17
Türkiye’deki Farkl› Bölgelerden ‹zole Edilen Likenlerin
Antimikrobiyal Aktiviteleri
Özlem OSMANA⁄AO⁄LU (*), Atilla YILDIZ (**), Sefa C. SAÇILIK (*)
ÖZET
Bu çal›flmada farkl› bölgelerden toplanan Letaria vulpina, Pseudoevernia furfuraceae var. furfuraceae ve Evernia divericata liken örneklerinden elde edilen aseton ve kloroform ekstraktlar›n›n pozitif çomaklar, Gram-pozitif koklar, Gram-negatif çomaklar ile Candida albicans üzerindeki antimikrobiyal aktivitesi araflt›r›lm›flt›r. Gerek aseton gerekse kloroform ile haz›rlanan ekstraktlarda Gram-pozitif kok ve çomaklara karfl› inhibitör etki elde edilirken, Gram-negatif çomaklar ve Candida albicans’a karfl› herhangi bir aktivite gözlenmemifltir. Çal›flmam›zda disklere emdirilen farkl› ekstrakt dozlar› ile zon çaplar›ndaki art›fl oranlar› aras›nda herhangi bir korelasyon kurulamaz iken, ekstraksiyon için kloroform yerine aseton kullan›lmas› durumunda inhibitör aktivetinin göstergesi olan zonlar›n daha büyük çaplarda elde edilebilece¤i gözlemlenmifltir.
Anahtar kelimeler: Likenler, antimikrobiyal aktivite
SUMMARY
Antimicrobial Activity of Lichens Collected from Different Regions of Turkey
In this study, the antimicrobial activity of acetone and chloroform extracts of lichens, such as Letaria vulpina, Pseudoevernia furfuraceae var. furfuracae and Evernia divericata were tested against different Gram-pozitif cocci and bacilli, Gram-negative bacilli as well as the yeast, Candida albicans. The lichen extractions prepared by both acetone and chloroform showed inhibitory activity against Gram-positive cocci and bacilli. However, no such activity was observed against Gram-negative bacilli and Candida albicans. There is no correlation between different extract concentrations absorbed to discs and increments in zone diameters. The diameter of inhibitory zones were found to be larger when acetone is used instead of chloroform in extraction procedure.
Keywords: Lichens, antimicrobial activity
Türk Mikrobiyol Cem Derg 30: 17-19
G‹R‹fi
Liken metabolitlerinin de¤iflik mikroorganizmalar, mayalar ve algler üzerine antagonist (antibiyotik) etki gösterdi¤i uzun y›llardan beri bilinmektedir (1), Denenen liken örneklerinin %50’sinden fazlas›n›n antibiyotik etki gösterdi¤i, en etkili maddelerin ise usnik asitler, pulvunik asit türevleri (örne¤in vulpinik asit) ve alifatik asitler oldu¤u ve bu maddelerin de özellikle Gram-pozitif bakterilere ve baz› funguslara antagonist aktivete gösterdi¤i bildirilmifltir (2). Bunlara ilaveten likenlerin antiherbivor(3, 4) ve antitümör (5) aktivete göstermeleri de di¤er önemli özelliklerdendir. Ülkemizde liken floras›na yönelik çal›flmalar›n say›s› gün geçtikçe artamas›na karfl›l›k, likenlerin
kimyas› veya mikrobiyolojisi ile ilgili çal›flmalar çok az say›dad›r. Bu konuda yap›lan çal›flmalar aras›nda Cladonia foliacea (Huds) Willd’den kloratranorin izolasyonu (6), Evernia prunastri ve Ramalina farinacea (L.) AcH.’den elde edilen ekstrelerin Gram-pozitif bakterilere karfl› etkileri (7), Pseudovernia furufuracea (l.) Zopf var. Furufuracea’n›n antimikrobiyal etkisi (8), Türkiye’deki Hypogymnia (Nyl.) Nyl. cinsine ait türlerin kimyasal ve taksonomik de¤erlendirilmesi (9) ve likenlerde var olan primer ve sekonder maddelerin özellikleri ile ilgili çal›flmalar say›labilir. Bu çal›flmada Türkiye’deki de¤iflik bölgelerden toplanan letana vulpina, Pseudovernia furufuracea var. furufuracea ve Evernia divericata likenlerinden elde edilen aseton ve kloroform ekstraktlar›n›n farkl› mikroorganizmalar üzerine antogonist aktivitesinin araflt›r›lmas› amaçlanm›flt›r.
(*) Gazi Üniversitesi, Fen-Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümü, 06500, Teknikokullar, Ankara
(**) Ankara Üniversitesi, Fen Fakültesi, Biyoloji Bölümü, 06100, Tando¤an, Ankara
Türk Mikrobiyol Cem Derg 30:17-19
18
GEREÇ VE YÖNTEM
Çal›flmam›zda kullan›lan liken örnekleri 1995-1996 y›llar› aras›nda K›zlcahamam ve Çubuk ormanl›k alanlar›ndan toplanm›flt›r.
Ekstraktlar›n haz›rlanmas›: Kurutulan liken örneklerinden 0.1 g tart›larak, içerisinde 5 ml kloroform veya 5 ml aseton bulunan tüplere ilave edilmifl ve oda ›s›s›nda 20-25 dakika inkübe edilmifltir. Santrifüjde 15000 rpm’de çevrildikten sonra 0.45μm’lik membran filtreden (Sartorious) geçirilen ekstraktlardan 6 mm çap›ndaki steril ka¤›t disklere 50 μl, 75 μl ve 100 μl kloroform veya aseton ekstreleri emdirilmifltir. Kontrol diskler ise sadece ekstraktlar›n içerdi¤i oranlarda aseton veya kloroform ile muamele edilmifltir. Bütün diskler hava ak›m› yard›m› ile kurutulduktan sonra antibiyograma geçilmifltir.
Antibiyogram: Kirby-Bauer taraf›ndan önerilen disk-difüzyon yöntemine göre yap›lm›flt›r. (10). K›saca, Mueller-Hinton s›v› besiyerinde McFarland 0.5 bulan›kl›l›¤›na ayarlanan bakteri kültürlerinden steril eküvyonlar ile al›nan örnekler Mueller-Hinton kat› besiyerine inoküle edilmifltir. ‹nokülasyondan sonra ayn› test mikroorganizmas› için aseton, kloroform ekstreleri emdirilmifl diskler ve kontrol diskleri yerlefltirilmifltir. 37° C’de 1 gece inkübe edilen kültürlerdeki disklerin etraf›ndaki zon çaplar›
kaydedilmifltir. Denemeler üç tekrarl› yap›lm›flt›r. BULGULAR
Tablo 1’de de¤iflik liken örneklerinden elde edilen aseton ve kloroform ekstrerilerinin de¤iflik mikroorganizmalar üzerine gösterdi¤i inhibitör etki zon çaplar› olarak belirtilmifltir. Tabloda verilen de¤erler, üç kez tekrarlanan deney sonuçlar›n›n ortalamalar›d›r.
Çal›flmam›zda kullan›lan liken örneklerinden hiçbiri gerek Candida albicans gerekse Gram-negatif bakteriler üzerine antibakteriyel etki göstermemifltir. Test edilen Gram-negatif bakteriler flunlard›r: Shigalle flexneri (ATCC 12022), Salmonella typhimurium (ATCC 14028), Alcaligenes faecalis (ATCC 8750), Enterobacter aerogenes (klinik izolat), Escherichia coli (klinik izolat), P roteus vulgaris (ATCC) 6380), Aeromonas caviae (karkas izolat›), Klebsbiella pneumoniae (klinik izolat) ve Pseudomonas aeruginosa (klinik izolat)
Çal›flmam›zda disklere emdirilen ekstrakt dozu (50, 75 ve 100μl) art›fl› ile zon çap› büyüklü¤ü aras›nda herhangi bir korelasyon kurulamam›flt›r. Bunun aksine ekstraksiyon için kloroform yerine aseton kullan›lmas› durumunda daha genifl zon çaplar› elde edildi¤i gözlenmifltir (Tablo 1).
19 TARTIfiMA
Likenler taraf›ndan oluflturuldu¤u bilinen yaklafl›k 200 madde ya¤l› asitler ve laktonlar, zeorin grubu bileflikler, pulvik asit türevleri, kumaron türevleri, depsidler, depsidonlar ve antrokinon türevleri olmak üzere yedi grupta toplanmaktad›r (2, 11). Likenler taraf›ndan sentezlenen bu maddelerin likenlerde büyük oranda bulunmas› ve ayn› özellikteki maddelere di¤er bitki gruplar›nda rastlanmay›fl›, likenlere ayr› bir önem kazand›rmaktad›r (9). Likenlerin içerdi¤i ve antibiyotik etkisi tafl›yan bu kimyasal maddelerin çok yavafl geliflen likenleri do¤adaki mikroorganizmalara karfl› dirençli k›larak, do¤ada likenler için koruyucu bir rol tafl›d›¤› belirtilmektedir (2). Gerek flimdiki çal›flmam›zda gerekse daha önceden yap›lm›fl olan çal›flmalarda liken metabolitlerinin Gram-pozitif bakterilere karfl› antagonist aktivite gösterdi¤i saptanm›flt›r. Gram negatif bakterilerin bu metabolitlerden etkilenmemesinin ise, bu grup bakterilerin hidrofobik veya amfipatik moleküllere çok az geçirgen olan bir d›fl zar yap›s›na sahip olmas›ndan dolay› olabilece¤i daha önceki çal›flmalarda bildirilmifltir. (12, 13).
Bu çal›flmada aseton kullan›larak elde edilen liken ekstraktlar›n›n Gram-pozitif bakterilerle yap›lan deneylerde oluflan inhibisyon zon çaplar›, kloroform kullan›larak elde edilen zon çaplar›na oranla daha büyük bulunmufltur. Elde edilen bu bulgu ekstraksiyon ifllemi esnas›nda kloroform yerine aseton kullan›ld›¤›nda daha iyi neticeler al›nabilinece¤ini düflündürmektedir.
Araflt›rmam›zda kullan›lan Staphylococcus aureus ATCC 43300 metisiline dirençli bir sufltur. Metisiline dirençli S. aureus (MRSA) son 30 y›ld›r gerek nozokomiyal gerekse toplum kaynakl› infeksiyonlar aras›nda önemli ölçüde tehlike sinyalleri veren bir patojen olmufltur (14, 15). MRSA infeksiyonlar›n›n tedavisinde tek seçene¤in
vankomisin olmas›, yeni alternatifler aranmas› için temel bir nedendir. Di¤er çal›flmalara ek olarak araflt›rmam›zda incelenen 3 liken örne¤inin, klinik aç›dan oldukça önemli olan MRSA üzerinde de antagonist aktivite gösterdi¤inin saptanmas› dikkat çekici bir bulgudur.
KAYNAKLAR
1. Burkholder PR, Evans AW, Mcveigh I, Thornton HK: Antibiotic activity of lichens, Botany 30: 250 (1944). 2. Vartio KO: Antibiosis in Lichens. Academic Press, P 547, New york (1973).
3 Lawrey JD: Biology of Lichenized Fungi, New York, (1984).
4. Lawrey JD: Biological role of lichen substances, The Bryologist 89: 111-(1986).
5. Takai M, Ueraha Y, Beisler JA: Usnic acid derivatives as potential antineoplastic agents, J Med Chem 22: 1380 (1979).
6. Güven KC, Reisch J, Güvener B, Zeybek U: Cladonia Foliacaea (Huds.) Wildld’den metil B-orsinkarboksilat ve klaratranorin izolasyonu hakk›nda, ACTA Pharmaceutica Turcica 28: 61 (1991).
7.Tamer AÜ, Özdemir A, T ü re C: Likenlerin antimikrobiyal aktivitesi üzerine bir araflt›rma, Anadolu Üniv. Fen-Edebiyat Derg 3: 49 (1991).
8. Öztürk fi, Güvenç fi: Farkl› bölgelerden toplanan liken örne¤i Pseudevernia furfuracea (L.) Zopf var. furfuracea’nin antimikrobiyal etkisinin karfl›laflt›r›lmas›, Tr J Botany 19: 145 (1995)
9. Zeybek N: Likenler ve sanayide önemi, Anadolu Üniv. Eczac›l›k Fakültesi Yay›nlar› 1: 91 (1983).
10. Bauer AW, Kirby Wmn, Sherris JC, Tu rck M: Antibiotic susceptibility testing by a standartized simple disc method, Am J Clin Pathol 45: 493 (1966).
11. Jahns HM: Collins guide to the ferns, mosses and lichens of Britain and northern and central europe Collins Grafton Street, London (1980).
12. Davis BD, Dulbecco R, Eisen HN, Ginsberg HS: Microbiology, 3 rd ed. Philadelphia (1980).
13. Lawrey JD: Lichen secondary compounds: evidece for a correspondence between antiherbivore and antimicrobial function, The Bryologist 92: 326 (1989). 14. Barber M : Methicillin-resistant staphylococci, J Clin Pathol 14: 385 (1961).
15. Saravolata LD, Markowitz N, Arking L, Pohlod D, Fisher E : Methicillin resistant Staphylococcus aureus. Epidemic observations during a community-acquired outbrake, Am Intern Med 96: 11 (1982).
