Clostridium difficile ‹nfeksiyonu Ön Tan›l› Hastalar›n
D›fl-k› Örneklerinde Toksin A ve B’nin Belirlenme S›kl›¤›
Özden BÜYÜKBABA BORAL(*)
ÖZET
Clostridium difficile hastanede yatan hastalarda diyareye neden olan en önemli nozokomiyal patojen bakteridir. Son y›llarda gelifltirilen duyarl› tan› yöntemleri, etkin antibiyo-tik tedavisi ve hastane infeksiyonlar› kontrol önlemlerine ra¤men, C.difficile’nin neden oldu¤u diyare ve kolit önem-li bir problem olmaya devam etmektedir.
Çal›flmam›zda C.difficile infeksiyonu ön tan›s› ile 1998-2000 y›llar› aras›nda laboratuvar›m›za gönderilen 360 hastan›n d›flk› örne¤inde “ImmunoCard Toxin A (Meridian Diagnostic)” kit ile, 2000-2002 y›llar› aras›nda gönderi-len 400 d›flk› örne¤inde ise, “Premier Toxin A/B (Meridi-an Diagnostic)” kit kull(Meridi-an›larak toksin varl›¤› araflt›r›l-m›flt›r.
‹lk çal›flma döneminde toksin A varl›¤› hastalar›n %4.7’sinde, ikinci çal›flma döneminde ise toksin A/B varl›-¤› hastalar›n %12’sinde saptanm›flt›r. ‹ki ayr› çal›flma dö-neminde elde edilen pozitif sonuçlar karfl›laflt›r›ld›¤›nda, son iki y›lda istatistiksel olarak ileri derecede anlaml› bir artma oldu¤u (x2y=11.98 p<0.001) gözlenmifltir.
Sonuçla-r›m›z, C.difficile’nin toxA- toxB+ sufllar›n›n varl›¤› göz önüne al›narak, C.difficile infeksiyonlar›n›n tan›s›nda her iki toksini birlikte saptamaya yönelik kitlerin kullan›lmas›-n›n uygun olaca¤›n› göstermifltir.
Anahtar kelimeler: C.difficile infeksiyonlar›, toksin A/B, ELISA
SUMMARY
Frequency of the Toxin A and B in Stool Samples of Pa-tients with Suspected Clostridium difficile Infection C.difficile is the most important nosocomial pathogen cau-sing diarrhea in hospitalized patients. Despite the sensiti-ve diagnostic methods desensiti-veloped in the recent years, effec-tive antimicrobial treatment and hospital infection control measures, diarrhea and colitis caused by C.difficile conti-nuous to be an important problem.
In this study stool samples of 360 patients send to our la-boratory between the years 1998-2000 with the suspection of C.difficile infection were investigated by using “Immu-noCard Toxin A (Meridian Diagnostic)” kit and 400 stool samples send between the years 2000-2002 were investiga-ted by using “Premier Toxin A/B (Meridian Diagnostic)” kit for the presence of toxins.
In the first part of the study, the presence of toxin A was ob-served in 4.7% of the patients, and in the second part of the study the presence of toxins A/B was observed in 12% of the patients. When the positive results obtained in the two parts of the study are compared, statistically important in-crease was observed (x2y=11.98 p<0.001) in the last two
years.
Our results show that considering the presence of C.diffi-cile toxA- toxB+ strains it is appropriate to use kits that detect both toxins together for the diagnosis of C.difficile infections.
Key words: C.difficile infections, toxins A/B, ELISA
G‹R‹fi
Clostridium difficile,insanlar›n %2-10’unun normal gastrointestinal floras›nda yer alan bir bakteridir. C.difficile’nin önemli bir özelli¤i, bir çok antibiyoti-¤e nisbi dirençli olmas›d›r. Bu nedenle, antibiyotik kullan›m› s›ras›nda veya kullan›m›n› izleyen dönem-de h›zla ço¤alarak toksin üretebilirler. Üretilen tok-sin enterokolit geliflimine yol açar. Daha sonraki dö-nemde ise inflamatuar hücre ve fibrin birikimi, mu-koza nekrozu ve pseudomembran oluflumuna neden
olur ve sonuçta pseudomembranöz kolit geliflebilir (1,2).
C.difficile sufllar›nda toksin üretimi, kromozomal bir gen olan “tox” geninin kontrolündedir ve bu gen tüm sufllarda bulunmaz. Toksin A (308 kDa) ve toksin B (270 kDa) olmak üzere iki farkl› toksin üretebilirler. Toksin A bir enterotoksin, toksin B ise bir sitotoksin-dir. Her iki toksininde barsak mukozas›nda harabiye-te neden olan sitotoksik enzimler oldu¤u ve mukoza hücreleri harabiyetinde sinerjistik etkileri oldu¤u ka-n›tlanm›flt›r (3,4). Bu patogenezin gerçekleflebilmesi için bakterinin barsak epitel hücrelerine önceden
ko-(*) ‹stanbul T›p Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dal›, ‹stanbul.
lonize olmas› gerekir. C.difficile’nin adezyonu ve kolonizasyonunda rol oynayan çeflitli virulans fak-törleri belirlenmifltir. Bunlar kapsül, hiyaluronidaz, kollagenaz gibi proteolitik enzimler ve mukoza-hücre birliktele¤inde rol oynayan adhezinlerdir (5,9). Kolonizasyondan sonra uygun koflullar oldu-¤unda h›zla ço¤alan C.difficile’nin toksijenik suflla-r› toksin üretir. Toksin A enterosit mikrovilluslasuflla-r›n- mikrovilluslar›n-da bulunan kendi reseptörlerine ba¤lan›r. Polonük-leer hücrelerin ve makrofajlar›n göçünü uyararak yo¤un inflamatuar reaksiyona neden olur. Kuvvetli bir sitotoksiteye sahip olan toksin B ise inflamasyo-na u¤rayan dokulara penetre olarak mukozada ciddi lezyonlar›n geliflimine yol açar (2,3,10).
C.difficile’nin patojenitesini etkileyen önemli bir faktör de konak direncidir. Yenido¤anlar›n d›flk›s›n-da toksin A/B miktar› çok yüksek düzeydedir. An-cak yenido¤anlarda infeksiyon görülmez. Çünkü toksin A’n›n ba¤land›¤› epitel hücre reseptörü ileri yafllarda (yaflla orant›l› olarak) üretilir. Bununla bir-likte, asemptomatik eriflkinlerdeki konak direncinin nedeni henüz bilinmemektedir. Sonuç olarak C.dif-ficile’nin neden oldu¤u klinik tablolar›n ciddiyeti sadece sufla ba¤l› bir olay de¤ildir (2).
C.difficiletümü antibiyoti¤e ba¤l› olmak üzere; di-yare geliflen hastalar›n %20-30’unda, kolit geliflen hastalar›n %50-75’inde ve pseudomembranöz kolit geliflen hastalar›n %90’dan fazlas›nda etken olarak bulunmaktad›r (11-14).
C.difficileiliflkili diyare ve kolitin klinik tan›s› için en çok kullan›lan yöntem, d›flk› örneklerinde tok-sinlerin gösterilmesidir. Sitotoksin B’nin hücre kül-türlerinde belirlenmesi duyarl› ve özgül bir yöntem-dir. Bu yöntemin dezavantajlar›; pozitif sonuçlar›n dört saat gibi k›sa bir sürede sonuç vermesine kar-fl›n, negatif bir sonuç verebilmek için 48 saat bekle-meye gereksinim olmas›, her laboratuvarda uygula-namamas› ve pahal› olmas›d›r (15,16). Toksin A ve B’nin belirlenmesi amac› ile bir çok ELISA kiti ge-lifltirilmifltir. Bu kitlerin duyarl›l›klar› %63-94, öz-güllükleri ise %75-100 aras›nda de¤iflmektedir (3,17).
F serogrubunda yer alan C.difficile sufllar›, toksin A üretmeden, sadece toksin B üretirler, bu nedenle sa-dece toksin A’n›n belirlenmesine yönelik haz›rlanan
ELISA kitlerinin duyarl›l›k ve özgüllükleri daha az-d›r (18).
Bu çal›flmada; 1998-2000 y›llar› aras›nda C.difficile infeksiyonu ön tan›s› ile Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dal›’na gönderilen 360 has-tan›n d›flk› örneklerinde ImmunoCard toksin A kiti kullan›larak al›nan sonuçlar ile, 2000-2002 y›llar› aras›nda yine C.difficile infeksiyonu ön tan›s› ile gönderilen 400 hastan›n d›flk› örneklerinde Premier toksin A/B kiti kullan›larak al›nan sonuçlar karfl›lafl-t›r›lm›fl ve tart›fl›lm›flt›r.
GEREÇ VE YÖNTEM
1998-2000 y›llar› aras›nda C.difficile diyaresi ön ta-n›l› 360 hastan›n d›flk› örne¤i “ImmunoCard Toxin A (Meridian Diagnostic)” kit kullan›larak, kit prosedü-rüne uygun olarak incelenmifltir.
2000-2002 y›llar› aras›nda C.difficile diyaresi flüphe-si ile gönderilen 400 hastaya ait d›flk› örne¤i “Premi-er Toxin A/B (M“Premi-eridian Diagnostic)” kit kullan›la-rak, kit kurallar›na uyularak incelenmifltir. ‹statistik-sel de¤erlendirmede Ki-kare testi kullan›lm›flt›r. BULGULAR
1998-2000 y›llar› aras›nda, C.difficile toksin A, yö-nünden incelenen 360 d›flk› örne¤inin 17 (%4.7)’sin-de toksin A saptanm›flt›r.
2000-2002 y›llar› aras›nda C.difficile toksin A/B yö-nünden incelenen 400 d›flk› örne¤inin 48 (%12)’sin-de toksin A/B belirlenmifltir. ‹ki ayr› çal›flma döne-minde elde edilen pozitif sonuçlar karfl›laflt›r›ld›¤›n-da, son iki y›lda art›fl oldu¤u gözlenmifl ve aradaki fark›n istatistiksel olarak ileri derecede anlaml› oldu-¤u (x2y= 11.98 p<0.001) saptanm›flt›r.
TARTIfiMA
Antibiyoti¤e ba¤l› diyarelerin en önemli etkeni C.difficile’dir. C.difficile’nin bu infeksiyonlarda bu-lunma s›kl›¤›n›n, kullan›lan antimikrobiyal ajanlara, hastan›n toplumda veya hastanede bulunufluna, ko-na¤a göre de¤iflti¤i ve %3.2-%29 aras›nda oldu¤u bildirilmektedir (19,20). Sa¤l›kl› eriflkinlerde C.diffi-cilekolonizasyonu çok az görülmektedir. Ancak has-tanede yatan hastalar aras›nda kolonizasyon oran›, 1-2 haftal›k yat›fl süresinde %13 iken, dört haftadan fazla yat›fl süresinde %50’ye kadar ç›kmaktad›r (21).
ABD’nde önemli nozokomiyal patojenlerden oldu¤u kabul edilen C.difficile’nin her y›l yaklafl›k 3 milyon olguya, hastane d›fl›nda tedavi edilen hastalar aras›n-da ise, y›laras›n-da 20.000 olguya neden oldu¤u tahmin edil-mektedir (22).
C.difficile’nin hastanede yatan ve beta-laktam antibi-yotik alan hastalar›n %15’inde, klindamisin kullanan-lar›n %10-25’inde diyareye neden oldu¤u bildiril-mektedir (20,23).
Yurdumuzda C.difficile ile ilgili çal›flmalar azd›r. Bu çal›flmalardan birinde Öztürk ve ark. (24) antimikro-biyal madde kullan›lan ve diyaresi olan 238 hastan›n 81 (%34)’inde ELISA ile toksin A varl›¤› belirlemifl-lerdir. Bu yüksek orana karfl›l›k, bu çal›flmada birinci çal›flma döneminde (1998-2000) 360 hastan›n sadece %4.7’sinde toksin A varl›¤› saptanm›flt›r. Karaer ve ark. (25) akut diyaresi olan 457 hastan›n 24 (%5.2)’ünün, kontrol grubundaki 90 sa¤l›kl› bireyin ise 7 (%7.7)’sinin d›flk› örneklerinde C.difficile üretil-mifltir. Ancak kontrol grubuna ait sufllar›n toksin olufl-turmad›¤›n›, buna karfl›l›k, diyareli hasta grubundan 4 (%0.8)’ünün toksin A/B üretti¤ini bildirmifllerdir. Ay-gün ve ark. (26) hastanede yat›fl s›ras›nda diyare geli-flen 125 hastadan dördünün (%3.2) d›flk› örneklerinde ELISA ile toksin A/B varl›¤› belirlemifllerdir. Balaban ve ark. (27) antibiyoti¤e ba¤l› diyare geliflen hastala-r›n %9’unda ELISA ve di¤er tan› yöntemleri ile, C.difficile’nin etken oldu¤unu bildirmifllerdir. Çal›fl-mam›zda da ikinci çal›flma döneminde (2000-2002) toksin A/B varl›¤› çal›flma sonucuna yak›n bir oranda (%12) belirlenmifltir. Ancak hastanelerin antibiyotik kullan›m politikalar›, hastalar›n hastanede yat›fl süre-leri, hastane infeksiyonu kontrol yöntemleri aras›nda-ki farklar›n, infeksiyon s›kl›¤›n› önemli ölçüde de¤ifl-tirebilece¤i göz önünde tutulmal›d›r.
Çal›flmam›zda birinci ve ikinci çal›flma dönemlerinde al›nan pozitif sonuçlar aras›ndaki fark, büyük olas›-l›kla 1998-2000 y›llar› aras›nda sadece toksin A’y› belirlemeye yönelik bir kitin kullan›lm›fl olmas› ve bu nedenle C.difficile toxA- toxB+ sufllar ile geliflen infeksiyonlar›n belirlenememifl olmas›na ve muhte-melen ikinci çal›flma döneminde daha yayg›n antibi-yotik kullan›m›na ba¤lanabilir.
C.difficile infeksiyonu tan›s›nda kullan›labilecek bir
çok yöntem vard›r. Bunlar aras›nda yer alan kültür yönteminin duyarl›l›¤› %89-100, özgüllü¤ü %84-99’dur. Ancak üretilen suflun toksin oluflturup olufl-turmad›¤›n›n ek bir deneyle belirlenmesi gerekmek-tedir. Bu nedenle zaman al›c› ve pahal› oldu¤undan rutin olarak kullan›m› k›s›tl›d›r (28). Toksinlerin belir-lenmesinde çeflitli yöntemler kullan›labilir. Örne¤in; hücre kültürlerinde sitotoksin belirlenmesi, duyarl›l›-¤› (%67-100), özgüllü¤ü (%85-100) yüksek bir yön-tem olmakla birlikte pahal›, standardizasyonunun tam sa¤lanamam›fl olmas› ve zaman al›c› (48 saat) olmas› nedeni ile pratikte kullan›lmamaktad›r (29). Lateks aglutinasyonu ile C.difficile glutamat dehidrogenaz antijeninin belirlenmesi h›zl› ve pratik bir yöntem ol-makla beraber duyarl›l›¤› (%58-92) ve özgüllü¤ü (%80-96) düflüktür. Ayr›ca non-toksijenik sufllarla oluflan kolonizasyonlarda da yanl›fl pozitif sonuçlar vermektedir (3,28). ELISA ile d›flk›da toksin A/B’nin belirlenmesi en s›k kullan›lan rutin tan› yöntemidir. Bu amaçla bir çok ticari kit gelifltirilmifltir. Bu kitler-de duyarl›l›¤›n %65-%95, özgüllü¤ün ise %75-%100 oldu¤u bildirilmektedir (17).
Çeflitli çal›flmalarda, C.difficile’nin hem toxA- toxB+ ve hem de toxA+ toxB- sufllar›n›n bulunabilece¤i ve her ikisinin de infeksiyon oluflturabildi¤i bildirilmek-tedir (30-32). Bu nedenle sadece toksin A’n›n belir-lenmesine yönelik ELISA kitleri tan› duyarl›l›¤›n› dü-flürmektedir (32).
Lozniewski ve ark. (32) C.difficile toksini aranmas› iste¤i ile laboratuvara gönderilen diyareli 1104 d›flk› örne¤inin 130 (%11.7)’unda, Premier toksin A/B ELI-SA kit ve toksijenik kültür yöntemleri ile pozitiflik saptam›fllar ve ELISA’n›n h›zl›, duyarl› ve rutin tan› için uygun bir yöntem oldu¤unu bildirmifllerdir. O’Connor ve ark. (33) d›flk› örneklerinde, C.difficile kültürü ve Vero hücre kültürlerinde sitotoksik aktivi-tenin belirlenmesini alt›n standart olarak alm›fllar, dört farkl› ticari tan› kitinin duyarl›l›k ve özgüllü¤ü-nü karfl›laflt›rm›fllard›r. Sonuç olarak ImmunoCard Toxin A (Meridian Diagnostic) kit için duyarl›l›¤›n %52, özgüllü¤ün %100, C.difficile toksin A (Oxoid Ltd.) kitin duyarl›l›¤›n›n %49, özgüllü¤ünün %99, Toxin A/B-TechLab kitinin duyarl›l›¤›n›n %80, öz-güllü¤ünün %99 ve Premier Toxin A/B (Meridian Diagnostic) kitinin duyarl›l›¤›n›n %82, özgüllü¤ü-nün %99 oldu¤unu bildirmifllerdir.
Çal›flmam›zda O’Connor ve ark.’n›n denedikleri iki kit kullan›lm›flt›r. ‹lk çal›flma döneminde kullan›lan ImmunoCard toksin A kit ile al›nan pozitiflik oranla-r›n›n düflük (%4.7) olmas› bu kitin O’Connor ve ark.’n›n da belirledikleri gibi düflük duyarl›l›k oran›-na (%52) sahip olmas›ndan ve daha önce de bildiril-di¤i gibi, C.difficile toxA- toxB+ sufllar›n›n saptana-mamas›ndan kaynaklanabilir. Son iki y›ll›k çal›flma döneminde kulland›¤›m›z Premier toksin A/B kitinin O’Connor ve ark. duyarl›l›k ve özgüllük yönünden di¤er tan› kitlerine göre en üstün oldu¤unu bildirmifl-lerdir. Çal›flmam›zda bu kitle son iki y›lda saptanan pozitiflik oran› %12’ye ç›km›fl ve iki ayr› çal›flma dönemindeki fark›nda istatistiksel olarak ileri dere-cede anlaml› oldu¤u belirlenmifltir (p<0.001). Sonuç olarak, d›flk› örneklerinde ELISA ile toksin A/B’nin saptanmas›, C.difficile’nin neden oldu¤u in-feksiyonlar›n belirlenmesinde pratik ve duyarl› bir yöntemdir. Ancak toksijenik kültür ile birlikte uygu-land›¤›nda duyarl›l›¤›n %100, özgüllü¤ün %99.3’e ç›kt›¤› göz önüne al›n›rsa, olana¤› olan laboratuvar-lar›n bu iki yöntemi birlikte uygulamas› tan› duyarl›-l›¤›n› artt›racakt›r.
KAYNAKLAR
1. Brooks GF, Butel JS, Morse SA: Jawettz, Melnick, Adelberg’s Medical Microbiology, 22nd ed. p187, 267, McGraw-Hill Co., London (2001).
2. Johnson S, Gerding DN: Clostridium difficile. “May-hall CG (ed). Hospital Epidemiology an Infection Con-trol”, 2nd ed. p467, Lippincott Williams and Wilkins, New York (1999).
3. Donald EF:Clostridium difficile infection. “Moellering RC (ed). Emerging Pathogens: Implications for the Futu-re”, p51, Pharma Libri, Montreal (2000).
4. Boriello SP, Davies MA, Kamiya S, Reed PJ, Seddon S:Virulence factors of Clostridium difficile, Rev Infect Dis 12(Suppl 1.2):185 (1990).
5. Boriello SP, Welch AR, Barclay FE, Davies MA: Mu-cosal association by Clostridium difficile in the hamster gastrointestinal tract, J Med Microbiol 25:191 (1988). 6. Seddon SV, Boriello SP:Proteolitic activity of Clostri-dium difficile, J Med Microbiol 36:307 (1992).
7. Eveillard M, Fourel V, Barc MC, Kerneis S, Cocon-nier MH, Karjalainen T, Bourlioux P, Servin AL: Iden-tification and characterization of adhesive factors of Clos-tridium difficile involved in adhesion to human colonic en-terocyte-like Caco-2 and mucus-secreting HT 29 cells in culture, Mol Microbiol 7:371 (1993).
8. Karjalainen T, Barc MC, Collignon A, Trolle S, Bo-ureau H, Cotte-Laffitte J, Bourlioux P:Cloning of a ge-netic determinant from Clostridium difficile involved in adherence to tissue culture cells and mucus, Infect Immun 62:4347 (1994).
9. Waligora AJ, Barc MC, Bourlioux P, Collignon A, Karjalanien T: Clostridium difficile cell attachment in modified by environmental factors, Appl Environ Microbi-ol 65:4234 (1999).
10. Davies MA, Boriello SP: Detection of capsule in stra-ins of Clostridium difficile of varying virulence and toxi-genicity, Microb Pathog 9:141 (1990).
11. Bartlett JG:Clostridium difficile: Clinical considera-tions, Rev Infect Dis 12:243 (1990).
12. George WL, Rolfe RD, Finegold SM:Clostridium difficile and its cytotoxin in feces of patients with antimic-robial agent-associated diarrhea and miscellaneous condi-tions, J Clin Microbiol 15:1049 (1982).
13. Bartlett JG, Taylor NS, Chang T, Dzink J:Clinical and laboratory observations in Clostridium difficile colitis, Am J Clin Nutr 33:2521 (1980).
14. Kelly CP, Pothoulakis C, LaMont JT:Clostridium difficile colitis, N Engl J Med 330:257 (1994).
15. Lyerly DM, Neville LM, Evans DT, Fill J, Allen S, Greene W, Sautter R, Hnatuck P, Toprey DJ, Schwalbe R: Multicenter evaluation of the Clostridium difficile TOX A/B TEST, J Clin Microbiol 36:184 (1998).
16. Lyerly DM, Krivan HC, Wilkins TD:Clostridium difficile: Its disease and toxins, Clin Microbiol Rev 1:1 (1988).
17. Gerding DN, Johnson S, Peterson LR, et al: Clostri-dium difficile-associated diarrhea and colitis, Infect Con-trol Hosp Epidemiol 16:459 (1995).
18. Depitre C, Delmee M, Avesani V, et al: Serogroup F strains of, Clostridium difficile produce toxin B but not to-xin A, J Med Microbiol 3:434 (1993).
19. McFarland LV: Diarrhea acquired in the hospital, Gastroenterol Clin North Am 22:563 (1993).
20. McFarland LV, Surawiez CM, Greenberg RN, et al: Prevention of beta-lactam-associated diarrhea by Saccha-romyces boulardi-i compared wboulardi-ith placebo, Am J Gastroenterol 90:430 (1995).
21. Landry ML, Topal J, Ferguson D, Gludetti D, Tang Y: Evaluation of biosite triage Clostridium difficile panel for rapid detection of Clostridium difficile in stool samp-les, J Clin Microbiol 39:1855 (2001).
22. Hirschhorn LR, Trnka Y, Onderdonk A, et al: Epi-demiology of community-acquired Clostridium difficile-associated diarrhea, J Infect Dis 169:127 (1994).
23. Barlett JG:Antibiotic-associated diarrhea, Clin Infect Dis 15:573 (1992).
24. Öztürk R, Midilli K, Ergin S, Ero¤lu C, Aygün G, Okyay K:‹shalli olgularda ELISA yöntemi ile Clostridi-um difficile toksin A aranmas›, 5. Ulusal ‹nfeksiyon Has-tal›klar› Kongresi, Kongre kitab› s101, ‹stanbul (1995). 25. Karaer P, Yark›n F, Alhan E, Köksal F:‹shalli ve asemptomatik kiflilerin d›flk›lar›nda Clostridium difficile
ve toksinleri ile di¤er enteric patojenlerin insidans›, 5. Ulu-sal ‹nfeksiyon Hastal›klar› Kongresi, Kongre kitab› s.101, ‹stanbul (1995).
26. Aygün G, Aslan M, Yaflar H, Altafl K:Hastanede ya-tarken geliflen ishal olgular›nda Clostridium difficile tok-sin A+B araflt›r›lmas›, ANKEM Derg 16:82 (2002). 27. Balaban N, Karahan ZC, Koca Y, Güvener E: Clos-tridium difficile’ye ba¤l› infeksiyonlar›n tan›s›nda kullan›-lan çeflitli yöntemlerin karfl›laflt›r›lmas›, Mikrobiyol Bült 35:211 (2001).
28. Thielman NM:antibiotic-associated colitis. “Mandell GL, Bennett JE, Dolin R (eds): Principles and Practice of Infectious Diseases”, p1111, 5th Ed. Churchill Livingsto-ne, Philadelphia (2000).
29. Kelly CP, Pothoulakis C, LaMont JT:Clostridium difficile colitis, N Engl J Med 330:257 (1994).
30. Al-Barrak A, Embil J, Dyck B, Olekson K, Nicoll D, Alfa M, Kabani A:An outbreak of toxin A negative, toxin
B positive Clostridium difficile-associated diarrhea in a Canadian tertiary-care hospital, Can Commun Dis Rep 25:65 (1999).
31. Limaye AP, Turgeon DK, Cookson BT, Fritsche TR: Pseudomembraneous colitis caused by a toxin A- B+ stra-in of Clostridium difficile, J Clstra-in Microbiol 38:1696 (2000).
32. Lozniewski A, Rabaud C, Dotto E, Weber M, Mory F:Laboratory diagnosis of Clostridium difficile-associa-ted diarrhea and colitis: Usefulness of premier cytoclone A+B enzyme immunoassay for combined detection of sto-ol toxins and toxigenic C.difficile strains, J Clin Microbisto-ol 39:1996 (2001).
33. O’Connor D, Hynes P, Cormican M, Collins E, Cor-bett-Feeney G, Cassidy M:Evaluation of methods for de-tection of toxins in specimens of feces submitted for diag-nosis of Clostridium difficile associated diarrhea, J Clin Microbiol 39:2846 (2001).
