T.C
NİĞDE ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
BİYOLOJİ ANA BİLİM DALI
ALABALIK (Oncorhynchus mykiss) KAS VE SOLUNGAÇ DOKULARINDA FARKLI KONSANTRASYONLARDA POLEN EKSTRAKTI
UYGULAMASI İLE MEYDANA GELEN BİYOKİMYASAL DEĞİŞİMLER
AYŞE KIRKBEŞ Ocak 2014 A . K IR K B E Ş , 2014 Y Ü K S EK Lİ S A N S TE Zİ N İĞ D E Ü N İV ER S İTE S İ F EN B İLİ MLER İ EN S Tİ TÜ S Ü
T.C.
NĐĞDE ÜNĐVERSĐTESĐ FEN BĐLĐMLERĐ ENSTĐTÜSÜ
BĐYOLOJĐ ANA BĐLĐM DALI
ALABALIK (Oncorhynchus mykiss) KAS VE SOLUNGAÇ DOKULARINDA FARKLI KONSANTRASYONLARDA POLEN EKSTRAKTI
UYGULAMASI ĐLE MEYDANA GELEN BĐYOKĐMYASAL DEĞĐŞĐMLER
AYŞE KIRKBEŞ
Yüksek Lisans Tezi
Danışman
Doç. Dr. ZELĐHA SELAMOĞLU TALAS
iv ÖZET
ALABALIK (Oncorhynchus mykiss) KAS VE SOLUNGAÇ DOKULARINDA FARKLI KONSANTRASYONLARDA POLEN EKSTRAKTI
UYGULAMASI İLE MEYDANA GELEN BİYOKİMYASAL DEĞİŞİMLER
KIRKBEŞ, Ayşe Niğde Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Ana Bilim Dalı
Danışman : Doç. Dr. Zeliha SELAMOĞLU TALAS
İkinci Danışman : Dr. Shapour KAKOOLAKI
Ocak 2014, 46sayfa
Son yıllarda doğal antioksidanların insan sağlığı açısından önemini ortaya koyan birçok çalışma yapılmaktadır. Doğal antioksidan özellikte bir ürün olan arı poleni, içeriğini oluşturan polifenoller ve flavanoidler ile çeşitli farmakolojik etkiler gösterebilmekte ve oksidatif stresi nötralize eden hücrelerin kapasitesini arttırarak, antioksidatif ve antiinflammatuar olarak katkıda bulunmaktadır. Bu çalışmada, farklı konsantrasyonlarda (0.5, 2.5, 5, 10, 20, 30 ppm) polen ekstraktı uygulaması ile gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss) kas ve solungaç dokularında meydana gelecek biyokimyasal değişiklikler kontrol grubu verileri ile karşılaştırılarak etkin polen ekstraktı konsantrasyonu tespit edilecektir. Böylece çalışmamızda gökkuşağı alabalıklardan elde edilecek doku parçalarında biyokimyasal parametreler analiz edilerek polen ekstraktının gökkuşağı alabalık kas ve solungaç dokularında hangi konsantrasyonda en etkili antioksidan kapasiteye sahip olduğunun araştırılması hedeflenmektedir.
v SUMMARY
BIOCHEMICAL CHANGES ON RAINBOW TROUT (Oncorhynchus mykiss) MUSCLE AND GILL TISSUES THAT OCCUR WITH THE TREATMENT OF
DIFFERENT CONCENTRATIONS OF POLLEN EXTRACT
KIRKBES, Ayse Nigde University
Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Biology
Supervisor : Assoc. Prof. Dr. Zeliha SELAMOĞLU TALAS
Co-Advisor :Dr. Shapour KAKOOLAKI
January 2014, 46 pages
There are many studies carried out to introduce the importance of natural antioxidants on human health in recent years. Bee pollen is extremely rich in natural antioxidants, it is rich in polyphenols and flavonoids therefore it may show various pharmacological effects and increases the capacity of the cells which neutralizes oxidative stress and contributes as an antioxidative and antiinflammatory. In this study effective pollen extract concentration will be determined by comparing different concentrations of pollen extract (0.5, 2.5, 5, 10, 20, 30 ppm) on the biochemical changes in the muscle and gill tissues of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) to the control group. Thus in our study the most effective antioxidant capacity of the pollen extract has been aimed to investigate by analysing of biochemical parameters in the muscle and gill tissues of rainbow trouts.
vi ÖN SÖZ
Bu yüksek lisans çalışmasında, antioksidan özellikte bir besin olan polen farklı konsantrasyonlarda hazırlanarak, alabalık kas ve solungaç dokularında kontrol grubu değerleri ile karşılaştırıldı. Çalışmamızın sonucunda polenin alabalık kas ve solungaç dokularında 10 ppm konsantrasyonda en etkili antioksidan aktiviteye sahip olduğu tespit edildi.
Yüksek lisans tez çalışmamın yürütülmesi esnasında, yardımlarını esirgemeyen danışman hocam, Sayın Doç. Dr. Zeliha SELAMOĞLU TALAS’a teşekkürlerimi sunarım. Yüksek lisans tez çalışmam esnasında tecrübelerine başvurduğum Iranian Fisheries Research Organization da araştırmacı, eş danışmanım Sayın Dr. Shapour KAKOOLAKI’ye, tez çalışmam esnasında çalışma laboratuvarından yararlandığım Gaziantep Üniversitesi, Fen Edebiyat Fakültesi öğretim üyesi Sayın Yrd. Doç. Dr. Hasan AKGÜL’e, Cumhuriyet Üniversitesi Veteriner Fakültesi öğretim üyesi Sayın Yrd. Doç. Dr. Sevgi DURNA DAŞTAN’a, tez çalışmam boyunca benden manevi desteğini esirgemeyen biyoloji ana bilim dalı yüksek lisans öğrencisi sevgili arkadaşım Fatma KURUL’a, Niğde Üniversite’si yüksek lisans öğrencisi çalışma arkadaşım Hamide BALI DOĞAN’a, Niğde Ünivesitesi doktora öğrencisi çalışma arkadaşım Mehmet Fuat GÜLHAN’a ve diğer çalışma arkadaşlarıma sonsuz teşekkürler.
Bu tezi, sadece bu çalışmam boyunca değil, tüm öğrenim hayatım boyunca maddi ve manevi koruyuculuğumu üstlenen babam Dede KIRKBEŞ’e, annem Fatma KIRKBEŞ’e ve sevgili kardeşlerim Fatma Selin, Rukiye ve Semanur KIRKBEŞ’e ithaf ediyorum. Bu çalışmaya F-380 numaralı proje ile finansal destek sağlayan Cumhuriyet Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimine ve çalışanlarına katkılarından dolayı teşekkür ederim.
vii İÇİNDEKİLER ÖZET ………...………...…..iv SUMMARY …...………..………..………..….…………...v ÖN SÖZ ……...…………..………...………...…...vi İÇİNDEKİLER ………...……...………...vii ÇİZELGELER DİZİNİ ………...………...ix ŞEKİLLER DİZİNİ ………...……...x
SİMGE VE KISALTMALAR ………...…….xii
BÖLÜM I GİRİŞ ..……..………...…………...………...1
BÖLÜM II GENEL BİLGİLER ………..………....3
2.1 Oksidatif Stres ve Etkileri ………….………..3
2.2 Antioksidan Savunma Sistemleri ………..…..4
2.3 Doğal Arı Ürünleri……….…..…6
2.3.1 Polenin genel özellikleri ………..…………6
2.4 Çalışılan Deney Hayvanı Hakkında Bilgiler ………...8
2.5 Tez Kapsamında Çalışılan Dokular ………8
2.5.1 Kas doku ………..………8
2.5.2 Solungaç doku ………...8
2.6 Tez Kapsamında Çalışılan Parametreler ………..….…..9
2.6.1 MDA ……..……….…...9
2.6.2 TAS-TOS-OSİ ………...9
2.6.3 Tiyol grubu………..………..…...10
BÖLÜM III KAYNAK ÖZETLERİ ………...…………...11
BÖLÜM IV MATERYAL ve METOD ………..……….…..14
4.1 Materyal ………14
4.1.1 Deneyde kullanılan kimyasal maddeler ……….14
4.1.2 Deneyde kullanılan aletler ………...14
4.1.3 Balıkların temini ve deney gruplarının hazırlanması ………...…….15
4.2 Metodlar ..……….15
4.2.1 Polen ekstraktının hazırlanması ……….15
4.2.2 Diseksiyon işlemi ………..16
viii
4.3 Biyokimyasal Analizler ………....16
4.3.1 Malondialdehit (MDA) düzeylerinin analizi ……….16
4.3.2 Toplam antioksidan seviye (TAS) analizi ……….17
4.3.3 Toplam antioksidan seviye (TOS) analizi ……….17
4.3.4 Oksidatif stres indeksi (OSI) analizi ………..17
4.3.5 Tiyol gruplarının analizi ……..………..17
4.3.6 Protein analizi ………18
4.3.7 İstatistiksel analiz ………..18
BÖLÜM V BULGULAR ………..19
5.1 Malondialdehid (MDA) Analiz Sonuçları ………19
5.1.1 Kas dokuda MDA analiz sonuçları ………19
5.1.2 Solungaç dokuda MDA analiz sonuçları ………...20
5.2 Toplam Antioksidan Seviye (TAS) Analiz Sonuçları ………..21
5.2.1 Kas dokuda TAS analiz sonuçları ……….21
5.2.2 Solungaç dokuda TAS analiz sonuçları ……….22
5.3 Toplam Oksidan Seviye (TOS) Analiz Sonuçları ………23
5.3.1 Kas dokuda TOS analiz sonuçları ……….23
5.3.2 Solungaç dokuda TOS analiz sonuçları ………24
5.4 Oksidatif Stres İndeksi (OSİ) Analiz Sonuçları ………...….… ..25
5.4.1 Kas dokuda OSİ analiz sonuçları ………..25
5.4.2 Solungaç dokuda OSİ analiz sonuçları ………..26
5.5 Toplam Tiyol Düzeyi Analiz Sonuçları……….27
5.5.1 Kas dokuda toplam tiyol düzeyi analiz sonuçları ………27
5.5.2 Solungaç dokuda toplam tiyol düzeyi analiz sonuçları ……….28
BÖLÜM VI TARTIŞMA ………...29
KAYNAKLAR ………...37
ÖZGEÇMİŞ ………45
ix
ÇİZELGELER DİZİNİ
Çizelge 2.1. Arılar tarafından toplanan polende bulunan maddeler ……….7 Çizelge 5.1. Kontrol grubu ve 96 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda polen ekstraktı uygulanan alabalıkların kas dokularında MDA düzeyleri………...19 Çizelge 5.2. Kontrol grubu ve 96 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda polen ekstraktı uygulanan alabalıkların solungaç dokularında MDA düzeyleri……….…..……...20 Çizelge 5.3. Kontrol grubu ve 96 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda polen ekstraktı uygulanan alabalıkların kas dokularında TAS düzeyleri……….…...………..21 Çizelge 5.4. Kontrol grubu ve 96 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda polen ekstraktı uygulanan alabalıkların solungaç dokularında TAS düzeyleri ……….…………...…..22 Çizelge 5.5. Kontrol grubu ve 96 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda polen ekstraktı uygulanan alabalıkların kas dokularında TOS düzeyleri .………...………. 23 Çizelge 5.6. Kontrol grubu ve 96 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda polen ekstraktı uygulanan alabalıkların solungaç dokularında TOS düzeyleri ………..……...………24 Çizelge 5.7. Kontrol grubu ve 96 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda polen ekstraktı uygulanan alabalıkların kas dokularında OSİ düzeyleri ……….……….25 Çizelge 5.8. Kontrol grubu ve 96 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda polen ekstraktı uygulanan alabalıkların solungaç dokularında OSİ düzeyleri ……….……….26 Çizelge 5.9. Kontrol grubu ve 96 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda polen ekstraktı uygulanan alabalıkların kas dokularında tiyol düzeyleri ………..….……….27 Çizelge 5.10. Kontrol grubu ve 96 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda polen ekstraktı uygulanan alabalıkların solungaç dokularında tiyol düzeyleri …...……28
x
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil 2.1. Hücrenin antioksidan savunma mekanizması ………...4 Şekil 5.1. Kontrol grubu ve 96 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda polen ekstraktı uygulanan alabalıkların kas dokularında MDA değerlerini gösteren grafik …..19
Şekil 5.2. Kontrol grubu ve 96 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda polen ekstraktı uygulanan alabalıkların solungaç dokularında MDA değerlerini gösteren grafik ……….20 Şekil 5.3. Kas Kontrol grubu ve 96 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda polen ekstraktı uygulanan alabalıkların kas dokularında TAS değerlerini gösteren grafik ….21 Şekil 5.4. Kontrol grubu ve 96 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda polen ekstraktı uygulanan alabalıkların solungaç dokularında TAS düzeylerini gösteren grafik ………...22 Şekil 5.5. Kontrol grubu ve 96 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda polen ekstraktı uygulanan alabalıkların kas dokularında TOS düzeylerini gösteren grafik ………...………..23 Şekil 5.6. Kontrol grubu ve 96 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda polen ekstraktı uygulanan alabalıkların solungaç dokularında TOS düzeylerini gösteren grafik ………...…………..24 Şekil 5.7. Kontrol grubu ve 96 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda polen ekstraktı uygulanan alabalıkların kas dokularında OSİ düzeylerini gösteren grafik ………..………...25 Şekil 5.8. Kontrol grubu ve 96 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda polen ekstraktı uygulanan alabalıkların solungaç dokularında OSİ düzeylerini gösteren grafik ……….……..26
xi
Şekil 5.9. Kontrol grubu ve 96 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda polen ekstraktı uygulanan alabalıkların kas dokularında toplam tiyol düzeylerini gösteren grafik ………...27
Şekil 5.10. Kontrol grubu ve 96 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda polen uygulanan alabalıkların solungaç dokularında toplam tiyol düzeylerini gösteren grafik ………...………..28
xii SİMGE VE KISALTMALAR Simgeler Açıklama α Alfa β Beta Kısaltmalar Açıklama DPPH 1,1-difenil-2-picrylhydrazine C2H5OH Etil Alkol H3PO4 Fosforik Asit GSH-Px Glutatyon Peroksidaz GSSH Oksitlenmiş Glutatyon GR Glutatyon Redüktaz
H2O2 Hidrojen Peroksit
HO-. Hidroksil Radikal
CAT Katalaz
CAPE Kafeik Asit Fenil Etil Ester
MDA Malondialdehit
OSİ Oksidatif Stres İndeksi
KCI Potasyum Klorür
ROT Reaktif Oksijen Türleri
DHA Semidehidroaskorbat
1
O2 Singlet Oksijen
NaH2PO4 Sodyum Bi Hidrojen Fosfat
NaOH Sodyum Hidroksit
NaCI Sodyum Klorür
SOD Süperoksit Dizmutaz
O2-. Süperoksit Radikali
TAS Toplam Antioksidan Seviye
TOS Toplam Oksidan Seviye
1 BÖLÜM I
GİRİŞ
Çevre, insan sağlığı ve hastalıklar için önemli bir yere sahiptir. Çevresel streslerin oksidatif strese ve hücre redoks dengesinde değişikliklere sebep olduğu bilinmektedir. Toksik, mutajenik ve karsinojenik etkilere sebep olabilen çevresel kirleticiler ve kimyasal maddelere maruz kalma ile toplum sağlığı üzerinde çeşitli olumsuzluklar meydana gelmekte ve dolayısıyla birçok canlı da bu durumdan zarar görmektedir (Francoa vd., 2009). Bu toksik maddeler hücrede serbest radikallerin etkisini arttırarak kanser gibi birçok kronik hastalıkların ortaya çıkmasına yol açan oksidatif hasarlara sebep olmaktadırlar (Murphy, 2001).
Stres faktörlerinin gideriminde ve zararlı etkilerinin önlenmesinde kullanılan ilaçların yanı sıra antioksidan maddelere de ihtiyaç duyulmaktadır. En iyi antioksidan etkiye sahip bileşikler arasında biyoflavonoidler yer almaktadır. Özellikle de doğal arı ürünleri, zengin biyoflavonoid içeriği ile dikkat çeken antioksidan maddeler arasında yer almaktadır (Leja vd., 2007; Selamoğlu Talas vd., 2013).
Arı ürünlerinin birçok hastalığın önlenmesi ve tedavi amaçlı kullanımına “apiterapi” denilmektedir. Apiterapi bugüne kadar çok fazla gündemde yer almasada, arıcılık kadar eski bir yöntemdir. Bal arılarının çiçekli bitkilerden toplayıp konsantre hale getirdikleri karbonhidratlar, vitaminler, koenzim, polifenoller, aroma bileşikleri ile terpen ve terpenoidler, alifatik bileşikler, yağ asitleri gibi uçucu bileşikler bu doğal ürünlerin bileşenleri arasında yer alan, yüksek antioksidan kapasiteye sahip besin maddeleridir (Mercan vd., 2007; Selamoğlu Talas vd., 2013).
Son zamanlarda dikkat çekici antioksidan maddelerden biri de çiçekli bitkilerin anterlerinde oluşan ve döllenmede rol alan erkek üreme birimi olan polendir. Polen; protein, karbonhidrat, mineral madde, enzim ve vitamin bakımından zengin besin maddesidir. Arılar yavruları beslemek ve kovanın protein ihtiyacını karşılamak için polen toplarlar. Topladıkları bu poleni kovana taşıyarak petek gözlerinde biriktirirler. (Campos vd., 2008).
Tüm çevrede olduğu gibi sularda da sanayinin gelişmesine bağlı olarak artan kirlilik, başta insan olmak üzere insan diyetinde önemli bir yer tutan balık ve birçok sucul
2
organizmada çeşitli sağlık problemlerinin oluşumuna yol açmaktadır (Liua vd., 2011). Besin zincirinde yer alan ve protein kaynağı olarak insanlar tarafından tüketilen balıklarda oluşan stres faktörleri, besin zinciri yolu ile onları tüketen insanlara geçmektedir (Eraslan vd., 2007).
Sucul organizmalarda hem metabolik hem de çevresel faktörlerin etkisiyle meydana gelen oksidatif stres ve yol açtığı hasarlar antioksidan ajanlar kullanılarak giderilebilmektedir. Arı ürünleri arasında önemli bir yer tutan polenin sucul organizmalar üzerinde antioksidan etkisi ve en etkin antioksidan konsantrasyonunun belirlenmesine yönelik bir araştırmaya ve literatür bilgisine rastlanmamıştır.
Bu bilgiler doğrultusunda, bu çalışmada farklı konsantrasyonlarda (0.5, 2.5, 5, 10, 20, 30 ppm) polen ekstraktı uygulaması sonucu gökkuşağı alabalığının (Oncorhynchus
mykiss) kas ve solungaç dokularında bazı biyokimyasal parametrelerin analizi ile
antioksidan olarak en etkin polen konsantrasyonunun belirlenmesi hedeflenmiştir. Bu çalışmada, ekstraksiyon işleminden sonra elde edilen polen özütleri farklı konsantrasyonlarda hazırlanarak, alabalıkların bulunduğu akvaryum ortamına uygulamalar yapıldı. Uygulamalardan sonra, gökkuşağı alabalıklarında kas ve solungaç dokularının malondialdehit (MDA) düzeyi, toplam antioksidan seviye (TAS), toplam oksidan seviye (TOS), oksidatif stres indeksi (OSİ) ve toplam tiyol düzeyleri Rel Assay marka ticari kitler kullanılarak analiz edildi.
3 BÖLÜM II GENEL BİLGİLER 2.1 Oksidatif Stres ve Etkileri
Çiftlenmemiş elektrona sahip olan serbest radikaller başka moleküllerle kolayca elektron alışverişine girebilen kararsız yapılı oksidan moleküller ya da reaktif oksijen türleri (ROT)’dir. Bu moleküller, kararlı hale gelebilmek için hücrelere saldırarak hücrelerde hasar oluşturabilirler (Thirumalai vd., 2011). Biyolojik sistemlerde serbest radikal oluşumunun artması; prooksidanlar ile antioksidanlar arasındaki dengenin, prooksidanlar lehine bozulması olarak tanımlanan oksidatif stresin zarar verici etkilerini de arttırmaktadır. Oksijenden türevlenen başlıca reaktif türler; süperoksit radikali (O2.-), hidroksil radikali (HO.-), hidrojen peroksit (H2O2) ve singlet oksijen(1O2)’dir.
Hücrede enerji metabolizmasında oksidasyon esnasında oluşan ya da oksidazlar gibi bazı enzimlerin aktivitesi sonucu oluşan O2
.-, hidrojen peroksite yıkılır ve bu da geçiş metalleri varlığında daha çok hasar verici radikallere dönüşerek hücrelere zarar vermektedir (Scheibmeir vd., 2005).
Moleküler oksijenin çevresindeki moleküllerden 2 e- alması ya da süperoksitin bir elektron alıp 2 H atomuyla birleşmesi sonucu oluşan hidrojen peroksit; serbest radikal değildir, fakat hücresel zarlardan kolaylıkla geçerek zararlı bazı etkilere sebep olabilmektedir (Deaton ve Marlin, 2003).
Moleküler oksijene üç elektron transferi ile meydana gelen ve vücutta serbest radikal hasarının en önemli sorumlusu olan HO-., süperoksit ile hidrojen peroksitin reaksiyona girmesi sonucu da meydana gelmektedir (Song, 2004).
Ortaklanmamış elektron taşımayan ve radikal olmayan tek reaktif oksijen molekülü ise tekil oksijen (1O2)’dir (Akkuş, 1995).
Hücreler hafif oksidatif stresi tek başlarına tolere edebilseler de genellikle antioksidan enzim sistemlerini aktif hale getirerek oksidatif stresin zararlı etkilerini azaltmaya çalışırlar (Sun ve Hu, 2005).
4 2.2 Antioksidan Savunma Sistemleri
ROT’un oluşumunu ve bunların meydana getirmiş olduğu hasarları önlemek için birçok savunma mekanizması bulunmaktadır. Bu mekanizmalar "antioksidan savunma sistemleri" veya kısaca "antioksidanlar" olarak bilinmektedir (Şekil 2.1).
Şekil 2.1. Hücrenin antioksidan savunma mekanizması (Akkuş, 1995)
Antioksidanlar; hücre içi ve hücre dışı enzim ve enzim olmayan savunma mekanizmaları geliştirerek organizmayı oksijenin hasar verici reaksiyonlarına ve düşük molekül ağırlıklı serbest radikal hasarına karşı korurlar (McLean vd., 2005).
Balıklarda antioksidan savunma sistemleri, çevresel koşullardan (suyun sıcaklığı ve oksijen oranı, mevsimsel değişimler, hastalık, stres, kirlilik, gürültü, ışık) ve besin içeriğinden etkilenmektedir. Balığın sağlığı ve gelişiminde etkili olan antioksidan maddelerin belirli düzeylerde bulunması gerektiği yapılan araştırmalarla ortaya konulmuştur (Tuna Keleştemur ve Özdemir, 2011).
Enzim ve enzim olmayan antioksidanlar; endojen ve ekzojen kaynaklı olabilmektedirler. Süperoksit dizmutaz (SOD), glutatyon peroksidaz (GSH-Px) ve katalaz (CAT) başlıca enzim olan endojen antioksidanlardır. SOD, süperoksit radikalini hidrojen peroksit ve moleküler oksijene dönüştüren enzimdir (Nadithea ve Baea, 2010).
5
Sitosolde bulunan ve 4 selenyum atomu içeren GSH-Px, tetramerik yapıda olup hidrojenperoksit radikalinin indirgenmesinden sorumlu enzimdir (Parks vd., 1996). Dört tane hem grubu içeren katalaz bir hemoprotein olup peroksizomlarda bulunur ve hidrojen peroksidi suya ve oksijene parçalar (Parks vd., 1996).
Melatonin, glutatyon ve albumin gibi endojen moleküller enzim olmayan antioksidanlar sınıfında yer almaktadırlar. Hücrenin hemen hemen tüm organellerine ve birçok dokuya rahatça girerek geniş bir aktivite gösterebilen melatonin, HO
radikalini temizleyen çok güçlü bir antioksidandır. Dokularda yaygın olarak indirgenmiş (GSH) ve oksitlenmiş (GSSG) şekilde bulunan glutatyon; karaciğerde glutamik asit, sistein ve glisinden oluşan, epoksit, peroksit ve diğer serbest radikalleri yıkarak zararlı bileşiklerin detoksifikasyonunda görev alan antioksidan özellikte bir tripeptittir (Cnubben vd., 2001). Yapısında bulunan çok sayıdaki sülfidril grubu aracılığıyla bakır iyonlarını sıkı şekilde bağlayan albumin, bakır bağımlı lipit peroksidasyonu ile HO.- oluşumunu inhibe etmektedir (Halliwell ve Gutteridge, 2000).
Vitaminler (E, A, C) gıda ile alınan ekzojen antioksidanlar olup, E vitamini (α tokoferol) yağda çözünebilen temel antioksidanlardandır. Plazmada baskın olarak bulunan ve en yüksek antioksidan aktiviteye sahip olan α- tokoferol membran lipitlerinde çözünerek peroksidasyon zincirini kırar. A vitamini (β-karoten)’nin antioksidan etkisi tekil oksijeni yakalaması, serbest radikalleri temizlemesi ve hücre membranı lipitlerini oksidatif dejenerasyona karşı koruması şeklindedir. Suda çözünebilen ve zincir kıran bir antioksidan olan C vitamini (askorbik asit) ise özellikle detoksifikasyon metabolizması esnasında meydana gelen serbest radikalleri ve ROT’ları etkisiz hale getirmektedir (Carr vd., 2000).
6 2.3 Doğal Arı Ürünleri
Antioksidanların insan ve diğer canlıların sağlığı üzerindeki etkileri her geçen gün daha fazla aydınlatılmakta ve ön plana çıkmaktadır. Birçok hastalığın tedavisinde antioksidan özellik gösteren doğal ürünlerden yararlanılmaktadır. Özellikle, son yıllarda dünyada “apiterapi” adı verilen arı ürünleri ile tedavi yöntemleri dikkat çekmektedir. Arıcılık faaliyetlerinden elde edilen bal, polen, propolis, arı sütü ve arı zehiri gibi ürünler halk arasında birçok hastalığın tedavisinde ilaçların yanı sıra ek terapötik ajanlar olarak kullanılmaktadır. Polen antioksidan kapasitesi oldukça yüksek olan bir arı ürünüdür (Şahinler, 2000). Yüksek koruyucu potansiyele sahip olan bu antioksidan maddenin özellikle sucul organizmalar üzerindeki antioksidan etkisi ve sucul canlılardaki etkin konsantrasyonu ile ilgili bir çalışmaya ve literatür bilgisine henüz rastlanılmamıştır.
2.3.1 Polenin genel özellikleri
Polen; çiçekli bitkilerde çiçeklerin erkek organlarının (stamen) üst kısmında bulunan polen kesecikleri içinde yer alan, bal arıları tarafından toplanan çiçek tozlarıdır (Chenga vd., 2013). Arı poleni, uzun çağlardan beri besleyici özelliği ile bilinen ve bileşimi, öncelikle bitki kaynağına ve bunun yanı sıra iklim koşullarına, toprak tipi ve arıcılık faaliyetleri gibi diğer faktörlere de bağlı olan flavonoidlerce zengin, enerji verici bir besin maddesidir (Pascoal vd., 2014).
Arılar, poleni toplamaya çiçeklerin açtığı ve hava sıcaklığının 14oC’nin üzerinde olduğu ilkbahar mevsiminde başlarlar. Polen; arıların ağız parçaları, bacakları ve vücutlarını örten sert kıl örtüsü yardımıyla çiçeklerin erkek organlarından toplanır. (Özcan vd., 2003; Almeida-Muradian vd., 2005). Kaynağına göre farklılık gösterse de genel olarak içeriğinde; % 13-55 karbonhidrat, % 10-40 protein, % 20-30 su, % 1-13 lipit ve % 20 civarında diğer maddeleri bulunduran polen; bir canlının büyüyüp gelişebilmesi için günlük alınması gereken aminoasitleri, vitaminleri ve mineral maddeleri yeterli miktarlarda ve dengeli olarak içermektedir (Çizelge 2.1) (Sammataro ve Avitabile, 2004).
7
Çizelge 2.1. Arılar tarafından toplanan polende bulunan maddeler (Süer ve Sorkun, 2001)
Antioksidan aktivitesi, içeriğinde yer alan tiyoller, polifenoller ve flavonoidlerle bağlantılı olan polen, hücre yenileyici özelliğe sahip, yaşlanmayı geciktiren antioksidan özellikte bir üründür. Fenolik bileşikler antiradikal özellik gösterirler diğer bir deyişle, radikal süpürücü etkiye neden olurlar (Campos vd., 2010; Pietta, 2000; Martínez-Flórez vd., 2002). Polen, içeriğinde bulunan polifenolikleri sayesinde, kanser, antienflamatuar, kardiyo vasküler ve nörodejeneratif hastalıklar gibi kronik rahatsızlıkların önlenebilmesi için doğal besin olarak kullanılmaktadır. Polenin içerdiği quersetin, rutin ve chyrisin flavonoidleri hücrede apoptozu arttırarak kanser oluşumunu engelleyebilmektedir. Polen içinde bulundurduğu doğal antibiyotiklerle bağırsak iltihaplarını, yaralarını ülseri, mide yaralarını iyileştirir. Yapılan araştırmalarda geleneksel tıbbi tedavi gören ülserli hastaların % 29’u iyileşirken polenli kürle beslenen hastaların iyileşme oranı ise % 59,2 olarak gözlemlenmiştir (Çankaya ve Korkmaz, 2008; Marghitaş vd., 2009).
En az 8 çeşit tat veren madde vardır (karbonhidratlar) En az 11 çeşit renk veren madde vardır (karotenoidler) Vitaminler (C, E, A, B)
Asit, riboflavin (B2 ) ve piridoksin (B6 ) Başlıca mineral maddeler: K, Na, Ca, Mg, S
İz elementler: A1, B, C1, Cu, I, Fe, Mn, Ni, Si, Ti, Zn En az 6 (fenolik asit dahil) çeşit asit vardır
Nükleik asitler ve nükleotitler, DNA, RNA ve diğerleri 100 den fazla enzim bulunmaktadır.
8 2.4 Çalışılan Deney Hayvanı Hakkında Bilgiler
Yapay yöntemlerle yumurta alımının kolaylığı ve kuluçka sürelerinin kısalığı gibi özelliklerinden dolayı yetiştiricilikte çoğunlukla tercih edilen gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss); vücudu uzamış ve az basık olup, sırt kısmında bulunan yağ yüzgeci ile karakteristiktir (Emre ve Kürüm, 2007). Gökkuşağı alabalığının büyüme oranı suyun sıcaklığına ve ortamdaki besin miktarına bağlı olarak değişmektedir. Soğuk bölgelerde ve sert sularda yaşayan bu balıklar, sıcak bölgelerde ve durgun sulardaki balık türlerine göre daha uzun yaşamaktadırlar (Eren, 2011).
2.5 Tez Kapsamında Çalışılan Dokular 2.5.1 Kas doku
Balıkların kas sistemi miyomerlerden meydana gelmiştir (Demir, 1992). Balıklardaki kas fibrilleri yapı bakımından sıcakkanlı hayvanların kas fibrilleri ile aynıdır. Tek farkı kas fibrillerinin uzunluğu sıcakkanlı hayvanların kas fibrillerinin uzunluğu kadar değildir (Ternes, 1994). Balıklardaki kas bölümlerinin açık ya da koyu olması miyoglobin konsantrasyon farkından kaynaklanmaktadır. Koyu renkliler kalp kasına benzemektedir. Koyu renkli olan kaslar kesintisiz yüzmeyi sağlar. Açık renkli kaslar ise sırt ve karın bölgesinde bulunup, kaçma gibi durumlarda işe yarar (Tülsner ve Band, 1994). Balığın insanlar tarafından fileto kısmı yenilmektedir. Dolayısıyla, balık insan diyetinin önemli bir parçası olduğu için, balığın kas dokusunda meydana gelen hasarlar, besin zinciri yolu ile balığı tüketen insanı da etkilemektedir (Lenka vd., 2014). 2.5.2 Solungaç dokusu
Solungaçlar; suda erimiş oksijenin kana alınması, kandaki karbondioksitin atılmasını sağlayan solunum yüzeyinin kıvrılması ve dallanmasıyla meydana gelen yapılardır (Demirsoy, 1992). Bu sebepten dolayı su ortamında yaşayan canlıların oksijen ihtiyaçlarını karşılayabilmeleri için, solungaçlarının sürekli sulu ortamda bulunması gerekir (Noyan, 1993).
Solungaç, sürekli olarak balığın çevresi ile temasını sağlayan dokudur ve bu sebeple çözülebilir toksik maddelerin ana girişlerinden birisi olduğu için, kirleticilerden en fazla etkilenen organdır. Kirleticilerin solungaçlarda neden oldukları toksikopatolojik
9
lezyonlar genel olarak epitel dokuda kabarma, nekroz, lamellar yapıda erime, hipertrofi, hiperplazi, epitel dokuda kopma, mukus salgısında artış şeklinde ortaya çıkar. Solungaçların kimyasallardan etkilenmesi balığın solunum sisteminde olumsuzluklar ortaya çıkararak ölüme varan çok ciddi zararlara neden olmaktadır (Val ve Kapoor, 1987; Lawrence ve Hemingway, 2003).
2.6 Tez Kapsamında Çalışılan Parametreler 2.6.1 Malondialdehit (MDA)
Lipit peroksidasyonu, biyomoleküller için büyük oranda hasar verici özelliğe sahip bir zincir reaksiyonudur. Membrandaki doymamış yağ asitleri serbest radikaller ile reaksiyona girip peroksidasyon ürünlerini oluştururlar. Lipit peroksidasyon sonucu oluşan ürünler doğruca membran yapısına katılarak geri dönüşümsüz hasar oluştururken, dolaylı olarak, reaktif aldehitler üreterek diğer hücre bileşenlerine zarar vermektedirler. Bunun sonucunda ise, doku hasarını yayarak çeşitli bozulumlara sebep olurlar (Wang ve Quinn, 1999; Rikans ve Hornbrook, 1997). Hücre membranlarında üç veya daha fazla çift bağ içeren yağ asitlerinin peroksidasyonundan meydana gelen ve hücresel bozulumun en önemli belirteçlerinden olan MDA; iyon alışverisine etki ederek membranda bulunan bileşiklerin çapraz bağlanmasına yol açıp iyon geçirgenliği ve enzim aktivitelerinde değişimlere sebep olmaktadır. Üç karbonlu bir ketoaldehit olan MDA, normal metabolik şartlarda asetat veya malonata kadar okside olur, daha sonra kreps döngüsü ile CO2’e indirgenerek atılır. Aşırı lipit peroksidasyonuyla artan MDA konsantrasyonu dokulara hasar vermektedir (Murray vd., 1996; Kalender vd., 2002). 2.6.2 TAS – TOS – OSİ
Serbest oksijen radikalleri; lipid peroksidasyonu, disülfit bağları ile proteinlerin bağlanması, DNA hasarı gibi hücresel hasarlar meydana getirirler (Robbins vd., 1992). Metabolik ve fizyolojik süreçler sonucu oluşturulan ROT’lar; enzimatik ve enzimatik olmayan antioksidan mekanizmalarla vücuttan uzaklaştırılırlar. Bazı durumlarda, oksidanlardaki artış ve antioksidanlardaki azalma önlenemeyerek oksidatif taraf lehine kayan oksidan/antioksidan denge sonucu oksidatif stres oluşmaktadır (Harma, 2005). Normalde serbest radikaller ve antioksidan savunma sistemleri arasında bir denge vardır. Fakat çeşitli nedenlerle serbest radikallerin miktarı antioksidan savunma sistemlerinin kapasitesini aşarsa hücrelerin lipit, protein ve DNA bileşenlerinde
10
oksidatif hasara neden olurlar (Halliwell ve Guttaridge, 1996). Oksidan moleküller endojen olarak organizmada üretilebildiği gibi, dış çevreden de alınmaktadır. Elektron transport zinciri ve ksantin oksidaz, monoamin oksidaz gibi enzimler majör endojen reaktif oksijen kaynaklarıdır (Nobi, 2005). Total antioksidan kapasiteye en büyük katkı plazmadaki antioksidan moleküllerden gelmektedir. Plazmada bilirubin, serbest demiri toplayan transferin ve seruloplazmin, ürik asit, E vitamini, C vitamini ve proteinler gibi antioksidanlarda bulunmaktadır (Dani vd., 2003). Toplam oksidanın, toplam antioksidan potansiyele yüzde olarak oranı oksidatif stres indeksi olarak ifade edilmektedir (Harma vd., 2003).
2.6.3 Tiyol grubu
Sülfür içeren tiyol grupları (-SH grubu), antioksidan sistemin önemli bir üyesidir ve enzimatik ve enzimatik olmayan mekanizmalarla ROT ve diğer serbest radikalleri yok ederek proteinlere bağlı radikal peroksit süpürme etkinliğini arttırırlar (Köse vd., 2010). Tiyollerdeki -SH grupları oksidatif strese karşı koruyucu özelliğe sahiptir. Oksidatif stres, fizyolojik koşullar ve sülfür içeren aminoasitlerin ortamdaki yoğunlukları; tiyollerin antioksidan ya da prooksidan etki gösterip gösteremeyeceğini belirleyen faktörlerdir. Plazma tiyolleri arasında en çok bulunan sistein aminoasidi olup bunu takip eden homosistein ve glutatyondur (Fang vd., 2002; Yardim Akaydin vd., 2003).
11 BÖLÜM III KAYNAK ÖZETLERİ
Eraslan ve arkadaşlarının yapmış olduğu bir çalışmada 28 adet Wistar cinsi sıçanlar 4 gruba ayrılıyor. Birinci grup kontrol grubu olarak seçilirken diğer gruplara sırasıyla; ikinci gruba 100 mg polen, üçüncü gruba 20 mg propoxur (dış parazit) ve dördüncü gruba 20 mg propoxura ilaveten 100 mg polen uygulanıyor. Yapılan analizler sonucunda, yalnızca polen uygulanan deney grubu ile kontrol grubunun MDA seviyeleri arasında anlamsal bir farkın olmadığı (P>0.05) gözlenmiştir. Yalnızca propoxur verilen deneysel gruplar ile polen ve propoxurun birlikte verildiği deneysel grupların MDA düzeyleri karşılaştırılmış ve propoxur ile polenin birlikte verildiği deneysel grupların MDA değerlerinde, yalnızca propoxur verilen gruba göre anlamlı bir şekilde azalmalar olduğu tespit edilmiştir (P<0.05) (Eraslan vd., 2009).
Maruyama ve arkadaşları tarafından yapılan çalışmada karregenan (Kırmızı deniz yosunlarından elde edilen, kıvam artırıcı gıda katkı maddesi) ile ödem oluşturdukları sıçana Cistus bitkisinden elde edilen arı poleninin etanol ekstraktı uygulanarak, polenin sıçanlardaki antienflamatuar etkisi incelenmiş ve nitrik oksit üretimini inhibe ederek güçlü bir antienflamatuar aktivite gösteren Cistus poleninin bazı flavonoidlerinin de antienflamatuar etkiye kısmen katkısının olabileceği önerilmiştir (Maruyama vd., 2010). Gülhan ve arkadaşlarının yapmış olduğu bir çalışmada, gökkuşağı alabalığına farklı konsantrasyonlarda (10, 20, 30 ppm) propolis, sipermetrin ve propolis+sipermetrin uygulaması yapılmış ve MDA düzeyleri incelenmiştir. Yalnızca propolis uygulanan grubun MDA değerleri, kontrol grubu verilerine istatistiksel olarak yakın tespit edilmiştir. Propolis ve sipermetrinin birlikte uygulandığı grubun MDA düzeyleri ile yalnızca sipermetrin uygulanan grubun MDA düzeyleri karşılaştırıldığında; sipermetrin ve propolisin birlikte uygulandığı grubun MDA seviyelerinde, yalnızca sipermetrin uygulanan gruba göre anlamlı azalmalar olduğu gözlenmiştir (P<0.05). Bu sonuçlara göre, sipermetrine maruz bırakılmış alabalıkların biyokimyasal parametrelerinde meydana gelen olumsuz etkilerin propolis ilavesi yapılarak giderilebileceği ortaya konulmuştur (Gülhan vd., 2012).
12
Šarić ve arkadaşları Cystus incanus L. (Cistaceae)’den elde edilen arı poleni ile yapılan fare besininin oksidan/antioksidan durumunu, östrojen/antiöstrojen aktivitesini ve gen ifade profillerini araştırmışlardır. Arı polen örneğindeki 7 fenolik bileşik yüksek performans likit kromotografisi ile analiz edilmiştir. C. incanus arı polenindeki fenolikler; flavonol (pinocembrin), flavanoller (kuersetin, kampferol, galangin, ve izorhamnetin) ve fenilpropanoidler (kafeik asit) olarak belirlenmiştir. Gıdalara ek olarak kullanılan arı poleninin (ticari besin peletleri ile 100 mg/kg bw karışımı) fare dokularında lipit peroksidasyonunu azalttığı vurgulanmıştır (Šarić vd., 2009).
Leja ve arkadaşları 12 bitki türünden elde ettikleri polenlerin total antioksidan seviyelerini ve radikal süpürme aktivitelerini araştırmışlardır. Çalışmada bitki polenlerinin fenolik içeriklerinin oldukça değişkenlik gösterdiği bildirilmiştir. Bitki türlerinden elde edilen arı polenlerinin çoğunda antioksidan kapasite çok yüksek olarak tespit edilmiştir (Leja vd., 2007).
Mesquite ağacı (Prosopis juliflora) poleninin fenolik kompozisyonunun antioksidan kapasitesi in vitro ve in vivo olarak biyolojik sistemlerde lipit peroksidasyonunun inhibisyonu ile değerlendirildi. İki farklı sistemde elde edilen sonuçlar karşılaştırıldı ve
P. juliflora poleninin doğal antioksidan olarak düşünülen flavonoidlerin önemli bir
kaynağı olduğu sonucuna varıldı. Mesquite polen ekstraktlarının gösterdiği antioksidan aktivite hem in vitro hem de in vivo sistemlerde flavonol konsantrasyonu ile ilgilidir (Almaraz-Abarca vd., 2007).
Chenga ve arkadaşları Crataegus pinnatifida (Rosaceae) bitkisinden elde ettikleri polenin ekstraktını, oksidatif strese bağlı oluşan DNA hasarına karşı inceledikleri çalışmada; polenin toplam fenolik içeriği, toplam flavonoid içeriği, antioksidan aktivitesi ve serbest radikal süpürücü aktivitesi ve radikallerin zararlı etkilerine karşı DNA'yı koruduğu gözlendi. Bu koruyucu etkilerin toplam fenolik ve flavonoid içeriğiyle alakalı olduğu belirtilmiştir (Chenga vd., 2013).
Melipona subnitida türü arının Brezilya’nın kuzeydoğusunda zengin bitki çeşitliliğine
sahip yarı kurak bir bölgeden topladığı sarı ve kahverengi polen çeşitlerinin Silva ve arkadaşları tarafından incelendiği bir çalışmada; polenin kimyasal bileşimi, bitki kaynağı ve serbest radikal süpürücü aktivitesi araştırılmıştır. Sarı polenlerden; naringenin, isorhamnetin ve D-mannitol, kahverengi polenlerden ise; b-sitosterol,
13
tricetin, selagin, ve 8-methoxiherbacetin gibi bileşenler izole edilmiştir. Çalışmada polende ilk kez tespit edilen selagin ve D-mannitolün 1,1-difenil-2-picrylhydrazine (DPPH) testi ile radikal temizleme aktivitesindeki önemi belirlenmiştir (Silva vd., 2006).
Bal arısı ürünlerinden olan propolis ile yapılan çalışmalarda, propolisin içeriğindeki flavanoidlerin lipit peroksidasyonunu azalttığı ve serbest radikal oluşumunu engellediği gözlenmiştir (Sun vd., 2000; Ichikawa vd., 2002). Flavanoidler, iz elementlerle veya radikallerle şelat yaparak antioksidan özellik gösterirler (Prytzyk vd., 2003; Wang vd., 2004). Flavanoidler, hücre zar yapısındaki doymamış yağ asitlerini oksidanlara karşı askorbat gibi koruyabilirler (Havsteen, 2002). Propolisin ana bileşenlerinden birisi olan kafeik asit fenil etil ester (CAPE), reaktif oksijen türlerinin üretimini engellemektedir (Hosnuter vd., 2004).
Peshenko ve arkadaşları tarafından yapılan çalışmada, sıçan koku epitelinde bulunan ve tiyol bağımlı antioksidan aktiviteye sahip 28 kDa’luk bir protein tespit edilmiştir. Böylece bu tür tiyol bağımlı proteinlerin glutamin sentaz ve hemoglobin gibi radikal duyarlı proteinleri oksidatif hasarlara karşı koruyucu antioksidan aktiviteye sahip olduğu gösterilmiştir. Araştırmacılar tarafından saflaştırılan bu protein katalaz veya glutatyon peroksidaz aktivitelerine sahip değil iken, antioksidan aktivitesini tiyol gruplarının varlığı ile göstermektedir (Peshenko vd., 1998).
Fujimoto ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada, azo bileşikleri tarafından indüklenen lipid oksidasyonunun inhibisyonu üzerine, sistein tiyolleri varlığında metil kafeik asit ve metil dihidro kafeik asitin sinerjistik etkisi araştırılmıştır. Metil kafeik asite monotiyol grubunun, metil dihidro kafeik asite ise mono ve ditiyol gruplarının eklenmesi, kafeik asitlerin her ikisinin antioksidan kapasitelerinin ortaya çıkmasında, sinerjistik etkilerin katkısı gösterilmiştir (Fujimoto vd., 2013).
14 BÖLÜM IV
MATERYAL ve METOD 4.1 Materyal
Bu çalışmada; farklı konsantrasyonlardaki polen ekstraktının alabalıkların kas ve solungaç dokuları üzerinde oluşturduğu etkiler bazı biyokimyasal parametrelerde meydana gelen değişimler analiz edilerek incelenmiştir. Bu etkilerin araştırılabilmesi için öncelikle polen ekstratı hazırlanmıştır. Hazırlanan polen ekstraktının uygulanacağı deney hayvanları olan alabalıklar, Niğde-Çamardı Ecemiş alabalık üretim tesislerinden temin edilmiştir. Polen ekstraktı farklı konsantrasyonlarda (0.5, 2.5, 5, 10, 20, 30 ppm) hazırlanarak balıkların bulundukları su ortamlarına uygulanmış ve çeşitli analiz kitleri kullanılarak alabalık kas ve solungaç dokularında TAS, TOS ve OSİ düzeyleri belirlenmiştir. Ayrıca balık dokularında lipit peroksidasyonunun son ürünü olan MDA düzeyinin belirlenmesi ve tiyol düzeylerinin tayini şeklinde analizler de yapılmıştır. 4.1.1 Deneyde kullanılan kimyasal maddeler
Bu çalışmada kullanılan kimyasal maddeler; potasyum klorür (KCI), sodyum hidroksit (NaOH), fosforik asit (H3PO4), sodyum klorür (NaCI), sodyum bi fosfat (NaH2PO4), etil alkol (C2H5OH), DTNB, tiyobarbitürik asit (TBA)’tir.
4.1.2 Deneyde kullanılan aletler
Deneysel çalışmalar boyunca başlıca; derin dondurucu dolap (-80o
C), hassas terazi, otomatik pipet, homojenizatör (Ultra Turrax), soğutmalı santrifüj (Nuve NF-800-R), spektrofotometre, sonikatör, karıştırıcılı ısıtıcı tabla (Elektro.mag M22), pH metre (PH 1000-masa tipi) kullanılmıştır.
15
4.1.3 Balıkların temini ve deney gruplarının hazırlanması
Bu çalışma 03.11.2011 tarihli ve B.30.2.CUM.0.01.00.00-50/94 sayılı Cumhuriyet Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu’nun onayı ile gerçekleştirilmiştir. Niğde–Çamardı Ecemiş Alabalık üretim tesislerinden temin edilen gökkuşağı alabalıkları, Niğde Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü Araştırma Laboratuvarları’na oksijen takviyesiyle uygun koşullarda getirilmiş ve çalışma boyunca canlı kalması sağlanmıştır. Balıklar laboratuvara getirilmeden önce ortam koşulları, balıkların yaşayabileceği uygun sıcaklık ve oksijen sağlanarak ayarlanmıştır. Alabalıkların herbiri 200 L’lik akvaryumlara 7 adet olacak şekilde paylaştırılıp 10 gün boyunca ortama adaptasyonları sağlanmıştır ve bu adaptasyon süresince balıklar Excel Pond marka pelet yemle beslenmiştir. Ortama adaptasyonları sağlanan alabalıkların; kontrol grubu ve farklı konsantrasyonlarda polen ekstraktı (0.5, 2.5, 5, 10, 20, 30 ppm) uygulanan gruplar olmak üzere toplam 7 ayrı çalışma grupları oluşturulmuştur. Hazırlanan polen ekstraktı, 96 saat boyunca alabalıkların yaşama ortamları olan akvaryum suyuna belirtilen konsantrasyonlarda uygulanmıştır. Bu sürenin sonunda anestezik madde olarak karanfil yağı (40 mg/L) (Hoskonen ve Pirhonen, 2004) uygulanarak alabalıkların kas ve solungaç dokuları alınmıştır.
4.2 Metodlar
4.2.1 Polen ekstratının hazırlanması
Çalışmada kullanılan ham polen Balıkesir iline ait Kocaavşar köyünde bulunan arı çiftliğinden temin edilmiştir. Marghitaş ve arkadaşlarının belirlediği yönteme göre polen ekstratının hazırlanması; ham polen örneklerinin oda sıcaklığında farklı konsantrasyonlardaki etil alkol serilerinden geçirilmesiyle gerçekleştirildi. Öncelikle, 30 gram ham polen örnekleri 100 mL % 70’lik etil alkol içerisinde 1 saat boyunca karıştırılarak ekstrakte edildi. Filtre kağıdından süzülerek elde edilen polen örneklerinin ekstraksiyon işlemleri, daha sonra sırasıyla % 50’lik ve % 30’luk etanol içerisinde sürdürüldü. Her aşama sonrası filtre kağıdından geçirilen bu polen örnekleri sonikatörde 15 dk boyunca sonifiye edildi ve filtrasyon işlemini takiben etanol ile elde edilen polen homojenatı vakum altında kurutuldu. Hazırlanan kuru ekstrakt kullanılana kadar 4o
C’de ışığa maruz kalmayacak şekilde muhafaza edildi (Marghitaş vd., 2009).
16 4.2.2 Diseksiyon işlemi
Anestezik madde olarak karanfil yağı (40 mg/L) (Hoskonen ve Pirhonen, 2004) uygulanan alabalıkların, stresten korunarak bir havlu içerisine sarılıp, vücutları kurutuldu ve kuyruk venalarından kesim işlemi ile vücuttan kanları uzaklaştırılıp diseksiyon aleti ile dokulara zarar verilmeden kas ve solungaç dokuları alındı.
4.2.3 Biyokimyasal çalışmalar için doku numunelerinin hazırlanması
Alabalıklardan diseksiyon işlemi ile elde edilen kas ve solungaç dokuları analiz için kullanılıncaya kadar derin dondurucuda -80oC’de muhafaza edildi. Elde edilen dokular uygulanacak farklı işlemlerden dolayı iki parçaya ayırıldı. Doku parçalarının birinci kısmında lipit peroksidasyonunun son ürünü olan MDA düzeyleri belirlendi. İkinci parçada ise; TAS, TOS, OSİ, tiyol düzeyleri ve toplam protein miktarı tespit edildi. MDA analizleri için kullanılacak dokular hassas terazide tartma işlemlerinden sonra buz izolasyonu altında 1/10 (w/v) oranında % 1,15’lik KCI çözeltisinde homojenize edildi. Elde edilen doku homojenatları analiz işlemleri yapılıncaya kadar -80oC’ de derin dondurucuda bekletildi. Dokuların ikinci parçasında biyokimyasal parametrelerin analizlerinin yapılabilmesi için, öncelikle doku numunelerinin tartılıp 1/5 (w/v) oranında fosfat tamponu (pH:7,4; 0,02 M)içerisinde buz izolasyonu ile homojenizasyon işlemleri gerçekleştirildi. Homojenizasyondan sonra doku örnekleri, 4000 rpm de 15 dakika boyunca santrifüj edildi. Santrifüj sonucu elde edilen doku süpernatantları biyokimyasal analizler yapılıncaya kadar -80oC’de derin dondurucuda saklandı.
4.3 Biyokimyasal Analizler
4.3.1 Malondialdehit (MDA) düzeylerinin analizi
Alabalık dokularında lipit peroksidasyonun son ürünü olan MDA düzeyleri, Esterbauer ve Cheeseman‘ın (1990)’in önerdiği metod ile belirlendi. Tiyobarbitürik asit (TBA) ile 90-95°C‘de reaksiyona giren MDA, pembe renkli kromojen oluşturmaktadır. 30 dk sonra hızla soğutulan doku numunelerinin 532 nm‘deki absorbansları spektrofotometre ile okundu. Elde edilen sonuçlar nmol/g doku proteini olarak ifade edildi (Esterbauer ve Cheeseman, 1990).
17 4.3.2 Toplam antioksidan seviye (TAS) analizi
Doku serumlarındaki TAS, Erel (2004a) tarafından geliştirilen otomatik bir ölçüm yöntemi kullanılarak saptanmıştır. Bu yöntemde biyolojik moleküller için en güçlü radikal olan hidroksil radikali kullanılmıştır. Deneyde; içerisinde demir iyonu çözeltisi bulunan reaktif 1 ile içinde hidrojen peroksit mevcut olan reaktif 2 karıştırıldı. Diğer güçlü radikaller ise hidroksil radikali tarafından üretilen kahverengi dianisidinil radikal katyonu olarak oluşturuldu. Kullanılan bu yöntemde, hidroksil radikali tarafından başlatılan serbest radikal reaksiyonlarına karşı doku numunelerinin antioksidan etkisinin kapasitelerinin ölçülmesi amaçlanmıştır. Bu test, son derece hassas ve güvenilir ölçümlere sahiptir (<3%). Sonuç olarak, elde edilen veri litre başına eşdeğer Trolox (eşdeğerli mmol Troloks./L) milimol olarak ifade edilmektedir (Erel, 2004a).
4.3.3 Toplam oksidan seviye (TOS) analizi
Doku süpernatantlarındaki TOS, Erel (2005) tarafından geliştirilen tam otomatik kolorimetrik ölçüm yöntemi kullanılarak belirlendi. Doku numunelerindeki mevcut oksidanlar; demir iyonunu, demir iyon-o-dianisidin kompleksine oksitlemektedirler. Oksidasyon reaksiyonu, reaksiyon ortamında bol olarak bulunan gliserol molekülleri tarafından arttırılmaktadır. Ortamda bulunan gliserol, bu reaksiyonu hızlandırarak yaklaşık üç katına çıkarabilmektedir. Ferrik iyonlar asidik ortamda “ksilenol orange” ile renkli bir kompleks oluştururlar. Analiz hidrojen peroksitle kalibre edilip, sonuçlar litre başına denk mikromolar hidrojen peroksit (μmol H2O2 equivalent/L) olarak ifade edilmektedir (Erel, 2005).
4.3.4 Oksidatif stres indeksi (OSİ) analizi
Total Oksidan Seviye (TOS)’nin Total Antioksidan Seviye (TAS)’ye oranlanması şeklinde ifade edilerek, Oksidatif Stres İndeksi (OSİ) belirlenir ve bu oran, Total Oksidan Seviye (TOS)/Total Antioksidan Seviye (TAS) şeklinde gösterilir (Harma vd., 2003). Hesaplamalar yapılırken öncelikle, TAS değerleri μmol/L ye çevrilmiştir.
4.3.5 Tiyol gruplarının analizi
Doku serumlarında serbest sülfidril gruplarının düzeyleri, Hu ve arkadaşları (Hu vd., 1993) tarafından modifiye edilen, Ellman’ın (1959) metoduna göre analiz edildi. Bu
18
yöntem, doku numunelerindeki serbest tiyol gruplarının bazik ortamda 5,5 ditiyobis 2-nitrobenzoik asit (DTNB) ile sarı renkli bir kompleks oluşturması ve oluşan bu renkli bileşiğin 412 nm dalga boyundaki absorbansının spektrofotometrik olarak ölçülmesi esasına dayanır ve bu yöntem ile elde edilen sonuçlar milimolar olarak ifade edilmektedir (Erel, 2004b).
4.3.6 Protein analizi
Balık dokularında toplam protein miktarını belirlemek için Lowry (1956) yöntemi kullanıldı (Lowry vd., 1956). Bu metot, alkali koşullarda fosfomolibdik/fosfotungistik asit çözeltisinin (Folin-Ciocalteau reaktifi) proteinlerdeki fenolik amino asitlerle verdiği reaksiyona dayanmaktadır. Bu yöntemde alkali koşullarda iki farklı reaksiyon gerçekleşmektedir. Birinci reaksiyonda peptit bağları ile Cu+2
arasında biüre reaksiyonu sonucu indirgenmiş bakır oluşur. İkinci reaksiyonda ise Folin-Ciocalteu ayıracı, tirozin ve triptofan amino asitleri ile tepkimeye girerek indirgenir ve mavi renkli heteropolimolibden kompleksi meydana getirir. Bu yöntem pH’ya karşı çok duyarlıdır (pH:10,0-10,5). Bu nedenle uygun bir pH’ın sağlanabilmesi için reaktifin seyreltilmesi gerekebilir.
4.3.7 İstatistiksel analiz
Elde edilen veriler SPSS V.16 hazır paket programı kullanılarak istatistiksel olarak değerlendirildi. Çalışma gruplarından elde edilen verilerin karşılaştırılmasında Kruskal-Wallis testi kullanıldı. Bu test sonucunda P<0,05 olduğu için veriler Mann Whitney U testiyle analiz edildi. Bu testte uygulama grupları ile kontrol grubu değerleri karşılaştırılarak farklılığın önemli olup olmadığı tespit edildi. P<0,05 olması durumunda elde edilen farkın istatistiksel olarak anlamlı olduğu kabul edildi.
19 BÖLÜM V BULGULAR 5.1 Malondialdehit (MDA) Analiz Sonuçları 5.1.1 Kas dokuda MDA analiz sonuçları
Deneysel çalışmalardan elde edilen verilere göre, farklı konsantrasyonlarda polen ekstraktı uygulanan alabalık kas dokularında, bütün uygulama grupları (0.5, 2.5, 5, 10, 20, 30 ppm) kontrol grubu verileri ile karşılaştırıldığında, MDA değerlerinde kontrol grubuna göre, istatistiksel olarak anlamlı azalmalar (P<0.05) meydana geldiği gözlenmiştir. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında; 10, 20 ve 30 ppm konsantrasyonlarda polen ekstraktı uygulanan gruplarda istatistiksel olarak en düşük MDA değerleri gözlenmiştir (P<0.05) (Çizelge 5.1) (Şekil 5.1).
Çizelge 5.1. Kontrol grubu ve 96 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda polen ekstraktı uygulanan alabalıkların kas dokularında MDA düzeyleri
GRUPLAR MDA (nmol/gP)
Kontrol 13,99±0,77a 0.5 ppm 11,58±0,68b 2.5 ppm 10,20±0,93b 5 ppm 9,61±0,99b 10 ppm 7,57±1,01c 20 ppm 7,34±0,51c 30 ppm 7,72±0,50c
a,b,c her satırda farklı harflerle gösterilen rakamlar olmak üzere istatistiksel olarak birbirinden farklıdır (P<0.05). Tabloda verilen değerler ortalama ± standart hata (n=7) değeri olarak ifade edilmektedir
Şekil 5.1. Kontrol grubu ve 96 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda
polen ekstraktı uygulanan alabalıkların kas dokularında MDA düzeylerini gösteren grafik 0
5 10 15
20 5.1.2 Solungaç dokuda MDA analiz sonuçları
Alabalık solungaç dokularında, tüm uygulama grupları MDA seviyelerine göre, kontrol grubu verileri ile karşılaştırıldığında, bütün uygulama gruplarında (0.5, 2.5, 5, 10, 20, 30 ppm) istatistiksel olarak anlamlı azalmalar (P<0.05) olduğu görülmüştür.
Kontrol grubu verileri ile karşılaştırıldığında, 10 ppm konsantrasyonda polen ekstraktı uygulanan gruplarda istatistiksel olarak en düşük MDA değerleri tespit edilmiştir (Çizelge 5.2) (Şekil 5.2).
Çizelge 5.2. Kontrol grubu ve 96 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda polen ekstraktı uygulanan alabalıkların solungaç dokularında MDA düzeyleri
GRUPLAR MDA (nmol/gP)
Kontrol 9,80±0,99a 0.5 ppm 4,28±0,66b 2.5 ppm 5,77±0,62b 5 ppm 4,68±0,68b 10 ppm 2,97±0,75c 20 ppm 4,10±0,90b 30 ppm 5,17±1,09b
a, b, c her satırda farklı harflerle gösterilen rakamlar olmak üzere istatistiksel olarak birbirinden farklıdır (P<0.05). Tabloda verilen değerler ortalama ± standart hata (n=7) değeri olarak ifade edilmektedir.
Şekil 5.2. Kontrol grubu ve 96 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda polen ekstraktı uygulanan alabalıkların solungaç dokularında MDA düzeylerini gösteren grafik
0 2 4 6 8 10 12 Kontrol 0.5 ppm 2.5 ppm 5 ppm 10 ppm 20 ppm 30 ppm
21
5.2 Toplam Antioksidan Seviye (TAS) Analiz Sonuçları 5.2.1 Kas dokuda TAS analiz sonuçları
Yapılan deneysel çalışma sonucunda saptanan verilere göre, farklı konsantrasyonlarda polen ekstraktı uygulanan gökkuşağı alabalığı kas dokularında, kontrol grubu verilerine göre 0.5 ppm konsantrasyon grubu hariç, diğer konsantrasyon (2.5, 5, 10, 20 ve 30) gruplarında toplam antioksidan kapasitenin istatistiksel olarak anlamlı (P<0.05) şekilde arttığı tespit edilmiştir. Diğer taraftan; 2.5, 5, 20 ve 30 ppm konsantrasyon gruplarında TAS değerleri arasında istatistiksel olarak anlamlı bir farkın olmadığı (P>0.05) gözlenmiştir. Tüm uygulama grupları içerisinde polen ekstraktının 10 ppm konsantrasyonda en etkili antioksidan aktiviteye sahip olduğu saptanmıştır (Çizelge 5.3) (Şekil 5.3).
Çizelge 5.3. Kontrol grubu ve 96 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda polen uygulanan alabalıkların kas dokularında TAS düzeyleri
GRUPLAR TAS (mmol Trolox Eqv./L)
Kontrol 1,15±0,07c 0.5 ppm 1,27±0,07c 2.5 ppm 1,58±0,04b 5 ppm 1,61±0,10b 10 ppm 1,87±0,06a 20 ppm 1,48±0,12b 30 ppm 1,53±,0,09b
a, b, c her satırda farklı harflerle gösterilen rakamlar olmak üzere istatistiksel olarak birbirinden farklıdır (P<0.05). Tabloda verilen değerler ortalama ± standart hata (n=7) değeri olarak ifade edilmektedir.
Şekil 5.3. Kontrol grubu ve 96 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda polen ekstraktı uygulanan alabalıkların kas dokularında TAS düzeylerini gösteren grafik
0 0,5 1 1,5 2 Kontrol 0.5 ppm 2.5 ppm 5 ppm 10 ppm 20 ppm 30 ppm
22 5.2.2 Solungaç dokuda TAS analiz sonuçları
Yapılan analiz sonuçlarına göre, solungaç dokularında tüm deneysel guplar (0.5, 2.5, 5, 10, 20 ve 30 ppm) kontrol grubu değerleri ile karşılaştırıldığında, istatistiksel olarak 5, 10, 20 ve 30 ppm konsantrasyonlarda anlamlı artışların (P<0.05) olduğu gözlenmiştir. Elde edilen bulgular doğrultusunda, alabalık solungaç dokusunda istatistiksel olarak 10 ve 20 ppm konsantrasyonda polen ekstraktının daha etkili antioksidan kapasiteye sahip olduğu saptanmıştır (Çizelge 5.4) (Şekil 5.4).
Çizelge 5.4. Kontrol grubu ve 96 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda polen uygulanan alabalıkların solungaç dokularında TAS düzeyleri
GRUPLAR TAS (mmol Trolox Eqv./L)
Kontrol 1,05±0,08c 0.5 ppm 1,36±0,10c 2.5 ppm 1,79±0,09c 5 ppm 1,69±0,11b 10 ppm 2,01±0,07a 20 ppm 1,96±0,07a 30 ppm 1,65±0,07b
a, b, c her satırda farklı harflerle gösterilen rakamlar olmak üzere istatistiksel olarak birbirinden farklıdır (P<0.05). Tabloda verilen değerler ortalama ± standart hata (n=7) değeri olarak ifade edilmektedir.
Şekil 5.4. Kontrol grubu ve 96 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda polen ekstraktı uygulanan alabalıkların solungaç dokularındaTAS düzeylerini gösteren grafik
0 0,5 1 1,5 2 2,5 Kontrol 0.5 ppm 2.5 ppm 5 ppm 10 ppm 20 ppm 30 ppm
23
5.3 Toplam Oksidan Seviye (TOS) Analiz Sonuçları 5.3.1 Kas dokuda TOS analiz sonuçları
Farklı konsantrasyonlarda polen ekstraktı uygulanan alabalık kas dokularının toplam oksidan seviyeleri, kontrol grubu verileri ile karşılaştırıldığında, tüm deneysel gruplarda (0.5, 2.5, 5, 10, 20 ve 30) istatistiksel olarak anlamlı azalmaların (P<0.05) olduğu saptanmıştır.
Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, 10 ve 20 ppm konsantrasyonlarda polen ekstraktı uygulanan gruplarda istatistiksel olarak en düşük TOS değerleri tespit edilmiştir (P<0.05) (Çizelge 5.5) (Şekil 5.5).
Çizelge 5.5. Kontrol grubu ve 96 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda polen uygulanan alabalıkların kas dokularında TOS düzeyleri
GRUPLAR TOS (μmol H2O2 Eqv./L)
Kontrol 2,74±0,18a 0.5 ppm 2,32±0,17b 2.5 ppm 2,27±0,11b 5 ppm 2,21±0,06b 10 ppm 1,98±0,16c 20 ppm 2,02±0,06c 30 ppm 2,35±0,09b
a, b, c her satırda farklı harflerle gösterilen rakamlar olmak üzere istatistiksel olarak birbirinden farklıdır (P<0.05). Tabloda verilen değerler ortalama ± standart hata (n=7) değeri olarak ifade edilmektedir
Şekil 5.5. Kontrol grubu ve 96 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda polen ekstraktı uygulanan alabalıkların kas dokularında TOS düzeylerini gösteren grafik
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 Kontrol 0.5 ppm 2.5 ppm 5 ppm 10 ppm 20 ppm 30 ppm
24 5.3.2 Solungaç dokuda TOS analiz sonuçları
Farklı konsantrasyonlarda polen ekstraktı uygulanan alabalık solungaç dokularında tüm deneysel grupların (0.5, 2.5, 5, 10, 20 ve 30 ppm) TOS verileri, kontrol grubu TOS değerleri ile karşılaştırıldı. Yapılan deneysel çalışma sonucunda, 0.5 ppm konsantrasyon değeri ile kontrol grubu arasında istatistiksel bir farkın olmadığı (P>0.05) saptanmıştır. 2.5, 5, 10, 20 ve 30 ppm konsantrasyon değerleri, kontrol grubu verileri ile karşılaştırıldıklarında istatistiksel olarak anlamlı azalmaların olduğu (P<0.05) belirlenmiştir. En düşük TOS değerleri 10 ve 20 ppm konsantrasyonlarda gözlenmiştir (Çizelge 5.6) (Şekil 5.6).
Çizelge 5.6. Kontrol grubu ve 96 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda polen ekstraktı uygulanan alabalıkların solungaç dokularında TOS düzeyleri
GRUPLAR TOS (μmol H2O2 Eqv./L)
Kontrol 1,85±0,12a 0.5 ppm 1,78±0,10a 2.5 ppm 1,58±0,06b 5 ppm 1,55±0,11b 10 ppm 1,16±0,14c 20 ppm 1,21±0,10c 30 ppm 1,55±0,02b
a, b, c her satırda farklı harflerle gösterilen rakamlar olmak üzere istatistiksel olarak birbirinden farklıdır (P<0.05). Tabloda verilen değerler ortalama ± standart hata (n=7) değeri olarak ifade edilmektedir
Şekil 5.6.Kontrol grubu ve 96 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda polen ekstraktı uygulanan alabalıkların solungaç dokularında TOS düzeylerini gösteren grafik
0 0,5 1 1,5 2 Kontrol 0.5 ppm 2.5 ppm 5 ppm 10 ppm 20 ppm 30 ppm
25
5.4 Oksidatif Stres İndeksi (OSİ) Analiz sonuçları 5.4.1 Kas dokuda OSİ analiz sonuçları
Farklı konsantrasyonlarda polen ekstraktı uygulanan tüm deneysel gruplarda (0.5, 2.5, 5, 10, 20 ve 30) alabalık kas dokuda oksidatif stres indeksi, kontrol grubu verileri ile karşılaştırıldığında, kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı azalmalar (P<0.05) olduğu saptanmıştır. En düşük OSİ değeri 10 ppm konsantrasyonda gözlenmiştir (Çizelge 5.7) (Şekil 5.7).
Çizelge 5.7. Kontrol grubu ve 96 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda polen uygulanan alabalıkların kas dokularında OSİ düzeyleri
GRUPLAR OSİ (TOS/TAS)
Kontrol 0,24±0,002a 0.5 ppm 0,18±0,001b 2.5 ppm 0,14±0,001b 5 ppm 0,13±0,001b 10 ppm 0,10±0,002c 20 ppm 0,13±0,002b 30 ppm 0,15±0,003b
a, b, c her satırda farklı harflerle gösterilen rakamlar olmak üzere istatistiksel olarak birbirinden farklıdır (P<0.05). Tabloda verilen değerler ortalama ± standart hata (n=7) değeri olarak ifade edilmektedir.
Şekil 5.7. Kontrol grubu ve 96 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda polen ekstraktı uygulanan alabalıkların kas dokularında OSİ düzeylerini gösteren grafik
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 Kontrol 0.5 ppm 2.5 ppm 5 ppm 10 ppm 20 ppm 30 ppm
26 5.4.2 Solungaç dokuda OSİ analiz sonuçları
Deney gruplarından elde edilen sonuçlar kontrol grubu verileri ile karşılaştırıldığında OSİ değerlerinde istatistiksel olarak anlamlı azalmalar olduğu gözlendi (P<0.05).
İstatistiksel olarak kontrol grubu verilerine göre, en düşük OSİ değerleri 10 ve 20 ppm konsantrasyonlarda tespit edilmiştir (Çizelge 5.8) (Şekil 5.8).
Çizelge 5.8. Kontrol grubu ve 96 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda polen uygulanan alabalıkların solungaç dokularında OSİ düzeyleri
GRUPLAR OSİ (TOS/TAS)
Kontrol 0,17±0,003a 0.5 ppm 0,13±0,001b 2.5 ppm 0,08±0,007b 5 ppm 0,09±0,005b 10 ppm 0,05±0,002c 20 ppm 0,06±0,001c 30 ppm 0,09±0,005b
a, b, c her satırda farklı harflerle gösterilen rakamlar olmak üzere istatistiksel olarak birbirinden farklıdır (P<0.05). Tabloda verilen değerler ortalama ± standart hata (n=7) değeri olarak ifade edilmektedir.
Şekil 5.8. Kontrol grubu ve 96 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda polen ekstraktı uygulanan alabalıkların solungaç dokularında OSİ düzeylerini gösteren garfik
0 0,05 0,1 0,15 0,2 Kontrol 0.5 ppm 2.5 ppm 5 ppm 10 ppm 20 ppm 30 ppm
27 5.5 Tiyol Düzeyi Analiz Sonuçları
5.5.1 Kas dokuda tiyol düzeyi analiz sonucu
Elde edilen bulgulara göre, farklı konsantrasyonlarda polen ekstraktı uygulanan alabalık kas dokusunda tüm deneysel gruplar, kontrol grubu tiyol düzeyleri ile karşılaştırıldığında, tüm gruplarda (0.5, 2.5, 5, 10, 20, 30 ppm) kontrol grubu değerlerine göre istatistiksel olarak anlamlı artışların (P<0.05) olduğu gözlenmiştir. 5 ppm konsantrasyonda kontrol grubu verilerine göre, tiyol değerinde istatistiksel olarak en fazla anlamlı artış saptanmıştır (Çizelge 5.9) (Şekil 5.9).
Çizelge 5.9. Kontrol grubu ve 96 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda polen ekstraktı uygulanan alabalıkların kas dokularında toplam tiyol düzeyleri
GRUPLAR Toplam Tiyol (mmol/L)
Kontrol 0,69±0,09c 0.5 ppm 1,43±0,16b 2.5 ppm 1,65±0,12b 5 ppm 2,05±0,08a 10 ppm 1,43±0,17b 20 ppm 1,60±0,09b 30 ppm 1,34±0,06b
a, b, c her satırda farklı harflerle gösterilen rakamlar olmak üzere istatistiksel olarak birbirinden farklıdır (P<0.05). Tabloda verilen değerler ortalama ± standart hata (n=7) değeri olarak ifade edilmektedir.
Şekil 5.9. Kontrol grubu ve 96 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda polen ekstraktı uygulanan alabalıkların kas dokularında toplam tiyol düzeylerini gösteren grafik
0 0,5 1 1,5 2 2,5 Kontrol 0.5 ppm 2.5 ppm 5 ppm 10 ppm 20 ppm 30 ppm
28
5.5.2 Solungaç dokuda tiyol düzeyi analiz sonuçları
Farklı konsantrasyonlarda polen ekstraktı uygulanan bütün deneysel grupların (0.5, 2.5, 5, 10, 20 ve 30 ppm) alabalık solungaç dokularında tiyol (-SH) düzeyleri kontrol grubu verileri ile karşılaştırıldı. Elde edilen verilere göre, 2.5 ppm konsantrasyondaki polen ekstraktı grubunun verileri, kontrol grubu verileri ile karşılaştırıldığında, istatistiksel olarak anlamlı bir farkın olmadığı gözlenmiştir (P>0.05). 0.5, 5, 10, 20 ve 30 ppm konsantrasyonlarda polen ekstraktı uygulanan grupların sonuçları kontrol grubu verileri ile karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı artışlar (P<0.05) belirlenmiştir.
Kontrol grubu verilerine göre en yüksek tiyol düzeyi 10 ppm konsantrasyon grubunda gözlenmiştir (Çizelge 5.10) (Şekil 5.10).
Çizelge 5.10. Kontrol grubu ve 96 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda polen ekstraktı (0.5, 2.5, 5, 10, 20, 30 ppm) uygulanan alabalıkların solungaç dokularında toplam tiyol düzeyleri
GRUPLAR Toplam Tiyol (mmol/L)
Kontrol 0,10±0,06c 0.5 ppm 0,87±0,14b 2.5 ppm 0,38±0,05c 5 ppm 0,97±0,02b 10 ppm 1,29±0,16a 20 ppm 0,81±0,12b 30 ppm 0,85±0,05b
a, b, c her satırda farklı harflerle gösterilen rakamlar olmak üzere istatistiksel olarak birbirinden farklıdır (P<0.05). Tabloda verilen değerler ortalama ± standart hata (n=7) değeri olarak ifade edilmektedir.
Şekil 5.10. Kontrol grubu ve 96 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda polen uygulanan alabalıkların solungaç dokularında toplam tiyol düzeylerini gösteren grafik
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 Kontrol 0.5 ppm 2.5 ppm 5 ppm 10 ppm 20 ppm 30 ppm
29 BÖLÜM VI TARTIŞMA
Bu çalışma kapsamında, strese karşı koruyucu ve terapötik bir ajan olan polen ekstraktı, 96 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda gökkuşağı alabalıklarına uygulandı ve alabalık kas ve solungaç dokularında; malondialdehit, toplam antioksidan ve oksidan seviyeleri, oksidatif stres indeksi ve tiyol düzeyleri belirlendi. Çalışmada, polenin hangi konsantrasyon düzeyinin gökkuşağı alabalıklarında en yüksek antioksidan etkiye sahip olabileceği araştırıldı. Çalışma sonunda elde edilen bulgular istatistiksel analizlerle değerlendirildi ve polen ekstraktının kas ve solungaç dokularında farklı konsantrasyonlarda farklı antioksidan etki düzeylerine sahip olduğu sonucuna varıldı. Yaptığımız çalışmada, gökkuşağı alabalığı kas ve solungaç dokularına farklı konsantrasyonlarda polen ekstraktı uygulanması sonucu elde edilen MDA değerleri, kontrol grubu verileri ile karşılaştrıldığında istatistiksel olarak anlamlı azalmalar olduğu saptandı (P<0.05). Bu durumun sebebi olarak, alabalık kas ve solungaç dokularında polenin antioksidan etki göstererek lipit peroksidasyonunu engellediği söylenebilir. Lipit peroksidasyonu sonucu oluşan MDA, organizmada fizyolojik ve metabolik bozukluklara yol açmaktadır. Polen, içeriğinde bulunan flavonoidler yardımıyla reaktif oksijen türlerinin nötralize edilmesini sağlayarak hücrenin zarar görmesini engellemektedir.
Eraslan ve arkadaşlarının yapmış olduğu bir çalışmada 28 adet Wistar cinsi sıçanlar 4 ayrı deney grubuna ayrılıyor. Birinci grup kontrol grubu olarak seçilirken, diğer gruplara sırasıyla; 100 mg polen, 20 mg propoxur (dış parazit) ve dördüncü gruba ise, 20 mg propoxura ilaveten 100 mg polen uygulanıyor. Yapılan analizler sonucunda, yalnızca polen uygulanan grup ile kontrol grubu MDA seviyeleri arasında istatistiksel olarak anlamlı bir farkın olmadığı gözlenmiştir. Yalnızca propoxur verilen grup ile polen ve propoxurun birlikte verildiği grubun MDA düzeyleri karşılaştırılmış ve propoxur ile polenin birlikte uygulandığı grubun MDA değerlerinde yalnızca propoxur uygulanan gruba göre anlamlı azalmalar olduğu tespit edilmiştir (Eraslan vd., 2009). Bizim yaptığımız çalışmada da polen ekstraktının alabalık kas ve solungaç dokularında MDA düzeylerini kontrol grubu değerlerine göre istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde
