2.1.3.1.3.1. TIMP-2 BAĞIMLI MT-1 MMP ARACILI PROMMP-2 AKTİVASYON MEKANİZMASI

MMP-2’nin aktivasyon mekanizması, diğer MMP’lerden farklı olarak hücre yüzeyinde TIMP-2 bağımlı MT-1 MMP aracılı mekanizma ile gerçekleşmektedir. MMP-2’nin endojen inhibitör proteini olarak tanımlanan TIMP-2, aynı zamanda MT-1 MMP aracılı MMP-2 aktivasyonunda rol oynar. Düşük seviyede bulunan TIMP-2, N-terminal bölgesinden MT-1 MMP’nin aktif bölgesine bağlanır. Bu ikili kompleks proMMP-2’nin bağlanması için reseptör görevi görür: TIMP-2, C-terminalinden proMMP-2’nin C terminaline bağlanır. Serbest MT-1 MMP molekülü proMMP-2’nin propeptid bölgesini koparır, ara ürün oluşur. Daha ileri proteoliz işlemi ile MMP-2 tamamen aktif MMP-2 formuna dönüşür. İleri proteoliz ya otokatalitik (26) bir proteoliz ile ya da plasminojen (plasmin) sisteminin devreye girmesiyle oluşur (29). TIMP-2 yüksek seviyede bulunduğu zaman ise fazla TIMP-2’ler MT-1 MMP’lere bağlanarak proMMP-2 aktivasyonunu engeller (30). TIMP-2 bağımlı MT-MT-1 MMP aracılı MMP-2 aktivasyon mekanizması Şekil 5’te gösterilmektedir.

Şekil 5: TIMP-2 bağımlı MT-1 MMP aracılı MMP-2 aktivasyon mekanizması

Ekstrasellüler Ekstrasellüler Intrasellüler Intrasellüler TIMP-2 seviyesi yüksek TIMP-2 seviyesi düşük

2.3. ENDOSTATİN: ANJİOGENEZ İNHİBİTÖRÜ

Endostatin ilk kez 1996 yılında murine hemanjioendotelyoma (EOMA) hücre hattının ortamından izole edilmiştir. Sekans analizi ile Tip XVIII kollajenin NC-1 bölgesine ait 20 kDa ağırlığında bir fragman olduğu gösterilmiştir (2).

2.3.1.YAPISAL ÖZELLİKLERİ

Endostatin Tip XVIII kollajenin trimerize olmuş C-terminalinin parçalanması ile oluşmaktadır (Şekil 6). Bu parçalanmanın sistein proteinaz grubu enzimlerden Katepsin L, serin proteinaz elastaz ve MMP’ler aracılığı ile olabileceği gösterilmiştir. MMP’ler dışında da diğer proteazlar endostatinin hem oluşumunda hem de stabilitesini sağlamada görev alırlar (31, 8). Endostatin; heparan sülfat proteoglikan ve perlekan ile birlikte vasküler bazal membranda lokalize olmaktadır (32). Endostatin kompakt globüler bir yapıya sahiptir ve heparine bağlanmada fonkiyonel 11 arjinin rezidüsü ile karakterizedir. Endostatinin N- terminalinde bir Zn+2 atomu yer almaktadır; bu Zn+2 atomunun endostatinin biyolojik etkisi için fonksiyonel olmadığı, fakat intramoleküler disülfid köprülerinin stabilizasyonunda gerekli olduğu gösterilmiştir (33). Tip XVIII kollajen ile Tip XV kollajenin NC-1 bölgeleri % 60 sekans benzerliğine sahiptir. Tip XV kollajenin NC-1 bölgesinin de proteolitik fragmanının anti-anjiojenik aktiviteye sahip olduğu fakat etkisinin endostatinden daha az olduğu gösterilmiştir. Tip XV kollajenin NC-1 bölgesine ait bu proteolitik fragmanlar Zn+2 ve heparin bağlanma bölgeleri içermeyip “restin” olarak adlandırılmaktadır (32).

Şekil 6: Kollajen XVIII’in yapısı ve endostatin oluşumu Trimerize olmuş bölge

Proteazlar (Katepsin, MMPs)

2.3.2. ENDOSTATİNİN HÜCRE YÜZEY RESEPTÖRLERİ

Endostatin için tanımlanmış reseptörler mevcuttur. Endostatin, hücre adezyonunu α5β1 integrinler aracılığı ile gösterdiği bildirilmektedir. Endostatin ve α5β1 integrin arasındaki etkileşimin bloke edildiği bir çalışmada endostatin ile indüklenen hücre migrasyonunun kaybolduğu gösterilmiştir. Bunun sonucunda da α5β1 integrinin endostatin için fonksiyonel bir reseptör olduğu kabul edilmiştir (34).

Endostatin aynı zamanda heparine bağlanan bir proteindir. Arjinin rezidüsünde meydana gelen nokta mutasyonunun heparine bağlanmayı engellediği ve dolayısıyla endostatin fonksiyon kaybının meydana geldiği gösterilmiştir. Endostatinin düşük afinite ile endotel hücrelerinde eksprese edilen hücre yüzey heparan sülfat proteoglikanlarından glipikan 1 ve 4’e de bağlandığı bildirilmektedir. Endostatin glikozaminoglikanlar için de oldukça spesifik tanınma motiflerine sahiptir. Bu durumda endostatinin hangi hücre spesifik yüzey proteoglikan türlerine bağlanacağı afinitesi ile ilişkilidir. Endostatin, ayrıca VEGF–2 reseptörüne yarışmalı olarak bağlanarak reseptör aktivitesinde inhibisyon oluşturur (35).

2.3.3. ENDOSTATİNİN ETKİ MEKANİZMASI

Hayvan modellerinde yapılan çalışmalar ile rekombinant endostatinin tümör büyümesini ve anjiogenezi inhibe ettiği gösterilmiştir. Down sendromlu bireylerde endostatinin dolaşımdaki seviyesi yüksek olarak saptanmış ve bu yüksekliğin bu bireylerde KOL18A1 geninin 3 kez fazla kopyalanmasıyla meydana gelen anomali ile ilişkili olabileceği bildirilmiştir. Bu kişilerde solid tümör insidansının düşük olması da bu KOL18 geninde görülen bu anomali ile ilişkilendirilmektedir (36).

Endostatinin antianjiojenik etkisinin temelinde yer alan biyolojik mekanizmalar arasında endotelyal hücre migrasyonunun inhibisyonu, hücre döngüsünün duraklaması ve apoptosiz indüksiyonu yer almaktadır. Endotel hücrelerinde endostatinin α5β1 integrine bağlanması ile Src-kinaz sinyal ileti yolağının aktive olduğu gösterilmiştir. Ayrıca endostatinin integrinler aracılığı ile RhoA GTPaz aktivitesini baskıladığı ve Ras ve Raf ailesine ait sinyal ileti yolaklarını da inhibe ettiği bildirilmektedir (Şekil 7). Bu etkiler sonucunda endostatinin hücre iskeletinin organizasyonunda yer alan aktin monomerlerinin birbirinden ayrılmasına, hücre-matriks etkileşimlerinin bozulmasına ve endotel hücre

migrasyonunun yavaşlamasına neden olduğu, bunlara bağlı olarak da anjiogenezi baskıladığı gösterilmiştir (35, 37, 38).

Şekil 7: Endostatinin etki mekanizmaları

Tüm bu anti-migrasyon ve anti-anjiogenik etkilerine ek olarak endostatinin bir proteinaz inhibitörü gibi davranabildiği de gösterilmiştir. Endostatinin MMP-2’nin katalitik bölgesine bağlanarak MMP-2 aktivitesini inhibe ettiği bildirilmektedir. Endostatinin MMP-2’ ye bağlanma afinitesinin MMP-2’nin doğal inhibitör proteini olan TIMP-2’den daha zayıf

Adezyon ve

olduğu da gösterilmiştir. MMP-9 ve MMP-13 aktivitelerinin de yine endostatin tarafından inhibe edildiği bildirilmektedir. Buna zıt olarak 9 ve diğer MMP’lerin (3, MMP-7 ve MMP-13) “Endostatin” oluşumunda önemli rolleri olduğu gösterilmiştir. Yine MMP-2, MMP-3, ve MMP-13’ün anjiogenez inhibitörlerinden “Tumstatin” oluşumunda rol oynadığı saptanmıştır. Endostatinin MMP inhibitörü olarak davranması yanında, endostatin oluşumunda MMP’lerin rol almaları, MMP’lerin anjiogenik etkilerinin yanında anti-anjiogenik etkileri ile anjiogenez regülasyonundaki rollerine de dikkat çekmektedir (8, 38).

2.4. VASKÜLER ENDOTELYAL BÜYÜME FAKTÖRÜ: ANJİOGENEZ STİMÜLATÖRÜ

Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörü (VEGF) ilk olarak 1983 yılında karakterize edildiğinde vasküler permiabilite faktörü (VPF) olarak tanımlanmıştır. 1989 yılında ise başka bir grup araştırıcı tarafından endotel hücreleri için mitojenik özelliğe sahip heparine afinetisi yüksek olan yeni bir protein, VEGF olarak tanımlanmıştır. Daha sonra ise bu iki proteinin aslında tek bir genden eksprese edilen aynı protein olduğu kanıtlanmıştır (4).

2.4.1. VEGF AİLESİ

VEGF ailesi VEGF veya VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E ve plasenta büyüme faktörü olarak adlandırılan PIGF’den oluşmaktadır. İnsan VEGF geni sekiz ekzon ve yedi intron bölgesi içermektedir. Bu genin; VEGF-121, VEGF-145, VEGF-165, VEGF-189 ve VEGF-206 olmak üzere amino asit sayıları birbirinden farklı beş farklı ürünü vardır. VEGF proteinlerinin heparin ve heparin sülfata bağlanma afinitelerine göre farklı izoformları vardır. VEGF 121 ve VEGF 165, çoğu hücrede en fazla ekspresse edilen proteinler arasındadır. VEGF-B yapısal olarak VEGF’e çok benzer. 167 aminoasitten oluşan ve uygun reseptörüne bağlanan form ve 186 aminoasitten oluşan çözünür form olmak üzere iki farklı tipi vardır. VEGF-B’nin her iki izoformu da VEGF-A ve diğer büyüme faktörleri ile bir araya gelerek heterodimer oluşturabilirler. VEGF-C, ilk kez prostat karsinoma hücrelerinden klonlanmıştır. Matür formu, VEGF homoloji bölgesi içerir ve VEGF-165 ile % 30 benzerlik gösterir. VEGF-C, pre-protein olarak sentezlenir ve ardışık proteolitik işlemlerle hem reseptörüne bağlanmak için hem de biyoaktivitesi için en uygun formu alır. VEGF-D,

VEGF-C ile % 60 sekans benzerliğine sahiptir. VEGF-E ise Paropox virüs den izole edilmiştir. PIGF, insan plasenta kaynaklı olup, VEGF ile % 50 homoloji gösterir (4).

2.4.2. VEGF RESEPTÖRLERİ

Tirozin kinaz ailesinden VEGFR-1, VEGFR-2 ve VEGFR-3, VEGF için afiniteleri yüksek reseptörlerdir. VEGFR-1, VEGF-A, VEGF-B ve PIGF için uygundur. VEGF-A, VEGF-C ve VEGF-D, VEGFR-2 ye bağlanır. VEGFR-3 ise VEGF-C ve VEGF-D’yi bağlar. Reseptörlerin ekspresyon yerleri birbirinden farklıdır. Örneğin, VEGFR-3, başlıca lenfatik endotelde ekspresse edilirken, kan damarları endotelinde de ekspresse edilir. Bir diğer reseptör grubu ise Nöropilin-1 (NRP-1) ve Nöropilin-2 (NRP-2) olarak tanımlanan non-tirozin kinaz grubu reseptörlerdir. Bunlar VEGF-A, -B, -E ve PIGF’yi bağlama yeteneğindedirler. NRP-1, vasküler endotelde, nöronlarda ve bazı tümör hücrelerinde eksprese edilir ve VEGFR-1 ve VEGFR-2 ile de birlikte eksprese edilir. NRP-2 ise VEGF-C’ye bağlanır, endotel ve lenfatik damarlarda VEGFR-3 ile birlikte eksprese edilirler.

VEGF (VEGF-A) çoğunlukla homodimerler halinde bulunur ve aktif formu 45 kDa ağırlığındadır. Reseptörüne bağlandıktan sonra, öncelikle reseptör dimerizasyonu olur. Her reseptör tirozin kinaz bölgelerinde otofosforilasyona uğrayarak aktif forma dönüşür. Bu aktivasyonu, sinyal ileti yolaklarında görevli fosfolipaz C-γ/protein kinaz C (PKC), ras proteinleri, fosfotidilinozitol-3-kinaz (PI3K), Mitojen-aktive protein kinaz (MAPK) proteinlerinin aktivasyonu izler ve vasküler permiabilite, hücre canlılığı, proliferasyonu ve migrasyonun artışı ile sonuçlanır (Şekil 8) (39).

2.4.3. VEGF EKSPRESYONUNUN REGÜLASYONU

VEGF ekspresyonunun regülasyonu, transkripsiyon, translasyon ve posttranslasyon seviyesinde düzenlenir. Transkripsiyonel düzeyde VEGF regülasyonu çok iyi çalışılmış ve VEGF geni promotör bölgesinin özellikleri sekans analizleri ile aydınlatılmıştır. Promotör bölgeye bağlanan, spesifik protein-1 (Sp-1), hipoksi ile indüklenen faktör-1 (HIF-1), sinyal ileten ve aktivatör transkripsiyon faktör-3 (Stat-3), aktivatör protein-1 (AP-1), aktivatör protein-2 (AP-2) gibi birçok transkripsiyon faktörü bulunmaktadır. Bu çok sayıdaki transkripsiyon faktörleri, VEGF regülasyonunun kompleksliğine işaret etmektedir.

Tümör hücreleri, VEGF transkripsiyonunu etkileyen regülatör proteinlerle yapısal VEGF eksprese ederken diğer yandan VEGF ekspresyonu hipoksi, asidoz, oksidatif stres, regülasyon düzenleri bozulmuş çeşitli büyüme faktörü ve sitokinleri kapsayan tümör mikroçevre koşullarından etkilenerek indüklenebilir. VEGF ekspresyon regülasyonunun düzenlenmesinde görevli sinyal ileti yolakları Şekil 9’da gösterilmektedir (4, 40).

Şekil 8: VEGF reseptörleri ve etki mekanizmaları

Sitokinler Reseptörler

Tirozin Kinaz Reseptörleri

Tirozin Kinaz2

Dimerizasyon bölgesi

Tirozin Kinaz1

Sinyal İleti Yolakları

Şekil 9: VEGF ekspresyonunun regülasyonu

2.5. TÜMÖR HÜCRE İNVAZYONU VE METASTAZ OLUŞUMU

Malign tümör gelişimi kompleks ve çok aşamalı bir süreçtir. Tümör hücrelerinin invazyonu bazal membran bütünlüğünün bozulmasıyla başlayan 3 aşamada gelişir. İlk olarak neoplastik hücreler bazal membran üzerinde bir araya gelirler, bazal membran bütünlüğünü bozan proteolitik enzimler üretirler ve bazal membrandan geçerek komşu stromal bağ dokusuna doğru yayılırlar (Şekil 10). Bu aşamalar tümör gelişimi ve yayılması süresince defalarca tekrarlanır. Tümör hücreleri kan ve lenf dolaşımına girerek bulunduğu yerden diğer

Tirozin kinaz reseptörleri

Stres ROS/RNS UV Hipoksi Asidoz Stres ROS/RNS UV Hipoksi Asidoz Sitokinler IL-6 IL-18 IL-15 Tümör Biyolojisi Canlılık Büyüme Anjiogenez Metastaz

organlara da yerleşirler. Tümör büyümesi için anjiogenez zorunlu bir basamaktır. Anjiogenez, ESM’nin yeniden modellenmesini gerektiren bir süreçtir (41).

Şekil 10: Tümör hücre invazyonu ve metastazı

2.5.1. TÜMÖR-STROMA ETKİLEŞİMİ VE MMP’LERİN SEKRESYONU

Tümör hücrelerinin gelişimi ve ilerlemesi hem tümör hücresine hem de tümör hücresinin diğer komşu hücreler (fibroblast, inflamatuar hücreler vb) ile olan etkileşimine

1. Epitele yerleşmiş primer tümör 2. Bazal membranın yıkılması ile tümör komşu stromal dokulara yayılır ve anjiogenez indüklenir. 3. Tümör hücresi kan ve lenfatik damarlara penetre olur ve dolaşıma katılır. 4. Tümör hücreleri hedef dokularda kapiller duvarlara tutunur. 5. Tümör hücreleri normal dokulara yayılır. 6. Tümör hücreleri hedef dokularda metastaz oluşturmak için çoğalırlar ve anjiogenez indüklenir.

Lökosit göçü ve aktivasyonu

Migrasyon İnvazyon Canlılık Proliferasyon Fibroblast aktivasyonu ve göçü MMP sekresyonu _Kontakt bağımlı sinyal değişimi Sitokinler Tümör hücresi Yeniden modellenme İnflamasyon Endotelyal hücre proliferasyonu

bağlıdır. Stromal hücreler ile tümör hücreleri arasındaki etkileşimin tümör invazyonu ve metastazı için çok önemli olduğu bilinmektedir. Tümör hücreleri, salgıladıkları faktörler, hücre-hücre veya hücre-matriks iletişimi ile bulunduğu mikroçevre ile etkileşim içindedirler. Tümör hücrelerinden kemotaktik faktörlerin salınımı, mikroçevrede bulunan inflamatuar hücrelerin tümör bölgesine gelmesini ve bu bölgede makrofaj ve monosit gibi inflamatuar hücrelerden salınan büyüme faktörü ve sitokinlerin artışına yol açmaktadır. İnflamatuar hücrelerden salgılanan sitokinler de stromal hücrelerden ESM’yi yıkan proteaz salınımını indüklerler (16, 42) (Şekil 11). Aşırı MMP ekspresyonu ile ilişkili kanser gelişiminin aynı zamanda kalıcı bir inflamasyon gelişimiyle de ilişkili olduğunu gösteren birçok çalışma mevcuttur. Böylece bir tümör hücresinin temel ilkesi, konakçının olanaklarını kullanarak kendi metabolizmasını daha ekonomik hale getirmek olur (43).

2.6. KOLOREKTAL KANSER

4/5’i kolonda 1/5’i rektumda meydana gelen kolorektal kanserler; başta endüstriyel batı toplumları olmak üzere, dünya genelinde akciğer, meme ve prostat kanserlerinden sonra en sık görülen kanserdir. Kanserden ölümler sıralamasında ise kolorektal kanser nedeniyle ölümler ikinci sırada yer almaktadır. Görülme yaşına bakıldığında, 50 yaş ve üzeri bireylerde, kolorektal kanser gelişim riski, gençlere göre anlamlı bir şekilde yüksektir. Diyetsel risk faktörleri arasında ise kolonda anaerobik fekal floranın baskın üremesi için zemin hazırlayan sığır etinin ve hayvansal yağların aşırı tüketimi önemlidir. Anaerop mikroorganizmalar, kolonda yağ asitlerinin ve safra asitlerinin etki düzeyini arttırmaktadırlar. Bu maddeler, hem kolon mukozasına zarar vermekte hem de diğer zararlı bileşiklerin kolon mukozası üzerindeki etkilerini güçlendirmektedirler. A, C ve E vitaminlerinden yoksun beslenme de bir diğer diyetsel risk faktörüdür. Ailesel risk açısından değerlendirmelerde ise kolorektal karsinomlu hastaların, birinci dereceden akrabalarındaki kolorektal kanser gelişim riski, kontrol gruplarıyla karşılaştırıldığında, üç kat artmış olarak bulunmaktadır (44)

2.6.1 KOLOREKTAL KARSİNOMLARIN EVRELENDİRİLMESİ

Kolorektal kanserlerin evrelendirilmesinde; tümör büyüklüğü, yerleşimi, basit, kompleks ya da tübül yapısı, invazyon derinliği, lenf düğümü ve uzak organ metastazı, tümör yayılım şekli, peritona yayılım, lenfositik infiltrasyon, venöz ya da lenfatik invazyon, fibrosis miktarı ve cerrahi çıkarılabilirlik dikkate alınan kriterler arasındadır. Bu kriterlerden tümör yayılım şekli, venöz ve lenfatik invazyon ile lenfositik infiltrasyon klinik gidişi direkt olarak etkileyen faktörlerdir. Karaciğer, kolorektal karsinom hücrelerinin kan yoluyla metastazının ilk hedefidir. Akciğer, beyin ve kemik iliği ise diğer metastaz odakları arasındadır.

Kolorektal kanserlerin evrelendirilmesinde kullanılan Dukes Evrelendirmesi yaklaşık 70 yıl önce tanımlanmış olup, halen klinik uygulamalarda kullanılmaktadır. 1986 yılında ise Hutter ve Sobin “Universal Staging System for Cancer of Colon and Rectum” adlı evrelendirme sistemini ileri sürdüler. Bu sisteme göre Dukes evreleri, klinik ve patolojide yaygın olarak kullanılan “Tumour, Node, Metastasis (TNM)” sistemine adapte edilerek güncellenmiştir (Tablo 2). Ancak klinik uygulamada TNM evrelendirme sistemi, diğer kanser tiplerinde olduğu gibi daha yaygın olarak kullanılmaktadır (45, 46) (Tablo 3).