Etlerdeki Lipid Peroksidasyonunun Bir Ürünü Olarak Malonaldehid ve Ölçüm Yöntemleri

(1)

E T L E R D E K İ LİPİD PEROKSİDASYONUNUN BİR ÜRÜNÜ OLARAK

M A LO N A LD EH İD ve ÖLÇÜM YÖNTEMLERİ

Dr. Efsun KARABUDAK*

Ö Z E T

L ipid p e ro k sid a sy o n ıı çiğ ve p iş m iş et ve ürünlerinde kalite kaybının en ö n e m li nedenidir. Biyolojik dokular da çoklu d o y m a m ış y a ğ asitlerinin peroksidasyoıı reak siyonu serbest r a d ik a lle r tarafından başlar. Malonalde- hid (M D A ) iki veya üç çift b a ğ içeren çoklu doymamış y a ğ asitlerinin ikincil bir o k sid a syo n ürünüdür. Okside olmuş yağlı b e sin le rd e g ö zle n e n absorbsiyon spektru- nıu, tiobarbitiirik asit (T B A ) ile M D A arasındaki reak siyondan dolayı g erçekleşir. K etonlar, ketosteroidler, asitler, şekerler, a m in o a sitle r, okside p r o te in le r , piri- d'ınler, p ir im id in le r ve vitam inler TBA ile reaksiyona g i rer. Bu m a d d e le r e T B A R S (T B A ile reaksiyona giren m a d d e le r) denir. B e sin le rd e k i lipid oksidasyonıınun b e  lirlenmesinde çeşitli nıeto d la r v a r d ır, f a k a t standart bir nıetod k u ll a n ıl m a m a k ta d ı r . 2-c özellikle yağ içeren et ürünlerindeki o k s i d a t i f a cıla şm a n ın ö lçü m ü n d e kulla nılmaktadır. TBA y ö n t e m i n i n, bazı analitik dezavantaj ları olm akla b e r a b e r kolaylığı, ek o n o m ik olması ve k ı sa zam an içinde çok sa y ıd a ö rnek analiz edebilme özel liğinden dolayı k ro m a to g r a fik yön tem lere tercih edil mektedir. Bu d e r l e m e d e , etlerde lipid peroksidasyonıı- mın bir ürünü ola ra k M D A 'nın o lu ş u m u, miktarı ve öl çüm yö n te m le rin e ilişkin y a y ın la r ö zetlen m iştir.

A n a h t a r S ö z c ü k l e r : 2-tio b a rb itü rik asit, m alonaldehid ( MDA) , T B A R S , o to o k s id a s y o n

A B S T R A C T

M a l o n a l d e h y d e a s a P r o d ı ı c t o f L i p i d P e r o x i d a t i o n in M e a t s a n d its A n a l y t i c a l T e c h n i q u e s

Lipid p e ro x id a tio n is o ne o f the mcıjor caııses o f c/uality deterioration in ravv a n d c o o k e d mecıt p r o d u c t s . The pe- roxidation reaction o f p o ly u n s a tu r a te d fa t ty acids in bi- ological tissues can be initiated by f r e e radicals. M a lo  naldehyde ( MDA ) \vas sho\vn to be a secondarv oxida- tion p ro d u c t o f p o ly u n s a tu r a t e d f a t t \ acids containing three or m o re d o u b le bonds. The absorprion spectrıım

* Hacettepe Üniversitesi S T Y O Beslenme ve Diyetetik Bölümü

obtained with oxidized fatty foods is like the spectrıım obtained when thiobarbitııric acid (TBA) and MDA re- act. Other substances, such as ketones, ketosteroids,

acids, esters, sıtgars, aıııino acids, oxidızed proteins, pyridines, pyrimidines, and vitamins can react \vith TBA; they ar e naıııed TBARS (substances that react \vith TBA). A nıımber o f nıethods are avaible fo r deter- mination o f lipid oxidation in foods but no standart met- hod is used. The 2-thiobarbitııric acid (TBA) test has been \videly used fo r measııring oxidative rancidity in fa t containing foods, especially meat products. The TBA nıethod, ho\vever, nıay be preferred över the chroma- tographic nıethod becaııse o f its simplicity, especially when a large nıımber o f sanıple need to be analyzed in a short period o f time on a daily basis. The pıırpose o f this revieu’ is to sıımmarize concerns regarding the for- mation and cjııantijication and nıethods o f measııring o f malonaldehyde as a prodııct o f lipid peroxidation in nıııscle tissues.

K ey Words: 2-thiobarbituric acid, malonaldehyde (MDA), TBARS, aııtoxidation

GİRİŞ

Lipid oksidasyonu, etlerde bulunan yağların işleme ve depolanmaları süresince, ortamda bulunan prook- sidan maddeler tarafından parçalanarak oksidatif ürünlerin oluşmasıdır. Oksidasyon sonucu ileri dü zeyde acı (ransit) tat oluşumuyla sonuçlanan bir kali te bozukluğu gözlenir ( 1).

Yağların Oksidasyonu ve Malonaldehid Oluşumu

Lipid oksidasyon mekanizması; başlangıç, gelişme ve sonuç olmak üzere üç aşamada gerçekleşen ve serbest radikallerin oluşumuna neden olan reaksi yonlar zinciridir. Isı, ışık, geçiş metalleri ve yüksek enerjili radyasyon gibi başlatıcıların varlığında trigliserid veya serbest yağ asidi molekülünden bir serbest radikal meydana gelir. Serbest radikalin, oksijenle reaksiyonu sonucu peroksil radikali oluşur. Bu reak siyon sadece moleküler oksijen ile değil süperoksit anyon (Ov*'*, hidrojen peroksit (H20 2) ve hidroksi ra dikal (OH*) gibi dieer türlerle de oluşur (1,2)._o _j _* _'

(2)

44

KARABUDAK E.

Serbest radikal mekanizması; birinci faz (primer oksidasyon) ve ikinci faz (ikincil oksidasyon) olarak ayırt edilir. Birinci faz süresince, oksidasyon yavaş ve belli bir düzende gider. Özellikle sıvı bitkisel yağ larda çoklu doymamış yağ asitlerinin oksidasyon me kanizması kötü lezzetin ve bozulmanın gelişmesine

neden olur. Oluşan serbest radikal bir trigliserid veya serbest yağ asidi ile etkileşerek hidroperoksitleri meydana getirir. Genellikle kötü lezzete neden olan hidroperoksitler ilk üründür. Oluşumlarında iki çeşit mekanizma öne sürülür. Birincisi; karanlıkta meyda na gelen klasik serbest radikal oluşum mekanizması, İkincisi; ışık veya bazı fotosensitizörler varlığında başlayan foto-oksidasyon mekanizmasıdır. Bu meka nizmada; klorofil, miyoglobin, eritrosin ve diğer pig mentler, riboflavin ve diğer metal iyonları gibi sensi- tizörler, singlet (tekli) oksijeni meydana getirir. Olu şan bu singlet oksijen, moleküler oksijenden 1500 kat daha hızla metil linoleatla reaksiyona girer ve al- lil hidroperoksitleri oluşturur (3). Bunların dışında üçüncü olarak da henüz baştan sona çalışılmayan, li- poksigenaz mekanizmasıyla hidroperoksitler oluşur (3,4). Kararlı bileşikler olmayan bu birincil (primer) oksidasyon ürünlerinden hidroperoksitler, birçok maddenin oksidasyonuna neden olur ve polimerizas- yonla koyu renkli organik polimerler meydana geti rir. Proteinlerle veya aminoasitlerle de etkileşime gi rebilir. Özellikle sistein ve metioninin yan zincirleri bu etkileşime daha hassastır (4 ,5).

İkincil fazda oksidatif olaylar hızla gelişir. Lipid hid roperoksitleri çok dayanıksızdır ve homolitik veya heterolitik kırılma sonucu, serbest alkoksi radikalle rine parçalanır. Farklı hidroperoksitler, farklı ikincil

ürünleri verir. Örneğin; metil linoleatın 13-hidroperoksitinin kırılması pentane ve metil 13-oxo 9 ,1 1-tri- dekadienoatı meydana getirirken; metil linoleatın 9- hidroperoksitinin kırılması 2, 4- dekadienal ve metil oktanoat’ın oluşumuna neden olur. Bütün bunların sonucunda kötü tat ve kokuya neden olan alkoller, aldehidler, ketonlar, asitler, hidrokarbonlar ve epoksit- ler gibi ikincil oksidasyon ürünleri oluşur (2,3,6,7). Alkoller daha az miktarda oluşur. Doymuş aldehidler (formaldehid, hekzanal), doymamış aldehidler (akro- lein), 4-hidroksi 2 nonenal, (3-dikarbonil bileşikleri (malondialdehid) en fazla oluşan bileşikler arasında sayılır (3). Formaldehit, karsinojenik olarak düşünü lürken. akroleinin hayvanlara, bitkilere ve tek hücre li organizmalara toksiktir (7). M alondialdehid (MDA) ise mutajen ve potansiyel karsinojen olarak tanımlanmaktadır (8 ).

Malonaldchidin Kimyasal Yapısı ve Reaktifliği

Serbest radikal reaksiyonlarının son fazında oluşan üç karbon atomlu bir dialdehid olan

malondialdehi-din kapalı formülü C 3H 40 2 ve m olekül ağırlığı 7 2 ’dir. Lipid fraksiyonu içeren besinlerde m eydana gelen otooksidasyon sonucu oluşan M D A düzeyini öğrenmede tiobarbitürik asit (TBA ) testinden yarar lanılmaktadır (3).

M D A , 1, 1,3 ,3 -te tra e th o k sip ro p a n ın (T E P ) v eya 1,1,3,3-tetramethoksipropanm (TM P) asidik hidroli ziyle elde edilir. Dayanıklı bir M D A solüsyonu, T E P ’in asit hidrolizi sonucu oluşur. Asit ortam da TEP hemiasetal ve ethanole hidrolize olur. Hem iase- tal de ayrışarak 1,3-propanediale yani m alondialde- hide (MDA) ve ethanole dönüşür. M D A su içinde, çoğunlukla uçucu olmayan enolat anyonu olarak b u lunur. Nötr p H ’da; protein, am inoasit, glikojen ve di ğer bileşenlerle reaksiyona girerek bağlı form daki M D A ’yı oluşturur (8). D ondurarak d e p o la m a süre since M DA ile miyosinin e-am ino gruplarıyla olan reaksiyonu -2 0 °C ’de 0 ° C ’den daha fazla olmuştur. MDA özellikle histidin, arginin, tirozin ve metionin ile reaksiyona g irm ek ted ir (9). Bağlı fo rm d a k i M D A ’nın serbest forma geçmesi için gereken opti mum koşulların tespiti oldukça zordur. Kuvvetli ısı ve asit ile muamele etmeden özellikle et proteinlerine bağlı M D A ’nın tamamının hidrolizi güçtür. Bu ortam sağlandığı zaman ise T B A ile M D A kom pleksinin d a yanıklılığı tehlikeye girer ve geri kazanılan M D A miktarı ile ilgili problemler ortaya çıkabilir (3,9).

MDA ve TBA ile R eaksiyona G iren M a d d elerin (TBARS) Kaynakları

TBA ile reaksiyona girerek renk oluşturan m addeler iki kaynaktan ileri gelir. Bunlar; yağ kaynaklı ve yağ kaynaklı olmayan M D A ve benzeri m ad d elerd ir (8). Aldehidler dışında ketonlar, ketosteroidler, asitler, esterler, şekerler, imidler ve am idler (üre), amino- asitler, okside proteinler, piridinler ve pirim idinler gibi diğer maddeler TB A ile reaksiyona girer ve so nuçta oluşan yapıya T B A ile reaksiyona giren m a d deler (TBARS) denir (3,10).

Yağ kaynaklı M D A ve T B A R S : M D A , örneğin,

araşidonik asitten oluşan trom boksan A 2'nin (T x A 2) enzimatik atık ürünü olarak oluşur. A raşidonik asidin

11. ve 15. karbon atomu oksidasyona uğrar ve b u ra dan prostaglandin G 2 oluşur. Bu prostaglandin hidro- peroksidaz tarafından prostaglandin H 2’ye indirge nir. Bundan da tromboksan A 2, M D A ve 12(L)-hidroksi-5,8,10-heptadekatrienoik asit (H H T ) oluşur ( 11, 12).

MDA, enzimatik olmayan yolla çoklu d o y m a m ış yağ asitlerinin oksidasyonunun son ürünü olarak da m e y dana gelebilir (8 ). Çoklu d o ym am ış yağ asitlerinin (ÇDYA) oksidasyonunda iki m ekanizm a vardır. B i

(3)

rincisi; hidroksi radikalleri gibi serbest oksijen radi kalleri çoklu d o y m a m ış yağ asitlerinin oksidasyonu- nu başlatır. İkincisi; se rb e st oksijen makromolekülle- re b a ğ la n ara k m o le k ü lü o k sid a sy o n a uğratır ve pe roksitleri üretir. Y a ğ peroksil radikalleri, Ç D Y A ’nın o to o k s id a s y o n u n a aracılık ed er ve oksidasyon ürün lerinden ilki olan y ağ hidroperoksitleri m eydana ge lir. Üç v eya d a h a fazla çift b a ğ a sahip yağ asitleri ok sijenle k o n jü g e peroksit radikalleri oluşturur. Bunlar dan T B A testi sırasın d a ayrışarak M D A oluşur. Ç D Y A ’nın p eroksitlerinden m eydana gelen MDA miktarını ve b u n u n tespitini pH , sıcaklık, geçiş metal lerinin varlığı, yağ asitlerinin doym am ışlık derecesi, a n tio k s id a n la rın v arlığ ı e tk ile m e k te d ir. Etlerde Ç D Y A ’nın çoğu trigliseridlerden daha çok fosfolipid- lerle esterleşm iş halde bulunur. Fosfolipid fraksiyon ları T B A R S üretim inin baş sorumlularındandır (8). D em ir, bakır gibi geçiş metalleri oksidasyon reaksi yonunu katalize edebilir. D em ir, hemoglobinin ve m iyo g lo b in in y a p ısın d a b u lu n d u ğ u için biyolojik sis tem lerde o k sid a sy o n reak siy o n u için önemlidir. Bun lar yağ asidi hid ro p ero k sitlerin in M D A ’ya parçalan masını kolay laştırır (13).

Y a ğ k a y n a k l ı o l m a y a n M D A ve T B A R S : M D A ’ya b en zey en , fakat M D A o lm a y a n ve M D A ’nın göster diği reaksiyonları gösteren bazı bileşikler vardır. D N A , d e o k s in ü k le o s id le r veya deoksinükleosidlere g a m m a irridasyonu u y g u la n m a sı, T B A ile reaksiyo na girebilen ve 532 n m ’de m a k s im u m absorbans ve rebilen, kırm ızı p ig m e n tle r oluşturan bileşikler vere bilir. Bu bileşikler bu özelliklerine rağmen MDA de ğildir (14).

D -glikozun 5. ve 6 . karbonlarının hidroksi radikalle riyle re ak siy o n u s o n u n d a , sırasıyla, 1 ve 2 mol MDA oluştuğu bildirilm iştir. G lik o zu n 2., 3. ve 6 . karbon larının hidroksi radikalleriyle reaksiyonu sonunda M D A eldesi a z a lm a k ta d ır (8 ).

E n d o j e n ve e k z o j e n k a y n a k l ı M D A ’nın m e t a b o lizm ası: S erbest radikal reaksiyonu sonucu oluşan M D A , m u tajen ik ve karsinojenik etkisinden dolayı o ld u k ç a ilgi ç e k m i ş t i r . Y a p ıla n çalışm alarda, M D A ’nın D N A ile reak siy o n a girerek mutajenik et kide b u lu n d u ğ u gösterilm iştir (15,16).

In vivo o rta m d a endojen M D A oluşumunu; ozon, nitrojen oksitler, hiperoksia ve bazı xeııobiotikler gi bi lipid p e ro k sıd a sy o n u n u stimüle eden çevresel fak törler de arttırm aktadır. Ç D Y A 'n ı n bozulması sonu cu oluşan ekzojen M D A 'n i n metabolizması endojen M D A ’dan önem li ölçüde farklıdır ( 12).

Besinlerdeki M D A 'n i n ö n em siz bir bölümü serbest formda e m ilm ek ted ir ve bu nedenle diyetin dokular daki serbest M D A "nin önemli bir kaynağı olduğu

sa-nılmamaktadır. Tütsülenmiş balık, sığır kıyması, ta vuk ve sosis gibi hayvansal kaynaklı besinlerdeki top lam M D A ’nin çok az bir kısmı serbest formda bulun makta ve bu sindirim sırasında besinlerdeki lizin pro teininin serbest e-amino grubu ile reaksiyona girerek insanlarda emilen baskın form olan, N-e-(2-propenal) lizin oluşturmaktadır. Bu form, dokulardaki serbest M D A ’nın kaynağı değildir ve diyetteki M D A ’nın olabilecek toksik etkisini azaltmaktadır ( 12).

Pişirmeden sonra ve dondurarak depolama sonrasın da besinlerin MDA içeriğinde bir düşme olmaktadır (17,18). Bu durum birkaç mekanizmaya bağlanmak tadır. Birincisi; kızartma şartları altında ısıtılan etler de bir aldehid olan M D A ’nın kolayca buharlaştığı sa nılmaktadır (17,18). Öyle ki, N-e-(2-propenal) lizin benzer şartlar altında ısıtıldığında, M D A ’nın lizin’den ayrıldığı görüşü de vardır (15). İkincisi; MDA ortamdaki proteinlere bağlanarak miktarında azalma olmaktadır (9).

MDA besinlerde, insan plazmasında ve idrarda sap- tanabilmekte ve karsinojenez ile ilişkili biyolojik davranışlar göstermektedir. Plazmada ve idrardaki MDA miktarları, besinlerdeki (ekzojen) veya doku lardaki (endojen) lipid peroksidasyonunun gösterge sidir (19). Besinlerin oksidasyonunun ölçümünde de değişik analitik yöntemler kullanılmaktadır (20-22). MDA Tayini

İkincil oksidasyon ürünlerinden olan MDA'nın öl çüm yöntemleri, meydana gelen değişikliklere göre belirlenir. Eğer primer değişiklikler varsa; oksijen alımı, çoklu doymamış yağ asitlerinin kaybı, hidro- peroksitlerin meydana gelmesi (peroksit değeri) de ğerlendirilir. İkincil değişiklikler oluştuysa; karbo nillerin oluşumu (dinitrofenil hidrazonelar veya gaz kromatografik ölçümleri), malonaldehid oluşumu (TBA testi), hidrokarbonların oluşumu (pentan gibi) ölçülebilir (20). Hidroperoksit yıkımının başladığı durumda, peroksit değerinin ölçülmesi, yağın oksi dasyon derecesinin belirlenmesinde yararlıdır. An cak uçucu bileşiklerin (karbonil) miktarı artmaya başladığında, bu bileşiklerin konsantrasyonunu yan sıtan TBA sayısı gibi değerlerin belirlenmesi, anali tik açıdan daha doğru sonuçlan verir (21,22). TBA testi, Kreis testi ve peroksit değerinden çok daha has sastır (3).

İkincil oksidasyon ürünü olan MDA spektrototomet- rede, yüksek basınçlı sıvı kromatogratisinde (HPLC) ve gaz kromatografisinde (GC) tespit edilerek mikta rı saptanabilir.

Spektrofotom etre: Besinlerde ve biyolojik sistem lerde TBA ile reaksiyona giren MDA'nın değerlendi rilmesinde, spektrofotometre sıklıkla kullanılmakta

(4)

46

KARABUDAK E.

dır. Bu testin spektrofotometrede kullanılmasındaki en büyük dezavantaj, T B A reaksiyonunun sadece M D A için özel olm am ası, M D A ’ya benzeyen fakat M D A olmayan bileşiklerle de reaksiyona girerek bu bileşiklerin de ölçü lm esid ir. Bu nedenle testte T B A R S deyimi M D A ’nın yerine daha çok kullanıl

maktadır (23).

T B A sayısı, yağ ve yağlı gıdalarda otooksidasyon so nucu oluşan ransiditenin (acılaşmanın) ölçüsünü be lirlemek amacıyla kullanılan basit, hızlı ve hassas bir

yöntemdir. İki molekül T B A bir molekül M D A ile reaksiyona girerek 532 n m ’de maksimum absorbans veren kırmızı renkli M D A -T B A kompleksini oluştu rur. TB A analizinin sonucunda elde edilen değer TBA sayısı olarak bilinir ve mg MDA/kg et karşılı

ğıdır (Şekil 1) (8,14). TBA testi temelinde M D A , be sinlerde çoklu doymamışlık içeriği ve oksidatif acı manın miktarına bağlı olarak 0-10 ppm arasında bu lunur (23).

TBA testinin sonuçları ile duyusal analizlerin sonuç ları arasında bir korelasyon vardır. Ancak TBA yön temi etlerde duyusal olarak algılanan acı kokunun eşik değeri için genel bir referans sayı olarak düşü

nülmemelidir. Çünkü TBA sayısı; hayvanın yaşı, beslenme durumu, etin çiğ veya pişmiş olması ve analizde kullanılan TBA yönteminin çeşidi gibi fak törlerden etkilenir (8,24). Acılaşmaya neden olan kı sa karbon zincirli ürünlerin birikimine paralel olarak TBA sayısında bir artış olur. TBA sayısının bir avan

tajı da; besinden doğrudan örnek alınarak yapılabil mesi ve yağların ekstraksiyonu işlemine gerek olm a dığından analiz sırasında oluşabilecek hataların orta dan kalkmasıdır (25,26). Bununla beraber TBA testi kullanılacağı zaman bazı noktalar gözönünde bulun durulmalıdır. Birincisi; et örneklerinde M DA oluşu mu ve miktarı; Ç D Y A ’nın doymamışlık derecesine, oksidasyonu katalizleyen katalizörün tipine ve

pe-ro k s id a s y o n k o ş u lla r ın a , y a ğ k a y n a k l ı o l m a y a n M D A oluşum una, M D A ’nın d iğ er b iy o lo jik m a te r yallerle olan re ak siy o n u n a b ağ lıd ır (27). İkincisi; T B A testi sırasında ısıl işlem ve asidik k o şu lların u y

gulanması, T B A ile reak siy o n a g ire b ile ce k m a d d e le rin o lu ş u m u n a n e d e n o l m a k t a d ı r . Ü ç ü n c ü s ü ; T B A ’nın diğer m addelerle de re a k s iy o n a g irm e si so

nucu oluşan kırmızı pigm en tin a b so rb a n sı da ö lç ü le bilir (8).

A raştırm acılar tarafından b e sin le re u y g u la n a b ile n çeşitli T B A yöntemleri geliştirilm iştir. Bu y ö n t e m lerden birincisinde; örnek, d o ğ ru d a n T B A so lü sy o n u ile ısıtılır ve reaksiyon sonucu olu şan p ig m e n t büta- nolle ekstrakte edilir (28,29). İk in cisin d e; ö rn e k , b u har ile distile edilir (17,30,31). Ü ç ü n c ü s ü n d e ise; ö r nek, asitle ekstrakte edilir (32,33). Son bir y ö n te m d e de; örnekteki yağ ekstrakte edilir (1 5 ,3 4 ,3 5 ).

T B A testi, ekstre edilen veya e d ile m e y e n tü m y a ğ la r daki bozulm anın ö lçü m ü n ü g ö s te rm e k te d ir. Bu n e denle, karışık yağ örüntüsü olan b esin ler için sıklıkla kullanılmaktadır. Özellikle et ve et ü rü n le rin d e , saf yağ ve katı yağlarda d aha çok k u lla n ılm a k ta d ır. B ir çok araştırmacı T a r la d g is ’in y ö n te m in e (30) b a ş v u r ma eğilimi göstermiştir. Bu y ö n te m , asitlendirilm iş şartlar altında buhar distilasy o n u n u k apsar. Distilas- yon yöntem inde ısı işlem inin u y g u la n m a s ı sonucu okunan T B A sayısı, ekstrak siy o n y ö n te m in d e o k u nan T B A sayısından yaklaşık 3 kat d a h a fazla o l m a k tadır (33). Bu nedenle yeni geliştirilen asit distilas- yonlu T B A yöntem inin ö zg ü n lü ğ ü arttırılm ış, h o m o - jenizasyon veya distilasyon sırasında çeşitli antioksidanlar eklenerek analiz sırasında o lu şa b ile c ek isten meyen bozulm a reaksiyonlarının o lu ş u m u ö n le n m iş tir (34,36). Ekstraksiyon y ö n tem i, d istilasyon y ö n te mine göre distilasyon işlemine ihtiyaç d u y m a m a s ı ve daha basit olm asından dolayı d ah a avantajlıdır. A n cak ekstraksiyon yöntem inin duyarlılığı azdır (31).

H ohn

/ \ ^

°

H H O NH H+ O s N H N H

Malonaldehid 2-tiobarbitürik asit T B A -M D A kom pleksi

(5)

K ü rle n m iş et ürünlerinde nitrit M D A ile reaksiyona gireb ileceğ in d en dolayı T B A yönteminin kullanımı sınırlı o lm a k ta , analiz sonucu bulunan M D A miktarı gerçek d e ğ erin d en d aha az olmaktadır. Bunu önle m ek için analiz sırasında sülfonam id eklenirse, nitrit- le sü lfo n am id d ia z o n y u m tuzları oluşur ve nitritin M D A ile re ak s iy o n a girmesi önlenm iş olur (8,25). T B A ile lipid oksid asy o n u n u ölçmede 450 n m ’deki

absorbans sınırlıdır. A ldehidler içinde alkanlar baskın ise bu dalga boyu kullanılmaktadır. Katalitik demir

(III) tuzlarının varlığında alifatik aldehidler kısa zin

cirli aldehidlere parçalanır ki bu da, T B A değerlendir m esinde 450 n m ’de belirlenir. Bu aldehidlerin toksi- kolojik ve m utajen ik etkileri vardır. Alkenallar, tat lımsı, m e y v e m si ve yağlımsı gibi tanımlanan belirgin aromayı verir. A lkenalların, absorbsiyon hassasiyeti alkanallerden çok daha yüksektir (Xmax= 452). TBA ve alkadienallerle gözlenen kromoforlar 532 n m ’de absorblanır. A raştırm acılar, çoklu doymamış yağların oksidatif b o zu lm asıy la oluşan M D A ’nın 532 n m ’de kırmızı renk verdiğini onaylam ışlardır (3,30).

Et ve et ü r ü n le r in d e özellikle oluşan m addeler T B A R S olarak tayin edilir. T B A varlığında karbon hidratlar 1 0 0 ° C ’de ısıtıldığında koyu bir absorbsiyon bandı ( ^ max= 454) oluşur. Fruktozla en fazla girişim gözlenir. T B A reaktifi direkt olarak formik, glikolik, gliserik, şik im ik , sialik ve sorbik asitlerle reaksiyona girer (3).

Y ü k s e k b a s ın ç lı sıvı k r o n ıa to g r a fisi (HPLC):

M D A tayininin d a h a duyarlı ve spesifik olması için yüksek basınçlı sıvı krom atografisi (HPLC) yöntemi geliştirilmiştir. H P L C yöntem i, Tarladgis ve arka daşlarının (30) spektrofotom etrik TB A testinden da ha hassastır ve her bir distilatı değerlendirmek için 5 d ak ikaya ihtiyaç vardır. H P L C , serbest ve bağlı M D A ve distilasyon süresince oluşan M D A ’nın ta m am ını ölçer (8,25).

M D A o ld u k ça hidrofilik bir bileşik olduğu için tü- revlendirilm esi g e rek m e k te d ir ve yine örnek distile edileceğinden analiz sırasında M D A oluşabilmekte- dir (37). Bu y ö n tem hızlı olm asına karşın, analiz için fazla örnek g e rek m e k te ve örnek miktarı azaldıkça kayıplar artm ak tad ır (38). H P L C yönteminin en bü yük avantajı, analizlerde solvent ekstraksiyonuna ih tiyaç d u y u lm am ası ve yeterince hassas olmasıdır. H PLC yöntem inin kullanımını sınırlayan en büyük neden ise kolon öm rü n ü n az olması ve (8,25) pahalı bir yöntem olm asıdır (39). Duyarlılığı 1 ng'dır ve be sinlerdeki T B A - M D A kompleksi için spesifiktir (40). G a z k r o m a t o g r a f i s i : M DA tayininde gaz kromatog- rafisınin avantajları H P L C 'y e göre daha fazladır.

Ka-piller kolondan dolayı M D A ’nın diğer bileşiklerle et kileşimi az olur. Gaz kromatografisinde örnek hazır lanması çoklu solvent ekstraksiyonu ve evaporasyonu gerektirdiğinden analiz için uzun bir zamana ihtiyaç vardır. MDA tayini için mutlaka türevlendirme yapıl malı ve türevlendirmeye bağlı olarak da hem serbest hem de bağlı MDA tayin edilebilmektedir (8).

SONUÇ ve ÖNERİLER

MDA, çoklu doymamış yağ asitleri ve yağ olmayan organik maddelerden meydana gelir. Ortamda oluşan MDA miktarını yağ asidinin doymamışlık derecesi ve zincir uzunluğu, antioksidanlar, oksijen çeşitleri, geçiş metalleri, sıcaklık, ortam p H ’sı etkilemektedir. HPLC ve G C ’de yöntem hassas ve spesifik iken, G C ’de analiz süresi uzundur. Spektrofotometrik yön tem ise kısa zamanda fazla sayıda örneğin analizine olanak tanıdığı için kromatografik yöntemlere tercih edilir. Spektrofotometrik yöntemin en büyük olum suzluğu spesifikliğinin ve duyarlılığının az oluşudur. Yeni geliştirilen asit ekstraksiyonlu TBA yönteminin spesifikliği ve distilasyon sırasında antioksidanlar eklenerek doğruluğu arttırılmıştır. Ayrıca, TBA yön temi ile lipid peroksidasyonunu değerlendiren süb jektif ve objektif yöntemler arasında büyük bir kore lasyon vardır. Okside olmuş besinler insan sağlığı üzerinde olumsuz etkiler göstermektedir. Bu nedenle özellikle yağlı besinlerin içerisinde bulunan oksidas yon ürünlerinin miktarı ve çeşidi bilinmelidir.

KAYNAKLAR

1. Taub IA. Free radical reactions in food. J Chemical Education 1984;61:313-24.

2. Harris P, Tali J. Rancidity in fish. In: Ailen JC, Hamil- ton RJ (eds). Rancidity in Foods. Chapman & Hail, London, 1994:256. *

3. Guillen-Sans R, Guzman-Chozas M. The thiobarbituric acid (TBA) reaction in foods: A revievv. CRV Food Scien and Nutr 1998;38:315-30.

4. Drumm TD. Spanier MA. Changes in the content of li pid autoxidation and sulfur-containing compounds in cooked beef during storage. J Agric Food Chem

19914;39:336-43.

5. Spanier AM, Edvvards JV, Dupuy HP. The vvarmed- over flavor process in beef: A study of meat proteins and peptides. Food 1 ech 1988;June: 110-8.

6. Khayat A, Sch\vall D. Lipid oxidation in seafood. Fo od Tech 1983:July: 130-40.

7. Hallivvcll B, Mıırcia MA. Chirieo S. et al. Free radicals and antioxidants in food and in vivo: VVhat they do and hovv they \vork. CRV Food Scien Nutr 1995;35:7-20. 8. Raharjo S. Sofos JN. Methodology for measuring ma

lonaldehyde as a prodııct of lipid peroxidation in muscle tissues: A revievv. Meat Science 1993;35:145-69.

(6)

48

KARABUDAK E.

9. Buttkus H. The reaction of myosin with malonaldehyde. J Food Scien 1967;32:432-4.

10. Frankel EN, Neff WE. Formation of malonaldehyde from lipid oxidation products. Biochim Biophys Açta

1983;754:264-9.

11. Rhee KS. Enzymic and nonenzymic catalysis of lipid oxidation in muscle foods. Food Technology 1988;Ju- ne: 127-32.

12. Draper HH, Hadley M. A review of recent studies on the metabolism of exogenous and endogenous malondialdehyde. Xenobiotica 1990;20:901-7.

13. Kanner J. Oxidative processes in meat and meat pro ducts: Quality implications. Meat Sci 1993;36:169-85. 14. Shadidi F, Hong C. Evaluation of malonaldehyde as a

marker of oxidative rancidity in meat products. J Food Biochemistry 1991;15:97-105.

15. Siu GM, Draper HH. A survey of the malonaldehyde content of retail meats and fish. J Food Science

1978;43:1147-9.

16. Mukai FH, Goldstein BD. Mutagenicity of malonal dehyde, a decomposition product of peroxidized pol yunsaturated fatty acids. Science 1976;191:868-9.

17. Shamberger RJ, Shamberger BA, Wills CE. Malonal dehyde content of foods. J Nutr 1977;107:1404-9.

18. Nevvburg DS, Concon JM. Malonaldehyde concentra- tions in food are affected by cooking conditions. J Fo od Scince 1980;45:1681-7.

19. Boyd MF, McGuire V. Evidence of lipid peroxidation in premenopausal vvomen with mammographic dyspla- sia. Cancer Letters 1990;50:31-7.

20. Gray JI, Pearson AM, Monahan FJ. Flavor and aroma problems and their measurement in meat, poultry and fish products. In: Pearson AM, Dutson TR (eds). Qu- ality Attributes and Their Measurement in Meat, Po ultry and Fish Products. Blackie Academic, 1994:250. 21. Kupranycz DB, Paquette G, van de Voort FR. The

mechanisms of lipid autoxidation II. Non volatile se- condary oxidation products. Can Inst Food Sci Technol J 1985;18:197-206.

22. Kupranycz DB, Paquette G, van de Voort FR. The mechanisms of lipid autoxidation I. Primary oxidation products. Can Inst Food Sci Technol J 1985; 18:112-8. 23. Kubow S. Routes of formation and toxic consequences

of lipid oxidation products in foods. Free Radical Bi- ology Med 1992;12:63-81.

24. Poste LM, Willemot C, Butler G, Patterson C. Sensory aroma scores and TBA values as indices of warmed- over flavor ın pork. J Food Science 1986;51:886-8. 25. Melton LS. Methodology for follovving lipid oxidation

in muscle foods. Food Technol 1983;37:105-1 1.

26. Moyland DV, Taylor AJ. A review of the methodology of the 2-thiobarbituric acid test. Food Chem

1991;40:271-91.

27. Hoyland DV, Taylor AJ. A modified distillation method for the detection of fat oxidation in foods. Int J F o od Scien Tech 1989;24:153-161.

28. Yu TC, Sinnhuber RO. 2-thiobarbituric acid m ethod for the measurement of rancidity in fishery products. Food Tech 1957,104-8.

29. Sinnhuber RO, Yu TC, Yu TC. Characterization o f the red pigment formed in the 2-thiobarbituric acid determination o f oxidative rancidity. F o o d R e s e a r c h

1958;23:626-33.

30. Tarladgis BG, Watts BM, Younathan M T , D ugan LR. A distillation method for the quantitative determination of malonaldehyde in rancid foods. J A m er Oil C h e m Soc 1960;37:44-8.

31. Witte VC, Krause GF, Bailey ME. A new extraction method for determining 2-thiobarbituric acid values o f pork and b e e f during storage. J F o o d S c ie n c e

1970;35:582-5.

32. Tarladgis BG, Pearson AM , Dugan LR. C hem istry of the 2-thiobarbituric acid test for determination o f oxidative rancidity in foods. 2. Formation o f the T B A -m a - lonaldehyde complex without acid-heat treatment. J Sci Food Agric 1964;15:602-7.

33. Salih AM, Smith DM, Price JF, et al. M odified extraction 2-thiobarbituric acid method for m easuring lipid oxidation in poultry. Poultry Scien 1987;66:1483-8. 34. Pikul J, Leszczynskı ED, Kummerovv FA. E lim ination

of sample autoxidation by buthylated hydroxytoluen additions before thiobarbituric acid assay for malonal- dehiyde in fat from chicken meat. J Agric Food C h e m

1983;31:1338-42.

35. Pikul J, Lesczynski DE, Kummerovv FA. Evaluation o f three modified T B A methods for measuring lipid oxidation in chicken meat. J A g ric F o o d C h e m

1989;37:1309-13.

36. Turner EW , Paynter W D , Montıe EJ, et al. Use o f the 2-thiobarbituric acid reagent to measure rancidity in

frozen pork. Food Tech 1954;July:326-30.

37. Kishida E, Oribe M. Mochizuki K, et al. D e te rm in a ti on of malondialdehyde with chemical derivazition into the pyrmidin compound and HPLC . B iochim Biophy

Açta 1990;1045:187-8.

38. Csallany AS, Guan MD, Manvvaring JD, Addis PB. Free malonaldehyde determination in tissues by high- performance liquid c h ro m a to g ra p h y . Anal B iochem

1984;142:277-83.

39. Total Plasma Malondialdehyde levels in 16 Taivvanese colloge students determined by various thiobarbituric acid test ans a improved high-perform ance liquid chro- m ato g rap h y -b ased m ethod. C linical B io c h e m is tr y 2000;33:619-25.

40. Bird RP. Hung SSO, Hadley M, et al. D eterm ination o f malonaldehyde in biological materials by H P LC . J Bi ochem 1983;128:240-4.