TOKAT BÖLGESİNDE YETİŞEN BAZI YENEBİLEN YABANİ MANTAR TÜRLERİNDE YAĞ ASİDİ
KOMPOZİSYONLARI VE ANTİOKSİDAN KAPASİTELERİNİN ARAŞTIRILMASI
Fatma ÇETİN
Y. Lisans Tezi Kimya Anabilim Dalı Doç. Dr. Mahfuz ELMASTAŞ
2010 Her hakkı saklıdır
T.C.
GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
KİMYA ANABİLİM DALI
Y. LİSANS TEZİ
TOKAT BÖLGESİNDE YETİŞEN BAZI YENEBİLEN YABANİ
MANTAR TÜRLERİNDE YAĞ ASİDİ KOMPOZİSYONLARI VE
ANTİOKSİDAN KAPASİTELERİNİN ARAŞTIRILMASI
Fatma ÇETİN
TOKAT 2010
ahlak kurallarına uyulduğunu, başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunulduğunu, tezin içerdiği yenilik ve sonuçların başka bir yerden alınmadığını, kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat ya p ıl ma d ığ ın ı , tezin he r ha ng i b ir k ıs mın ın bu üniversite veya başka bir üniversitedeki başka bir tez çalışması olarak sunulmadığını beyan ederim.
i ÖZET Y. Lisans Tezi
Tokat Bölgesinde Yetişen Bazı Yenebilen Yabani Mantar Türlerinde Yağ Asidi Kompozisyonları ve Antioksidan Kapasitelerinin Araştırılması
Fatma ÇETİN
Gaziosmanpaşa Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü
Kimya Anabilim Dalı
Danışman: Doç. Dr. Mahfuz ELMASTAŞ İkinci Danışman: Yrd. Doç. Dr. İbrahim TÜRKEKUL
Bilindiği gibi Türkiye, fitocoğrafik konumundan dolayı oldukça zengin bir mantar florasına sahiptir. Ancak mantar açısından oldukça zengin bir ülke olmasına rağmen, Türkiye günümüzde bu mantarlardan yeterince yararlanılmamaktadır. Türkiye’de bol ve yaygın topluluklar oluşturan çeşitli türlere ait mantarlar kimyasal yönden araştırılmalı ve değişik etken maddeler yönünden taramaları yapılmalıdır. Böylece ham maddesi yönünden elverişli olanların bulunması yabani mantar potansiyelinin zenginleştirilmesi sağlanmış olacaktır. Son yıllarda, mantarların fitokimyasal ve biyolojik aktivite analizleri yaygın bir şekilde yapılmaktadır. Bu çalışmada Tokat bölgesinde yetişen yenebilen yabani dört mantar türünde (Morchella elata, Lactarius volemus,
Cantharellus cibarius ve Tricholama terrum) antioksidan kapasitelerini (serbest radikal
giderme aktivite, metal şelatlama aktiviteleri ve indirgeme gücü aktivite testleri) ve yağ asidi bileşenleri belirlenmiştir. Ayrıca bu mantar türlerinde lipit peroksidasyonun göstergesi olan malondialdehit (MDA) tayini de yapılmıştır. Elde edilen sonuçlara göre serbest radikal giderme aktivitesinin Lactarius volemus ve Morchella elata da diğer iki mantar türüne göre daha yüksek olduğu görülmüştür. Tricholama terreum tüm konsantrasyonlarda standartlar dahil en yüksek indirgeme gücü aktivitesine sahip olduğu gözlemlenmiştir. Elde edilen sonuçlara göre bu dört mantar türünü çok yüksek bir metal şelatlama aktivitesine sahip olduğu görülmüştür. Bu mantar ekstreleri koruyucu amaçlı olarak gıda ve kozmetik sanayisinde reaktif ara ürünlerin önlenmesi için kullanılabilir niteliktedir. Bu dört mantar türünün yağ asidi bileşenleri bakımından incelendiğinde, bu mantarların çok yüksek doymamış yağ asidi bileşenlerine sahip oldukları görülmüştür. Bu dört mantar türünün doymamış yağ asitlerinin doymuş yağ asitlerine oranları Morchella elata için 6,73, Lactarius volemus için 4,12, Cantharellus
cibarius için 3,73 ve Tricholama terrum için 5,21 olarak analiz edilmiştir.
Anahtar Kelimeler: Cantharellus cibarius, Lactarius volemus, Morchella elata,
ii ABSTRACT
Ms. Thesis
Investigation of Antioxidant Capacity and Fatty Acid Composition of Some Wild Edible Mushroom Species Growing in Tokat Region
Fatma ÇETİN Gaziosmanpaşa University
Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemistry
Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Mahfuz ELMASTAŞ Co Supervisor: Asssit. Prof.. Dr. İbrahim TÜRKEKUL
Turkey has a rich mushroom flora due to its phytogeographical position. Although a rich country in mushrooms, it has not been benefit enough from these fungi today. The chemical content of mushrooms grown in Turkey should be investigated and screened for active substances. In recent years, phytochemical analysis and biological activity analysis of mushrooms have widely been performed. In this study, fatty acid components and antioxidant capacity of four wild edible mushroom species (Morchella
elata, Lactarius volemus, Cantharellus cibarius and Tricholama terrum) were
determined in Tokat region. Moreover, malondialdehyde (MDA)as an indicator of lipid peroxidation, were also determined in this mushroom species. According to the obtained results free radical scavenging activity of Morchella elata and Lactarius volemus were observed higher than the other mushroom species. At all concentrations Tricholama terreum, including standards, has been observed the highest reducing power activity. According to the obtained results; the four mushroom species have a very high metal chelating activity. Fatty acid compositions of four mushroom species were examined and these mushrooms have high unsaturated fatty acid components. The ratio of unsaturated fatty acids to saturated fatty acid ratio were for Morchella elata 6.73, for
Lactarius volemus 4.12, for Cantharellus cibarius 5.21 and for Tricholama terrum
3.73.
Keywords: Cantharellus cibarius, Lactarius volemus, Morchella elata, Tricholoma
iii TEŞEKKÜR
Tez çalışmam boyunca, bilgi, fikir ve literatür temini konusunda her türlü desteğini gördüğüm, her zaman benim için bir yol gösterici olan ve tez yazımında yardımlarını esirgemeyen değerli hocam Doç. Dr. Mahfuz ELMASTAŞ ve ikinci danışmanım Yrd. Doç. Dr. İbrahim TÜRKEKUL’a;
Öncelikle moral desteğinden dolayı ve tezimin yazım aşamasında ve laboratuar çalışmaları sırasında her türlü bilgi birikimini benimle paylaşan sevgili hocam Yrd. Doç. Dr. Ayşe ŞAHİN’e,
Laboratuar çalışmalarımda yardımcı olan arkadaşlarım Uzman Hüseyin AKŞİT, Uzman Özkan ŞEN, Burcu SOMTÜRK, Duygu MISIRLI ve hocam Uzman Nusret GENÇ’e,
Bölümümüzün her türlü imkânından faydalanmamı sağlayan Gaziosmanpaşa Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü yöneticilerine ve manevi desteklerini esirgemeyen bütün öğretim elemanlarına;
Hayatım boyunca maddi ve manevi desteklerini esirgemeyen aileme, teşekkürü borç bilirim.
Fatma ÇETİN
iv İÇİNDEKİLER İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET ... i ABSTRACT ... ii TEŞEKKÜR ... iii İÇİNDEKİLER ... iv ŞEKİLLER DİZİNİ ... vi ÇİZELGELER DİZİNİ ... vii
SİMGE VE KISALTMALAR... .viii
1. GİRİŞ ... 1 2. 2. GENEL BİLGİLER ... 5 2.1. Tricholama Terreum ... 5 2.2. Morchella Elata ... 6 2.3. Lactarius Volemus ... 7 2.4. Cantharellus Cibarius ... 8 2.5. Literatür Özeti ... 9 2.6. Lipitler ... 11
2.6.1.Lipitlerin Ortak Özellikleri ... 12
2.6.2. Lipitlerin Sınıflandırılması ... 12
2.7. Yağ Asitleri ... 12
2.7.1. Yağ Asitlerinin Sınıflandırılmaları ... 13
2.7.2. Yağ Asitlerinin Kimyasal Özellikleri ... 16
2.8. Trigliseridler (triaçilgliseroller, nötral yağlar, yağlar) ... 17
2.8.1. Trigliseridlerin kimyasal özellikleri ... 18
2.9. Fosfolipidler ... 19
2.10. Sfingolipidler ... 20
2.11. Serbest Oksijen Radikalleri ve Antioksidanlar ... 20
2.11.1. Reaktif oksijen türleri ve etkileri ... 20
2.11.1.1. Yaşam İçin Oksijen (O2) ... 20
2.11.1.2. Moleküler Oksijenin Özellikleri ... 21
2.11.1.3. Reaktif Oksijen Türleri (ROS) ... 22
2.11.1.4. Süperoksit Radikali (O2 ) ... 22
2.11.1.5. Hidrojen Peroksit (H2O2) ... 24
2.11.1.6. Hidroksil Radikali (OH ) ... 25
2.11.2. Serbest Oksijen Radikallerinin Etkileri ... 25
2.11.3. Serbest Radikallerin Lipidlere Etkileri ... 27
2.11.4. Serbest Radikallerin Proteinlere Etkileri ... 30
2.11.5. Serbest Radikallerin Nükleik Asitler ve DNA'ya Etkileri ... 30
2.11.6. Serbest Radikallerin Karbonhidratlara Etkileri ... 31
3. MATERYAL ve YÖNTEM ... 32
3.1. Mantarlar ... 32
3.2. Kullanılan Kimyasal Maddeler ... 32
3.3. Mantar ekstraksiyonu ve analizler için hazırlanması ... 32
3.4. Antioksidan Aktivite Testleri ... 33
3.4.1. Serbest Radikal (DPPH·) Giderme Aktivitesi ... 33
v
3.4.3. Metal Şelatlama Aktivitesi... 35
3.5. Malondialdehit (MDA) Ölçümü ... 35
3.6. Yağ Asitleri Analizi ... 36
4. BULGULAR ve TARTIŞMA ... 37
4.1. Serbest Radikal (DPPH·) Giderme Aktivitesi... 37
4.2. İndirgeme Gücü Aktiviteleri ... 38
4.3. Metal Şelatlama Aktivitesi ... 39
4.4. Yağ Asitleri Analizi ... 40
4.5. Malondialdehit (MDA) Analiz Sonuçları ... 42
5. SONUÇ VE ÖNERİLER ... 44
vi
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil Sayfa
Şekil 2.1 Tricholoma terreum ... 6
Şekil 2.2 Morchella elata ... 7
Şekil 2.3 Lactarius volemus ... 8
Şekil 2.4 Cantharellus cibarius ... 9
Şekil 2.5 Stearik asit... 12
Şekil 2.6 Kaprik asit ... 13
Şekil 2.7 Ansatüre yağ asidi ... 14
Şekil 2.8 Monoansatüre yağ asidi ... 14
Şekil 2.9 Poliansatüre yağ asidi örnekleri ... 14
Şekil 2.10 Oleik asit, elaidik asit ... 15
Şekil 2.11 Halkalı yapılı yağ asitleri ... 16
Şekil 2.12 Doymamış yağ asidinin iyotla doyurulması ... 16
Şekil 2.13 Oksitlenmiş, doymamış bazı yağ asitleri ... 17
Şekil 2.14 Monogliserid, digliserid, trigliserid ... 18
Şekil 2.15 Serbest radikallerin hücreye etkileri ... 26
Şekil 2.16 Reaktif oksijen türlerinin zararı ... 27
Şekil 2.17 Yağ asidi zincirinin bir lipid radikali niteliği kazanması... 28
Şekil 2.18 Lipid peroksidasyonu ... 29
Şekil 2.19 Malondialdehit (MDA) ... 29
Şekil 4.1 Standart ve mantar numunelerinin değişik konsantrasyonlardaki % DPPH· radikali giderme aktiviteleri ... 38
Şekil 4.2 Mantar ekstreleri ve standartların değişik konsantrasyonlardaki indirgeme gücü aktiviteleri ... 39
vii
ÇİZELGELER DİZİNİ
Tablo 4.1. Mantarların yağ asidi bileşenleri ... 41 Tablo 4.2. Mantarların doymuş ve duymamış yağ asidi bileşen ve oranları ... 42 Tablo 4.3.Çalışılan mantarlardaki MDA miktarları ... 42
viii
SİMGE VE KISALTMALAR
Simge Açıklama
BHA Bütillenmiş Hidroksi Anisol BHT Bütillenmiş Hidroksi Toluen
DMSO Dimetilsülfoksit
GC-MS Gaz Kromatografisi- Kütle Spektrometresi KOH Potasyum Hidroksit
N Normal
MS Kütle Spektrometresi
NMR Nükleer Manyetik Rezonans ppm Milyonda bir kısım
1. GĐRĐŞ
Canlılar yaşamlarını devam ettirebilmesi için gerekli olan enerji ihtiyacını karşılayabilmeleri alınan besinlerin metabolizmaya girişi ile mümkün olmaktadır. Vücut tarafından alınan besinlerin enerjiye dönüştürülmesi için oksijen mutlak gereklidir. Katabolizma sırasında harcanan oksijenin bir dezavantajı reaktivitesi çok yüksek olan reaktif oksijen ara ürünleri (ROS) olarak bilinen zararlı bazı radikalleri meydana gelmesidir. Bu radikallerin üretimi stres durumlarında artış gösterir ve vücutta birçok hastalığın da sebebidir. Bu nedenle strese dayalı hastalıklar başta olmak üzere bir hastalık tedavisinde preperatif antioksidant maddelerin kullanılması hekimler tarafından tavsiye edilmektedir. Günümüzde kanserle serbest radikaller arasındaki ilişki yapılan deneylerle ispat edilmiştir. Bilindiği gibi serbest radikaller yani süper oksit ve hidroksil radikali gibi maddeler canlı organizmalarda ve dokularda diğer madde ve gruplarla reaksiyona girerek hücre içerisinde istenmeyen toksik maddeler oluşturabilirler. Bu ürünler vücuda zararlı olup çeşitli mekanizmalarla hücre harabiyetini tetikler sonrada hücre ölümüne yol açarlar (Gordon, 1996).
Antioksidanların gıda ve ilaç sanayiinde kullanımı yaygın olup neredeyse tükettiğimiz her ürüne antioksidan maddeler katılmaktadır ve bunlar gıdaları bozulmaya karşı korumakta olup onların daha uzun süreli saklanmasını sağlar (Roberfroid ve ark., 1995). Günümüzde, gıda sanayiinde özellikle, yağlı gıda mamullerin oksidasyonu ve lipit peroksidasyonu önlemek amacıyla kullanılmakta olan bütillenmiş hidroksi tolüen (BHT), bütillenmiş hidroksi anisol (BHA), gallat türevleri ve tert-bütil hidrokinon (TBHQ) gibi antioksidant maddelerinin toksik etkilerinden şüphelenilmektedir. Bu antioksidant gıda katkı maddelerinin toksik, kanserojen ve gastrit yapıcı özelliklerinden dolayı bebek mamaları ve çocuk gıdalarında kullanılmasına izin verilmemektedir (Türk Gıda Kodeksi, 1997). Ayrıca, antimikrobiyal olarak nitrit, nitrat, benzoik asit, sorbik asit, kükürt dioksit kullanılmaktadır. Nitrat ve nitrit insan metabolizmasının atılım ürünleridir ve vücutta birikmesi reaktif azot türlerine (RNS) dönüşmektedir. RNS de ROS gibi yüksek reaktivitye sahip olduğundan biyomoleküllerle reaksiyona girerek romatizmal hastalıklar, parkinson, kansere ve hücre harabiyetine sebep olmaktadır (Kotsonis ve ark., 2001). Antibakteriyal olarak kullanılan benzoik asit ve benzoik asit
türevleri ise nörolojik hastalıklara neden olmasının yanında kanserojen olduğu bilinmektedir. Bu amaçla gıda sanayiinde kullanılan kimyasal maddelerin büyük çoğunda toksik, nörölojik dejenerasyon, kanserojen vb. istenilmeyen etkilere sahiptirler (Türk Gıda Kodeksi, 1997). Bu nedenle; son yıllarda yeni, daha güvenli ve ucuz antioksidant ve antimikrobiyal maddelerin bulunması için doğal ürünler üzerinde yaygın çalışmalar yapılmaktadır (JECFA, 1996; Kahl, 1984; Goda, 1994).
Bilindiği üzere yağların insan sağlığı üzerine olan etkisi önem arz etmektedir. Đnsan sağlığı açısından çok önemli olan çoklu doymamış yağ asitleri içeren yağlardır. Esansiyel yağ asitlerini vücut sentezleyemediği için diyetle alınması gerekmektedir. w-3 ve w-6 yağ asitleri diyetle alınması gereken esansiyel yağ asitleridir. Daha çok doymuş yağ asitleri içeren yağlar insan sağlığı açısından zararlı olabilmektedir.
Yağlar hücrede yapı ve enerji maddesi olarak kullanılır. Enerji kaynağı olarak önce karbonhidratlar ikinci derecede yağlar kullanılır. Yağlar fazla alındığında kolayca yağ dokusu içinde depolanır. Deri altında ve iç organların çevresinde depo yağlar, canlıyı soğuktan, darbelerden korur. Yağların diğer bir önemli görevi de hücre zarını oluşturmalarıdır. Đnsan vücudunun çeşitli yerlerindeki hücre zarlarında %25 ile %75 nispet de bulunabilirler. Hücre zarına akıcılık ve esneklik kazandırırlar. Hidrofobik ve anyonik karakterleri sayesinde bazı iyon ve polar maddelerin de geçişine engel olurlar. Bazı yağların bileşiminde vücut tarafından yapılamayan büyüme, gelişme ve derinin sağlığı için gerekli olan yağ asidi bulunur.
Vücutta fazla alınan karbonhidrat ve proteinler yağa dönüştürülerek depolanır. Aşırı yağlı ya da yağa dönüştürülebilen besinlerde beslenme, damarlarda tıkanmalara yol açabilir; bunun sonucunda da kalp hastalıkları ve dolaşım bozuklukları ortaya çıkabilir. Ayrıca, şişmanlığa neden olur.
Türkiye, fitocoğrafik konumundan dolayı oldukça zengin bir mantar florasına sahiptir. Ancak mantarlar açısından oldukça zengin bir ülke olmasına rağmen, halk hekimliğinin mirası olan bu mantarlardan günümüzde yeterince yararlanılmamaktadır. Türkiye’de bol ve yaygın topluluklar oluşturan çeşitli türlere ait mantarlar kimyasal yönden araştırılmalı ve değişik etken maddeler yönünden taramaları yapılmalıdır. Böylece
içlerinde ham maddesi yönünden elverişli olanların bulunması ve bilinenlere yenilerin katılmasıyla yabani mantar potansiyelinin zenginleştirilmesi sağlanmış olacaktır.
Günümüzde fungus türlerinin besin olarak tüketilmesi yanında aktioksidant ve antimikrobiyal özelliklere sahip olmalarından dolayı ilaç sektöründe yaygın olarak kullanılmaları popülaritelerinin artmasına neden olmuştur. Makrofungusların teşhisi, lokalitelerinin belirlenmesi gıda ve ilaç endüstrisinde çalışanlar için oldukça önemlidir. Teşhisi yapılacak türler içinde tıbbi etkiye sahip olanlar, yeni kültürel çalışmalarda kullanılabilecek olanlar ve en önemlisi genetik materyal olarak değerlendirilmesi mümkün olanlar mutlaka çıkacaktır.
Son yıllarda, Dünyada mantarların fitokimyasal analizleri ve biyolojik aktiviteler araştırmaları yaygın bir şekilde yapılmaktadır. Bilimsel çalışmaların mantarlar üzerinde bu denli çok yapılmasının yukarıda bahsedilen nedenlerin yanı sıra aşağıdaki nedenlerde etkili olmuştur.
• Tüm dünyada on binlerce çeşidi bulunan mantar, protein ve demir açısından çok zengindir.
• Đçerdiği protein sayesinde etin yerini tutar.
• Bağışıklık sistemini güçlendirerek hastalıklara karşı direnci artırır. • Göze ve vücuda kuvvet verir.
• Mantarların doğadaki pozisyonları göz önüne alındığında onları asıl önemli kılan, ölü ve canlı organik maddeleri parçalamaları ve böylece karbon-azot devrinin sürdürülmesinde çok büyük bir rol oynamalarıdır.
• Yabani yenilebilir mantarlar sağlık için yenilebildiği gibi içerdiği değişik biyoaktif bileşenlerden dolayı da sinerji oluşturarak sağlıklı yaşamın devam etmesinde önemli rol oynamaktadır.
• Mantarlar fonksiyonel bileşiklerin kaynağı olduğundan destekleyici tıpta da kullanılan bir kaynaktır.
• Miselleri kültür ortamında yetiştirilebilir. Böylece daha kısa sürede daha fazla fonksiyonel grup elde edilebilir.
Bu nedenlerden dolayı; biz bu çalışmada Tokat bölgesinde yetişen yenebilen dört mantar türünde (Morchella elata, Lactarius volemus, Cantharellus cibarius ve
Tricholama terrum) antioksidan kapasitelerini(serbest radikal giderme aktivite,
süperoksit radikal giderme aktivite ve indirgeme gücü aktivite testleri) ve yağ asidi bileşenlerini belirlemeyi hedeflemekteyiz. Ayrıca bu mantar türlerinde lipit peroksidasyonun göstergesi olan malondialdehit (MDA) de analiz edilecektir.
2. GENEL BĐLGĐLER
2.1. Tricholoma terreum
Şapka 3.5-7 cm., konveks, sonradan düzleşir, parlak, koyu gri, keçemsi tüylüdür. Sap 7-9/2-4 cm., beyaz, pürüzsüz, ipek görünümlüdür.Eti sarımsı beyaz, tadı hoş, kokusu belirgin değildir.Lameller aralıklı, sarımsı-gri, çentiklidir. (Şekil 2.1) Spor izi beyaz, sporlar eliptik, ortalama 8-9/4-5 mikrondur (Philips, 1981; Breitenbach ve ark., 1991).
Kummer makrofungusu halk arasında "Cincile", "Mıhbaşı" ve "Karakız Mantarı" olarak adlandırılmakta ve pazarlarda satılmaktadır. Đyi bir yenebilen mantardır, çeşitli şekillerde yemeği hazırlanabilmektedir ve bilhassa çorbalarda lezzetlidir. Bu mantarın bir özelliği de, diğer mantarların sayısının azaldığı zaman halk tarafından mevsim olarak geç zamanlarda kolayca bulunabilmesidir. Ancak küçük boyutlu olması ve etli kısmının gevrek olması mantarın kötü özelliklerindendir. Mantar yol kenarlarında, çiğnenmiş olan otlaklarda ve parklarda yetişmektedir. Kalkerli topraklarda kümeler halinde, bilhassa sonbaharda eylül-ekim ve mayıs aylarında ortaya çıkmaktadır.
Tricholoma terreum (Fr.) Kummer sık sık karaçam altında yetişmesine rağmen,
karaçama bağlılık göstermez, diğer ağaçların altında da bulunabilmektedir. Yurdumuzda Bolu, Giresun, Sinop, Đstanbul, Manisa, Eskişehir ve Bursa illeri civarında yetişmektedir (Başaran ve ark., 1999).
Şekil 2.1 Tricholoma terreum
2.2. Morchella elata
Askokarpın şapkası 3-5 cm yüksekliğinde 2-4 cm çapında, yumurta ya da konik şekilde uç kısmı külah gibi sivridir. Bal peteği şeklindeki yapılar düzgün ve muntazam olarak biribirine bağlı, şapkanın kenarı sap üzerine keskin bir dirsek olmadan doğrudan inmekte olup, bal kahverengi, kırmızı-siyahımsıkahverengi, odacıklar mantar olgunlaşınca siyaha döner. Etli kısmı ince, balmumu şeklinde, kırılgan, tadı ve kokusu hoştur. Sapı 2-8 x 1-2 cm, silindirik düz veya üzerinde odacıklar bulunabilir. Taban kısım hafif kalınlaşır, önce beyaz sarı, olgunlaşınca kahverengiye döner. Sporları genişçe eliptik, renksiz, çeperin her iki ucunda da küçük yağ damlalı, 18-25 x 12-16 microndur (Şekil 2.2).
Toprakta, orman açıklıklarında, yol ve akarsu kenarlarında, bitki örtüsü yanmış arazide ilkbaharda, Mart ve Mayıs ayları arasında görülür. Akçaağaç, Fındık, Kayın, Dişbudak ve Karağaçların altında tek tek bulunur (Gücin, 1993).
Şekil 2.2 Morchella elata
2.3. Lactarius volemus
Russulaceae familyasından yenebilen bir mantar türü. Şapkası 5-15 cm kadar
büyüklükte, kuru ve et gibidir, hiçbir zaman yapışkan olmaz. Gençken yarım küre şeklinde tümsek olup olgunlaşınca açılır ve derin olmayan huni şekline dönüşür, üst tarafı düzensiz, dalgalı gibi bir hal alır. Kenarı başlangıçta içeri kıvrıktır, daha sonra düzensiz olarak dalgalı olur. Gençken sarımtırak kahverengi olgunlaşınca kırmızımsı kahverengi olan mantarın iki formu vardır. Kırmızı kahverengi tipi iğne yapraklı ağaç ve kayın ormanlarında yosunlar arasında gelişir, ateş sarısı tipi yalnızca kayın ve meşe ormanlarında bulunur (Şekil 2.3).
Temmuz ve Eylül arasında yapraklı ağaç meşçerelerinde bilhassa kayın ormanlarında ve sınırlarında, bazen çam meşçerelerinde gelişir. Badem gibi hoş bir tadı, balık gibi kokusu vardır. Kolay tanınabilen bir mantardır, bol miktarda çıkarılan beyaz sıvısı ile iyi ayırt edilebilir, bu sıvı çok lezzetlidir, renk değiştirmez ve balık kokusundadır. Taze mantar kesildiği zaman bol miktarda beyaz sıvısı akar, kuru ve yaşlı örneklerde bu özellik yoktur. Salamura edilmiş balık gibi olan kokusu, mantar yaşlandıkça artar (Anonim, 2010).
Şekil 2.3 Lactarius volemus
2.4. Cantharellus cibarius
Şapka 1-9cm çapında, gençken kenarı içe kıvrık, olgunlaşınca dalgalı ve loblu olup merkezi çukurdur. Sarı, soluk sarı, yumurta veya portakal sarısı renktedir. Sap 2-5x0,5-2,5cm, sert yapılı, şapka ile aynı renkte veya daha solgun, ellenince portakalsı olup tabana doğru incelir. (Şekil 2.4) Eti sarımsı beyaz, başlangıçta tatsız, bir süre sonra hafif yakıcı, kayısıyı andıran kokusu olukça güzeldir. Lameller dar, damarsı, düzensiz, çatallı, sap üzerine dökük ve yumurta sarısı renktedir. Spor izi sarımsı, sporlar elips şeklinde, ortalama 8-10x4,5-5,5 mikrondur (Philips, 1981; Breitenbach ve ark., 1991).
"Yumurta mantarı" olarak ta bilinen Cantharellaceae ailesinden lezzetli bir mantar türüdür. Şapkası sarı veya turuncu renkli ve huni şeklindedir. Sonbahardan ilkbahara kadar genelde yaprak döken ağaçların yoğun olduğu ormanlarda bolca bulunur. Gerçek anlamda lamelleri yoktur, sapının alt bölümünden şapkanın ucuna kadar uzanan buruşuk yapı Chanterellus cibarus’un ayırt edici bir özelliğidir. Spor baskısı pembemsi beyazdır. Genelde larva barındırmaz. Aroması kayısıyı andırır, piştiği zaman çok güzel kokar, o yüzden tatlılarda bile kullanılmıştır. Tereyağında sote olarak, tavuk etiyle beraber veya pizza üzerinde rahatça yenebilir. Kurutulmaya ve turşu yapımına da uygundur (Anonim, 2010).
Şekil 2.4 Cantharellus cibarius
2.5. Literatür Özeti
Bazı literatürlere göre mantar üretimi ilk defa Fransa da yapılmıştır. 1650 yıllarında Paris yakınlarında kavun üreticileri mantarın nasıl üretileceği tesadüfler sonucu keşfederek üretime başlamışlardır. 1678 yılında Mardaat mantarın hayvan gübresinde yetiştiğini; 1707 yılında Tournefort, mantarın mayıs -ekim ayları arasında açıkta toprak üzerinde, Kasım, Ağustos sonu arasında ise gübresi içinde yetiştirilebildiği belirten raporlar vermişlerdir. 1754 de Lundberg adlı araştırıcı mantarın tüm yıl boyunca üretilebileceğini belirten raporlar vermişlerdir. 1784 yılında Fransız Chambry 'nin mağara ve tünellerin mantar üretimi için çok uygun olduğu yolunda görüş belirtmesini takiben mantar üretimi süratle yayılmıştır. Çalışma yaptığımız bölgede kültür mantar üretimi yapıldığı bilinmektedir. Türkiye'de şapkalı mantarlar üzerine ilk çalışma Đstanbul yakınında Belgrat ormanlarında yapılmıştır (Lohwag, 1957;1959).
Bazı yabani yenebilir mantarların besinsel içeriği incelenmiş, çalışılan yabani yenilebilir mantarların zengin birer protein ve karbohidrat kaynağı oldukları ve az miktarda lipit içerdikleri belirlenmiştir. Đncelenen mantarların metal içerikleri ve enerji değerleri birbirine çok yakın ve daha önceki verilerle uyum içerisindedir. Elde edilen sonuçlar, bu
yabani yenilebilir mantarları, besin kaynağı olarak tüketilebilirlikleri açısından popüler kılmaktadır. (Çolak ve ark., 2009).
Tricholoma makrofungusunun antimikrobiyal aktivitesi incelenmiş, yapılan çalışmaya
göre Tricholoma terrum ekstrelerinin araştırmada kullanılan bazı gram (+) ve (-) bakterilere karşı antagonistik etki içermesine rağmen, maya kültürleri üzerine antimikrobiyal aktiviteye sahip olmadığı belirlenmiştir (Başaran ve ark., 1999).
Makrofungusların antimikrobiyal etkilerine, fungal yapıda sentezlenen ve ekseriyetle organizmaya has bazı fenolik bileşikler, purinler, pirimidinler, kuinonlar, terpenoidler ve fenil proponoid türevi antagonistik maddeler neden olmaktadır. Antitümoral etki gösteren en önemli maddeler ise kalvasin, volvotoksin, flammutoksin, lentinan ve porisin denilen yalnızca makrofunguslardan izole edilmiş maddeler olup aynı zamanda antiviral bileşiklerdir (Benedict ve ark., 1983).
Tricholoma türlerinin medikal özellikleri üzerine dünyada birçok araştırma
yürütülmektedir. (Mizuna ve ark., 1996). Tricholoma giganteum üzerinde in vivo çalışmalar sonucunda makrofungustan hazırlanan ekstraktların Ehrlich karsinomayı % 90, Sarcomayı ise % 80 oranında inhibe ettiğini saptamışlardır. Tricholoma mongolicum'âan elde ettikleri ekstraktların antitümoral aktiviteleri üzerine çalışmışlardır. Araştırıcılar ekstraktların farelerde Sarcoma 180 ni % 93 oranında inhibe ettiğini bildirmişlerdir. (Wang ve ark., 1995). Tricholoma mongolicum'un ekstraktlarından elde ettikleri iki lektin türevi olan TML-1 ve TML-2'nin antiproliferatif aktivitlerini ortaya çıkarmışlardır. Bu iki türevin beyaz farelerde Sarcoma 180'nin gelişmesini % 91,3 oranında, Ehrlich karsinoma'yı ise % 70 oranında inhibe ettiği yapılan çalışmalarla saptanmıştır. Ayrıca Çin tababetinde koruyucu olarak, mantarın sıcak su ekstraktlarının küçük çocukların göğsüne ve ayak tabanlarının altına sürülme işleminin yıllardır uygulandığı bilinmektedir (Ying ve ark., 1987).
Lactarıus mantarlarında izopentil difosfat aktivitesi, IDP (C14)’den türetilen radyoaktif C5 alkolleri Lactarıus mantarlarının homojenatlarında ölçülmüştür. Fosfotaz aktivitesini
engellemek için karışıma flor iyonlar eklenmiştir. DMADP (C14) dizisinin seviyesi %41 olarak bulunmuştur (Ohya ve ark., 1997).
Bazı yabani mantar türlerinde esteraz aktiviteleri çalışılmış ve Tricholoma terrum’nın esterolitik aktivite gösterdiği belirlenmiştir (Çolak ve ark., 2009).
Türkiye’de yetişen yirmi dört farklı yabani mantar türünün içerdiği ağır metallerin analizi yapılmış ve hangi metalleri ihtiva ettikleri belirlenmiştir. Çalışılan mantar türlerinde Pb, Cd, Hg, Fe, Cu, Mn ve Zn elementlerin analizi yapılmıştır (Tüzen ve ark., 1997).
Benzer bir çalışmada Tokatta yetişen yabani mantar türleri üzerine çalışılmış ve çalışılan mantarlarda ki ağır metaller; Cu, Cd, Pb, Zn, Mn, Fe, Cr ve Ni analiz edilmiştir. Çalışmada atomik absorbsiyon spektrometresinden faydalanılmış ve çalışılan mantar türleri arasında en yüksek Cr ihtiva eden mantarın Morchella elata olduğu belirtilmiştir (Işıldak ve ark., 2004).
Aktümsek ve arkadaşları Agaricus bisporus’un etli kısmı, sapı, lameli ve totalinin yağ asidi bileşenlerini ayrı ayrı gaz kromatografik yöntemle analiz etmiş, A. bisporus’un tüm yağ asidi bileşimlerinde linoleik asitin yüzdesinin en yüksek olduğunu, Linoleik asit yüzdesinin %53.45 - 68.78 arasında değiştiğini, yağ asidi bileşimlerinde linoleik asitten başka en yüksek yüzdeye sahip yag asitlerinin palmitik, oleik ve stearik asitler olduğunu göstermişlerdir (Aktümsek ve ark., 1998).
2.6. LĐPĐTLER
Lipitler genel ve belirli özellikleri suda çözünmeme olan, kimyasal olarak farklı bileşiklerdir. Biyolojik fonksiyonları da çeşitlilik gösterir:
Nötral yağlar olarak bilinen trigliseritler, birçok organizmada enerji için başlıca yakıt deposudur. Fosfolipidler ve steroller biyolojik membranların yapı taşlarıdırlar. Nispeten
küçük miktarlarda bulunan bazı lipidler, enzim kofaktörleri, elektron taşıyıcıları, hormonlar ve intraselüler haberciler olarak çok önemli fonksiyonlara sahiptirler
2.6.1. Lipitlerin ortak özellikleri
• Lipitler, biyolojik kaynaklı organik bileşiklerdir
• Lipitlerin yapılarında C, H, O bulunur. Ayrıca N, P, S gibi elementler de bazı lipitlerin yapısına girerler
• Lipitlerin temel yapı taşları yağ asitleridir
• Lipitler, suda çözünmeyen, apolar veya hidrofobik bileşiklerdir; kloroform, eter, benzen, sıcak alkol, aseton gibi organik çözücülerde çözünebilirler
• Lipitlerin enerji değerleri yüksektir.
2.6.2. Lipitlerin Sınıflandırılması 1. Yağ asitleri 2. Nötral yağlar 3. Fosfolipitler 4. Glikolipitler 5. Mumlar 6. Steroidler 7. Terpenler 2.7. Yağ Asitleri
Yağ asitleri, hidrokarbon zincirli monokarboksilik organik asitlerdir. Yapılarında, 4-36 karbonlu hidrokarbon zincirinin ucunda karboksil grubu bulunur. (Şekil 2.5)
HOOC
Yağ asitlerinin yapısında yer alan hidrokarbon zinciri karbonları, −COOH karbonundan itibaren isimlendirilir. −COOH karbonuna komşu ilk karbon atomuna α-karbon, ikinciye β-karbon, üçüncüye γ-karbon denir. En sonda yer alan metil grubunun karbonu ise ω veya n-karbon olarak isimlendirilir.
2.7.1. Yağ asitlerinin sınıflandırılmaları
• Doymuş (satüre) yağ asitleri • Doymamış (ansatüre) yağ asitleri • Ek gruplu yağ asitleri
• Halkalı yapılı yağ asitleri
Doymuş (satüre) yağ asitleri, hidrokarbon zincirleri çift bağ içermeyen ve dallanmamış olan yağ asitleridirler. (Şekil 2.6)
HOOC
Şekil 2.6 Kaprik asit
En basit doymuş yağ asidi, 2 karbona sahip asetik asittir. Doymuş yağ asitleri, iki karbonlu monokarboksilik asit olan asetik asit üzerine kurulmuş olarak tasarlanabilirler. Doymuş yağ asitlerinin 2-6 karbonluları kısa zincirli, 8-12 karbonluları orta zincirli, daha fazla karbonluları uzun zincirli olarak tanımlanırlar. Hayvansal yağlarda en çok bulunan doymuş yağ asitleri, 16 karbonlu palmitik asit ile 18 karbonlu stearik asittir.
CH3(CH2)14CO2H Palmitik asit CH3(CH2)16CO2H Stearik asit
Doymuş yağ asitlerinin karbon sayısı 10 ve daha az olanları oda sıcaklığında sıvı ve uçucudurlar; diğerleri katı yağlar olarak tanımlanırlar.
Doymamış (ansatüre) yağ asitleri, hidrokarbon zincirinde bir veya daha fazla çift bağ içeren yağ asitleridirler. (Şekil 2.7)
HOOC
Şekil 2.7 Ansatüre yağ asidi
Hidrokarbon zincirinde bir çift bağ içeren doymamış yağ asitleri, monoansatüre yağ asitleridirler. (Şekil 2.8)
CH3(CH2)7C=C(CH2)7COOH
O
OH
Şekil 2.8 Monoansatüre yağ asidi
Hidrokarbon zincirinde iki veya daha fazla çift bağ içeren doymamış yağ asitleri, poliansatüre yağ asitleridirler. (Şekil 2.9)
Poliansatüre yağ asitleri, içerdikleri çift bağ sayısına göre dienoik, trienoik, tetraenoik yağ asitleri olarak adlandırılırlar.
CH3
COOH
HOOC
Doymamış yağ asitleri oda sıcaklığında genellikle sıvıdırlar, suda çözünmezler, uçucu değillerdir.
Hayvansal yağlarda en çok bulunan doymamış yağ asitleri, palmitoleik asit, oleik asit, linoleik asit, araşidonik asittir.
Hayvanlarda depo yağlarını çoğunlukla palmitik ve oleik asitler oluşturur. Daha az olarak da stearik asit bulunur. Linoleik asit, linolenik asit ve araşidonik asit, insanlar için esansiyeldirler. Yani vücutta sentez edilmezler; besinlerle dışarıdan alınmaları gerekir.
Linoleik asit, mısır yağı, yer fıstığı, pamuk yağı ve soya fasülyesi yağı gibi tohum yağlarında bulunur. Linolenik asit, ayrıca keten tohumu yağında bulunur. Araşidonik asit, yer fıstığı yağında daha fazla miktarda vardır.
Doymamış yağ asidi karbon zincirleri içindeki çift bağların bulunduğu yerdeki değişiklikler, izomerleri oluşturur. En sık görülen izomer şekilleri, çift bağın etrafındaki diziliş ile ilgili olan cis- ve trans- izomer şekilleridir. (Şekil 2.10)
COOH
H H
COOH H
H
Şekil 2.10 Oleik asit, elaidik asit
Ek gruplu yağ asitleri, hidrokarbon zincirlerinde hidroksil grubu veya metil grubu gibi ek gruplar içeren yağ asitleridirler.
Halkalı yapılı yağ asitleri, hidrokarbon zincirleri halkalı yapı oluşturmuş olan yağ asitleridirler. (Şekil 2.11) (CH2)10CO2H (CH2)12CO2H COOH
Hidnokarpik Asit Kalmogrik Asit Prostanoik Asit
Şekil 2.11 Halkalı yapılı yağ asitleri
2.7.2. Yağ asitlerinin kimyasal özellikleri
Yağ asitlerinin karboksil grupları ile alkollerin hidroksil grupları arasından su çıkışı suretiyle yağ asidi ve alkolün birbirine ester bağıyla bağlanması sonucu esterler oluşur. Trigliseridler, gliserolün yağ asidi esterleridirler.
Yağ asitleri, karboksil grupları vasıtasıyla metallerle tuzları oluştururlar. Karbon sayısı 6’dan fazla olan yağ asitlerinin metallerle oluşturduğu tuzlara sabun denir.
Doymamış yağ asitlerinin yapısında yer alan etilen bağı (−CH=CH−), platin, nikel veya bakır varlığında kolaylıkla hidrojenle doyurulabilir. Đki hidrojen çift bağa girer ve doymamış yağ asidi doymuş hale geçer. Doymamış yağ asitlerinin yapısında yer alan etilen bağı flor, klor, brom, iyot gibi halojenlerden biri ile doyurulabilir. 100 g doymamış yağın gram cinsinden tuttuğu iyot miktarı, iyot indeksi olarak tanımlanır. iyot indeksi, cilt altı dokularda 65, karaciğerde 135’dir. (Şekil 2. 12)
H H R R I2 R R I H H I
Doymamış yağ asitlerinin çift bağları, oksidan etkiye göre sonuçta değişik ürünler meydana gelecek şekilde oksitlenirler. Çift bağlara O2 girmesiyle peroksit, endiol, epoksit, ketohidroksit gibi çeşitli gruplar ortaya çıkar. (Şekil 2. 13)
C O O C
C O O H
Dialkil peroksit
Alkil hidro peroksit
C O O O C Peroksi ester C O O C O O Di açil peroksit C O O H Peroksi asit
Şekil 2.13 Oksitlenmiş, doymamış bazı yağ asitleri
2.8. Trigliseridler (triaçilgliseroller, nötral yağlar, yağlar)
Gerek hayvansal yağlar gerekse bitkisel yağlar, yağ asitlerinin gliserin (gliserol) ile oluşturdukları oldukça kompleks esterlerdir. Bu esterlere gliserid adı verilir.
Gliserinin bir alkol grubu bir molekül yağ asidi ile esterleşirse monogliserid meydana gelir. Gliserinin iki alkol grubu iki molekül yağ asidi ile esterleşirse digliserid meydana gelir. Gliserinin üç alkol grubu da üç yağ asidi ile esterleşirse trigliserid meydana gelir. (Şekil 2.14)
H2C CHOH CH2 OH O OC Monogliserid H2C H C CH2 OH O OC O OC Digliserid H2C H C HC OH O OC O OC O OC Trigeliserid
Şekil 2.14 Monogliserid, digliserid, trigliserid
Genelde yağların yapısı trigliserid biçimindedir. Trigliseridlerde gliserin ile esterleşen yağ asitlerinin üçü de aynı ise yani α, β, α′ pozisyonlarının hepsinde aynı tür yağ asidi bulunuyorsa trigliseridler, basit yağlar olarak tanımlanırlar. Trigliseridlerde gliserin ile esterleşen yağ asitleri aynı değilse yani α, β, ′α pozisyonlarında farklı tür yağ asidi bulunuyorsa trigliseridler, karışık yağlar (miks yağlar) olarak tanımlanırlar.
Bitkisel yağlar, süt ürünleri ve hayvansal yağ gibi doğal yağların çoğu, basit ve karışık yağların kompleks karışımlarıdırlar. Bunlar, zincir uzunluğu ve doygunluk dereceleri farklı çeşitli yağ asitleri içerirler. Trigliseridler (yağlar, nötral yağlar), önemli biyolojik fonksiyonlara sahiptirler.
Yağlar, ya yüksek basınç altında su ile ya da normal basınç altında asitlerle kaynatılarak ya da lipaz gibi belirli enzimlerin katalitik etkisiyle hidrolize olurlar; gliserol ve yağ asitlerine parçalanırlar.
Yağlar, kuvvetli bazlarla kaynatılırlarsa, sabunlar ve gliserine ayrılırlar. 1 gram yağın sabunlaşması için gerekli olan mg cinsinden KOH miktarına, sabunlaşma sayısı denir.
Yağlardaki yağ asitlerinin doymamış bağları hidrojen ile doyurulabilir ve böylece doymuş yağlar meydana gelir.
Yağlardaki yağ asitlerinin doymamış bağlarına, klor, brom, iyot gibi halojenler katılabilir. 100 gram yağ tarafından absorbe edilen gram cinsinden iyot miktarına iyot sayısı denir.
Yağlardaki yağ asitlerinin doymamış bağları, çeşitli oksidan etkenlerle, çeşitli bileşikler oluşturmak üzere okside olurlar.
Yağlar, hava, ışık, rutubet, ısı ve bakteri etkisiyle kendilerine özgü koku ve tatlarını kaybederek acılaşırlar.
2.9. Fosfolipidler
Fosfolipidler, fosfat içeren lipidlerdir; fosfatidler olarak da bilinirler. Fosfolipidler, molekül yapılarındaki alkol türüne göre fosfogliseridler (gliserofosfolipidler) ve fosfosfingozidler (sfingomyelinler) olmak üzere iki grupta incelenirler.
Fosfogliseridlerin molekül yapısında gliserolün α-karbonunda doymuş yağ asidi, β-karbonunda doymamış yağ asidi, α'-β-karbonunda fosfat ve fosfogliseridin türüne göre değişen bir grup içerirler.
Sfingomiyelinler, alkol olarak gliserol yerine kompleks bir amino alkol olan sfingozin içeren fosfolipidlerdir.
Fosfogliseridler (gliserofosfolipidler), yapılarına göre gruplara ayrılırlar: 1. Ester gliserofosfolipidler
• Fosfatidilkolin (PC, lesitin)
• Fosfatidiletanolamin (PE, kefalin, sefalin) • Fosfatidilinozitol (PI)
• Fosfatidilserin (PS) 2. Eter gliserofosfolipidler • Plazmalojenler
• Trombosit aktive edici faktör
Fosfosfingozinler (Sfingomiyelinler), alkol olarak gliserol yerine kompleks bir amino alkol olan sfingozin içeren fosfolipidlerdir. Sfingomyelinler, sfingolipidler sınıfından da sayılırlar.
2.10. Sfingolipidler
Sfingolipidler, gliserol yerine bir uzun zincirli amino alkol olan sfingozin içeren bileşik lipidlerdir. Sfingozinin amino azotuna bir yağ asidinin amid bağı ile bağlanması suretiyle oluşmuş en basit sfingolipid seramiddir. Seramiddeki primer alkol grubundaki H yerine başka grupların gelmesiyle çeşitli sfingolipidler oluşmuştur. Seramide fosfokolin eklenmesiyle sfingomiyelinler oluşmuşlardır. Seramide bağlı olarak karbonhidrat içeren sfingolipidler, glikolipidler olarak bilinirler.
2.11. SERBEST OKSĐJEN RADĐKALLERĐ VE ANTĐOKSĐDANLAR
2.11.1. Reaktif oksijen türleri ve etkileri 2.11.1.1. Yaşam Đçin Oksijen (O2)
Havasız yerde yaşayamayız. Yaşamımızı sürdürmek için havanın moleküler oksijenini (O2) tükettiğimizi biliyoruz. Total oksijen tüketimimizin %90'ından fazlasından elektron
transport zinciri (solunum zinciri), %5-10'undan da diğer oksijen gerektiren reaksiyonlar sorumludur. Elektron transport zincirinde moleküler oksijen, yakıtlardan (glukoz, yağ asidi ve amino asitlerin karbon iskeleti) türeyen NADH ve FADH2'den elektronları alarak suya indirgenir. Bu yolda oksijen molekülünün kuvvetli oksitleyici gücü, ATP'nin yüksek enerjili fosfat bağı haline dönüştürülür.
Moleküler oksijen gerektiren fakat ATP' nin oluşumu reaksiyonuyla eşleşmeyen diğer reaksiyonlar, aminoasitlerin katabolizması, ilaçların detoksifikasyonu ve steroid hormonların sentezi gibi spesifik metabolik yollar için önemlidirler. Bu reaksiyonlarda diğer oksidazlar (oksijeni suya veya hidrojen perokside indirgeyen enzimler) ve oksijenazlar (oksijeni okside olan moleküle bağlayan enzimler) görev alırlar (Dawn ve ark., 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve ark. 1999).
2.11.1.2. Moleküler Oksijenin Özellikleri
Moleküler oksijen (O2), paralel spin durumlu iki ortaklanmamış (eşleşmemiş) elektrona sahiptir. Ortaklanmamış (eşleşmemiş) elektron içeren atom, atom grubu veya moleküller serbest radikal olarak tanımlanırlar. Ancak Fe3+, Cu2+, Mn2+ ve Mo5+ gibi geçiş metalleri de ortaklanmamış elektronlara sahip oldukları halde serbest radikal olarak kabul edilmezler, fakat serbest radikal oluşumunda önemli rol oynarlar. Serbest radikaller pozitif yüklü (katyon), negatif yüklü (anyon) veya elektriksel olarak nötral olabilirler.
Serbest radikal tanımına göre moleküler oksijen, bir biradikal (diradikal) olarak değerlendirilir. Biradikal oksijen, radikal olmayan maddelerle yavaş reaksiyona girdiği halde diğer serbest radikallerle kolayca reaksiyona girer. Biradikal oksijenin elektronlarından birinin enerji alarak kendi spininin ters yönünde olan başka bir orbitale yer değiştirmesiyle singlet oksijen oluşur. Singlet oksijen, eşleşmemiş elektronu olmadığı için radikal olmayan reaktif oksijen molekülüdür, delta ve sigma olmak üzere iki şekli vardır.
Organizmada geçiş metallerini (Fe2+ ve Cu+ gibi metaller) içeren enzimler vasıtasıyla moleküler oksijene tek elektronların transferi suretiyle oksidasyon reaksiyonları meydana gelir. Moleküler oksijen, biradikal doğasının bir sonucu olarak yüksek derecede reaktif oksijen türleri (ROS) oluşturma eğilimindedir (Dawn ve ark., 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve ark. 1999).
2.11.1.3. Reaktif Oksijen Türleri (ROS)
Reaktif oksijen türleri (ROS), normal oksijen metabolizması sırasında az miktarda oluşan süperoksit radikali (O2⋅−), hidrojen peroksit (H2O2) ve hidroksil radikali (OH•)'dir. O2 e -O2 moleküler oksijen süperoksit radikali e- ,2H+ H2O2 e - , H+ H2O + OH hidroksil radikali e- , H+ H 2O
Reaktif oksijen türleri, çeşitli serbest radikallerin oluştuğu serbest radikal zincir reaksiyonlarını başlatabilirler ve hücrede karbon merkezli organik radikaller (R•), peroksit radikalleri (ROO•), alkoksi radikalleri (RO•), tiyil radikalleri (RS•), sülfenil radikalleri (RSO•), tiyil peroksit radikalleri (RSO2•) gibi çeşitli serbest radikallerin oluşumuna neden olurlar (Dawn ve ark., 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve ark. 1999).
2.11.1.4. Süperoksit Radikali (O2⋅⋅⋅⋅−−−−)
Süperoksit radikali (O2⋅⋅⋅⋅−) hemen tüm aerobik hücrelerde moleküler oksijenin (O2) bir elektron alarak indirgenmesi sonucu oluşur. Đndirgenmiş geçiş metallerinin otooksidasyonu süperoksit radikali meydana getirebilir.
Fe3+ +
+ O2 Cu2+ + O2
Fe2+ + O2 O2
Süperoksit radikali kendisi direkt olarak zarar vermez. Bu radikal anyonun asıl önemi, hidrojen peroksit kaynağı olması ve geçiş metalleri iyonlarının indirgeyicisi olmasıdır. Süperoksit radikali düşük pH değerlerinde daha reaktifdir, oksidan perhidroksi radikali (HO2•) oluşturmak üzere protonlanır.
O2 +H
+
HO2
Süperoksit radikali ile perhidroksi radikali birbirleriyle reaksiyona girince biri okside olur diğeri indirgenir. Bu dismutasyon reaksiyonunda moleküler oksijen ve hidrojen peroksit meydana gelir.
HO2 + O2 + H+ O2 + H2O2
Süperoksit radikali hem oksitleyici hem indirgeyici özelliğe sahiptir. Örneğin ferrisitokrom c ya da nitroblue tetrazolium ile reaksiyonunda indirgeyici olarak davranarak bir elektron kaybeder ve moleküler oksijene okside olur.
sit c(Fe + O2 O2 +
3+) sit c (Fe2+)
Süperoksit radikali epinefrinin oksidasyonunda oksidan olarak davranarak bir elektron alır ve hidrojen perokside (H2O2) indirgenir.
Süperoksit radikalinin fizyolojik bir serbest radikal olan nitrik oksit (NO•) ile birleşmesi sonucu bir reaktif oksijen türü olan peroksinitrit (ONOO−) meydana gelir. Peroksinitrit, nitrit (NO2−) ve nitrat (NO3−) oluşturmak üzere metabolize edilir. Peroksinitrit, azot dioksit (NO2•), hidroksil radikali (OH•), nitronyum iyonu (NO2+) gibi toksik ürünlere dönüşebilir ki nitrik oksitin (NO•) zararlı etkilerinden peroksinitrit sorumludur (Dawn ve ark., 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve ark. 1999).
2.11.1.5. Hidrojen Peroksit (H2O2)
Hidrojen peroksit (H2O2), süperoksidin çevresindeki moleküllerden bir elektron alması veya moleküler oksijenin çevresindeki moleküllerden iki elektron alması sonucu oluşan peroksitin iki proton (H+) ile birleşmesi sonucu meydana gelir.
O2 + e- + 2H+ H2O2
O2 + 2e- + 2H+ H2O2
Biyolojik sistemlerde hidrojen peroksidin asıl üretimi, süperoksidin (O2⋅⋅⋅⋅−) dismutasyonu ile olur. Đki süperoksit molekülü, süperoksidin dismutasyonu reaksiyonunda iki proton alarak hidrojen peroksit ve moleküler oksijeni oluştururlar.
2O2 + 2H+ H2O2 + O2
Bu reaksiyon, radikal olmayan ürünler meydana geldiğinden dismutasyon reaksiyonu olarak bilinir, ya spontan gerçekleşir ya da süperoksit dismutaz (SOD) enzimi tarafından katalizlenir. Spontan dismutasyon pH 4,8'de en hızlıdır, enzimatik dismutasyon ise spontan dismutasyonun nispeten yavaş olduğu nötral ya da alkali pH'da daha belirgindir.
Hidrojen peroksit bir serbest radikal olmadığı halde reaktif oksijen türleri (ROS) kapsamına girer ve serbest radikal biyokimyasında önemli bir rol oynar. Çünkü Fe2+ veya diğer geçiş metallerinin varlığında Fenton reaksiyonu sonucu, süperoksit radikalinin (O2⋅⋅⋅⋅−) varlığında Haber-Weiss reaksiyonu sonucu en reaktif ve zarar verici serbest oksijen radikali olan hidroksil radikali (OH•) oluşturur.
Fenton reaksiyonu
Fe+2 + H2O2 Fe+3 + OH + OH
-Haber-weiss reaksiyon + H2O2
H+
O2 + H2O + OH
O2
Süperoksit radikalinin yağda çözünürlüğü sınırlı olduğu halde hidrojen peroksit yağda çözünür. Bu nedenle hidrojen peroksit kendisinin oluştuğu yerden uzakta olan fakat Fe2+ içeren membranlarda hasar oluşturabilir (Dawn ve ark., 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve ark. 1999).
2.11.1.6. Hidroksil Radikali (OH••••)
Hidroksil radikali (OH•), Fenton reaksiyonu ve Haber-Weiss reaksiyonu sonucu hidrojen peroksitten oluşmaktadır. Ayrıca suyun yüksek enerjili iyonize edici radyasyona maruz kalması sonucunda oluşur.
Hidroksil radikali son derece reaktif bir oksidan radikaldir, yarılanma ömrü çok kısadır. Hidroksil radikali olasılıkla reaktif oksijen türlerinin (ROS) en güçlüsüdür. Oluştuğu yerde tiyoller ve yağ asitleri gibi çeşitli moleküllerden bir proton kopararak tiyil radikalleri (RS•), karbon merkezli organik radikaller (R•), organik peroksitler (RCOO•) gibi yeni radikallerin oluşmasına ve sonuçta büyük hasara neden olur (Dawn ve ark., 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve ark. 1999).
R-SH + OH + H2O
-CH2- + OH -CH + H2O
RS
2.11.2. Serbest Oksijen Radikallerinin Etkileri
Reaktif oksijen türlerinin (ROS) oluşumu enflamasyon, radyasyon, yaşlanma, normalden yüksek parsiyel oksijen basıncı (pO2), ozon (O3) ve azot dioksit (NO2•), kimyasal maddeler ve ilaçlar gibi bazı uyarıların etkisiyle artar. Serbest radikaller
hücrelerin lipid, protein, DNA, karbonhidrat ve enzim gibi tüm önemli bileşiklerine etki ederler.
Süperoksit radikali (O2⋅⋅⋅⋅−) ve hidroksil radikali (OH•) sitoplazma, mitokondri, nükleus ve endoplazmik retikulum membranlarında lipid peroksidasyonunu başlatır. Membranlarda lipid peroksidasyonu meydana gelmesi sonucu membran geçirgenliği artar. Serbest radikallerin etkisiyle proteinlerdeki sistein sülfhidril grupları ve diğer aminoasit kalıntıları okside olarak yıkılır, nükleer ve mitokondriyal DNA okside olur (Dawn ve ark., 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve ark. 1999).
Şekil 2.15 Serbest radikallerin hücreye etkileri (Dawn ve ark., 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve ark. 1999).
Serbest oksijen radikallerinin tüm bu etkilerinin sonucunda hücre hasarı olur. Hücrede reaktif oksijen türlerinin (ROS) ve serbest radikallerin artışı hücre hasarının önemli bir nedenidir. Đskemi sonrasında reperfüzyon da reaktif oksijen türlerinin (ROS) artışına bağlı olarak iskeminin oluşturduğu hücre hasarını artırır. (Şekil 2.15)
Şekil 2.16 Reaktif oksijen türlerinin zararı (Dawn ve ark., 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve ark. 1999)
Serbest oksijen radikallerinin neden olduğu hücre hasarının birçok kronik hastalığın komplikasyonlarına katkıda bulunduğu düşünülmektedir. (Şekil 2.16) Aterogenez, amfizem/bronşit, Parkinson hastalığı, Duchenne tipi musküler distrofi, gebelik preeklampsisi, serviks kanseri, alkolik karaciğer hastalığı, hemodiyaliz hastaları, diabetes mellitus, akut renal yetmezlik, Down sendromu, yaşlanma, retrolental fibroplazi, serebrovasküler bozukluklar, iskemi/reperfüzyon injürisi gibi durumlarda serbest oksijen radikallerinin neden olduğu hücre hasarı söz konusudur.
2.11.3. Serbest Radikallerin Lipidlere Etkileri
Lipidler serbest radikallerin etkilerine karşı en hassas olan biyomoleküllerdir. Hücre membranlarındaki kolesterol ve yağ asitlerinin doymamış bağları, serbest radikallerle kolayca reaksiyona girerek peroksidasyon ürünleri oluştururlar.
Poliansatüre yağ asitlerinin oksidatif yıkımı lipid peroksidasyonu olarak bilinir. Lipid peroksidasyonu kendi kendini devam ettiren zincir reaksiyonu şeklinde ilerler ve
oldukça zararlıdır. Hücre membranlarında lipid serbest radikalleri (L•) ve lipid peroksit radikallerinin (LOO•) oluşması, reaktif oksijen türlerinin (ROS) neden olduğu hücre hasarının önemli bir özelliği olarak kabul edilir. Serbest radikallerin sebep olduğu lipid peroksidasyonuna "nonenzimatik lipid peroksidasyonu" denir.
Hücre membranlarında lipid peroksidasyonuna uğrayan başlıca yağ asitleri poliansatüre yağ asitleridir. Lipid peroksidasyonu genellikle yağ asitlerindeki konjuge çift bağlardan bir elektron içeren hidrojen atomlarının çıkarılması ve bunun sonucunda yağ asidi zincirinin bir lipid radikali niteliği kazanmasıyla başlar. (Şekil 2. 17)
y . x LH L.
Şekil 2.17 Yağ asidi zincirinin bir lipid radikali niteliği kazanması
Lipid radikali (L•) dayanıksız bir bileşiktir ve bir dizi değişikliğe uğrar. Lipid radikallerinin (L•) moleküler oksijenle (O2) etkileşmesi sonucu lipid peroksit radikalleri (LOO•) oluşur. Lipid peroksit radikalleri (LOO•), membran yapısındaki diğer poliansatüre yağ asitlerini etkileyerek yeni lipid radikallerinin oluşumuna yol açarken kendileri de açığa çıkan hidrojen atomlarını alarak lipidperoksitlerine (LOOH) dönüşürler ve böylece olay kendi kendini katalizleyerek devam eder. (Şekil 2. 18)
L . + O 2 LOO. LOO . + LH LOOH + L.
y x O O. LOO. y x O OH LOOH
Şekil 2.18 Lipid peroksidasyonu
Lipid peroksidasyonu sonucu oluşan lipid peroksitlerinin (LOOH) yıkılımı geçiş metalleri iyon katalizini gerektirir. Plazma membranı ve subsellüler organel lipid peroksidasyonu serbest radikal kaynaklarının hepsiyle uyarılabilir ve geçiş metallerinin varlığında artar. Lokal olarak hidrojen peroksitten (H2O2) Fenton reaksiyonu sonucu hidroksil radikali (OH•) oluşması zincir reaksiyonunu başlatabilir.
Lipid peroksitleri (LOOH) yıkıldığında çoğu biyolojik olarak aktif olan aldehitler oluşur. Bu bileşikler ya hücre düzeyinde metabolize edilirler veya başlangıçtaki etki alanlarından diffüze olup hücrenin diğer bölümlerine hasarı yayarlar.
Üç veya daha fazla çift bağ içeren yağ asitlerinin peroksidasyonunda malondialdehit (MDA) meydana gelir. (Şekil 2. 19)
O
O
Malondialdehit (MDA) kanda ve idrarda ortaya çıkar, yağ asidi oksidasyonunun spesifik ya da kantitatif bir indikatörü olmamakla beraber lipid peroksidasyonunun derecesiyle iyi korelasyon gösterir. Bu nedenle biyolojik materyalde malondialdehit (MDA) ölçülmesi lipid peroksit seviyelerinin indikatörü olarak kullanılır.
Nonenzimatik lipid peroksidasyonu çok zararlı bir zincir reaksiyonudur. Direkt olarak membran yapısına ve ürettiği reaktif aldehitlerle indirekt olarak diğer hücre bileşenlerine zarar verir. Böylece doku hasarına ve birçok hastalığa neden olur (Dawn ve ark., 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve ark. 1999).
2.11.4. Serbest Radikallerin Proteinlere Etkileri
Proteinler serbest radikallere karşı poliansatüre yağ asitlerinden daha az hassastırlar. Proteinlerin serbest radikal harabiyetinden etkilenme derecesi amino asit kompozisyonlarına bağlıdır. Doymamış bağ ve kükürt içeren triptofan, tirozin, fenilalanin, histidin, metiyonin, sistein gibi aminoasitlere sahip proteinler serbest radikallerden kolaylıkla etkilenirler. Bu etki sonucunda özellikle sülfür radikalleri ve karbon merkezli organik radikaller oluşur.
Serbest radikallerin etkileri sonunda, yapılarında fazla sayıda disülfit bağı bulunan immünoglobülin G (IgG) ve albümin gibi proteinlerin tersiyer yapıları bozulur, normal fonksiyonlarını yerine getiremezler. Prolin ve lizin reaktif oksijen türleri (ROS) üreten reaksiyonlara maruz kaldıklarında nonenzimatik hidroksilasyona uğrayabilirler. Hemoglobin gibi hem proteinleri de serbest radikallerden önemli oranda zarar görürler. Özellikle oksihemoglobinin süperoksit radikali (O2⋅⋅⋅⋅−) veya hidrojen peroksitle (H2O2) reaksiyonu methemoglobin oluşumuna neden olur (Dawn ve ark., 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve ark. 1999).
2.11.5. Serbest Radikallerin Nükleik Asitler ve DNA'ya Etkileri
Đyonize edici radyasyonla oluşan serbest radikaller DNA'yı etkileyerek hücrede mutasyona ve ölüme yol açarlar. Hidroksil radikali (OH•) deoksiriboz ve bazlarla
kolayca reaksiyona girer ve değişikliklere yol açar. Aktive olmuş nötrofillerden kaynaklanan hidrojen peroksit (H2O2) membranlardan kolayca geçerek ve hücre çekirdeğine ulaşarak DNA hasarına, hücre disfonksiyonuna ve hatta hücre ölümüne yol açabilir. Süperokside (O2⋅⋅⋅⋅−) maruz kalan DNA molekülleri hayvanlara enjekte edildiklerinde daha fazla antijenik özellik gösterirler ki bu oldukça önemli bir etkidir, çünkü otoimmün bir hastalık olan sistemik lupus eritematozusta (SLE) ve romatoit artritte (RA) dolaşımda anti-DNA antikorlar bulunur (Dawn ve ark., 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve ark. 1999).
2.11.6. Serbest Radikallerin Karbonhidratlara Etkileri
Serbest radikallerin karbonhidratlara etkisiyle çeşitli ürünler meydana gelir ve bunlar, çeşitli patolojik süreçlerde önemli rol oynarlar. Diyabet ve diyabet komplikasyonlarının gelişimi, koroner kalp hastalığı, hipertansiyon, cilt hastalıkları, romatoit artrit, behçet hastalığı, çeşitli deri ve göz hastalıkları, kanser gibi birçok hastalıkta ve yaşlılıkta serbest radikal üretiminin arttığı, antioksidan savunma mekanizmalarının yetersiz olduğu gösterilmiştir. Ancak bu hallerde serbest radikal artışının sebep mi yoksa sonuç mu olduğu tam olarak bilinmemektedir (Dawn ve ark., 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve ark. 1999).
3. MATERYAL ve YÖNTEM
3.1. Mantarlar
Çalışmamız için gerekli olan mantar türleri Tokat ilinin belirli bölgelerinden toplanmıştır. Volemus ve Cibarius Canpolat yaylasın dan, Terreum Kızıl iniş den ve
Elata da Almus bölgesin den nisan-haziran ayları arasında toplanmıştır. Mantarların tür
teşhisi Gaziosmanpaşa Üniversitesi Biyoloji Bölümü Mikoloji Araştırma Laboratuarında Yrd. Doç. Dr. Đbrahim TÜRKEKUL tarafından yapılmış ve herbariyum numarası alınmıştır.
3.2. Kullanılan Kimyasal Maddeler
Etanol (Tekkim), 1,1-Difenil 2-pikril hidrazil (DPPH) (Sigma), Metanol (Merck), Metiyonin, FeCl3 (Sigma), FeCl2 (Sigma), NaOH (Sigma), Aseton, Petrol Eteri (Merck), Ferrozin (Sigma), FeCl2.4H2O(Sigma), K3Fe(CN)6 (Sigma-Aldrich), Potasyum dihidrojen fosfat, Folin-ciocalteus reaktifi (Sigma-Aldrich), Dipotasyum hidrojen fosfat, BHT, BHA, α-tokoferol,
Beher, Balon, Vezin Kabları vb. laboratuar malzemeleri. Evaporatör (Heidolph Laborata 4001),
Santrifuj (EBA-21 Hettich), GC-MS (Perkin Elmer Clarus500)
pH metre, Mikro pipet, Manyetik karıştırıcı, Çeşitli ebatlarda vezin kapları,
3.3. Mantar ekstraksiyonu ve analizler için hazırlanması
Mantar türleri toplanıp güneş görmeyen yerde iyice kurutulduktan ve öğütüldükten sonra her bir mantar türünden 5gr alınarak 150 mL çözücüde (1:1 metanol+metilen klorür) numunelerin ekstraktları hazırlandı. Elde edilen her bir ekstre aşağıdaki antioksidan aktivite testleri için kullanıldı.
Daha sonra elde edilen her bir ekstraktın serbest radikal (DPPH·) giderme aktivitesi (Liyana-Pathirana ve ark., 2005), metal şelat oluşturma aktivitesi (Carter, 1971), indirgeme gücü aktivitesi (Oyaizu, 1986) in vitro olarak ölçüldü. Bu aktivitelerin her biri α-tokoferol (vitamin E), bütillenmiş hidroksi toluen (BHT), bütillenmiş hidroksi anisol (BHA) gibi antioksidan maddelerin antioksidan aktiviteleri ile karşılaştırıldı.
Antioksidan testleri çalışmada kullanılan mantarlar için üç tekrar yapılarak sonuçların ortalaması alınmıştır.
3.4. Antioksidan Aktivite Testleri
Doğal ürünler büyük oranda antioksidan özelliğe sahip fenolik bileşikler (örneğin; fenolik asitler, flavanoidler, antosiyaninler, taninler, lignanlar ve kateşinler) içerir. Bu bileşikler, kalp hastalıkları, bazı kanser türleri ve oksidatif strese bağlı diğer hastalıklara yakalanma riskini arttırdığı bilinen zararlı serbest radikalleri engeller. Bu bileşiklerin antioksidan özellikleri temelde onların hidrojen atomu vericisi veya indirgeme ajanı olarak davranmalarından dolayı indirgeyebilme yeteneklerinden kaynaklanır. Bu doğal antioksidanlar; serbest radikal toplayıcısı, zincir kırıcı, proantioksidant metal iyonlarını kompleksleştiricisi olarak davranır.
Meyvelerin, sebzelerin ve diğer doğal kaynaklı ürünlerin antioksidan aktivitesini bir tek testle kesin olarak tespit etmek zordur. Doğal kaynaklı ürünlerin antioksidan aktivitesini değerlendirmek için birçok test önerilmiştir. Doğal ürünlerin antioksidan aktivitesinin belirlenmesi için en azından üç test uygulanmalıdır.
3.4.1. Serbest Radikal (DPPH·) Giderme Aktivitesi
Mantarların serbest radikal (DPPH·:2,2-difenil-1-pikril hidrazil) giderme aktivitesi Liyana-Pothirano metoduna göre yapıldı (Liyana ve ark., 2005). Mantar ekstreleri ve standart (BHT, BHA, α-Tokoferol) olarak kullanılan bileşiklerden stok çözeltiler (1mg/mL) hazırlandı. Daha sonra1 mL (0,17 mM) DPPH· çözeltisine değişik
konsantrasyonlarda (10-80µg/mL) numune ve standartlardan ilave edildi. Son hacim etanolle 4 mL’ye tamamlandı. Pozitif kontrol için 3 mL etanol+1 mL DPPH· çözeltisiden oluşturuldu. Kör olarak etanol kullanıldı. Işık görmeyen yerde otuz dakika inkübe edildikten sonra 517 nm de absorbans okundu.
DPPH• (1,1-Difenil 2-pikril hidrazil) serbest bir radikaldir, bir elektron veya hidrojen radikali alarak stabil diamanyetik molekül haline gelir. Bu metod, koyu menekşe renkli olan DPPH· çözeltisinin, sistem içindeki herhangi bir molekül tarafından elektron transferi olduğunda renginin açılması ve bu renk değişikliğinin UV spektrometre ile ölçülmesi esasına dayanır renk ne kadar açılır ve çözelti absorbansı ne kadar düşük çıkarsa serbest radikal giderme aktivitesi o kadar artar.
Aşağıdaki formül kullanılarak serbest radikal (DPPH·) aktivitesi hesaplanmıştır.
DPPH· radikali giderme aktivitesi (%) = [(A0-A1/A0)X100)
A0: Negatif kontrolün absorbansı
A1: Ekstrelerin veya pozitif kontrol olarak kullanılan standartların absorbansı
3.4.2. Đndirgeme Gücü Aktivitesi
Mantar ekstraktlarının total indirgenme gücü Oyaizu metodu kullanılarak belirlendi (Oyaizu, 1986). Değişik konsantarsyonlar olacak şekilde mantar ekstrelerinin ve standartlardan tüplere pipetlendikten sonra üzerine 2,5 mL fosfat (KH2PO4 ) tamponu (0,2 M pH: 6,6) ve 2,5 mL potasyum ferrisiyanür K3Fe(CN)6 (%1’lik) çözeltileri ilave edildi. Đyice vortekslendikten sonra 20 dakika 50 oC’lik su banyosunda inkübe edildi. Daha sonra %10’luk trikloroasetik asit (TCA) çözeltisinden 2.5mL bu karışıma eklendi ve on dakika 3000 rpm’de santrifüjlendi. Santrifüjlenen karışımdan 2,5 mL alınıp üzerine 0,5 mL %1’lik demir(III) klorür (FeCl3) çözeltisi eklendi ve vortekslendi. Daha sonra UV-Vis spektroskopisi kullanılarak 700 nm’ de köre karşı absorbansları okundu.
3.4.3. Metal Şelatlama Aktivitesi
Mantarların metal şelatlama aktivitesi Carter tarafından belirlenen metotla yapıldı (Carter, 1971). Değişik konsantrasyonlarda (10-30µg/mL) numune ve standartlar üzerine sırayla 2 µM 0,05 mL FeCl2 ve 5 µM 0,2 mL ferrozin eklendi. Toplam hacmi 4 mL olacak şekilde etanol ilave edilir. Daha sonra on dakika oda sıcaklığında bekletilir. Kör için 2 µM 0,05 mL FeCl2 üzerine toplam hacim 4 mL olacak kadar etil alkol eklenilir. 562 nm de spektrofotometrede ölçümler yapıldı. Kontrol ferrozin ve FeCl2 içerir.
Metal Şelatlama Yüzdesi = ( A0 – A1 ) / A0 . 100
A0: Kontrol absorbansı
A1: Numune ve standartların absorbansı
3.5. Malondialdehit (MDA) Ölçümü
Mantarların Malondialdehit ölçümü Gutteridge ve Quinlan tarafından yayınlanan metoda göre yapıldı (Gutteridge ve ark., 1993). Deney kısaca şu şekilde yapıldı: 0,2 ml numune üzerine 0,8 ml fosfat tamponu, 0,025 mL BHT ve 0,5 %30’luk TCA eklendi. Tüpler vorteksle karıştırıldı ve iki saat buzda bekletilir. Daha sonra 2000 devir/dak. da 15 dak. santrifüj edildi. Süpernatantdan 1 mL alınarak başka bir tüpe aktarıldı. Üzerine 0,075 mL 0,1 M’lık EDTA ve 0,25 mL %1’lik TBA eklendi. Tüpler karıştırıldı ve kaynar su banyosunda 15 dk. bekletildi. Oda sıcaklığına getirildikten sonra spektrofotometrede 532 nm de köre karşı absorbansları okundu.
Hesaplama MDA-TBA kompleksinin 532 nm deki ekstinksiyon katsayısından (1,56x105 cm-1 M-1) yararlanılarak g/kg cinsinden MDA değerleri bulundu.
3.6. Yağ Asitleri Analizi
Örnekler önce öğütücüde öğütülerek toz haline getirildi. Daha sonra her bir mantar türünden 3,5 gram alınarak kloroform/ metanol (2:1) karışımı ile lipit ekstraksiyonu yapıldı. Evaporatorde çözücüsü uzaklaştırılan lipit örnekleri 2mL hegzanda çözüldü ve metil esterleri haline getirildi. Bunun için total lipit örneği bulunan her bir tüpe metil alkolde çözülmüş 2 N’lik KOH çözeltisinden 3mL ilave edildi. 3 dakika vortekslendi. Organik faza geçmiş olan yağ asitleri metil esterleri FĐD detektörü kullanılarak gaz kromatografi ile tayin edildi (Christe, 1993).
4. BULGULAR ve TARTIŞMA
4.1. Serbest Radikal (DPPH·) Giderme Aktivitesi
Mantarların ve standartların % DPPH· radikali giderme aktiviteleri belirlenmiştir (Şekil 4.1). Mantarlara ait sonuçlar standartlarla karşılaştırıldığında serbest radikal giderme aktivitelerinin Lactarius volemus ve Morchella elata da diğer iki mantar türüne göre daha iyi olduğu görülmüştür. Şekil 4.1 de görüldüğü gibi mantarlarda elde edilen serbest radikal giderme aktiviteleri pozitif kontrol olarak kullanılan BHT ve α-tokoferol sonuçları ile kıyaslandığında Morchella elata mantarının standartlara yakın bir aktiviteye sahipken Lactarius volemus yüksek konsantrasyonlarda standartlara yakın aktiviteye sahip olduğu görülmektedir. Tricholama terreum ve Cantharellus cibarius mantarlarının serbest radikal giderme aktivitelerinin standart olarak kullanılan BHA ve α-tokoferolden çok düşük olduğu gözlemlenmiştir. Tricholama terreum ve Cantharellus
cibarius mantarlarının serbest radikal giderme aktiviteleri yok denecek kadar düşük
olduğu Şekil 4.1’de de görülmektedir.
Kalyoncu ve arkadaşlarının 10 yabani mantar türü üzerinde yaptığı çalışma da
Morchella elata nın yüksek oranda radikal giderme aktivitesi gösterdiği belirlenmiştir.
(Kalyoncu ve ark., 2010). Queiros ve arkadaşlarının yenebilir bazı yabani mantar türleri üzerinde yapmış olduğu çalışmada Cantharellus cibarius un DPPH aktivitesinin oldukça düşük olduğu belirlenmiştir (Queiros ve ark., 2009). Ramirez-Anguiano AC ve arkadaşları yenebilir bazı yabani mantar türleri üzerinde yaptıkları çalışmada ayrı ayrı metanol ve su kullanarak elde ettikleri ekstraktların her ikisi de çok düşük oranda DPPH aktivite gösterdiği belirlenmiştir(Santoyo ve ark., 2009).
