Klimik Dergisi • Cilt 18, Say›:1 • 2005, s:30-33 30
Girifl
‹nsan normal floras›nda yo¤un olarak bulunan koagülaz-negatif stafilokoklar (KNS) s›kl›kla, morbidite ve mortaliteyle seyreden hastane infeksiyonlar oluflturmaktad›r (1,2). KNS, özellikle kateter, protez inplant, kalp kapak protezleri, hemo-diyaliz ve serebrospinal flant gibi inplante edilmifl t›bbi cihaz-lar›n infeksiyoncihaz-lar›nda en s›k sorumlu olan bakterilerdir (1-3). Buna ek olarak, altta yatan ciddi hastal›¤› olan ve immünosüp-rese hastalarda da en s›k izole edilen etken olarak karfl›m›za ç›kmaktad›r (4).
Stafilokoklar›n biyomateryallerde nas›l infeksiyon olufltur-duklar›n›n patojenik mekanizmalar› uzun y›llard›r araflt›r›l-maktad›r (5,6). Son y›llarda yap›lan çal›flmalarda KNS’nin inert materyallere aderans›n›n bafllang›ç basama¤›nda polisa-karid tabiat›ndaki “slime” yap›s›n›n önemli bir rol oynad›¤› gösterilmifltir (1,6,7). Bunun d›fl›nda “slime” yap›n›n bakteri fagositozunu zorlaflt›rd›¤› ve özellikle glikopeptid gibi makro-molekül antibiyotiklere direnci art›rd›¤› bildirilmifltir (8-11).
Her ne kadar “slime” yap›s›nda glikoproteinlerin, pepti-doglikanlar›n ve polisakaridlerin bulundu¤u tespit edilmiflse de
“Slime” Oluflumu ve Bunun Rol Oynad›¤› Bakteri
Aderans›nda Muhtemel Anahtar Molekül: Siyalik Asid
Serhan Sakarya
1, Serkan Öncü
1, Selcen Öncü
2, Barç›n Öztürk
1, Günay Tuncer- Ertem
3,
Cavide Sar›
4(1) Adnan Menderes Üniversitesi, T›p Fakültesi, ‹nfeksiyon Hastal›klar› ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dal›, Ayd›n (2) Adnan Menderes Üniversitesi, Bilim Teknoloji Araflt›rma ve
Uygulama Merkezi, Ayd›n
(3) Ankara E¤itim ve Araflt›rma Hastanesi, ‹nfeksiyon Hastal›klar› ve Klinik Mikrobiyoloji Klini¤i, Cebeci-Ankara
(4) Adnan Menderes Üniversitesi, T›p Fakültesi, Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dal›, Ayd›n
kesin kimyasal yap›s› halen aç›klanamam›flt›r (12). Di¤er yan-dan “slime”’›n karbonhidrat yap›s›n›n bakteri aderans›nda önemli rol oynad›¤› tespit edilmifltir (13,14).
Siyalik asid, mikroorganizmalar, vertebral›lar ve memeli-lerin dokular›nda yap›sal olarak bulunan bir karbonhidratt›r. Bu fleker canl› hücrelerinde glikokonjugatlar olarak bulunup, hücre yüzeyinde negatif elektrik flarj› sa¤lar. Ökaryot hücre yüzeyindeki siyalik asid hücreler aras› iliflkide önemli determi-nant olup siyalasyonun biyolojik sistemlerde düzenleyici bir etkisi vard›r. Membranla iliflkili olarak bulunan siyalik asidin hücre deformabilitesi, aderans› ve motilitesi gibi önemli özel-likleri üzerinde belirleyici etkisinin oldu¤u bilinmektedir (15-17). Siyalik asidin hücre yüzeyindeki miktar› nöraminidaz ve siyalotransferaz enzimleri arac›l›¤›yla ayarlanmaktad›r.
Biz, halen tam olarak yap›s› belirlenememifl “slime”›n bakteriye kazand›rd›¤› özellikler göz önüne al›nd›¤›nda yap›-s›ndaki siyalik asidin fonksiyonel bir molekül olabilece¤ini düflündük. Bu hipotezimizi kan›tlamak için siyalik asidin KNS’de in vitro “slime” üretimi ve bakteri aderans›ndaki rolünü araflt›rd›k.
Yöntemler
Bakteri sufllar›: Çal›flmada kateter infeksiyonu olan hasta-lardan izole edilen KNS kullan›ld›. ‹zolatlar›n idantifikasyonu Gram boyamas›, katalaz reaksiyonu, tüp koagülasyon testi gibi klasik yöntemlerle yap›ld›.
Kantitatif biyofilm (“slime”) oluflturma deneyi: ‹zole edi-len KNS “slime” oluflturup oluflturmad›klar› daha önce O’To-oler (18) taraf›ndan bildirilen teknik kullan›larak araflt›r›ld›. Özet: “Slime” oluflturan koagülaz-negatif stafilokoklar›n siyalik asid içeri¤inin, “slime” oluflumu ve kateter, protez gibi inplante edilmifl materyallere aderans›ndaki rolü in vitro olarak çal›fl›ld›. Bakterinin düzgün sentetik yüzeylere aderans› ve “slime” oluflturma miktar›, bakteri artan dozlarda Clostridium perfringens’ten elde edilmifl nöraminidaz ile muamele edile-rek kantitatif yöntemlerle belirlendi. “Slime” oluflturan koagülaz-negatif bakterilerin stafilokoklar›n nöraminidaz ile 100 mU/ml ve üzerindeki dozlarda muamelesi sonucu doza ba¤›ml› olarak azald›¤› görüldü (p<0.001). Bu bulgular, siyalik asidin “slime” yap›s›nda bulundu¤unu ve bakterinin inert yüzeylere aderans›nda rol oynad›¤›n› göstermektedir.
Anahtar Sözcükler: Bakteri aderans›, siyalik asid, nöraminidaz, slime, koagülaz-negatif stafilokoklar.
Summary: Sialic acid, probable key molecule for slime formation and its role on bacterial adherence. The role of sialic acid on slime formation and adherence of slime-forming coagulase-negative staphylococci to inert surface were studied in vitro. The quantitative biofilm assay and bacterial adherence to smooth surfaces were performed with increasing concentrations of ne-uraminidase extracted from Clostridium perfringens treated bacteria. Slime production of slime-forming coagulase-negative staphylococci at (100 mU/ml (p<0.001) decreased with further dose-dependent decrement at 300 mU/ml. These results indicate that, sialic acid is a constituent molecule of the slime and involved in bacterial adherence to inert surface.
%0.25 glikozlu triptik soya buyyonunda (TSB) 37°C’de bir ge-ce üretilen KNS, tekrar %0.25 glikozlu TSB’ye 1/40 oran›nda ekim yap›ld›ktan sonra steril 96’l›k U tabanl› plaklar›n her bir kuyucu¤una 200 µl eklenerek 37°C’de 48 saat inkübe edildi. ‹n-kübasyon sonras›nda plaklar boflalt›larak fosfat tamponlu salin ile nazikçe üç kez y›kan›p plaklar ters pozisyonda kurumaya b›-rak›ld›. Kuruyan plaklara 200µl %1’lik kristal viyole eklenerek 15 dakika boyanmas› için beklendikten sonra tekrar üç kez y›-kand›. Kuyucuklar içinde kalan kristal viyole, etanol-aseton (80:20) ile çözülerek kuyucuklar 595 nm’de ELISA mikro plaka
Klimik Dergisi • Cilt 18, Say›:1 31
medium NANase 10NANase 30NANase 100NANase 300
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 kontrol 10 30 100 300 NANaz (mU/ml) * *
Slime miktarı (Abs)
medium NANase 10NANase 30NANase 100NANase 300
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 Kontrol 10 30 100 300 NANaz (mU/ml)
Slime miktarı (Abs)
A B
Kontrol NANaz NANaz-SA
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75
*
*
Slime miktari (Abs)
fiekil 1. NANaz’›n (A) “slime” oluflturan ve (B) “slime” oluflturmayan KNS’de “slime” oluflumu üzerine etkisi. Siyah sütunlar ortalama ± (SE) “slime” oluflumuna NANaz muamelesinin etkisini, beyaz sütunlar da kontrol gruplar›n› göstermektedir. *NANaz ile muamele edilmemifl KNS (beyaz sütun) ile karfl›laflt›r›ld›¤›nda anlaml› bir düflüfl oldu¤unu göstermektedir (p<0.001).
fiekil 2. Her bir sütun “slime” oluflturan KNS’nin 300 mU/ml NANaz (siyah sütun), NANaz (300 mU/ml) ile birlikte N-asetilnöraminik asid (SA) (800 µg/ml) (yat›k çizgili sütun) ve kontrol grubunun ortalama ± (SE) absorbans de¤erlerini göstermektedir.
*Kontrol grubuyla (beyaz sütun) karfl›laflt›r›ld›¤›nda anlaml› bir düflüflün oldu¤unu (p<0.001); **NANaz ile muamele edilmifl grupla karfl›laflt›r›ld›¤›nda anlaml› bir art›fl oldu¤unu göstermektedir (p<0.01)
okuyucuda (Bio-tek, Biotech) oku-narak absorbans de¤erleri saptan-d›.
Nöraminidaz›n “slime” oluflu-muna etkisi: “Slime”-pozitif KNS izolatlar› %0.25 glikozlu TSB ile bir gece 37ºC’de inkübe edildi. %0.25 glikozlu TSB besiyerinde 1/40 oran›nda haz›rlana bakteri so-lüsyonuna, [1] artan dozlarda (10, 30,100,300 mU/ ml) Clostridium perfringens’ten izole edilmifl nöra-minidaz (NANaz; Sigma), [2] NA-Naz ile birlikte N-asetil nöraminik asid (Sigma) ve [3] sadece besiye-rinden oluflan kontrol gruplar›, ste-ril 96’l›k U tabanl› plaklar›n her bir kuyucu¤una 200 µl eklenip kantitatif biyofilm oluflturma dene-yi yap›ld›. Her bir deney üç kez ve her bir örnek için üç kuyucuk kul-lanarak yap›ld›
‹statistik metod. Deney ve kontrol gruplar›n›n sonuçlar›n›n ortalamalar› ANOVA testi kullan›larak karfl›laflt›r›ld› ve p de-¤eri <0.05 olanlar anlaml› kabul edildi.
Sonuçlar
NANaz’›n “slime” oluflumuna etkisi: “Slime” oluflturan KNS, NANaz ile (100 mU/ml (p<0.001) ve üzerindeki kon-santrasyonlarda muamelesi sonucu “slime” oluflumunda doza ba¤›ml› bir düflüfl oldu¤u tespit edildi (fiekil 1a). Slime olufltur-mayan KNS grubunda, kontrol ve NANaz ile muamele edilen gruplarda absorbans de¤erlerinde bir farkl›l›k olmad›¤› tespit edildi (fiekil 1b).
Slime oluflturan KNS’nin “slime” üretimleri üzerine NA-Naz aktivitesini belirlemek için, 300 mU/ml NANA-Naz aktivite-sini bloke eden N-asetilnöraminik asid (800 µg/ml) ile 0.5 saat, 37°C’de inkübe edilerek, yukarda aç›klanan kantitatif biyofilm oluflturma deneyi yap›ld›. Çal›flma sonunda NANaz aktivitesi-nin “slime” oluflumu üzerine etkisiaktivitesi-nin N-asetilnöraminik asid ile muamelesi sonras›nda azald›¤› görüldü (p<0.01) (fiekil 2).
‹rdeleme
Bakteri yüzey yap›lar› aderans ve virülansta en önemli be-lirleyicilerdir. Bakteri hücresinin biyomateryallere iliflkisinde, çevresel koflullar ve hem materyalin hem de bakterinin yüzey yap›s›na göre birtak›m mekanizmalar rol oynamaktad›r. “Sli-me” bir k›s›m bakterinin özgün olmayan aderans›nda önemli yap›lardan biridir. Biz bu çal›flmada, bakteri yüzeyindeki siyalik asidin uzaklaflt›r›lmas›yla “slime” üreten KNS’nin “slime” üretiminde azalma oldu¤unu gösterdik.
Bakteri d›fl polisakarid yap›lar› “slime” yap›s›n›n ana bir-leflenlerindendir (19). Konunun otörleri taraf›ndan “slime”, il-gili bakteri hücresinin kendisinin üretti¤i polimerik matriks olarak tan›mlanm›flt›r (20-22). Birçok türde “slime” anyonik tabiatta olup çevredeki kullan›lmayan esansiyel mineral ve be-sin maddelerini toplayan bir sistem de oluflturmaktad›r (20,22). Temelde “slime”, bakterinin yüzey ba¤lant›s›n›
çevre-leyen, kuvvetlendiren ve koruyan üç boyutlu çekim alan› olufl-turur. Bakteri ile inorganik materyaller aras›ndaki adezyon nonspesifik etkileflim ile olmaktayken canl› yap›larla adezyo-nu spesifik (adezin, ligand, lektin vs.) etkileflim ile olmaktad›r (20). Mikroorganizma inorganik maddelere kritik yak›nl›¤a eriflti¤inde (genellikle 1 nm) adezyonun en son belirleyicisi her iki yüzeyin oluflturdu¤u itici ve çekici güçlerin net toplam› be-lirler. Bu güçleri, elektrostatik ve hidrofobik iliflki, van der Waals, ›s› ve hidrodinamik güçler oluflturmaktad›r (6).
Birçok bakterinin aderans›nda karbonhidratlar yegane hedef moleküller olup, bunlardan siyalik asid spesifik ve nonspesifik aderans›n düzenlenmesinde rol oynayan reseptör, ligand ve adezinlerde yo¤un olarak bulundu¤u gösterilmifltir (23-28).
Her ne kadar, “slime”›n glikoproteinler, peptidoglikanlar ve polisakaridlerden olufltu¤una ait bilgiler varsa da, kimyasal yap›s› halen tam olarak belirlenememifltir. Hücre yüzeyinde glikokonjugatlar olarak bulunan siyalik asidin, hücre yüzeyine negatif elektrik yük sa¤lamas› ve membrana ba¤l› bulunan si-yalik asid miktar›n›n hücre deformabilite, aderans ve motilite-sini düzenleme gibi özellikleri, siyalik asidin, “slime”’in yap›-s›nda yer alabilece¤ini kuvvetle düflündürmektedir.
Bu çal›flmada “slime” oluflturan KNS’de artan dozlardaki NANaz ile muamele sonucu “slime” oluflumunun azalmas›, NANaz’›n bu aktivitesinin bir farmakolojik blokan› olan N-asetilnöraminik asid ile bloke edilebilmesi, yap›s› net olarak belirlenememifl “slime”in oluflumunda, siyalik asidin önemli rol oynayabilece¤ini kuvvetle göstermektedir.
Tojo ve arkadafllar› (14) S. epidermidis’in inorganik yüzey-lere adezyonunda rol oynayan galaktozdan zengin kapsül poli-sakaridini (CPA veya PS/A) izole ettiler. Christensen ve arka-dafllar› (13) proteaz ve ›s›ya dayan›kl› olan ve CPA’dan farkl› olan glikozdan zengin ekstraselüler “slime” ile iliflkili antijeni (SAA) izole ettiler. CPA ve SAA-pozitif ve SAA-negatif S. epi-dermidis sufllar›yla yap›lan çal›flmalarda, CPA primer adezyonu sa¤larken, SAA’n›n da yüzeydeki birikmeyi art›r›c› (örne¤in “slime” oluflmas›n›) rolünün oldu¤u tespit edilmifltir (13,14). Bunun yan›nda, hücre yüzeyinde bulunan siyalik asidlerin bü-yük bir k›sm›n›n oligosakaridlere a -glikozidik ba¤larla ba¤l› ol-du¤u gösterilmifltir. Glikoz ve galaktoz siyalik aside en s›k ba¤-lanan sakaridler olup ba¤lanmay› a (2Æ 3) ve a (2Æ 6) ba¤lar›y-la oluflturmaktad›r (29). Çal›flmada kulba¤lar›y-land›¤›m›z C. perfrin-gens’ten izole edilen NANaz çoktan aza do¤ru s›ralayacak olur-sak siyalik asidin a (2Æ 3), a (2Æ 6) ve a (2Æ 8) ba¤lar›n› k›r-maktad›r. Biz, bakteri hücre yüzeyinde galaktoz ve glikoz ile ba¤lanm›fl siyalik asidin, klostridiyal NANaz ile muamele sonu-cu uzaklaflt›r›lmas›n›n, CPA ve SAA fonksiyonlar›n› da bozabi-lece¤ini ve bu mekanizmayla “slime” oluflumunun ve bakterinin inorganik yüzeylere aderans›n›n azald›¤›n› düflünmekteyiz.
Sonuç olarak, “slime” oluflturan KNS’de “slime” oluflumu ve bakteri aderans› NANaz muamelesi ile azalmaktad›r. Bu da siyalik asidin “slime”in yap›s›nda yer ald›¤›n› ve “slime” olu-flumu d›fl›nda bakterinin aderans›nda da anahtar molekül olabi-lece¤ini göstermektedir.
Bu çal›flma Adnan Menderes Üniversitesi MARL-02002 no.’lu araflt›rma proje deste¤i ile yap›lm›flt›r.
Kaynaklar
1. Kloos WE, Bannerman TL. Update on clinical significance of co-agulase-negative staphylococci. Clin Microbiol Rev 1994; 7: 117-40
2. Huebner J, and Goldmann DA. Coagulase-negative staphylococci: role as pathogens. Annu Rev Med 1999; 50: 223-36
3. Rupp ME, Archer GL. Coagulase-negative staphylococci: patho-gens associated with medical progress. Clin Infect Dis 1994; 19: 231-43
4. Meskin I. Staphylococcus epidermidis. Pediatr Rev 1998; 19: 105-6 5. Foster TJ, McDevitt D. Molecular basis of adherence of staphylo-cocci to biomaterials. In: Bisno AL, Waldvogel FA, eds. Infection Associated with Indwelling Medical Devices. Second ed. Washing-ton, DC: ASM Press, 1994: 31-44
6. An YH, Friedman RJ. Concise review of mechanisms of bacterial adhesion to biomaterial surfaces. J Biomed Mater Res 1998; 43: 338-48
7. Vaudaux P, Yasuda H, Velazco MI, Huggler E, Ratti I, Waldvogel FA, Lew DP. Proctor RA. Role of host bacterial factors in modu-lating staphylococcal adhesion to implanted polymer surfaces. J Bi-omater Appl 1990; 5: 134-53
8. Boussard P, Pithsy A, Devleeschouwer MJ. Relationship between slime production, antibiotic sensitivity and the phage type of coagu-lase-negative staphylococci. J Clin Pharm Ther 1993; 18: 271-4 9. Gray ED, Peters G, Verstegen M, Regelmann WE. Effect of
extra-cellular slime substance from Staphylococcus epidermidis on the human cellular immune response. Lancet 1984; 1: 365-7
10. Ohshima Y, Schumacher-Perdreau F, Peters G, Quie PG, Pulverer G Antiphagocytic effect of the capsule of Staphylococcus simulans. Infect Immun 1990; 58:1350-4
11. Souli M, Giamarellou H. Effects of slime produced by clinical iso-lates of coagulase-negative staphylococci on activities of various antimicrobial agents. Antimicrob Agents Chemother 1998; 42: 939-41 12. Karamanos NK, Panagiotopoulou HS, Syrokou A, Frangides C, Hjerpe A, Dimitracopoulos G, Anastassiou ED. Identity of macro-molecules present in the extracellular slime layer of Staphylococcus epidermidis. Biochimie 1995; 77: 217-24
13. Christensen GD, Barker LP, Mawhinney TP, Baddour LM, Simp-son WA. Identification of an antigenic marker of slime production for Staphylococcus epidermidis. Infect Immun 1990; 58: 2906-11 14. Tojo M, Yamashita N, Goldmann DA, Pier GB. Isolation and
cha-racterization of a capsular polysaccharide adhesin from Staphylo-coccus epidermidis. J Infect Dis 1988; 157: 713-22
15. Cross AS, Wright DG. Mobilization of sialidase from intracellular stores to the surface of human neutrophils and its role in stimulated adhesion responses of these cells. J Clin Invest 1991; 88: 2067-76 16. Lichtman MA, Weed RI. Alteration of the cell periphery during
granulocyte maturation: relationship to cell function. Blood 1972; 39: 301-16
17. Lichtman MA, Weed RI. Cellular deformability of normal and le-ukemic hematopoietic cells: a determinant of marrow and vascular egress. In: Weiss L, ed. Fundamental Aspects of Metastasis. Ams-terdam: North-Holland, 1976: 319-25
18. O’Toole GA, Kolter R. Initiation of biofilm formation in Pseudo-monas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent sig-nalling pathways: a genetic analysis. Mol Microbiol 1998; 28: 449-61 19. Barding MG, Jass J, Lappin-Scott HM. Dynamics of bacterial bi-ofilm formation. In: Lappin-Scott HM, ed. Microbial Bibi-ofilms. New York, NY: Cambridge University Press, 1995: 46-63
20. Carpentier B, Cerf O. Biofilms and their consequences, with parti-cular reference to hygiene in the food industry. J Appl Bacteriol 1993; 75: 499-511
21. Elder MJ, Stapleton F, Evans E, Dart JK. Biofilm-related infections in ophthalmology. Eye 1995; 9(Pt 1): 102-9
22. Costerton JW, Stewart PS, Greenberg EP. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science 1999; 284: 1318-22 23. Burnette-Curley D, Wells V, Viscount H, Munro CL, Fenno JC, Fi-ves-Taylor P, Macrina FL. FimA, a major virulence factor associ-ated with Streptococcus parasanguis endocarditis. Infect Immun 1995; 63: 4669-74
24. Demuth DR, Duan Y, Brooks W, Holmes AR, McNab R, Jenkin-son HF. Tandem genes encode cell-surface polypeptides SspA and SspB which mediate adhesion of the oral bacterium Streptococcus gordonii to human and bacterial receptors. Mol Microbiol 1996; 20: 403-13
25. Ilver D, Arnqvist A, Ogren J, Frick IM, Kersulyte D, Incecik ET, Klimik Dergisi • Cilt 18, Say›:1 32
Berg DE, Covacci A, Engstrand L, Boren T. Helicobacter pylori adhesin binding fucosylated histo-blood group antigens revealed by retagging. Science 1998; 279: 373-7
26. Hultgren SJ, Abraham S, Caparon M, Falk P, St Geme JW 3rd, Normark S. Pilus and nonpilus bacterial adhesins: assembly and function in cell recognition. Cell 1993; 73: 887-901
27. St Geme JW 3rd, Cutter D. Influence of pili, fibrils, and capsule on
in vitro adherence by Haemophilus influenzae type b. Mol Microbiol 1996; 21: 21-31
28. Sakarya S, Ertem GT, Oncu S, Kocak I, Erol N. Escherichia coli bind to urinary bladder epithelium through nonspecific sialic acid mediated adherence. FEMS Immunol Med Microbiol 2003; 39: 45-50 29. Schauer R Chemistry, metabolism, and biological functions of
si-alic acids. Adv Carbohydr Chem Biochem 1982; 40: 131-234
