T.C.
PAMUKKALE ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
BİYOLOJİ ANABİLİM DALI
LILIUM CANDIDUM L. EKSTRAKTLARI ÜZERİNDE
ANTİOKSİDAN, HİSTO-BİYOKİMYASAL VE İÇERİK
AYDINLATMA ÇALIŞMALARI
YÜKSEK LİSANS TEZİ
ŞERİFE DEMİRBAŞ
T.C.
PAMUKKALE ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
BİYOLOJİ ANABİLİM DALI
LILIUM CANDIDUM L. EKSTRAKTLARI ÜZERİNDE
ANTİOKSİDAN, HİSTO-BİYOKİMYASAL VE İÇERİK
AYDINLATMA ÇALIŞMALARI
YÜKSEK LİSANS TEZİ
ŞERİFE DEMİRBAŞ
Bu tez çalışması PAÜ-BAP tarafından 2019FEBE020 nolu proje ile desteklenmiştir.
Bu çalışma, Pamukkale Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik Kurul Başkanlığı’na yapılan PAUHADYEK-2018/36 no’lu müracaata istinaden, Hayvan Deneyleri Etik Kurul Başkanlığı’nın 25.12.2018 tarih ve 2018/11 sayılı toplantı kararı ile etik açıdan uygun görülmüştür.
Bu tezin tasarımı, hazırlanması, yürütülmesi, araştırmalarının yapılması ve bulgularının analizlerinde bilimsel etiğe ve akademik kurallara özenle riayet edildiğini; bu çalışmanın doğrudan birincil ürünü olmayan bulguların, verilerin ve materyallerin bilimsel etiğe uygun olarak kaynak gösterildiğini ve alıntı yapılan çalışmalara atfedildiğine beyan ederim.
i
ÖZET
LILIUM CANDIDUM L. EKSTRAKTLARI ÜZERİNDE ANTİOKSİDAN,
HİSTO-BİYOKİMYASAL VE İÇERİK AYDINLATMA ÇALIŞMALARI
YÜKSEK LİSANS TEZİ ŞERİFE DEMİRBAŞ
PAMUKKALE ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI
(TEZ DANIŞMANI: PROF. DR. OLCAY DÜŞEN) (EŞ DANIŞMAN: DOÇ. DR. PINAR İLİ)
DENİZLİ, ŞUBAT - 2021
Bu çalışma, Liliaceae familyasına ait olan Lilium candidum L. türünün yer altı ve yer üstü kısımlarından elde edilen aseton, metanol ve su ekstraktları üzerinde yapılmıştır. Elde edilen ekstraktların antioksidan aktivite tayinleri (β-Karoten, DPPH, ABTS, Cuprac, Fosfomolibdenyum ve FRAP), toplam fenolik, flavanoid ve tanen miktar tayinleri ve HPLC metodu ile fenolik içeriklerinin belirlenmesi çalışılmıştır. Bunların yanı sıra L. candidum türünden elde edilen ekstraktların sıçanlar üzerindeki histo-biyokimyasal özellikleri de incelenmiştir.
Çalışma sonucunda L. candidum türünde serbest radikal giderim aktivitesinin en düşük yer altı distile su ekstraktında (6.76±0.15 mg/mL), en yüksek ise yer üstü aseton ekstraktında (1.07±0.54 mg/mL) olduğu belirlenmiştir. L. candidum türüne ait ekstraktlarda en yüksek flavanoid madde miktarının metanol yer altı ekstraktında (75.06±0.00 mgQE/g), fenolik bileşen miktarının aseton yer üstü ekstraktında (31±0.00 mg/mlGAE), tanen miktarının ise en yüksek yerüstü aseton ekstraktında (10.88±0.01 mgCE/g) olduğu tespit edilmiştir. Histo-biyokimyasal çalışmada ise L. candidum yeraltı sulu ekstraktı doza bağlı olarak, metanolik ekstraktı ise kullanılan tüm dozlarda olumlu etkiler göstermiştir.
ANAHTAR KELİMELER: Antioksidan, Histoloji, HPLC, Liliaceae, Lilium
ii
ABSTRACT
STUDIES ON THE ANTIOXIDANT, HISTO-BIOCHEMICAL AND PHYTOCHEMICAL CONTENTS OF THE EXTRACTS OF LILIUM
CANDIDUM L.
MSC THESIS ŞERİFE DEMİRBAŞ
PAMUKKALE UNIVERSITY INSTITUTE OF SCIENCE BİOLOGY
(SUPERVISOR: PROF. DR. OLCAY DÜŞEN) (CO-SUPERVISOR: DOÇ. DR. PINAR İLİ)
DENİZLİ, FEBRUARY 2021
This study was carried out on acetone, methanol and water extracts obtained from the underground and aboveground parts of Lilium candidum L. species belonging to the Liliaceae family. Antioxidant activity determinations of the extracts (β-Carotene, DPPH, ABTS, Cuprac, Phosphomolybdenum and FRAP), total phenolic, flavonoid and tannin quantification and determination of phenolic content by HPLC method were studied. In addition, histo-biochemical properties of extracts obtained from L. candidum species on rats were also examined.
As a result of the study, it was determined that the free radical scavenging activity in L. candidum species was lowest in underground aqueous extract (6.76±0.15 mg/mL) and the highest in aboveground acetone extract (1.07 ± 0.54 mg/mL). In extracts belonging to L. candidum species, the highest amount of flavanoid substance is in methanol underground extract (75.06 ± 0.00 mgQE/g), the amount of phenolic component is in acetone aboveground extract (31 ± 0.00 mg/ml GAE), and the amount of tannin is the highest in surface. It was found to be in acetone extract (10.88 ± 0.01 mgCE/g). In histochemical study, underground aqueous extract of L. candidum depending on the dose and methanolic extract of L.
candidum in all doses showed positive effects.
iii
İÇİNDEKİLER
Sayfa ÖZET ... i ABSTRACT ... ii İÇİNDEKİLER ... iii ŞEKİL LİSTESİ ... vSEMBOL LİSTESİ ... vii
ÖNSÖZ ... ix
1. GİRİŞ ... 1
1.1 Lilium candidum L. Türünün Genel Özellikleri ... 3
1.2 Serbest Radikaller ... 4
1.3 Antioksidanlar ... 4
1.4 Antioksidan Aktivite Tayin Yöntemleri ... 5
1.5 Sekonder Metabolitler ... 6
1.6 Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi ile Fenolik Bileşiklerin Analizi ... 7
1.7 Histokimyasal ve Yara Kontraksiyonu Çalışmaları ... 8
2. MATERYAL METOT ... 9
2.1 Bitkilerin Temin Edilmesi ve Teşhisi ... 9
2.2 Bitki Ekstraktlarının Hazırlanması ... 10
2.3 Antioksidan Kapasite Belirleme Yöntemleri ... 11
2.3.1 β-Karoten Linoleik Asit Yöntemi ... 11
2.3.2 Fosfomolibdenyum Yöntemi ... 12
2.3.3 DPPH Serbest Radikal Giderim Kapasitesinin Belirlenmesi ... 13
2.3.4 ABTS Radikal Giderim Aktivitesi ... 14
2.3.5 Demir İyonu İndirgeyici Antioksidan Gücü (FRAP) Yöntemi ... 15
2.3.6 Bakır İndirgeme Gücü Kapasitesi (CUPRAC) Yöntemi ... 15
2.4 Toplam Sekonder Metabolit Miktar Tayini ... 15
2.4.1 Toplam Fenolik Madde Miktarının Belirlenmesi ... 15
2.4.2 Ekstratların Toplam Flavonoid Bileşik Miktarının Belirlenmesi 16 2.4.3 Toplam Tanen Miktarının Belirlenmesi ... 16
2.5 HPLC metodu ile Fenolik Bileşenlerin Tayini ... 16
2.6 Histokimyasal ve Yara Kontraksiyonu Çalışmaları ... 18
2.6.1 Fare Gruplarının Oluşturulması ... 18
2.6.2 Eksizyon Yara Modeli Oluşturulması ... 19
2.6.3 Yara Kontraksiyonu ... 19
2.6.4 Histokimyasal Çalışmalar ... 20
2.6.5 İstatistiksel değerlendirme ... 20
3. BULGULAR ... 21
3.1 β-Karoten-Linoleik Asit Yöntemi ... 21
3.2 Fosfomolibdenyum Yöntemi ... 22
3.3 DPPH Serbest Radikal Giderim Kapasitesinin Belirlenmesi ... 23
iv
3.5 Demir İyonu İndirgeyici Antioksidan Gücü (FRAP) Belirlenmesi .... 26
3.6 CUPRAC Yöntemi ... 28
3.7 Toplam Fenolik Madde Miktarının Belirlenmesi ... 29
3.8 Toplam Flavonoid Madde Miktarının Belirlenmesi ... 30
3.9 Toplam Tanen Madde Miktarının Belirlenmesi ... 31
3.10 Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC/YPSK) ile Fenolik Bileşiklerin Analizi ... 32
3.11 Yara Kontraksiyonu ... 34
3.12 Histobiyokimyasal Bulgular ... 36
3.12.1 Genel Histolojik Yapı ... 36
3.12.2 Kollajen Fibriller ... 36 3.12.3 Elastik Fibriller ... 36 3.12.4 Bazal Membran ... 37 4. TARTIŞMA ... 38 5. SONUÇ VE ÖNERİ ... 47 6. KAYNAKLAR ... 48 7. ÖZGEÇMİŞ ... 56
v
ŞEKİL LİSTESİ
Sayfa
Şekil 2.1: L. candidum bitkisinin A: Genel görünümü, B: Toprak üstü kısmı, C: Toprak altı kısmı………..……….9 Şekil 2.2: L. candidum türünün kurutulması ve ekstraksiyona hazırlanması…....10 Şekil 2.3: Bitkilerin ekstraksiyon aşamaları………..11 Şekil 2.4: β-karoten çözeltisinin hazırlanışı………..12 Şekil 2.5: DPPH hazırlanışı ve serbest radikal giderim aktivitesi konsantrasyonları………...14 Şekil 3.1: L. candidum ekstraktlarının β-karoten-linoleik asit yöntemi ile antioksidan aktiviteleri (%)………21 Şekil 3.2: L. candidum ekstraktlarının fosfomolibdenyum yöntemi ile antioksidan
aktiviteleri (mg AAE/g)……….23 Şekil 3.3: Ekstraktlarının DPPH serbest radikal giderim aktivitesi (%)…………24 Şekil 3.4: Ekstraktlarının ABTS radikal katyonu giderim aktivitesi (%)……...26 Şekil 3.5: L. candidum ekstraktlarının FRAP yöntemiyle indirgeme gücü kapasiteleri (mgTE/g)………27 Şekil 3.6: L. candidum ekstraktlarının CUPRAC yöntemi ile farklı konsantrasyonlardaki absorbans grafiği (mgTE/g)………28 Şekil 3.7: L. candidum ekstraktlarının toplam fenolik madde miktarları (mg/mL GAE)………..30 Şekil 3.8: L. candidum eksraktlarının toplam flavonoid madde miktarları (mgQE/g)………30 Şekil 3.9: L. candidum ekstraktlarının toplam tanen madde miktarları (mgCE/g)………....32 Şekil 3.10: Sıçanlardaki eksizyonel yaraların 5, 10 ve 15. günlerdeki yara kontraksiyonları……….34 Şekil 3.11: Farelerde eksizyonel deri yaralarından alınan dokulara uygulanan histokimya fotomikrografları. E: Epidermis; D: Dermis; Elastik fibiller (ORC), bazal membran (PAS)………37
vi
TABLO LİSTESİ
Sayfa
Tablo 1.1 : Türkiye Florasında Yayılış Gösteren Lilium Taksonları…………..…2 Tablo 2.1: Deneysel çalışmalar için oluşturulan gruplar………...…18 Tablo 2.2: Deneyde kullanılan yöntemler ve amaçları...………...…20
Tablo 3.1: L. candidum ekstraktlarının toplam antioksidan madde miktarları (% İnhibisyon Değerleri)………... 21
Tablo 3.2: L. candidum ekstraktlarının fosfomolibdenyum antioksidan aktiviteleri (mgAE/g)…….………..……....22 Tablo 3.3: L. candidum ekstraktlarının DPPH serbest radikal giderim aktivitesi (IC50 değerleri mg/mL)………24
Tablo 3.4: L. candidum ekstraktlarının ABTS radikal giderim aktivitesi (IC50 değerleri mg/mL))………... 25
Tablo 3.5: L. candidum ekstraktlarının FRAP deney sonuçları
(mgTE/g)………...27 Tablo 3.6: L. candidum ekstraktlarının CUPRAC deneyi sonuçları
(mgTE/g)…..………..28 Tablo 3.7:. L. candidum ekstraktlarının toplam fenolik madde miktarları (mgGAE/g)……….29 Tablo 3.8: L. candidum eksraktlarının toplam flavonoid madde miktarları (mgQE/g)………30 Tablo 3.9: L. candidum ekstraaktlarının toplam tanen miktarları (mgCE/g)…...31 Tablo 3.10: L. candidum türünün metanol ekstraktlarının içerisindeki bazı fenolik bileşenlerin içerikleri ve miktarları………...………….33 Tablo 3.11: Ekstraktının topikal uygulamasının sıçanlarda yara kontraksiyon süresi üzerine etkileri………..…………..……….…….35
vii
SEMBOL LİSTESİ
ºC
Santigrat derece
gr
Gram
M
Molar
mM
Milimolar
μl
Mikrolitre
nm
Nanometre
%
Yüzde
mgQE/g
Kuersetin eşdeğeri
GAE
Gallik asit eşdeğeri
dH
2O
Distile Su
SOD
Süperoksit dismutaz
K
3Fe(CN
6)
Potasyum ferrosiyanür
viii
KISALTMA LİSTESİ
UV
Ultraviyole
DPPH
1,1-difenil-2-pikril-hidrazil
ABTS
2,2′-azinobis-(3-etilbenzotiazolin-6-sülfonik asit)
FRAP
Ferrik iyonu indirgeme antioksidan gücü
BHA
Bütillenmiş hidroksianisol
BHT
Bütil hidroksi toluen
TCA
Tirokloroasetik asit
ppm
Milyonda bir birim
dk
Dakika
Ab
Absorbans
pH
Hidrojen potansiyeli
rpm
Revolutions per minute
ix
ÖNSÖZ
Bu çalışmada desteğini ve yardımlarını esirgemeyen, beni bu yolcuğumda yalnız bırakmayıp benimle birlikte bu yolculukta yürüyen sevgili danışmanım Prof. Dr. Olcay DÜŞEN’e; bu çalışmanın hayata geçirilmesi sürecinde bilgi ve tecrübelerinden faydalandığım, araştırmanın her bir aşamasında görüşleriyle beni destekleyen, samimiyetini her zaman hissettiren ve beni doğru yönde yönlendiren hocam Prof. Dr. Ramazan MAMMADOV’a; büyük bir ilgiyle bana faydalı olabilmek için elinden gelenden fazlasını sunan güler yüzünü ve samimiyetini benden esirgemeyen eş danışmanım Doç. Dr. Pınar İLİ’e sonsuz teşekkürlerimi sunuyorum.
Çalışmalarım süresince verdikleri destekten dolayı en başta Dr. Özge KILINÇARSLAN AKSOY olmak üzere Nahide DENİZ, Rusif YUSUFLİ ve laboratuvardaki tüm arkadaşlarıma;
Bu çalışmanın gerçekleşmesinde, projenin maddi desteğini sağlayan Pamukkale Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi Başkanlığı’na ve Etik kurul izninin alındığı Pamukkale Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik Kurul (PAÜHADYEK) Başkanlığı’na;
Beni bu günlere getiren, hiçbir zaman desteklerini esirgemeyen ve bu hayattaki en büyük şansım olan aileme; annem Hasibe DEMİRBAŞ ve babam Mustafa DEMİRBAŞ’a, ayrıca bu zorlu pandemi döneminde motivasyonumu arttırdığı için minik yeğenim Hüseyin Alp YILDIRIM’a sonsuz teşekkürlerimi sunuyorum.
1
1. GİRİŞ
Anadolu zengin ve ilginç bir floraya sahip olması sebebiyle 1700’lü yıllardan bu yana birçok botanikçinin dikkatini çekmiş ve ülkemize çok sayıda geziler düzenlenmek suretiyle bitki örnekleri toplanmıştır. Anadolu’nun zengin bir floraya sahip olmasını topoğrafik, jeolojik ve jeomorfolojik yapılarının değişiklik göstermesine, deniz, göl, akarsu gibi çeşitli su ortamlarının etkisiyle oluşan klimatik farklılıkların çeşitliliğine, deniz seviyesi ila 5.000 metreler arasında değişen yükseklik farklılıklarına, tür endemizminin yüksek olmasına, Avrupa-Sibirya, Akdeniz ve İran-Turan Fitocoğrafik Bölgeleri’nin karşılaştığı bir yerde bulunmasına ve Asya, Afrika ve Avrupa kıtaları arasında bir köprü oluşturmasına bağlamak mümkündür (Erik ve Tarıkahya, 2004). Ülkemiz 12.000’den fazla bitki taksonuna sahip olup, bunların yaklaşık 3.649’u endemik türlerden oluşmaktadır (Güner ve diğ. 2012).
Dünyada geofit çeşitliliğinin en zengin olduğu bölgeler Akdeniz ikliminin görüldüğü, Cape Town, Akdeniz Havzası, Avustralya, Şilie ve Kaliforniya’dır (Proches ve ark. 2006). Türkiye’nin içinde yer aldığı Akdeniz Havzası Dünya’nın en zengin geofit florasına sahip bölgelerinden biridir. Yaklaşık üçte biri endemik 12.000’den fazla bitki türü içeren Anadolu’da başta Liliaceae, Amaryllidaceae, Iridaceae, Araceae, ve Orchidaceae familyaları olmak üzere çok sayıda monokotil familyaya, Ranunculaceae, Primulaceae ve Geraniaceae gibi dikotil familyaya ait soğanlı bitki türü bulunmaktadır (Başköse ve diğ. 2013).
Genel olarak soğanlı, yumrulu ve rizomlu bitkilerin hepsi “soğanlı bitkiler” olarak adlandırılmaktadır. Bilimsel anlamda “geofit (Yunanca geo= yeryüzü; phyton= bitki)” olarak isimlendirilen bu bitkilerin toprak altında depo görevi gören soğan, tuber ve rizom şeklinde gövdeleri bulmakta ve toprak üstündeki kısımları büyüme mevsimi tamamlandıktan sonra kuruyarak ölmektedir. Türkiye sahip olduğu tür çeşitliliğininden dolayı, soğanlı, rizomlu ve yumrulu bitkileri içine alan geofit bitkiler bakımından da zengin bir potansiyel içermektedir. Ülkemizde yaklaşık 900’dan fazla soğanlı, yumrulu ve rizomlu bitki türü yayılış göstermektedir (Davis 1988; Ekim ve diğ. 2000; Güner ve diğ. 2012).
2
Ülkemizde yayılış gösteren geofit familyalarından biri olan Liliaceae familyası kozmopolit bir familya olup, kuzey ve güney yarımkürenin daha çok tropikal ve ılıman bölgelerde doğal olarak yayılış göstermektedir (Seçmen ve diğ. 1998). Bu familya dünyada toplam 250 cins ve 3.500 kadar tür ile temsil edilirken, ülkemizde 5 cins ve 91 tür ile temsil edilmektedir (Güner ve diğ. 2012).
Liliaceae familyası içinde yer alan cinslerden biri olan Lilium L. dünya üzerinde başlıca Avrupa, Asya ve Kuzey Amerika’da, ülkemizde ise genellikle Kuzey, Doğu ve Batı Anadolu’da doğal olarak yayılış göstermektedir. Ülkemizde “Zambak” olarak isimlendirilen bu cins dünya genelinde yaklaşık 100 tür ile temsil edilmektedir (Pelkonen ve Pirttilä 2013). Lilium cinsi ülkemizde 7 tür, 8 taksonla temsil edilmekte olup, bu taksonlardan iki tanesi endemiktir (Tablo 1.1) (Güner ve diğ. 2012).
Tablo 1.1: Türkiye Florasında Yayılış Gösteren Lilium Taksonları Türkiye Florasında Yayılış Gösteren Lilium Taksonları 1. Lilium akkusianum R.Gämperle- Endemik
2. Lilium candidum L.
3. Lilium ciliatum P.H.Davis- Endemik 4. Lilium kesselringianum Miscz. 5. Lilium martagon L.
6. Lilium monadelphum M.Bieb. var. armenum (Miscz. ex Grossh.) P.H.Davis &
D.M.Hend.
7. Lilium monadelphum M.Bieb. var. szovitsianum (Fisch. & Avé-Lall.) Elwes 8. Lilium ponticum K.Koch.
Lilium türleri soğanlı ve çok yıllıklı bitkilerdir. Gösterişli çiçeklerinden dolayı
süs bitkisi olarak, aromatik özelliğinden dolayı parfüm endüstrisinde, ayrıca bazı etken maddelere sahip olmasından dolayı da cilt hastalıklarının (apse, sivilce) tedavisinde kullanılmaktadır (Mammadov ve diğ. 2017).
3
1.1 Lilium candidum L. Türünün Genel Özellikleri
Lillium candidum L., Liliaceae familyasından çok yıllık, otsu yapıda ve monoik
bir bitkidir (Cronquist 1988). Soğan çapı 3-5 cm arasında olup soğan kabuğu bulunmaz. Soğanlar birbiri üzerine dizilmiş 50 adet puldan oluşur. Bu pullar besin depolamak için değişime uğramış yapraklardır. Gövde boyu 50-130 cm uzunluğunda olup, 2-12 adet çiçek bulunmaktadır. Spiral dizilişli, parlak ve tüysüz yaprakları vardır. Bu türün çiçeklenmesi Mayıs ve Haziran aylarıdır. L. candidum’un başarılı büyüme ve çiçeklenmesi için sıcaklığın yüksek ve toprak drenajının iyi olması gerekmektedir (Baytop ve Mathew 1984).
Lilium candidum dünyada Balkanlar, Lübnan ve Filistin’de, ülkemizde ise
Akdeniz ve Ege Bölgelerinde yayılış göstermektedir (Davis 1984).
Son yıllarda Avrupa, ABD, Türkiye ve diğer birçok ülkede başarıyla yetiştirilmektedir (Baytop 1984; Khan ve diğ. 2010). L. candidum halk arasında, ak zambak veya Madonna zambak olarak isimlendirilmektedir (Özen ve diğ. 2012).
Lilium candidum, Türkiye için endemik tür değildir, fakat tükenme riski
yüksek olan türlerin içindedir. İnsanların yaşam alanlarına yakın bölgelerde yetiştiği için soğanları kolay bir şekilde sökülmekte ve ticari olarak satılmak suretiyle yetiştiği bölgede yoğunluğu azalma tehlikesi ile karşı karşıya kalmaktadır (Temeltaş 1999).
Lilium candidum, kesme çiçek endüstrisinde kullanılmak üzere Orta Doğu ve
Türkiye’de yüzyıllar boyunca yetiştirilmektedir. Yapraklarında saptanan saponin ve L.
candidum bitkisinde tespit edilen yeni bir flavonoid alkaoid türevi prolin-prolidin
ekonomik değerini daha da arttırmıştır (Mucaji ve diğ. 2000, Mimaki 1999, Vachálková 1999 Eisenreichova ve diğ. 1992). L. candidum özütü (LE) biyolojik olarak çeşitli aktif bileşikler içermektedir. Etnobotanikte yanıkların, ülserlerin, iltihapların ve yaraların iyileşmesi için kullanılmaktadır (Mimaki ve ark., 1999; Eisenreichova ve ark., 2004). Ayrıca L. candidum türünde antioksidan özelliğe sahip olan kemferol maddesi tespit edilmiştir. Kemferol maddesi dermal ilaçların yapısında bulunmaktadır (Cupakova ve diğ. 2012).
4
1.2 Serbest Radikaller
Serbest radikaller vücutta oksidatif stres sonucu oluşan endojen ve ekzojen kaynaklı alınan bileşiklerdir. Bir ya da birden çok elektron içeren, ömürleri kısa, kararsız, molekül ağırlığı düşük ve çok etkin moleküllerdir. Başka moleküllerle kolayca elektron alışverişine girebilen bu moleküllere oksidan moleküller veya reaktif oksijen türleri (ROT) de denilmektedir. (Çavdar ve diğ. 1997). Bu moleküller kararsızdır ve diğer bazı maddelerle kolaylıkla reaksiyona girerek, toksik etkisi yüksek yeni bileşikler meydana getirebilirler.
Serbest radikaller antioksidan sistemlerin yetersiz kalması durumunda DNA, protein ve lipit gibi makro moleküllerin oksidasyonuna neden olurlar. Oksidatif strese bağlı olarak oluşan in vivo DNA ve protein hasarının lipitlerdeki hasardan daha önemli olduğu ileri sürülmektedir. ROT üretimine neden olan tüm reaksiyonlar ve ajanlar protein oksidasyonu yanısıra hücre hasarına da yol açabilmektedir. Böyle hasarlar yapı değişimi ile birlikte yaşlanma ve hücre ölümüne sebep olacak şekilde biyolojik işlev kaybına yol açarlar.
Oluşan bu hasarın kanser, ateroskleroz, amiloidoz, yaşa bağlı bağışıklık yetersizliği, senil demans ve hipertansiyon gibi çeşitli hastalıklar ile ilişkili olduğu ve biyolojik yaşlanma sürecinde rol oynadığı bilinmektedir (Kopáni ve diğ. 2006).
1.3 Antioksidanlar
Serbest radikalleri nötralize ederek vücudun kendini yenilemesini sağlayan maddelere antioksidan denir. Hücrelerin normal solunumu sırasında yan ürün olarak oluşan ROT’lara karşı vücudun savunma sisteminde antioksidanların önemli bir rolü vardır. Serbest radikallerin hücreye zarar vermesini veya bu radikallerin oluşmasını engelleyen yapısında fenolik taşıyan bileşiklerdir (Temur, 2006).
Doğal kaynaklardan elde edilebildikleri gibi sentetik kaynaklardan da elde edilebilirler. İnsan vücudundan ve besinlerden alınarak üretilen antioksidanlar, hastalıklara sebep olduğu bilinen serbest radikallerin ve ROT’ların oksidatif zararlarına karşı önemli rol oynarlar. Ancak insan vücudundan üretilen
5
antioksidanların koruma etkileri sınırlı olduğundan dolayı ROT oluşumunun biyolojik sistemlerin antioksidan kapasitesini aşması durumunda oksidatif stres oluşabilmektedir (Aruoma ve Cuppet, 1997).
Önemli antioksidanlar C vitamini, E vitamini ve A vitamininin öncü maddesi olan β-karoten, flavonoidler ve bunlardan elektron alan çinko gibi maddelerdir (İriş ve Çınar 2019). Karotenoidler antioksidan ajanlar olarak bilinirler ve polifenol özellik göstermektedirler. Karotenoidler tekli oksijeni giderme özelliğine sahiptir. Özellikle fenolik bileşikler, bu yeteneklerinden dolayı ön plana çıkmaktadır (Sanjust ve diğ. 2008).
Antioksidanlar, serbest radikalleri hücre zarına, hücre bileşenlerine ve nükleik asitlere (DNA) zarar vermeden kendine bağlar. Bu nedenle antioksidan gıdalar, kalp hastalıklarına, kansere, erken yaşlanmaya karşı koruyucu ve gıdaların raf ömrünü uzatmak için görev yaparlar (Şen 2011).
1.4 Antioksidan Aktivite Tayin Yöntemleri
Antioksidan kapasite tayin yöntemleri kullanılan kimyasal reaksiyon açısından, hidrojen atomu transferi (HAT) ve tek elektron transferi (ET) (Huang DJ ve diğ 2005; Prior RL ve diğ. 2005) olmak üzere iki sınıfta toplanabilir.
HAT esaslı analiz yöntemlerinin çoğunda yarışmalı reaksiyon kinetiği izlenir. Kantitasyon, kinetik eğrilerden türetilir. HAT’a dayalı yöntemler genellikle bir yapay serbest radikal oluşturucu, bir oksitlenebilen probdan ve bir antioksidandan meydana gelir.
ET esaslı yöntemler, reaksiyon sonunun indikatörü olarak bir oksidan (aynı zamanda reaksiyonu takip etmek için prob olarak kullanılır) ile redoks reaksiyonunu içerir. HAT ve ET esaslı yöntemler bir numunenin koruyucu antioksidan kapasitesi yerine oksidan süpürücü kapasitesini ölçmeye dönüktür. HAT analiz yöntemleri:
İndüklenmiş düşük yoğunluklu lipoprotein otooksidasyonu
Oksijen radikal absorbans kapasitesi (ORAC) (Ellefson 2006)
Total radikal tuzaklayıcı antioksidan kapasitesi (TRAP) (Somogyi 2007)
6
ET esaslı analiz yöntemlerinde, bir reaksiyon karışımında antioksidan ve oksidan olmak üzere iki bileşen bulunur. Antioksidandan bir elektron alan oksidan renk değişimine neden olur. Bu renk değişiminin derecesi örnekteki antioksidan derişimi ile bağlantılıdır. Bu yöntemler:
Folin-Ciocalteu reaktifi (FCR) ile toplam fenolik madde analizi (Magalhães 2008)
Troloks eşdeğeri antioksidan kapasite (TEAC) ölçümü (Miller 1993)
Ferrik iyonu indirgeme antioksidan gücü (FRAP) ölçümü (Benzie 1996)
Cu (II) oksidan olarak kullanıldığı toplam antioksidan potansiyel
2,2-Difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) kullanarak toplam antioksidan potansiyel ölçümü (Huang 2005)
CUPRAC [Bakır (II) İndirgeyici Antioksidan Kapasite] yöntemi olarak sıralanabilir (Huang 2005).
1.5 Sekonder Metabolitler
Dünyadaki gelişmiş bitkilerden çeşitli yollarla izole edilmiş ve tanımlanmış 200.000’den fazla kimyasal vardır. Bu tür kimyasallar primer ve sekonder metabolitler olmak üzere iki ana gruba ayrılır. Primer metabolitler yağ asitleri, proteinler, karbohidratlar ve nükleik asitler gibi hücre bakımı için gereklidir. Sekonder metabolitler, fotosentez veya solunum metabolizmasına doğrudan katılmamalarına rağmen bitkilerin hayatta kalabilmesi için gerekli oldukları bilinmektedir. Kimyasal yapıları, primer metabolitlerle karşılaştırıldığında oldukça çeşitlidir ve bitki savunmasından sorumludur (Chikezie ve diğ. 2015).
Sekonder metabolitler ayrıca sinyal bileşikleri olarak işlev görür, tozlaştırıcıları çeker, ayrıca bitkiyi oksidanlardan ve ultraviyole radyasyondan korurlar. Sekonder metabolitler; flavanoidler, terpenler, nitrojen içeren alkaloidler, fenolik, polifenolik, ve sülfür içeren bileşiklerdir. Bu tür bileşikler yapı taşları ve biyosentetik enzimlerle primer metabolitlere bağlanır (Vora 2017).
Fenolik bileşikler bitkilerde daha yaygın olarak bulunan sekonder metabolitlerden biridir. Bitkilerdeki pentoz fosfat, şikimik asit ve fenilpropanoid
7
yollarından tüketilirler (Harborne 1980). Bu tür bileşikler, patojenlere ve avcılara karşı koruma sağlayarak bitkilerin büyümesi ve çoğalmasında önemli bir rol oynar. Ayrıca sebze ve meyvelerin renk, koku, tat gibi özelliklerine katkıda bulunurlar (Chikezie ve diğ. 2015). Yapı çeşitliliğinden dolayı, doğada oluşan çok çeşitli fenolik bileşikler vardır. Günümüzde 8.000’den fazla fenolik bileşik yapısı bilinmektedir.
1.6 Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi ile Fenolik Bileşiklerin Analizi
Kromatografi tekniği kullanılarak bitkinin pigmentlerinin ayrımı ilk kez 1906 yılında Rus botanikçisi Mikhail TSWET tarafından gerçekleştirilmiştir. Günümüzde kromatografi, uygun çözücü ortamındaki karışımın içerdiği maddelerin fiziksel ve kimyasal özelliklerine göre çözünerek ayrıldığı ayırma işlemlerine verilen isimdir (Yıldız ve diğ. 1997).
Bir karışımda bulunan bileşenler ayrılırken kalitatif ve kantitatif analizlerinin yapıldığı yöntem kromatografidir. Bu yöntemin çalışma düzeneği iki bileşenden oluşur: Sabit faz ve mobil (hareketli) fazdır. Mobil fazın içerisinde bulunan bileşenler, sabit faza ait dolgu maddesiyle etkileşimleri sebebiyle, bir miktar tutulurlar. Bu tutulma örneklere göre değişkenlik gösterir. Bunun sonucunda bileşenler sabit fazın sonlarına doğru farklı hızlarda ilerlediğinden dolayı birbirinden ayrılmış şekilde sabit fazı farklı zamanlarda terk ederler. Bu şekilde sabit fazdan çıkan bileşenlerin derişimleri uygun bir biçimde ölçülür, zamana veya mobil fazın kullanılan hacmine karşı y-ekseninde işaretlenerek ‘Kromatogram’ adı verilen grafikler elde edilir. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC), genellikle ayırma düzeneğine veya sabit fazın tipine göre gruplandırılır. Bunlar arasında; dağılma ya da sıvı-sıvı kromatografisini, adsorpsiyon ya da katı-sıvı kromatografisini, iyon-değişimi kromatografisini, boyut ayırıcı kromatografiyi, afinite kromatografisini ve kiral kromatografisiyi sayabiliriz (Eser ve Dinçel 2018).
8
1.7 Histokimyasal ve Yara Kontraksiyonu Çalışmaları
Yara, vücuttaki herhangi bir hasar sonucu dokunun bütünlüğünün bozulmasıdır (Erdil ve diğ. 1999). Yaralar akut ve kronik olarak oluşabilmektedir. Yara iyileşmesi birbirini takip eden 3 aşamadan meydana gelir. Bunlar; hemostatik ve inflamatuar reaksiyonlar, proliferatif faz ve olgunlaşma fazıdır (Brown ve diğ. 1994). Yaranın iyileşme süreci, o bölgeye salınan çeşitli sitokinler ve büyüme faktörleri tarafından düzenlenmektedir. Bunun yanında bazı faktörler de (kanama, diyabet ve bağışıklık sistemi) bu karmaşık olayları etkileyebilmektedir. Bu faktörler yaralı bölgenin enfekte olmasına veya yaranın açılmasına neden olarak kronikleşmesine sebep olabilmektedir (Levine 1990; Douglas ve diğ. 1995). İyileşmeyen kronik yaralar ise tıbbi sistemde çok büyük miktarlarda kaynak kullanımına neden olurken, hasta ve hasta yakınlarının yaşam kalitesini önemli ölçüde düşürmektedir (Han ve Ceilley 2017).
Bitkisel ekstraktlar yara tedavisinde yüzyıllardır kullanılmaktadır. Özellikle antioksidan içeren bileşiklerin yara iyileşmesinde daha etkili olduğu bilinmektedir (Kumar ve diğ. 2007). L. candidum, eski çağlardan beri halk hekimliğinde yaşa bağlı hastalıklar, yanıklar, ülserler ve öksürük gibi çeşitli rahatsızlıkların tedavisinde sıklıkla kullanılmaktadır (Zaccai ve diğ. 2020). Harici olarak kullanılan, çeşitli yöntemlerle hazırlanmış L. candidum ekstraktlarının ameliyat sonrası yara iyileşmesini hızlandırdığı bildirilmiştir (Patocka ve Navratilova 2019). Yakın zamanda yapılmış bir çalışmada L. candidum çiçek ekstraktı içeren merhemlerin yanık yarası alanında önemli bir azalmaya yol açtığı ve yanık yaralarını tedavi edebileceği gibi, iyileşme sürecini de hızlandırabileceği de rapor edilmiştir (Momtaz ve diğ. 2020).
9
2. MATERYAL METOT
2.1 Bitkilerin Temin Edilmesi ve Teşhisi
Çalışma materyalini oluşturan L. candidum örnekleri 2019 yılının, Mayıs ayında Balıkesir ilinin Manyas ilçesinde yerli yetiştirici olan Hasan DURAN’dan temin edilmiştir (Şekil 2.1). Temin edilen bitki örneklerinin tür teşhis işlemleri Pamukkale Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü Botanik Anabilim dalı Öğretim üyesi Prof. Dr. Olcay DÜŞEN tarafından gerçekleştirilmiştir.
Şekil 2.1: L. candidum bitkisinin A: Genel görünümü, B: Toprak üstü kısmı,
C: Toprak altı kısmı
C B A
10
2.2 Bitki Ekstraktlarının Hazırlanması
Çalışmada kullanılacak bitki örnekleri yetiştiriciden çiçekli halde temin edilmiştir. Temin edilen örnekler morfolojik özelliklerini çok fazla kaybetmeden yer altı ve yer üstü kısımları ayrılmıştır. Yer üstü ve yer altı kısımları küçük parçalara ayrılarak kuruması için laboratuvar ortamına serilmiştir (Şekil 2.2). Kuruduktan sonra laboratuar ortamında toz haline getirilmiştir.
Şekil 2.2: L. candidum türünün kurutulması ve ekstraksiyona hazırlanması
Ekstraksiyonlar değişik çözücülerin (aseton, metanol ve distile su) kullanımı ile hazırlanmıştır. Karışım çalkalamalı su banyosunda 55º C’de 6 saat bekletilerek süzülüp, daha sonra kalıntının üzerine tekrar çözücü eklenerek bir kez daha su banyosunda aynı işlem yapılmıştır. Bu işlem üç kez tekrarlanmıştır. Elde edilen ekstraktların çözücü kısmı Şekil 2.3’de görüldüğü gibi rotary evaporatörde uzaklaştırılmıştır. Ekstraktların yapısındaki su liyofilizatörde dondurularak çekilmiştir. Elde edilen sert bitki ekstraksiyonu yapılacak analizlere göre gerekli konsantrasyonlarda uygun çözücülerde çözünerek kullanılmıştır. Ekstreler biyolojik aktivite ve aktif bileşenlerin belirlenmesi çalışmalarında kullanılmak üzere üzere koyu renkli cam şişelere alınarak -20 0C de muhafaza edilmiştir (Mammadov ve ark. 2011).
11
Şekil 2.3: Bitkilerin ekstraksiyon aşamaları
2.3 Antioksidan Kapasite Belirleme Yöntemleri
2.3.1 β-Karoten Linoleik Asit Yöntemi
Ekstraktların toplam antioksidan aktivitesini belirlemek için β-karoten-linoleik asit yöntemi de kullanılmıştır. Bu yöntem, linoleik asitin inkübasyonu sırasında oluşan peroksit ürünlerinin bu antioksidanlarla nötralize edilmesini sağlar. Bunun sonucunda β-karotenin karakteristik sarı rengi korunmuş olur (Wettasinghe ve Shaididi 1999).
Linoleik asit + (O2-H2O) Konjuge dienler ve Bozunma ürünleri
β-karoten → Renk açılımı
Linoleik asit + (O2-H2O) + β-karoten + Antioksidan → Rengin korunumu β-karoten stok çözeltisi, 2 mg β-karotenin 10 ml kloroformda çözülmesiyle hazırlanmıştır. Bu çözeltinin 1 mililitresine, 40 mg linoleik asit ve 400 mg Tween 20 ilave edilmiştir. Kloroform rotary evoparotörde buharlaştırıldıktan sonra 100 ml distile
12
su ile karıştırılmıştır. Bu emülsiyonunun 4.8 mililitresi 0.2 mg örnek içeren 0.2 ml ekstrakt çözeltileri bulunan test tüplerine ilave edilmiştir. Emülsiyon test tüplerine ilave edilir edilmez spektrofotometre (Shimadzu UV–1601, Japon) kullanılarak başlangıç absorbansları 470 nm'de ölçülmüştür. Tüpler 50°C'de 120 dakika inkübasyona bırakılmış ve β-karotenin rengi kayboluncaya kadar inkübasyona devam edilmiştir (Şekil 2.4). Bu test sisteminde bütil hidroksi tolüen (BHT) pozitif kontrol olarak kullanılmıştır (Amin ve diğ. 2002). Toplam antioksidan aktivite aşağıdaki eşitlik kullanılarak hesaplanmıştır:
AA: [ 1- (A0-At / A0º - Atº)] x 100
Burada A0 örneğin ilk absorbansı, At kontrolun ilk absorbansı, A0º örneğin 120 dakika sonraki absorbansı, Atº kontrolun 120 dakika sonraki absorbansıdır (Amin ve diğ. 2004).
Şekil 2.4: β-karoten çözeltisinin hazırlanışı
2.3.2 Fosfomolibdenyum Yöntemi
Bu yöntem, özüt varlığında Mo (VI)’nın Mo (V)’e indirgenmesi sonucunda asidik pH’larda oluşan yeşil renkli fosfat-Mo (V) kompleksinin spektrofotometrik olarak takip edilmesi temeline dayanmaktadır (Prieto ve diğ. 1998). İçerisinde 0.01 mL özüt bulunan test tüplerine 3.0mL reaktif çözeltisi (0.588 M sülfürik asit, 0.036 mM sodyum fosfat ve 0.049 mM amonyum molibdat) ilave edilmiştir.
13
Test tüpleri 95 °C’de 90 dk inkübe edildikten sonra oda sıcaklığına kadar soğutulmuş ve köre karşı (3.0 ml reaktif çözelti ve 0.1 ml çözücü) 695 nm’de absorbans değerleri tespit edilmiştir. Özütlerin toplam antioksidan kapasiteleri standart askorbik asit grafiğinden elde edilen aşağıdaki eşitlik kullanılarak belirlenmiştir:
Absorbans= 0.0169 (askorbik asit) – 0.0071 (R2: 0.9999).
2.3.3 DPPH Serbest Radikal Giderim Kapasitesinin Belirlenmesi
Ekstraktların serbest radikal giderim aktiviteleri l,l-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) serbest radikali kullanılarak belirlenmiştir (Wu ve diğ. 2006). DPPH'in %0.004’lük (w/v) metanolik çözeltisinin 4 ml'si, ekstraktların 1 ml (0.2-1.0 mg)'si ile karıştırılmış ve oda sıcaklığında karanlık ortamda 30 dakika süresince inkübasyona bırakılmıştır. Bu süre sonunda örneklerin absorbansı spektrofotometrede 517 nm’de ölçülmüştür. Absorbans değerleri kullanılarak serbest radikal giderim aktivitesi aşağıdaki eşitlikten faydalanılarak hesaplanmıştır:
İnhibisyon (%) = 100 – [(A1/A0) x 100]
Burada; A0 kontrolun absorbansı ve A1 örneğin absorbansıdır.
Elde edilen % inhibisyon değerleri, mg/ml olarak belirlenen ekstrakt derişimlerine karşı grafiğe geçirilmiştir. Bu test sisteminde bütil hidroksi tolüen (BHT) standart olarak kullanılmıştır. Tüm deneyler üç tekrar halinde yapılmıştır.
Bu test yöntemi, kararlı serbest radikal DPPH’ın elektron veya hidrojen atomları veren antioksidan kimyasalların varlığında, bu kimyasallar tarafından süpürülmesi (temizlenmesi) ile karakteristik, mor rengin açılmasının spektrofotometrik olarak belirlenmesi temeline dayanır (Şekil 2.5) (Wu ve diğ. 2006).
14
Şekil 2.5: DPPH hazırlanışı ve serbest radikal giderim aktivitesi konsantrasyonları
2.3.4 ABTS Radikal Giderim Aktivitesi
Distile suda hazırlanmış 7.4 mM 2.2’-Azino-bis,3- etilbenzenothiazoline-6-sülfonik asid (ABTS) çözeltisi ve potasyum persülfat çözeltisinden 1 ml alınarak karıştırılmış ve 12-16 saat karanlıkta bekletilmiştir. Kullanmadan önce solüsyon spektrometrede 734 nm’de ölçülüp, 700 nm’ye kadar etanol ile seyreltilmiştir. Her deney için bu karışım taze olarak hazırlanmıştır. Ekstraktlardan stok hazırlanıp, stoktan 0.05 mg/ml ila 0.25 mg/ml arasında 5 farklı konsantrasyon elde edilmiştir. Hazırlanan metanollü ABTS çözeltisinden 2 ml alınıp oluşturulan konsantrasyonlar üzerine eklenmiştir. Bitki ekstraktı konulup 30 dakika karanlıkta bekletilmiştir. Spektrofotometrede 734 nm’de absorbans değeri okunmuştur. Standart olarak BHT kullanılmıştır. BHT yardımı ile çizilen standart eğriden ABTS radikal giderme aktivitesi hesaplanmıştır (Re ve diğ. 1999).
15
2.3.5 Demir İyonu İndirgeyici Antioksidan Gücü (FRAP) Yöntemi
Antioksidan kapasite tayininde kullanılan diğer bir metot olan indirgeme gücünde yüksek absorbans yüksek indirgeme potansiyelini göstermektedir. Metot, asidik ortamda antioksidan fenolik bileşiklerin [K3Fe(CN)6] içindeki Fe (III)’ün Fe(II)’ye indirgenmesine dayanmaktadır. İndirgeme reaksiyonu sonucu oluşan Prusya mavisi renkli kompleks 700 nm’de maksimum absorbans değerini göstermektedir. Antioksidan maddelerin faaliyetlerine bağlı olarak Prusya mavisi renk yeşil ile mavi arasında renk değiştirmektedir. Absorbans değerinin artması indirgeme gücünün yüksekliğini arttığını ifade eder (Matthew ve Abraham 2006).
2.3.6 Bakır İndirgeme Gücü Kapasitesi (CUPRAC) Yöntemi
Bitki özütlerininn 0.2 ile 1 mg/ml arasındaki farklı konsantrasyonları kullanılmıştır. Yöntemde her bir deney tüpüne 1 ml CuCl2.2H2O (10-2 M), 1 ml amonyum asetat (1 M Ph:7), 1 ml neokuproin (7.5x10-3 M) çözeltileri ile 0.6 ml saf su eklenmiştir. Daha sonra her bir tüpe bitkisel çözeltilerden 0.5 ml eklenip iyice karıştırılmıştır. Tüpler ağızları kapalı bir biçimde oda sıcaklığında ve karanlıkta ortamda 30 dakika bekletilmiştir. Bu süre sonunda absorbansları 450 nm’de okunmuştur (Apak ve diğ. 2006). Sonuçlar troloksa eşdeğer olarak hesaplanmıştır.
2.4 Toplam Sekonder Metabolit Miktar Tayini
2.4.1 Toplam Fenolik Madde Miktarının Belirlenmesi
Ekstraktların toplam fenolik madde miktarları Folin-Ciocalteu Reaktifi (FCR) kullanılarak gallik asite eşdeğer olarak belirlenmiştir (Slinkard ve Singleton 1977). 1 mg ekstrakt 1 ml metanolde çözülmüştür. 46 ml dH2O ve 1 ml FCR ekstrakt ile karıştırıldıktan 3 dk sonra %2’lik Na2CO3’dan 3 mL eklenmiştir. 2 saat süresince oda sıcaklığında inkübasyona bırakılıp periyodik aralıklarla çalkalanmıştır. Süre sonunda çözeltilerin absorbansları UV spektrofotometresi’nde 760 nm’de okunarak toplam
16
fenolik madde miktarları; gallik asitle çizilen kalibrasyon eğrisinden, mg olarak gallik asite eşdeğer olacak şekilde hesaplanmıştır.
2.4.2 Ekstratların Toplam Flavonoid Bileşik Miktarının Belirlenmesi
Bitki ekstraktlarındaki toplam flavonoid madde miktarları, kuersetine eşdeğer olarak alüminyum klorid spektrofotometrik metodu kullanılarak belirlenmiştir (Arvouet- Grand ve diğ. 1994). Bu metoda göre %2’ lik AlCl3 (1 ml) ile 2 mg/mL konsantrasyondaki bitki ekstraktı (1 ml) karıştırıldıktan sonra, 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübasyona bırakılmıştır. Süre bitiminde 415 nm’de karışımın köre karşı absorbansı belirlenmiştir. Aynı işlemler standart flavonoid olan kuersetin için de yapılarak, ekstraktların toplam flavonoid madde içerikleri kuersetine eşdeğer (mgQE/g) olarak verilmiştir.
2.4.3 Toplam Tanen Miktarının Belirlenmesi
Toplam tanen miktarının belirlenmesi için vanilin yöntemi kullanılmıştır (Bekir 2013). Tanenler, birçok gıdada doğal olarak bulunan polifenollerdir. İçerisinde 1.0 ml bitki özütü bulunan test tüpleri üzerine % 1.0’lik 0.5 ml vanilin solüsyonu ilave edilmiştir. 15 dakika oda sıcaklığında bekletilip, 500 nm de ölçümü yapılmıştır. Tanen içeriği, kateşin eşdeğeri (mgCE/g) olarak ifade edilmiştir.
2.5 HPLC metodu ile Fenolik Bileşenlerin Tayini
Kromatografi biri sabit diğeri hareketli olmak üzere iki farklı faz arasında karışımdaki maddelerin fiziksel ve kimyasal özelliklerine bağlı olarak ayrılması tekniğidir. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC), en yaygın olarak kullanılan analitik tekniklerden bir tanesidir (Tomruk 2005). Bitki ekstraklarındaki fenolik madde analizleri HPLC kullanılarak Gomes ve diğ. (2006)’ne göre tespit edilmiştir. Fenolik bileşiklerin HPLC analizi için öncelikle 15 farklı fenolik bileşikler standardının ayrı ayrı kalibrasyon grafiği çizilerek analiz metodu geliştirilmiştir. Örneklere ait kromatogramlar üzerindeki piklerin hangi fenolik bileşiğe ait olduğu
17
esas olarak standart fenolik maddelerin geliş zamanları ile karşılaştırılarak belirlenmiştir.
Kullanılan standart fenolik maddeler: Gallik asit, 3,4-dihidroksi benzoik asit, 4-hidroksi benzoik asit, 2,5-dihidroksi benzoik asit, klorojenik Asit, vanilik Asit, kafeik Asit, epikateşin, P-kumarik Asit, ferulik Asit, rutin, ellajik asit, naringin, kuersetin ve sinamik Asit.
HPLC metodu ile fenolik bileşen analizi hizmet alımı ile Mehmet Akif Ersoy Üniversitesi Bilimsel ve Teknoloji Uygulama ve Araştırma Merkezinde yaptırılmıştır. HPLC ile ilgili koşullar aşağıda sunulmuştur:
CBM: 20ACBM
Dedektör: DAD (SPD-M20A) (280 nm dalga boyunda çalışılmıştır) Kolon Fırını: CTO-10ASVp
Pompa: LC20-AT
Autosampler: SIL- 20ACHT Bilgisayar Programı: LC Solution
Mobil Faz (Hareketli faz): A: %3 Formik asit B: Metanol (HPLC analizinde Gomes ve diğ., (2006)’nun metodu modifiye edilerek kullanılmıştır; 0.2 g numune tartılmış, Mobil fazda çözülmüş, 0,45 μm filtreden geçirilip HPLC sistemine enjekte
18
2.6 Histokimyasal ve Yara Kontraksiyonu Çalışmaları
2.6.1 Fare Gruplarının Oluşturulması
Deneysel sırasında kullanılan Balb/c cinsi dişi fareler Pamukkale Üniversitesi Deneysel Cerrahi Uygulama ve Araştırma Merkezi’nden temin edilmiştir. Çalışma ile ilgili etik izinler Pamukkale Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik Kurul Başkanlığı’ndan (PAUHADYEK-2018/36) alınmıştır.
Çalışmada 6 grup oluşturulmuştur. Gruplar rastgele seçilmiş 6 adet fare içermektedir. Bu gruplar Tablo 2.1’de verilmiştir.
Tablo 2.1: Deneysel çalışmalar için oluşturulan gruplar
GRUPLAR GRUPLARA UYGULANAN İŞLEMLER
Grup 1 (Negatif kontrol
Grubu)
Farelerde eksizyon yarası oluşturulup, günde bir kez lokal olarak %10 povidone-iodine uygulanan grup.
Grup 2 (Kontrol Grubu)
Farelerde eksizyon yarası oluşturulup, günde bir kez lokal olarak etken maddesi %0.2 oranında nitrofurazon olan antiseptik pomad uygulanan grup.
Grup 3 (Deney Grubu)
Farelerde eksizyon yarası oluşturulup, günde bir kez lokal olarak %0.2 oranında nitrofurazon içeren pomad içinde hazırlanmış %5
L. candidum yeraltı distile sulu ekstraktı bulunan pomad
uygulanan grup.
Grup 4 (Deney Grubu)
Farelerde eksizyon yarası oluşturulup, günde bir kez lokal olarak %0.2 oranında nitrofurazon içeren pomad içinde hazırlanmış %10 L. candidum yeraltı distile sulu ekstraktı bulunan pomad uygulanan grup.
Grup 5 (Deney Grubu)
Farelerde eksizyon yarası oluşturulup, günde bir kez lokal olarak %0.2 oranında nitrofurazon içeren pomad içinde hazırlanmış %5
L. candidum yeraltı metanol ekstraktı bulunan pomad uygulanan
grup.
Grup 6 (Deney Grubu)
Farelerde eksizyon yarası oluşturulup, %0.2 oranında nitrofurazon içeren pomad içinde hazırlanmış, %10 L. candidum yeraltı metanol ekstraktı bulunan pomad günde bir kez lokal olarak uygulanan grup.
19
2.6.2 Eksizyon Yara Modeli Oluşturulması
Eksizyon yara modeli Misra ve Varma (2017)’nın uyguladığı prosedürde küçük değişiklikler yapılarak oluşturulmuştur. Fareler anestezi altında uyutulduktan sonra, elektrikli tıraş makinesi ile dorsal torasik bölgelerindeki tüyler traşlanmıştır. Steril punch-biyopsi aparatıyla 6 mm çapında, her farenin sırtında birbirinin dublikasyonu olacak şekilde karşılıklı 2 eksizyon oluşturulmuştur. Yaralar temizlendikten sonra, hayvanların birbirlerine zarar vermelerini önlemek amacıyla her bir fare ayrı ayrı kafeslere yerleştirilmiştir. Yaralı bölgeleri tamamen açık bırakılan hayvanlar enfeksiyon görülen hayvanların çalışmadan ayrılmasına yönelik olarak, enfeksiyona karşı yakından takip edilmiştir (Nayak ve diğ. 2007). Tüm yaralara her gün, uygulamaların tüm yarayı kapatmasına dikkat edilerek uygulamalar yapılmıştır (Ozay ve diğ. 2010). Yaralı bölgeye, pozitif kontrol grubunda etken maddesi %0.2 oranında nitrofurazon olan antiseptik pomad (Malviya ve Jain 2009), negatif kontrol grubuna ise %10 povidone-iodine uygulanmış, deney grubuplarına ise %0.2 oranında nitrofurazon içeren pomad içinde hazırlanmış, %5 L. candidum yeraltı metanolik ekstraktı bulunan pomad, %0.2 oranında nitrofurazon içeren pomad içinde hazırlanmış, %10 L. candidum yeraltı metanolik ekstraktı bulunan pomad, 0.2 oranında nitrofurazon içeren pomad içinde hazırlanmış, %5 L. candidum yeraltı sulu ekstraktı bulunan pomad ve %0.2 oranında nitrofurazon içeren pomad içinde hazırlanmış, %10 L. candidum yeraltı sulu ekstraktı bulunan pomad uygulanmıştır.
Anestezi altında Punch-biyopsi ile alınan deri örnekleri sıfırıncı gün olarak kabul edilmiştir. Günde 1 kez yaralı bölgelere yapılan uygulamalar, 15 gün boyunca sürmüştür. Onbeşinci günde tüm fareler sakrifiye edilerek, yara dokuları alınmıştır.
2.6.3 Yara Kontraksiyonu
Yara çapları en geniş iki bölgeden 0., 5., 10. ve 15. günlerde dijital kumpas ile ölçülerek not edilmiştir (Malviya ve Jain, 2009). Yara alanları aşağıdaki formüle göre hesaplanmıştır (https://bio-protocol.org/e1661) (1):
20
Yara kontraksiyonları aşağıda Nagappan ve diğ. (2012) tarafından belirtilen formül (2) kullanılarak hesaplanmıştır. Yara kontraksiyonu, orijinal cerrahi eksizyonunun yara bölgesindeki azalma yüzdesi şeklinde ifade edilmiştir.
Yara Kontraksiyonu (%) = 𝑂𝑟𝑗𝑖𝑛𝑎𝑙 𝑦𝑎𝑟𝑎 𝑎𝑙𝑎𝑛𝚤−𝐻𝑒𝑠𝑎𝑝𝑙𝑎𝑛𝑎𝑛 𝑌𝑎𝑟𝑎 𝐴𝑙𝑎𝑛𝚤
𝑂𝑟𝑗𝑖𝑛𝑎𝑙 𝑌𝑎𝑟𝑎 𝐴𝑙𝑎𝑛𝚤 x 100 (2)
2.6.4 Histokimyasal Çalışmalar
Deney başlangıcında alınan (sıfırıncı gün) punch-biyopsi örnekleri ile sakrifiye edilerek 15. günde yara bölgesinden alınan dokular formalin ile fikse edilerek, rutin doku takibi sonunda parafin bloklara gömülmüştür. Parafine gömülen dokulardan, mikrotom ile 5 µm kalınlığında kesitler alınarak preparatlar hazırlanmıştır. Elde edilen preparatlar deparafinize edildikten sonra, preparatlara Tablo 2.2’de gösterilen histokimya teknikleri uygulanmıştır. Tüm histokimyasal çalışmalarda standart prosedürler takip edilmiştir. Boyanan kesitler, B-600Ti Optika ışık mikroskobu (Optika Microscopes, Bergamo, İtalya) ile incelenmiş ve 4083.B5 OptikamB5 dijital kamera (Optika Microscopes, Bergamo, İtalya) kullanılarak fotoğraflanmıştır.
Tablo 2.2: Deneyde kullanılan yöntemler ve kullanılma amaçları
YÖNTEMLER AMAÇ
1. Hematoksilen&Eosin 2. Periyodik-asit şift 3. Masson tri-krom 4. Orcein
1. Genel histolojik yapı gösterilmesi 2. Bazal membran gösterilmesi 3. Kollajenin varlığı
4. Elastik fibril varlığı
2.6.5 İstatistiksel değerlendirme
Sonuçlar ortalama±standart sapma (SS) olarak ifade edilmiştir. Gruplar arasındaki yara kontraksiyon farklılıkları tek yönlü varyans analizi (ANOVA) testi kullanılarak analiz edilmiştir. Gruplar arasındaki farklılıklar için ise Tukey metodu uygulanmıştır. Analizler, Minitab 16 istatistik programı kullanılarak gerçekleştirilmiş ve p<0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir.
21
3. BULGULAR
3.1 β-Karoten-Linoleik Asit Yöntemi
Bu metot, örnek içinde herhangi bir antioksidan bulunmadığında β-karoten çözeltisi renginin hızla açılması esasına dayanmaktadır. L. candidum ekstraktlarının β-karoten-linoleik asit metoduyla belirlenen toplam antioksidan aktiviteleri Tablo 3.1 ve Şekil 3.1’de verilmiştir.
Tablo 3.1: L. candidum ekstraktlarının β-karoten-linoleik asit yöntemi ile toplam
antioksidan madde miktarları (% İnhibisyon Değerleri)
Çözücü
Lilium candidum
BHT Yer altı Yer üstü
Aseton 61.90±7.43 86.07±2.77 -
Metanol 21.42±16.67 25±11.31 91.59±1.40
Distile Su 98.03±6.15 64.0±4.89 -
Şekil 3.1: L.candidum ekstraktlarının β-karoten-linoleik asit yöntemi ile antioksidan
aktiviteleri (%) 0 20 40 60 80 100 120
Aseton Metanol Distile su
ANTİ O K Sİ DAN AK T İVİT E (% İnh ibi sy on Değ er leri ) EKSTRAKTLAR yer üstü yer altı
22
β-karoten-linoleik asit metodu ile L. candidum yer altı ekstraktları kısımında en yüksek antioksidan aktivite su ekstraktında (%98.03±6.15), en düşük antioksidan aktivite ise metanol ekstraktında (%21.42±16.67) görülmüştür. Yer üstü ekstraktlarında ise en yüksek antioksidan aktivite aseton ekstraktında (%86.07±2.77), en düşük antioksidan aktivite metanol ekstraktında (%25±11.31) görülmüştür. Elde edilen veriler ticari olarak satın alınan sentetik bir antioksidan olan BHT standardı (%91.59±1.40) ile kıyaslanmıştır. L. candidum yer altı su ekstraktı BHT standartından daha yüksek antioksidan aktivite gösterdiği belirlenmiştir.
3.2 Fosfomolibdenyum Yöntemi
Çalışılan ekstraktların fosfomolibdenyum yöntemi ile ölçülen toplam antioksidan aktivitesi askorbik asit eşdeğeri (mg AAE/g) olarak belirtilmiş ve Tablo 3.2 ve Şekil 3.2’de gösterilmiştir.
Tablo 3.2: L. candidum ekstraktlarının fosfomolibdenyum yöntemi ile antioksidan
aktiviteleri (mg AAE/g)
Çözücü
Lilium candidum
Yer altı Yer üstü
Aseton 78.95±2.09 122.22±7.55
Metanol 87.11±2.61 100.73±9.95
23
Şekil 3.2: L. candidum ekstraktlarının fosfomolibdenyum yöntemi ile antioksidan
aktiviteleri (mg AAE/g)
Fosfomolibdenyum yönteminde yer altı ekstraktlarında en yüksek antioksidan aktivite metanol ekstraktında (87.11±2.61 mg AAE/g), en düşük antioksidan aktivite distile su ekstraktında (61.65±4.79 mg AAE/g) bulunmuştur. Yer üstü ekstraktlarında ise en yüksek antioksidan aktivite aseton ekstraktında (122.22±7.55 mg AAE/g) ve en düşük antioksidan aktivite distile su ekstraktında (73.09±0.59 mg AAE/g) belirlenmiştir.
3.3 DPPH Serbest Radikal Giderim Kapasitesinin Belirlenmesi
Örneklerin serbest radikal giderim aktivitesi DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil) yöntemine göre belirlenmiş ve elde edilen veriler Tablo 3.3 ve Şekil 3.3’te verilmiştir. Bu yöntem DPPH’ın karakteristik mor renginde meydana getirilen renk değişikliğinin spektrofotometre ile ölçülmesi esasına dayanmaktadır. Renk değişiminin derecesi ekstrakt ya da antioksidan bileşiğin hidrojen verebilme yeteneğini dolayısıyla serbest giderim radikal aktivitesini yansıtmaktadır.
0 20 40 60 80 100 120 140
Aseton Metanol Distile su
ANTİ O K Sİ DAN AK T İVİT E ( m g AAE/ g) EKSTRAKTLAR yer üstü yer altı
24
Tablo 3.3: L. candidum ekstraktlarının DPPH yöntemi ile serbest radikal giderim
aktivite değerleri (IC50 değerleri mg/ml)
Çözücü
Lilium candidum
BHT Yer altı Yer üstü
Aseton 1.84±0.40 1.07±0.55 -
Metanol 1.72±0.67 2.08±2.09 24,65±1,19
Distile Su 6.76±0.15 1.62±1.18 -
Şekil 3.3: L. candidum ekstraktlarının DPPH serbest radikal giderim aktivitesi
(mg/mL)
L. candidum kısımlarının farklı çözücülerde hazırlanan ekstraktlarının, yer altı
ekstraktlarında serbest radikal giderim aktivitesi değeri en yüksek metanol ekstraktında (IC50: 1.72±0.67 mg/mL), en düşük distile su ekstraktında (IC50: 6.76±0.15mg/mL) bulunmuştur. Yer üstü ekstraktlarında ise en yüksek serbest radikal giderim aktivitesi aseton ekstraktında (IC50: 1.07±0.55 mg/mL), en düşük metanol ekstraktında (2.08±2.09 mg/mL) belirlenmiştir. L. candidum yer altı ve yer üstü ekstraktları BHT (IC50: 24.65±1.19 mg/mL) standardından daha iyi DPPH radikal giderim aktivitesi gösterdiği belirlenmiştir.
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Aseton Metanol Distile Su
DP P H R A Dİ KA L Gİ DE R İM A KT İVİ T E Sİ (m g/m L) Yer Altı Yer Üstü
25
3.4 ABTS Radikal Giderim Aktivitesi
Kromojenik bir redoks radikali olan ABTS [2,2-azinobis (3- etilbenzotiyazolin 6-sülfonat)] kararlı bir radikaldir. Hem suda hem organik çözücülerde çözündüğünden hem hidrofilik hem de hidrofobik antioksidan aktivite tayininde kullanılabilmektedir. Bu radikal 734 nm’de dalga boyu maksimumuna sahip olduğundan ortamda herhangi bir antioksidan ya da antioksidan etkiye sahip bir tür bulunması durumunda ilgili türlerden bir elektron alarak tekrar ABTS molekülüne dönüşmektedir. Belirli konsantrasyonlarda hazırlanan ekstrakt çözetisi ile ABTS çözeltisi karıştırılınca, çözeltinin mavi rengi açılmakta ve absorbansta bir azalma meydana gelmektedir. Bu azalmanın spektroskopik olarak takip edilmesiyle de özütlerin ABTS radikal giderim aktiviteleri ölçülmüş ve örneklerin troloksa eşdeğer olarak ABTS radikal giderim aktivitesi Tablo 3.4 ve Şekil 3.4 ’te verilmiştir.
Tablo 3.4: L. candidum ekstraktlarının ABTS radikal giderim aktivitesi (IC50
değerleri mg/mL)
Çözücü
Lilium candidum
BHT Yer altı Yer üstü
Aseton 1.09±2.02 0.83±1.28 -
Metanol 0.99±0.31 0.79±0.99 17,03±0,35
26
Şekil 3.4: L. candidum ekstraktlarının ABTS radikal giderim aktivitesi (mg/mL)
Lilium candidum ABTS radikal giderim aktivitesi yer altı ekstraktlarında en
yüksek metanol ekstraktında (IC50: 0.99±0.31 mg/mL), en düşük distile su ekstraktında (IC50: 1.57±0.25 mg/mL) bulunmuştur. Yer üstü ekstraktlarında ise en yüksek ABTS radikal giderim aktivitesi distile su ekstraktında (IC50: 0.75±0.42 mg/mL), en düşük ise aseton ekstraktında (IC50: 0.83±1.28 mg/mL) belirlenmiştir. L.
candidum yer altı ve yer üstü ekstraktları BHT (IC50: 17.03±0.35 mg/mL)
standardından daha iyi ABTS radikal giderim aktivitesi gösterdiği belirlenmiştir.
3.5 Demir İyonu İndirgeyici Antioksidan Gücü (FRAP) Belirlenmesi
Lilium candidum türünün yer altı ve yer üstü kısımlarının aseton, distile su,
metanol ile hazırlanan ektsraktları faklı konsantrasyonları 593 nm’de ölçülerek sonuçlar elde Tablo 3.5 ve Şekil 3.5 ‘te verilmiştir. Standart troloks kullanarak hesaplama yapılmıştır. Yöntem Fe (III)/TPTZ kompleksinin indirgemesi prensibine dayanmaktadır. 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8
Aseton Metanol Distile Su
AB T S RA DİKA L G İDE RİM AK T İVİT E Sİ ( m g /m L) EKSTRAKTLAR Yer altı Yer üstü
27
Tablo 3.5: L. candidum ekstraktlarının FRAP deney sonuçları (mgTE/g)
Çözücü Lilium candidum
Yer altı Yer üstü
Aseton 11.12±1.63 12.09±0.94
Metanol 6.76±0.74 8.94±4.93
Distile Su 0.49±0.48 7.04±2.16
Şekil 3.5: L. candidum ekstraktlarının FRAP yöntemiyle indirgeme gücü
kapasiteleri (mgTE/g)
Lilium candidum türünün yer altı kısmında demir iyonu indirgeyici antioksidan
gücü en yüksek aseton ekstraktında (11.12±1.63 mgTE/g) ve en düşük distile su ekstraktında (0.49±0.48 mgTE/g) belirlenirken, yer üstü ekstraktlarında en yüksek aseton ekstraktında (12.09±0.94 mgTE/g), en düşük distile su ekstraktında (7.04±2.16 mgTE/g) tespit edilmiştir.
0 2 4 6 8 10 12 14
Aseton Metanol Distile su
F RA P D E Ğ E RLE Rİ (m gTE /g ) EKSTRAKTLAR yer üstü yer altı
28
3.6 CUPRAC Yöntemi
Lilium candidum türüne ait ekstraktların antioksidan bileşiklerin Cu
(II)-neokuproin kompleksini Cu (I)-(II)-neokuproin kompleksine indirgemesine bakılmıştır. Yöntemde standart olarak Trolox kullanılmıştır. CUPRAC sonuçları Tablo 3.6 ve Şekil 3.6 ‘da verilmiştir.
Tablo 3.6: L. candidum ekstraktlarının CUPRAC deneyi sonuçları (mgTE/g)
Çözücü
Lilium candidum
Yer altı Yer üstü
Aseton 61.89±1.98 84.92±0.57
Metanol 66.03±2.02 67.85±1.54
Distile Su 56.13±0.38 72.39±1.24
Şekil 3.6: L. candidum ekstraktlarının CUPRAC yöntemi ile farklı
konsantrasyonlardaki absorbans grafiği (mgTE/g)
Lilium candidum türüne ait ekstraktların bakır indirgeme gücü yer altı kısmında en yüksek metanol ekstraktında (66.03±2.02 mgTE/g) ve en düşük distile su ekstraktında (56.13±0.38 mgTE/g) belirlenirken; yer üstünde ise en yüksek aseton ekstraktında (84.92±0.57 mgTE/g), en düşük metanol ekstraktında (67.85±1.54 mgTE/g) belirlenmiştir. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Aseton Metanol Distile su
CUP RAC DE Ğ E RL E Rİ (m g T E /g ) EKSTRAKTLAR yer üstü yer altı
29
3.7 Toplam Fenolik Madde Miktarının Belirlenmesi
Fenolik bileşikler bitki türevli antioksidanların büyük bir sınıfını oluşturmaktadırlar. Fenolik bileşikler arasında flavonoidler en önemli gruptur (Kuo ve ark. 1992). Toplam fenolik madde miktarı gallik aside eşdeğer (mg/ml GAE) olarak ifade edilmiştir. L. candidum türünde belirlenen fenolik madde miktarları Tablo 3.7 ve Şekil 3.7’ de verilmiştir.
Tablo 3.7:. L. candidum ekstraktlarının toplam fenolik madde miktarları (mg/mL
GAE)
Çözücü
Lilium candidum
Yer altı Yer üstü
Aseton 16±0.00 31±0.00
Metanol 15.75±0.00 20.75±0.00
Distile Su 8.75±0.00 18.25±0.00
Şekil 3.7: L. candidum ekstraktlarının toplam fenolik madde miktarları (mg/ml GAE)
Lilium candidum kısımlarının farklı çözücüler ile yapılan yer altı
ekstraktlarında en yüksek fenolik madde miktarı aseton ekstraktında (16±0.00 mg/ml GAE), en düşük distile su ekstraktında (8.75±0.00 mg/ml GAE) belirlenmiştir.
0 5 10 15 20 25 30 35
Aseton Metanol Distile su
T O P L AM F E NO L İK M ADDE M İK T ARI ( m g /m L G AE ) EKSTRAKTLAR yer üstü yer altı
30
Yer üstü kısmında ise en yüksek aseton ekstraktında (31±0.00 mg/ml GAE), en düşük distile su ekstraktında (18.25±0.00 mg/ml GAE) tespit edilmiştir.
3.8 Toplam Flavonoid Madde Miktarının Belirlenmesi
Ekstraktların toplam flavonoid miktarları Arvouet-Grand ve ark. (1994) tarafından belirlenen yöntem kullanılarak quercetin’e eşdeğer olarak hesaplanmış ve elde edilen veriler Tablo 3.8 ve Şekil 3.8’de verilmiştir.
Tablo 3.8: L. candidum eksraktlarının toplam flavonoid madde miktarları (mgQE/g)
Çözücü
Lilium candidum
Yer altı Yer üstü
Aseton 7.46±0.00 5.85±0.00
Metanol 75.06±0.00 57.31±0.00
Distile Su 1.43±0.00 2.75±0.00
Şekil 3.8: L. candidum eksraktlarının toplam flavonoid madde miktarları
(mgQE/g) 0 10 20 30 40 50 60 70 80
Aseton Metanol Distile su
T O P L AM F L AVO NO İD M ADDE M İK T ARI ( m gQ E /g ) EKSTRAKTLAR yer üstü yer altı
31
Lilium candidum kısımlarının farklı çözücülerle yapılan yer altı ekstraktlarında
flavanoid madde miktarı en yüksek metanol ekstraktında (75.06±0.00 mgQE/g), en düşük distile su ekstraktında (1.43±0.00 mgQE/g) bulunmuştur. Yer üstü kısmında ise en yüksek metanol ekstraktında (57.31±0.00 mgQE/g), en düşük distile su ekstraktında (2.75±0.00 mgQE/g) belirlenmiştir.
3.9 Toplam Tanen Madde Miktarının Belirlenmesi
Toplam tanen miktarı, Bekir ve ark. (2013)’nin uyguladığı metotta bazı modifiyeler yapılarak belirlenmiştir. L. candidum türünün çalışılan çözücülere göre tanen miktarları Tablo 3.9 ve Şekil 3.9 ‘da verilmiştir.
Tablo 3.9: L. candidum ekstraktlarının toplam tanen miktarları (mgCE/g)
Çözücü
Lilium candidum
Yer altı Yer üstü
Aseton 8.76±0.02 10.88±0.01
Metanol 2.08±0.01 4.23±0.01
Distile Su 1.02±0.02 2.12±0.01
Şekil 3.9: L. candidum ekstraktlarının toplam tanen madde miktarları (mgCE/g)
0 2 4 6 8 10 12
Aseton Metanol Distile su
T O P L AM T ANEN M İK T ARI (m g CE /g ) EKSTRAKTLAR yer üstü yer altı
32
Lilium candidum türüne ait toplam tanen miktarları yer altı kısmında en yüksek
aseton ekstraktında (8.76±0.02 mgCE/g) ve en düşük distile su ekstraktında (1.02±0.02 mgCE/g) belirlenirken, yer üstü kısımlarında en yüksek aseton ekstraktında (10.88±0.01 mgCE/g), en düşük distile su ekstraktında (2.12±0.01 mgCE/g) tespit edilmiştir.
3.10 Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC/YPSK) ile Fenolik Bileşiklerin Analizi
Lilium candidum türünün metanolik ekstraktlarının fenolik bileşik içerik
tanımlaması ve miktarlarının belirlenmesi HPLC yöntemi ile yapılmıştır. Elde edilen veriler Tablo 3.10’da verilmiştir.
33
Tablo 3.10: L. candidum türünün metanol ekstraktlarının içerisindeki bazı fenolik
bileşenlerin içerikleri ve miktarları (µg/g)
Standartlar Metanol yerüstü Metanol yeraltı Alıkonma zamanı (dakika) 1) Gallik asit 100.590 175.800 6.8
2) 3,4-dihidroksi benzoik asit 15.849 10.838 10.7
3) Klorojenik asit 69.308 175.077 15.7
4) 4-hidroksi benzoik asit 43.543 71.313 17.2
5) 2,5-dihroksi benzoik asit 5.118.519 2.000.89 18.2
6) Vanilik asit 128.988 4.115.300 19.2 7) Kafeik asit 747.840 26.686.175 21.3 8) Epikateşin 3.195.383 4.397.617 22.7 9) p-kumarik asit 267.279 13.778 26.1 10) Ferulik asit 16.817 249.778 30.1 11) Naringin 1.343.441 43.457 45.6 12) Rutin 1.460.717 1.677.707 47.7 13) Ellajik asit 6.074.910 3.781.727 49.7 14) Sinnamik asit 2.419.450 122.752 71.1 15) Kuersetin 1.068.151 1.255.737 70.4
HPLC metoduna göre; fenolik bileşenlerden metanol ekstraktlarında yer üstünde en yüksek ellajik asit (6.074.910 µg/g), yer altında ise kafeik asit (26.686.175 µg/g) bulunmuştur.
34
3.11 Yara Kontraksiyonu
Lilium candidum ektstrakları ile yapılan histolojik çalışmalar sonucunda 5.
günden 15. güne doğru yara kontraksiyonlarında genel bir artış gözlenmiştir (Şekil 3.10).
Şekil 3.10: Sıçanlardaki eksizyonel yaraların 5., 10. ve 15. günlerdeki yara
kontraksiyonları
Yara çaplarının ölçümleri sonucunda hesaplanan, gruplara ait yara kontraksiyon yüzdeleri Tablo 3.11’de verilmiştir.
0 20 40 60 80 100 120 5. Gün 10. Gün 15. Gün
