192
Pamukkale Üniversitesi T›p Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dal› Denizli
Melek Demir, Nural Cevahir, ‹lknur Kaleli
‹letiflim / Correspondence: Melek Demir Adres / Address: Siteler M Barbaros C, Yenibahçelievler Sitesi C1 Blok No: 3 K›n›kl› 20100/Denizli Tel: 258 295 24 82 Fax: 258 294 24 33 E-mail: mdemir@pau.edu.tr
Investigation of the effect of subminimal inhibitory concentrations of
ciprofloxacin on the haemagglutination properties of
Escherichia coli strains
ÖZET
Bu çal›flmada siprofloksasinin subminimal inhibitör konsantrasyonlar›n›n (sub-M‹K) üropatojenik Escherichia coli (E.coli) sufl-lar›n›n hemaglütinasyon (HA) ve mannoza dirençli hemaglütinasyon (MRHA) özellikleri üzerine etkisi araflt›r›lm›flt›r. Çal›flmada dört E.coli suflu incelenmifltir. ‹ncelenen tüm E.coli sufllar›nda HA varl›¤› siprofloksasinin 1/2-1/16xM‹K konsantrasyonlar›nda pozitif olarak saptanm›flt›r. MRHA özelli¤i iki suflta 1/2xM‹K'de (+), di¤er konsantrasyonlarda (+++) ve di¤er iki suflta tüm sub M‹K'lerde (+++) olarak de¤erlendirilmifltir. Sonuçta, çal›flmaya dahil edilen tüm E.coli sufllar›nda siprofloksasinin sub M‹K’lar›nda HA ve MRHA özelliklerinin etkilenmedi¤i görülmüfltür.
Anahtar sözcükler:E.coli, MRHA, siprofloksasin, sub-M‹K SUMMARY
In this study, it was investigated the effect of subminimal inhibitory concentrations (sub-MIC) of ciprofloxacin on the haemagg-lutination (HA) and mannose-resistant haemagghaemagg-lutination (MRHA) properties of uropathogenic Escherichia coli (E.coli) strains. Four E.coli strains were included in this study. In 1/2-1/16xMICs of ciprofloxacin, HA properties of E.coli were found positive. In two strains, MRHA properties were found (+) positive in 1/2xMIC and (+++) positive in the other sub-MICs. In other two stra-ins MRHA was found (+++) positive in all MICs. It was concluded that HA and MRHA properties were continued in sub-MICs of ciprofloxacin in all E.coli strains included this study.
Key words: E.coli, MRHA, ciprofloxacin, sub-MIC
Siprofloksasinin sub-minimal inhibitör konsantrasyonlar›n›n
Escherichia coli sufllar›n›n hemaglutinasyon özellikleri
üzerine etkisinin araflt›r›lmas› (*)
Türk Mikrobiyol Cem Derg (2007) 37 (4) : 192-195
© 1993 Türk Mikrobiyoloji Cemiyeti / Turkish Microbiological Society ISSN 0258-2171
(*) Bu çal›flma XXXII. Türk Mikrobiyoloji Kongresi'nde (12-16 Eylül 2006 Antalya) sunulmufltur. G‹R‹fi
‹drar yolu infeksiyonlar› bakteriyel infeksiyonlar aras›nda en s›k rastlan›lan›d›r. Escherichia coli (E.coli) üriner infeksiyon etkenleri aras›nda gerek ayaktan gerekse yatan hastalarda en s›k soyutla-nan mikroorganizmad›r(1-3). E.coli sufllar› fimbri-yal yap›lar, hücre yüzey hidrofobisitesi, hemoli-zin, siderofor gibi çeflitli virulans faktörleri ile in-feksiyon oluflturur. Birçok inin-feksiyonun bafllang›-c›nda gerekli olan mikroorganizman›n konak hüc-reye tutunmas›d›r. Di¤er birçok virulans faktörü yan›nda fimbriyal yap›lar idrar yolu epiteline tu-tunma ve burada kolonize olup infeksiyon
yap-ma özellikleri nedeniyle önemlidir. E.coli suflla-r›nda mannoza duyarl› (MSHA) ve mannoza di-rençli hemaglütinasyon (MRHA) yapan fimbrilar gösterilmifltir (2). MRHA yapan fimbriyal ya-p›lardan en önemli olan› P fimbriyalard›r. Anti-bakteriyel maddelerin etkili¤ini, ilaç konsantras-yonu, ilac›n farmakodinamik özellikleri, kona¤›n özellikleri ve bakteriye ait virulans özellikleri be-lirlemektedir (4-7). Antibakteriyel maddelerin sub-minimal inhibitor konsantrasyonlar› (sub-M‹K) bakterilerin üremelerinin durdurulmas› üze-rine etkileri olmayan ancak halen bakterilerin çe-flitli biyokimyasal ve yüzey yap›lar› üzerine etki-lerinin oldu¤u konsantrasyon olarak
tan›mlanmak-193
tad›r. Antibiyotiklerin sub-M‹K'lerinin bakterilerin yüzeye tutunmalar›nda rol alan fimbriyal yap›lar, yüzey hidrofobisitesi, hareket, fagositoz gibi özel-likleri üzerine de¤ifltirici etkileri tan›mlanm›flt›r (4,8,9). Bu etkiler sonuçta virulans özelli¤inde azalmaya neden olabilmektedir.
Bu çal›flmada siprofloksasinin subminimal inhibi-tör konsantrasyonlar›n›n E.coli sufllar›n›n hemag-lütinasyon (HA) ve MRHA özellikleri üzerine et-kisinin araflt›r›lmas› amaçlanm›flt›r.
GEREÇ VE YÖNTEM
Çal›flmaya idrar kültüründen soyutlanm›fl, daha önceden E. coli olarak tan›mlanm›fl ve MRHA özellikleri pozitif olarak belirlenmifl olan dört kli-nik sufl dahil edilmifltir.
Hemaglütinasyon ve MRHA özelliklerinin belirlenmesi. Hemaglütinasyon için tüm sufllar›n kanl› agar ve Colonization factor antigen (CFA) agar besiyerlerindeki kolonileri kullan›lm›flt›r (7,8). CFA agar; %1 casamino asit, %0.15 yeast extract, %0.002 MgSO4, %0.005 MnCl2 ve %2
agar içerecek flekilde haz›rlanm›flt›r(9).
Sufllar›n 37 ºC'de bir gecelik inkübasyondan son-raki kültürlerinden fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde süspansiyonlar› (yo¤unluk yaklafl›k 109-1010 CFU/ml olacak flekilde) haz›rlanm›flt›r.
HA ve MRHA özelli¤i lam aglütinasyon yönte-mi ile araflt›r›lm›flt›r. Test için 0 grubu insan ka-n›ndan elde edilen eritrositlerin PBS içinde %3 oran›nda süspansiyonu haz›rlanm›flt›r. Ayr›ca %3 D-mannozlu ve D-mannozsuz PBS solüsyonlar› haz›rlanm›flt›r. Lam üzerinde bir damla (25µl) ha-z›rlanm›fl olan bakteri süspansiyonu ile bir dam-la eritrosit süspansiyonu kar›flt›r›lm›flt›r; buna bir damla mannozlu veya mannozsuz PBS eklenmifl ve oda s›cakl›¤›nda ve +4 ºC'de 5 dakika sonun-da aglütinasyon varl›¤› de¤erlendirilmifltir. Aglü-tinasyonun mannoz varl›¤›nda inhibe olmamas› durumunda MRHA pozitif olarak kabul edilmifl-tir. Bu ifllemler hem kanl› agar hem de CFA agarda üreyen koloniler ile yap›lm›flt›r.
Melek Demir, Nural Cevahir, ‹lknur Kaleli
Minimal inhibitör konsantrasyonun (M‹K) saptanmas›. Çal›flmaya al›nan flufllar›n kanl› agar-daki bir gecelik inkübasyondan sonraki taze kül-türlerinden bulan›kl›k 0.5 McFarland olacak fle-kilde süspansiyonlar› haz›rlanm›fl; daha sonra bu bakteri süspansiyonlar› son yo¤unlu¤u 106
CFU/ml olacak flekilde dilüe edilmifl ve M‹K araflt›rmas›nda bu yo¤unluklar› kullan›lm›flt›r (5). M‹K araflt›rmas› s›v› dilüsyon yöntemi ile, kat-yon-ayarl› Mueller-Hinton buyyon kullan›larak yap›ld›. Sonuçlar 37 ºC'de 18 saat inkübasyondan sonra de¤erlendirilmifltir (10).
Subminimal inhibitör konsantrasyonlarda MRHA araflt›r›lmas›. Bir gecelik inkübasyondan sonra M‹K de¤erleri belirlenmifl olan tüm suflla-r›n 1/2xM‹K, 1/4xM‹K, 1/8xM‹K ve 1/16xM‹K tüplerinden HA ve MRHA varl›¤› yukar›da aç›k-lanan yöntem ile araflt›r›lm›flt›r.
Hiç aglütinasyon gözlenmedi ise negatif, nasyon gözlendi ise; belirgin bir flekilde aglüti-nasyon oluflumundan zay›f bir aglütiaglüti-nasyon olu-flumuna göre (+++), (++), (+) pozitif fleklinde de-recelendirilerek yorumlanm›flt›r (5).
BULGULAR
‹ncelenen dört E.coli suflunun M‹K de¤erleri: 1, 0.5, 0.5 ve 0.125 mg/ml olarak belirlenmifltir. Sufllar›n tüm sub-M‹K de¤erlerinde HA ve MRHA özelli¤inin pozitif olarak devam etti¤i saptanm›flt›r. MRHA özelli¤i dört suflun ikisinde 1/2x M‹K' de (+), di¤er konsantrasyonlarda (+++) olarak yorumlanm›flt›r. Di¤er iki suflta tüm sub-M‹K'lerde (+++) de¤erlendirilmifltir. TARTIfiMA
E.coli sufllar›nda fimbriyal yap›lar üzerine pek çok çal›flma yap›lm›flt›r (5-7, 11-13). Özellikle pi-yelonefritli hastalardan soyutlanan sufllar›n önem-li bir k›sm›nda MRHA varl›¤› gösterilmifltir. An-tibiyotiklerin düflük dozlar›nda bakterilerin viru-lans özellikleri üzerine etkilerinin olup olmad›¤›, profilaktik tedavi protokollerinin düzenlenmesinde
194
Siprofloksasinin sub-minimal inhibitör konsantrasyonlar›n›n Escherichia coli sufllar›n›n hemaglutinasyon özellikleri üzerine etkisinin araflt›r›lmas›
üzerinde çal›fl›lan bir konudur. E.coli sufllar›n›n özellikle kinolon grubu antibiyotikler olmak üzere sub-M‹K'lerde çeflitli virulans özelliklerinin ne öl-çüde etkilendi¤ine dair çal›flmalar vard›r (8,9,14-18). Yap›lan çal›flmalar özellikle konak yap›lar›na tutunmada rol alan fimbriyal yap›lar, adherans ve hücre yüzey hidrofobisitesi üzerinedir.
Bu çal›flmada üriner infeksiyon etkeni olan E.coli sufllar›n›n fimbriyal özelliklerinin siproflok-sasinin sub-M‹K'lerindeki de¤iflimi incelenmifltir. ‹ncelenen tüm sufllar MRHA yapan fimbriyal ya-p›lar içeriyordu. MRHA yapan fimriyal yaya-p›lar›n varl›¤› sub-M‹K çal›flmas› yap›lmadan önce hem kanl› agar hem de CFA agardaki koloniler kul-lan›larak araflt›r›lm›flt›r. Literatürde MRHA arafl-t›rmalar›nda farkl› yaklafl›mlar vard›r. HA veya MRHA araflt›rmalar› bakterilerin yüzeyinde eks-prese olan fimbriyal yap›lar›n insan veya guinea-pig eritrositleriyle hemaglütinasyon verme-si temelinde yap›lmaktad›r. Bu amaçla insan ve-ya guinea-pig A veve-ya 0 grup eritrositleri ile tüp, lam veya mikroplate yöntemi kullan›larak yap›lan farkl› çal›flmalar vard›r (5,6,13). Ayr›ca bakterile-rin bir kaç günlük s›v› besiyebakterile-rinde inkübasyon-dan sonra kat› besiyerine yap›lan ekimlerinde oluflan kolonilerinin kullan›ld›¤› çal›flmalar ve bir gecelik kat› besiyerinde inkübasyondan sonraki kolonilerin kullan›m› ile yap›lan çal›flmalar vard›r (6,7). CFA agar›n fimbriyal yap›lar›n daha iyi eksprese olmas› ve belirginleflmesi amac›yla kul-lan›lmas› önerilmektedir, ancak kanl› agar ve CFA agar kullan›larak yap›lan farkl› çal›flmalar vard›r (5-7). M‹K araflt›r›lmas› için standart ola-rak kanl› agardaki bir gecelik üremeden sonola-raki kolonilerin kullan›m› önerilmektedir. Bu nedenle çal›flmam›zda sub-MIK saptanmadan önce suflla-r›n HA ve MRHA özellikleri hem CFA agarda hem de kanl› agarda üreyen koloniler kullan›la-rak incelenmifltir. CFA agarda yap›lan çal›flmada biraz daha güçlü aglütinasyon elde edilmifl ol-makla birlikte, kanl› agarda üreyenlerde de belir-gin aglütinasyon gözlenmifltir. M‹K çal›flmas› ve sub MIK çal›flmas›, çal›flman›n afl›r›
fimbrilasyon-dan etkilenmemesi için kanl› agarda bir gecelik üremeden sonra elde edilen kolonilerden yap›l-m›flt›r ve 1/2, 1/4, 1/8, 1/16xM‹K'deki tüplerden HA ve MRHA varl›¤› araflt›r›lm›flt›r. Tüm sufllar-da siprofloksasinin farkl› sub-M‹K de¤erlerinde hemagglütinasyon ve MRHA özelli¤inin devam etti¤i gözlenmifltir. ‹ki suflta 1/2xM‹K'te azalm›fl olmakla birlikte yine de aglütinasyon gözlenmifl-tir. Kinolon grubu antibiyotiklerin sub M‹K'leri-nin bakterilerin fimbriyal yap›lar› ve aderans›n› azaltt›¤›n›, inhibe etti¤ini bildiren çal›flmalar ya-n›nda (8,14,16,17), artt›rd›¤›n› bildiren (18) çal›fl-malar da vard›r.
Bask›n ve ark(14) üç farkl› florokinolonun sub-M‹K konsantrasyonlarda E.coli sufllar›n›n MRHA ve adherans özellikleri üzerine etkilerini araflt›r-d›klar› çal›flmalar›nda siprofloksasinin sadece 1/2xM‹K de hemaglitünasyon inhibisyonu yapt›-¤›n› bildirmifllerdir.
Yap›lan di¤er bir çal›flmada siprofloksasinin 0.25 M‹K ve 0.125 M‹K konsantrasyonlar›nda kontro-le göre sufllar›n aderans etkisini azaltm›fl oldu¤u-nu ancak aderans özelli¤inin azalm›fl olmakla bir-likte devam etti¤i gösterilmifltir(16). Balague ve ark(18) 25 E.coli suflu üzerinde yapt›klar› çal›fl-malar›nda siprofloksasinin 1/4xM‹K konsantrasyo-nunda kontrole göre 12 suflta anlaml› bir de¤i-flim saptamad›klar›n› ancak 13 suflta kayda de¤er flekilde hemaglütinasyon ve hücre yüzey hidrofo-bisitesinde art›fl gözlediklerini bildirmifllerdir. Antibakteriyel maddelerin infeksiyonu tedavi ede-cek ancak konak hücrelere zarar vermeyeede-cek uy-gun dozlarda kullan›m› önemlidir. Her antibakte-riyel maddenin serum konsantrasyonu ve doku konsantrasyonu farkl›d›r. Genellikle dokulara ulaflt›¤›nda antibakteriyel maddelerin M‹K de¤er-lerinin alt›ndaki konsantrasyonlarda bulundu¤u belirtilmektedir (2). Bu nedenle çeflitli antibakte-riyel maddenin sub-M‹K konsantrasyonlar›n›n bakterilerin virülans özellikleri üzerine etkilerinin (azalt›c› veya artt›r›c›) bilinmesi tedavi yaklafl›m-lar› aç›s›ndan önemlidir.
195
Melek Demir, Nural Cevahir, ‹lknur Kaleli
KAYNAKLAR
1. Özsüt H, Çalangu S. ‹drar yolu infeksiyonlar›. In: Topçu AW, Söyletir G, Do¤anay M, eds. ‹nfeksiyon Hastal›klar› 1. bask› ‹stanbul: Nobel T›p Kitapevleri, 1996: 921-6. 2. Svanborg C, Godaly G. Bacterial virulance in urinary tract infection. Infect Dis Clin North Am 1997; 11: 513-529. 3. Parlak E, Erol S, K›z›lkaya M, Altoparlak Ü, Parlak M. Yo¤un bak›m hastalar›nda görülen nozokomiyal üriner sistem infeksiyonlar›. Mikrobiol Bult 2007; 41: 39-49.
4. Craig WA. Pharmacokinetic/Pharmacodynamic parameters: Rationale for antibacterial dosing of mice and men. Clin In-fect Dis 1998; 26: 1-12.
5. Gander RM, Thomas VL, Forland M. Mannose-resistant hemagglutination and P receptor recognition of uropathogenic Escherichia coli isolated from adult patients. J Infect Dis 1985; 151: 508-513.
6. Blanco J, Alonso MP, Gonzales EA, Blanco M, Garabal JI. Virulence factors of bacteraemic Escherichia coli with par-ticular reference to production of cytotoxic necrotising factor (CNF) by P-fimbriate strains. J Med Microbiol 1990; 31: 175-183.
7. Evans DJ, Evans DG, Höhne C, Noble MA, Haldane EV, Lior H, Young LS. Hemolysin and K antigens in relation to serotype and hemagglutination type of Escherichia coli isola-ted from extraintestinal infections. J Clin Microbiol. 1981; 13: 171-8.
8. Braga PC, Sala MT, Sasso MD. Pharmacodynamic effects of subinhibitory concentrationsof rufloxacin on bacterial viru-lence factors. Ant›m›crob Agents Chemother 1999; 43: 1013-1019.
9. Braga PC, Sala MT, Sasso MD. sub MIC concentration of cefodizime interfere with various factors affecting bacteri-al virulence. J Antimicrob Chemother 2000; 45: 15-25. 10. Antimikrobik Duyarl›l›k Testleri ‹çin Uygulama Standart-lar›; Onalt›nc› Bigi Eki. (Clinical and Laboratory Standards Institute /CLSI : Çeviri Editörü Gür D.) Ankara:Bilimsel T›p Yay›nevi, 2006.
11. Puzova H, Siegfried L, Kmetova M, Filka J, Takacova V, Durovicova J. Fimbriation, surface hydrophobicity and se-rum resistance in uropathogenic strains of Escherichia coli. FEMS Immunol Med Microbiol 1994; 9: 223-229.
12. Ruhi ZM, Özenci H, Atao¤lu H, Aysev D. Üriner sis-tem infeksiyonu bulunan çocuklar›n idrarlar›ndan izole edilen Escherichia coli sufllar›n›n virulans faktörleri ve antibiyotik duyarl›l›klar›. Türk Mikrobiyol Cem Derg 2000; 30: 85-92. 13. Hoflgör M, Coflar G, Ermertcan fi, Çar›kç› AY. Üropa-tojen Escherichia coli kökenlerinin baz› virulans özellikleri. ‹nfeks Derg 2000; 14: 225-228.
14. Bask›n H, Do¤an Y, Bahar IH, Yulug N. Effect of subminimal inhibitory concentrations of three fluoroquinolo-nes on adherence of uropathogenic strains of Escherichia co-li. Int J Antimicrob Agents 2002; 19: 79-82.
15. Kovar›k JM, Hoepelman IM Verhoef J. Influence of Fluoroquinolones on expression and function of P fimbriae in uropathogenic Escherichia coli. Ani›microb Agents Che-mother 1989; 33: 684-688.
16. Drago L, Vecchi ED, Mombelli B, Nicola L, Vali M, Gismondo MR. Activity of levofloxacin and ciprofloxacin againist urinary pathogens. J Antimicrob Chemother 2001;48: 37-35.
17. Vidya KC, Malya PS, Rao PS. Inhibiton of bacterial ad-hesion by subinhibitory concentrations of antibiotics. Indian J Med Microbiol 2005; 23: 102-105.
18. Balagué Cl, Fernández L, Pérez J, Grau R. Effect of ciprofloxacin on adhesive properties of non-P mannose-resis-tant uropathogenic Escherichia coli isolates. J Antimicrob Chemother 2003; 51: 401-404.
